Evidenza in favore della presenza in cellule di grano duro di un enzima

secondario capace di metabolizzare gli idroperossidi prodotti dalle Lpx e

catalizzare ad alta efficienza il bleaching del β-carotene

Per verificare tale ipotesi, cioè che i prodotti delle due lipossigenasi di grano duro possano avere una diversa efficienza nel determinare il bleaching del β-carotene, tale reazione è stata misurata in estratti grezzi. Considerando che in tali preparati l’attività dell’isoforma-1 rappresenta circa il 20-25% dell’attività LOX complessiva e che le due forme isoenzimatiche hanno un rapporto stechiometrico tra la reazione secondaria di degradazione del β-carotene e quella primaria di produzione degli idroperossidi di circa il 40 e il 5%, il valore atteso avrebbe dovuto essere di poco superiore a quello dell’isoforma-2, e comunque intermedio rispetto a questi due valori. Al contrario dell’atteso, però, il risultato ottenuto (un rapporto stechiometri- co pari a 50.2 ± 1.2%) è molto simile a quello precedentemente riportato per la LpxB-1.2.

Un simile dato sembra suggerire che anche gli idroperossidi generati dalla Lpx-2, se prodotti nell’estratto grezzo, siano in grado di catabolizzare il carotenoide con un’alta efficienza. Tale comportamento potrebbe essere spiegato dalla presenza, sia negli estratti grezzi che nel preparato semi-purificato con cui è stata eseguita la caratterizzazione dell’isoforma-1, di un enzima secondario capace di metabolizzare i prodotti delle lipossi- genasi e generare a sua volta metaboliti in grado di catalizzare in maniera più efficiente il bleaching del β-carotene rispetto agli idroperossidi.

Per avvalorare tale ipotesi si è verificata la presenza di un enzima in grado di degradare i prodotti delle lipossigenasi. A tal fine gli 13S-H(P)ODE sono stati generati utilizzando una lipossigenasi di soia disponibile commercialmente (Sigma L6632-1). Una volta prodotti, l’enzima è stato allontanato mediante ultrafiltrazione e gli idroperossidi sono stati impiegati come substrato per verificare la presenza di un enzima in grado di metabolizzarli. Analizzando le frazioni ottenute per frazionamento a scambio ionico di estratti grezzi su colonna di DEAE-Sephacel si è in effetti ottenuto evidenza della presenza di uno o più enzimi capaci di metabolizzare gli 13S-H(P)ODE nel materiale non trattenuto dalla resina (Figura 104). Il risultato spiegherebbe perfettamente la differenza tra l’isoforma-2, purificata quasi all’omogeneità elettroforetica, e l’isoforma-1, che co-eluisce in scambio anionico con questo enzima secondario. Che la metabolizzazione degli 13S-H(P)ODE non sia una reazione inversa di quella catalizzata dalle LOX sembra provato sia dai dati di letteratura, che non avvalorano la reversibilità della reazione, sia dal fatto che tale attività non viene evidenziata nelle frazioni in cui è presente l’isoforma-2.

Figura 103. Rapporto stechiometrico tra la reazione secondaria di degradazione del β- carotene e quella primaria di produzione

degli idroperossidi per le due isoforme di lipossigenasi oggetto

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Per cercare di separare comunque l’enzima secondario dalla LpxB-1.2, si sono frazionati estratti grezzi mediante cromatografia a gel filtrazione su una colonna di resina Sephacryl S200, in modo tale da poter trarre anche indicazioni riguardanti la massa molecolare relativa del primo. Come risulta evidente dal profilo di eluizione riportato in Figura 105, l’enzima secondario viene in tal modo parzialmente risolto dalle due forme di Lpx. Il confronto con il profilo di eluizione di marcatori a peso molecolare noto ha permesso di stimare la sua massa relativa intorno ai 110 kDa. Anche con questa tecnica cromatografica, inoltre, si ha evidenza di un solo picco di attività enzimatica capace di metabolizzare i prodotti delle lipossigenasi, anche se tale picco non può essere attribuito in maniera certa a un solo enzima. Figura 105. Profilo di eluizione ottenu- to per fraziona- mento di estratti grezzi da cellule in coltura di grano duro mediante cromatografia a gel flitrazione su colonna di Sephacryl S200. Si può notare la risoluzione della attività lipossige- nasica da quella responsabile della metabolizzazione degli 13S- H(P)ODE. Figura 104. Profilo di eluizione in cromatografia a scambio anionico su colonna di DEAE-Sephacel dell’enzima secondario presente nella coltura cellulare di grano duro della cv. Ofanto e capace di metabolizzare gli 13S-H(P)ODE.

