Determinazione dell'attività enzimatica delle lipossigenas

2.4.1. Preparazione delle soluzioni dei substrati e delle miscele di reazione

Le lipossigenasi catalizzano la reazione di bleaching del β-carotene come conseguenza indiretta dell’azione sul substrato fisiologico, il linoleato: i carotenoidi fungono da co- substrato, venendo ossidati dagli idroperossidi che si generano nella prima reazione. Per i saggi in vitro vengono preparate, immediatamente prima dell’uso, le seguenti soluzioni:

Soluzione di linoleato

4.5 mg di linoleato di sodio (Sigma-Aldrich L8134), vengono sciolti in 870 µL di acqua, 30 µL di tween 20 (Sigma-Aldrich P1379) e 100 µL di tampone 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; la soluzione viene rimescolata fino a completo scioglimento del linoleato, e mantenuta in ghiaccio fino all’utilizzo. Essa ha una concentrazione teorica di 15 mM, ma in pratica il titolo risulta leggermente inferiore, a causa della rapida ossidazione del composto (Pastore et al., 2000); una volta preparata, la soluzione deve essere utilizzata in giornata.

Soluzione di β -carotene

5 mg di β-carotene (Fluka 22040) vengono sciolti in 2.5 mL di cloroformio e 140 µL di tween 20. La soluzione così preparata viene mantenuta in freezer a -20°C. Quando richiesto, una aliquota da 0.5 mL di questa soluzione viene mandata a secco, sotto cappa chimica, per rotazione manuale del tubo da 50 mL in cui è posta; il residuo secco viene rapidamente risospeso in 10 mL di acqua, e la concentrazione della soluzione ottenuta viene determinata spettrofotometricamente a 460 nm sulla base di un coefficiente di assorbimento molare di 125000 cm-1 M-1; questa soluzione acquosa viene utilizzata in giornata. Si nota una blanda ossidazione del β-carotene anche quando si trova disciolto in cloroformio a -20°C, perdendo circa il 10% dell’assorbanza iniziale in 10 giorni (Craft, 1992): per questo motivo anche la soluzione stock viene periodicamente fatta ex-novo.

93

Soluzione di luteina

Viene utilizzato un preparato di luteina ottenuto tramite estrazione della xantofilla da colture cellulari di Chlorella e conservato a -20°C in MetOH 100% (paragrafo 2.4.2). Ad aliquote da 75 µL del suddetto preparato si addizionano 10 µL di una soluzione di Tween20 allo 0.05%: questo volume è ottimale per una miscela di reazione di 250 µL di volume finale, in quanto si ottiene una concentrazione di detergente dovuto unicamente alla luteina dello 0.002%. Si evapora totalmente la soluzione di luteina in MetOH 100% ponendola in una eppendorf da 1.5 mL aperta in un bagnetto termostatico a 55°C: il tempo impiegato per il processo è di circa 45 min.

Soluzione FOX

Il saggio FOX è basato sulla riduzione dei perossidi da parte del Fe2+ in condizioni acide; la produzione del Fe3+ porta alla formazione di un complesso Fe3+-XO, generando un composto colorato che presenta un massimo di assorbanza a 560 nm (Jiang et al., 1992), con un coefficiente di assorbimento molare di circa 70000 M-1 cm-1, valore che viene calcolato di volta in volta tramite taratura con concentrazioni crescenti di H2O2. La miscela di reazione

FOX è costituita da metanolo-acqua in rapporto 9:1. Alla parte acquosa vengono addizionati, in ordine, i seguenti componenti:

 H2SO4 25 mM

 Butil-idrossitoluene (BHT) 4 mM  Xylenol Orange (XO) 76 mg L-1

 FeSO4 2 mM

La variazione dell’ordine di aggiunta alla miscela delle soluzioni compromette il corretto sviluppo della soluzione. La miscela viene preparata almeno 15 minuti prima dell’utilizzo; l’aggiunta del BHT ha come fine quello di ridurre l’eventuale rumore di fondo causato dalla presenza nell’estratto utilizzato di molecole ossidanti (Pinto et al. 2007).

