Caratterizzazione biochimica dell'attività lipossigenasica 1 Determinazione del valore ottimale di pH

Il valore di pH ottimale per l’attività lipossigenasica e per quella di bleaching dei carotenoidi viene determinato aggiungendo alla miscela di reazione in diverse proporzioni Tris-HCl e Tris base, secondo lo schema riportato in Figura 72. Per i valori di pH inferiori a 7 viene utilizzato invece il tampone MES, che presenta un PkA inferiore. Alla fine di ogni saggio il pH effettivo è misurato mediante l’ausilio di un pHmetro. I dati vengono quindi riportati in grafici che mettono in relazione l’attività lipossigenasica e il pH.

Figura 72. Tabella di preparazione del tampone Tris-HCl a diversi valori di pH (a sinistra) e

schema rappresentante i più importanti tamponi biologici in ordine di PkA (a destra).

2.5.2. Determinazione dei parametri cinetici: KM e Vmax

Per spiegare le proprietà cinetiche della maggior parte degli enzimi può essere impiegato il modello di Michaelis-Menten, in cui un enzima (E) si combina con il substrato (S) per formare un complesso (ES), che poi procede a formare il prodotto finale (P). La velocità di formazione del prodotto (V) è data dall’equazione

dove Vmax è la velocità quando l’enzima è completamente saturato dal substrato, e la KM è la

concentrazione di substrato a cui la velocità di reazione è la metà di quella massima. La velocità massima è data dal prodotto tra il numero di turnover e la concentrazione totale di enzima. La prima corrisponde al numero di molecole di substrato convertite in prodotto per l’unità di tempo da un unico sito catalitico a concentrazione satura di substrato. L’equazione in oggetto descrive un’iperbole equilatera dove Vmax e KM sono gli asintoti (Figura 73A). Il

valore della KM può essere quindi calcolato per interpolazione grafica. La suddetta equazione

può essere linearizzata ponendo sugli assi cartesiani gli inversi della concentrazione e della velocità (Figura 73B), in modo che i due asintoti siano trasformati in intercette. Quest’ultimo modello, descritto da Lineweaver-Burk, permette una più semplice analisi dei dati.

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Figura 73. Rappresentazione grafica delle equazioni di Michaelis-Menten (A) e di

Lineweaver-Burk (B).

La determinazione dell’affinità delle lipossigenasi per i substrati, in particolare l’acido linoleico, è stata valutata variando la concentrazione del linoleato tra 0 e 1 mM. Con i dati ottenuti è stata ricavata la curva di Michaelis-Menten, di cui è stata effettuata la linearizzazione con il metodo dei doppi reciproci. Questo metodo ha il vantaggio che i valori di velocità v per un dato valore di concentrazione di substrato [S] sono facilmente deducibili, ma ha lo svantaggio di condensare i punti dei dati ad alte [S] in una piccola regione e di mettere in rilievo i punti a basse [S]. In alcuni casi particolari, i parametri cinetici sono stati calcolati tramite il software “Prism 6 for Windows” (versione 6.03, GraphPad Software Inc.) che si basa su una analisi non lineare.

2.5.3. Determinazione della stabilità enzimatica

La stabilità enzimatica viene valutata misurando ogni 12 o 24 ore l’attività specifica su aliquote di un preparato parzialmente purificato, conservato nel frattempo in ghiaccio. I risultati ottenuti sono espressi come percentuale del valore ottenuto al tempo 0.

2.5.4. Determinazione del contenuto proteico di un campione

Per determinare la concentrazione proteica di un campione viene utilizzato il saggio di Bradford (1976) che si basa sul principio del legame non covalente in ambiente acido tra un colorante, il Blu di Comassie, e i gruppi basici delle proteine. Questo legame sviluppa un colore scuro con massimo di assorbimento a 595 nm, misurabile per mezzo di uno spettro- fotometro. Il reattivo viene preparato sciogliendo 100 mg di Coomassie Brillant Blue G250 in 50 mL di etanolo 96%, mantenendo la soluzione in blanda agitazione per mezzo di un magnete; si aggiungono quindi 100 mL di acido fosforico 85% e si porta lentamente al volume di 1 L con acqua distillata. Quando il colorante ha raggiunto un buon grado di solubilizzazione (dopo circa 20 minuti di agitazione) si procede alla filtrazione su carta della soluzione per eliminare il composto in eccesso. Il reattivo così ottenuto viene conservato in una bottiglia di vetro scuro, e rimane stabile per alcuni mesi a temperatura ambiente.

La risposta quantitativa del reattivo deve essere determinata sperimentalmente per ogni preparazione. Aliquote da 1 mL della soluzione colorimetrica sono distribuite in provette tipo Eppendorf da 1.5 mL. Dopo aver preparato una soluzione 1 mg mL-1 di albumina di siero bovina (BSA), che può essere poi conservata a –20°C, si alleste una diluizione della stessa in

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modo da ottenere una concentrazione di 0.2 mg mL-1. Aliquote comprese tra 5 e 25 µL di quest’ultima soluzione, corrispondenti a 1-5 µL di proteina, sono aggiunte alle provette in duplicato. Dopo aver lasciato a temperatura ambiente per 10 minuti in modo da consentire il completo sviluppo del colore, l’assorbanza dei campioni viene determinata allo spettro- fotometro a 595 nm contro un bianco costituito da solo reattivo. Con i risultati ottenuti si costruisce una curva di taratura ponendo in ordinata i valori di assorbanza e in ascissa quelli relativi alla concentrazione di BSA; la pendenza della retta interpolante rappresenta il valore di assorbanza che corrisponde a 1 µg di proteina. Solitamente l’ambito di linearità del metodo è compreso tra 0.1 e 0.4 A595, ma tali valori sono determinati di volta in volta analizzando la

curva di taratura ottenuta.

Al fine di determinare la concentrazione proteica di un campione incognito, dopo aver preparato una diluizione opportuna dell’estratto ad aliquote da 1 mL di reattivo sono uniti solitamente 5 volumi differenti (nell’ambito compreso tra 5 e 25 µL) di campione, e si determina con le modalità indicate l’assorbanza risultante. Si rapportano quindi i valori ottenuti a 1 mL di campione e se ne calcola la media; il dato viene quindi diviso per il valore di assorbanza che corrisponde a 1 µg di proteina: il risultato, eventualmente corretto per il fattore di diluizione, rappresenta la concentrazione di proteine solubili in µg mL-1.

2.6. Determinazione dell'espressione dei geni Lpx di grano duro