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Per ottenere una ulteriore verifica, sono state effettuate alcune prove con la LOX ricombinante di soia disponibile commercialmente. Dati di letteratura indicano che gli idroperossidi prodotti dalla LOX di soia presentano una ridotta capacità di causare il bleaching dei carotenoidi, con un rapporto stechiometrico tra la reazione lipossigenasica primaria e quella del catabolismo del β-carotene inferiore al 15% anche in condizioni ottimali (Wu et al., 1999). Anche nelle condizioni sperimentali utilizzate nel presente lavoro, l’enzima ricombinante ha in effetti evidenziato una efficacia di bleaching molto bassa, pari a circa il 7% della produzione di idroperossidi. Se però allo stesso preparato veniva aggiunta una piccola aliquota di una frazione ottenuta per gel filtrazione e contenente l’enzima secondario, si determinava un notevole innalzamento del rapporto stechiometrico fino ad arrivare a valori vicini al 40% (Figura 106). Analogamente a quello osservato per la Lpx-2 di grano, anche con la LOX1 di soia l’efficienza di degradazione dei carotenoidi aumenta dunque di quasi dieci volte in presenza di questo enzima.

Questi risultati sembrano dunque rafforzare la possibilità che la presenza di un enzima finora non caratterizzato svolga un ruolo cruciale nella degradazione dei carotenoidi in grano. Questa scoperta aprirebbe nuove prospettive nella selezione di genotipi con ridotta attività di bleaching dei carotenoidi e nella messa a punto del processo di produzione della pasta al fine di ottenere un prodotto finale con un elevato contenuto di questi fitonutrienti.

Gli idroperossidi prodotti dalle LOX sono molecole altamente reattive e tossiche per la cellula, e devono essere rapidamente metabolizzati. A questo scopo vi sono una serie di enzimi (Figura 107) quali l’idroperossido liasi (HPL), l’allene ossido sintasi (AOS), la divinil etere sintasi (DES), perossigenasi (POS), idroperossido reduttasi (HR) e epossi alcool sintasi (EAS) capaci di utilizzare gli H(P)ODE come substrati per produrre molecole classificate come ossilipine. Alcuni di questi enzimi come la HPL, la AOS e la DES sono tra loro connessi e formano una classe di citocromi P450, denominata CYP74 (Matsui et al., 1996), specializzata nel metabolismo degli idroperossidi derivanti dai PUFAs. Questi enzimi si contraddistinguono dalle altre proteine appartenenti ai citocromi P450 in quanto non necessitano di legare l’ossigeno molecolare, ma sono in grado di utilizzare gli idroperossidi come donatori e fonte di equivalenti riducenti. Un’altra importante caratteristica di questa classe di proteine è che non necessita di alcun cofattore, come a esempio NADH e NADPH, per svolgere la propria attività metabolica (Mosblech, 2009).

Figura 106. Rapporto

stechiometrico tra il bleaching dei carotenoidi e la reazione lipossigenasica da parte della LOX di soia in assenza (sinistra) o in

presenza (destra) dell’enzima secondario parzialmente purificato e

risolto dalle LOX endogene di grano per gel

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Figura 107. Enzimi coinvolti nel metabolismo degli idroperossidi prodotti dalle LOX e classi

di molecole generate: idroperossido liasi (HPL), allene ossido sintasi (AOS), divinil etere sintasi (DES), perossigenasi (POS), idroperossido reduttasi (HR) e epossi alcool sintasi (EAS)

(Blee, 2002).

L’identificazione di quale tra queste attività possa coincidere con l’enzima secondario evidenziato nel presente lavoro potrebbe contribuire in modo significativo a chiarire il meccanismo d’azione della co-ossidazione, che a oggi non è stato ancora del tutto delucidato (Chedea e Jisaka, 2013). Visto che in passato alcuni studi hanno evidenziato una maggiore efficenza di bleaching del β-carotene quando vengono generati cheto e idrossi-acidi grassi rispetto ad altri prodotti della via delle lipossigenasi (Casey e Hughes, 2004), i principali candidati potrebbero essere ritenuti l’idroperossido reduttasi, che genera idrossidi, e la perossigenasi.

3.1.10. Livelli di attività enzimatica delle Lpx e dell'enzima secondario in semi di