2.4.2. Purificazione della luteina da cellule di Chlorella protothecoides

La luteina, come la maggior parte dei carotenoidi, è disponibile commercialmente a prezzi molto elevati. Pertanto si è messo a punto un metodo per purificarla dall’alga verde Chlorella protothecoides (Shi et al., 1997). Questa microalga, cresciuta in condizioni eterotrofe, è caratterizzata da elevate concentrazioni di luteina, che viene accumulata all’interno della cellula. Nella collezione algale del laboratorio di Fisiologia e Biochimica vegetale è presente il ceppo ATCC 30411 di Chlorella protothecoides che è stato quindi utilizzato per mettere a punto un protocollo di purificazione preparativa capace di fornire luteina in quantità e a un livello di purezza idonei al suo utilizzo per la determinazione dell’attività delle LOX. A tal fine cellule di Chlorella vengono raccolte per centrifugazione a 2500 g per 5 min e la biomassa ottenuta viene risospesa in 25 mL g-1 di metanolo100%. L’estrazione in solvente organico viene lasciata procedere per 30 min al buio, vortexando ogni 10 min. Dopo un’ulteriore centrifugazione il supernatante viene trasferito in un pallone di vetro da 500 mL e concentrato a temperatura ambiente sotto vuoto mediante un apparato Rotavapor.

L’ottenimento di un preparato di luteina con un accettabile livello di purezza richiede la sua risoluzione dagli altri pigmenti presenti, in particolare delle clorofille e del β-carotene. L’esclusione di tali molecole dal campione di interesse non risulta però semplice per via della loro comune natura fortemente idrofobica. La metodica prescelta è stata quella dell’estrazione in fase solida (SPE), utilizzando colonnine C18 in cui la resina, affine ai composti polari grazie alle lunghe catene idrocarburiche presenti, trattiene sia le clorofille che i carotenoidi. La luteina è una xantofilla, mentre il β-carotene non contiene atomi di ossigeno, per cui risulta essere significativamente più idrofobico della prima. Le clorofille presentano una polarità

94

intermedia tra i due carotenoidi, quindi la cromatografia dovrebbe portare al seguente ordine di eluizione: luteina, clorofille e β-carotene. Una volta che il campione è stato concentrato circa 10 volte, aliquote da 5 mL vengono caricate su una cartuccia C18 octadecil (Baker, 500 mg), precedentemente riequilibrata mediante il passaggio di 10 mL di metanolo 100% e 10 mL di metanolo 95%. Il flusso viene regolato a 60 mL ora-1 e viene mantenuto costante mediante l’ausilio di una pompa peristaltica. Una volta caricato il campione, la colonna viene eluita prima con metanolo 95%, e successivamente con metanolo 100%; si raccolgono frazioni da 1 mL (Figura 71). Le frazioni contenenti luteina sono combinate e concentrate come descritto in Rotavapor.

Figura 71. Eluizione

dei diversi pigmenti per SPE su colonna C18 octadecil. La luteina eluisce per prima e viene separata

sia dalle clorofille sia dal β-carotene.

La purezza del preparato ottenuto viene analizzata mediante HPLC. Una aliquota da 20 µL del campione viene iniettata su una colonna a fase inversa Zorbax ODS C18 (Agilent) da 5 µm,  4,6 mm e 250 mm di lunghezza. La corsa cromatografica, gestita da un apparato Kontron 450 con acquisizione automatica del segnale, procede a 1 mL min-1 mediante un gradiente complesso (Bertazzini, 2009), misurando l’assorbanza dell’eluato a 444 nm mediante un detector Kontron 432.

2.4.3. Saggi per la rilevazione dell'attività delle lipossigenasi

Attività in vitro della lipoossigenasi (saggio diretto a 234 nm)

L’attività lipossigenasica può essere valutata spettrofotometricamente misurando diret- tamente l’incremento di assorbanza a 234 nm (Grossman e Zakut, 1979). La miscela di reazione è costituita da 100 µL di tampone 0.5 M Tris HCl pH 7.5 (concentrazione finale 50 mM) e 34 µL della soluzione di linoleato (finale 500 µM) in un volume finale di 1 mL. Dopo aver pre-equilibrato la miscela a 35°C in un bagnetto termostatico per 3 minuti, la reazione viene fatta partire mediante l’aggiunta di un opportuno volume di estratto in una cuvetta di quarzo da 1 mL di volume. L’assorbanza a 234 nm viene seguita per 5 min attraverso una lettura ogni 15 sec contro un bianco costituito da un campione parallelo senza acido linoleico. L’attività viene calcolata in pkat (1 pkat corrisponde alla comparsa di 1 pmol di idroperossido al secondo) sulla base di un coefficiente di assorbimento molare dell’idroperossido pari a 30000 M-1 cm-1.

95

Attività in vitro della lipoossigenasi (saggio FOX)

L’attività della lipossigenasi può essere valutata spettrofotometricamente in maniera indiretta misurando l’incremento di assorbanza a 560 nm provocata dalla reazione tra gli idroperossidi prodotti dalla reazione primaria e il reattivo FOX (Jiang et al., 1992). La miscela di saggio è costituita da 200 µL di tampone 0.5 M Tris HCl pH 7.5 (concentrazione finale 50 mM) e 68 µL della soluzione di linoleato (500 µM), in un volume di 2 mL. Dopo aver pre- equilibrato la miscela a 35°C in un bagnetto termostatico per 3 minuti, la reazione viene fatta partire mediante l’aggiunta di un opportuno volume di estratto. Ogni 2 min vengono prelevati 100 µL di miscela di saggio, che sono addizionati a 900 µL di miscela FOX, lasciati reagire per 15 min e letti allo spettrofotometro a 560 nm in una cuvetta di polimetacrilato da 1 mL di volume. L’attività viene calcolata sulla base di un coefficiente di estinzione molare pari a 71000 M-1 cm-1.

Attività di bleaching del B-carotene ad opera della lipoossigenasi

L’attività di bleaching del β-carotene (e della luteina) viene valutata spettrofotometrica- mente misurando la diminuzione di assorbanza a 460 nm. La miscela di reazione è costituita da 100 µL di tampone 0.5 M Tris HCl pH 7.5 (concentrazione finale 50 mM), 34 µL della soluzione di linoleato (500 µM), e un volume variabile della soluzione acquosa di β-carotene (o luteina) in modo da ottenere una concentrazione pari a circa 8 µM (abs = 1) in un volume finale di 1 mL. Dopo aver pre-equilibrato la miscela a 35°C in un bagnetto termostatico per 3 minuti, la reazione viene fatta partire mediante l’aggiunta di un opportuno volume di estratto in una cuvetta di polimetilmetacrilato da 1 mL di volume. L’assorbanza a 460 nm viene seguita per 5 o 10 min attraverso una lettura ogni 30 sec contro un bianco costituito da un campione parallelo senza enzima. L’attività viene calcolata sulla base di un coefficiente di assorbimento molare di 125000 M-1 cm-1 per il β-carotene (Borrelli et al., 1999) e uno di 137096 M-1 cm-1 per la luteina.

Modalità miniaturizzate di saggio

Tutti i saggi descritti, laddove opportuno, sono stati effettuati anche su scala più ridotta grazie all’utilizzo di particolari cuvette (UVette, Eppendorf) nelle quali il volume minimo del campione è di soli 50 µL. Solitamente i saggi miniaturizzati vengono effettuati in un volume finale di 200 µL, permettendo di ridurre l’utilizzo dei reagenti di 5 volte rispetto al protocollo usuale.

2.4.4. Saggio per la rilevazione dell'attività di metabolizzazione dei 13S-H(P)ODE

I 13S-H(P)ODE del linoleato sono stati prodotti in vitro tramite l’utilizzo della LOX di soia prodotta dalla Sigma (L6632-1) come sospensione in ammonio solfato a una concentrazione di 3.6 mg mL-1 e a una attività specifica di 500000-1000000 U mg-1. In una provetta eppendorf vengono a questo fine uniti tampone 50 mM potassio fosfato, pH 8.8, 500 μM acido linoleico, 0.1% (v/v) Tween 20 e 10000 U di LOX commerciale in un volume di 1 mL (Brash e Song, 1996). La reazione viene lasciata procedere a completamento, al termine del quale la concentrazione di 13S-H(P)ODE viene misurata a 234 nm su una diluizione del preparato.

L’attività di metabolizzazione dei H(P)ODE viene misurata in presenza di 0.2 mM 13S- H(P)ODE, seguendo il conseguente decremento di assorbanza a 234 nm.

96

2.5. Caratterizzazione biochimica dell'attività lipossigenasica