Clonaggio del gene codificante la proteina VP

Propagazione del virus, estrazione, retro-trascrizione ed amplificazione del dsRNA virale

Le colture cellulari di BHK-21 sono state infettate con lo stipite virale di EHDV-6 e successivamente incubate finché non hanno mostrato un effetto citopatico diffuso (ECP: 90-100%), quindi il virus è stato raccolto ed utilizzato per l'estrazione del dsRNA tramite il kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen), seguendo le istruzioni della ditta.

Il gene che codifica per l’intera proteina virale VP7 è stato retro-trascritto usando una tecnica di amplificazione dell’intera lunghezza del cDNA (FLAC- full-length amplification of cDNA) descritta da Maan et al. nel 2007a., e successivamente amplificato mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizzando la seguente coppia di primers:

VP7 His Fwd 5'-CACCATGGACACGATTGCTGCAAGAG-3' VP7 His Rev 5'- GTAAGTTGAATTTGGGAAAACGTACAAATG-3'

La reazione è stata eseguita utilizzando l’enzima DNA Polimerasi proof-reading Pfx50™ (Thermo Fisher Scientific), secondo il programma che segue:

Iniziale denaturazione 94 °C, 2 min Denaturazione 94 °C, 15 sec

Per 35 cicli

Annealing 60 °C, 30 sec Estensione 72 °C, 1 min Estensione finale 72 °C, 10 min

La miscela di reazione è stata così composta: 1 µl DNA (1-100 pg/µl), 1.5 µl dNTPs 10 mM, 5 µl Buffer Pfx50™ PCR Mix 10X, 1.5 µl primer forward, 1.5 µl primer reverse, 1 µl Pfx50™ DNA Polymerase (5 U/µl), portando a volume finale di 50 µl con acqua nucleasi-free.

Prima di procedere con il clonaggio, l'amplificato è stato sottoposto a corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1% in tampone salino TBE 1X (Tris-borato 0,009 M, EDTA 1 mM pH 8). La banda d’interesse, relativa al gene VP7, è stata tagliata, asportata dal gel di agarosio e purificata utilizzando il kit di estrazione QIAquick Gel Extraction (Qiagen) secondo il protocollo raccomandato dalla casa produttrice. Brevemente, la banda, dopo essere stata pesata, è stata solubilizzata in un volume di Buffer QG pari a tre volte il volume della banda stessa ed incubata in termo-blocco per 10 minuti alla temperatura di 50 °C. È stato successivamente aggiunto un volume di isopropanolo per precipitare il DNA. Il campione è stato caricato in una colonnina del kit e centrifugato per 1 minuto a 13000 rpm a temperatura ambiente (TA). I passaggi successivi comprendono: l'aggiunta di 0.5 ml Buffer QG con centrifuga di un minuto per rimuovere le tracce di agarosio; il lavaggio con 0.75 ml di Buffer PE (contenente etanolo 96%) per 2-5 minuti con successiva centrifuga per 1 minuto; ed un’ulteriore centrifuga a secco per eliminare l'etanolo residuo. Il DNA infine è stato eluito in 10 µl di buffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5).

Reazione di ligasi

Per poter inserire il frammento di VP7 nel vettore di trasferimento pENTR™/D- TOPO® _{(Thermo Fisher Scientific), l’amplicone ed il vettore stesso sono stati}

quantizzati tramite spettrofotometro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific). In base ai valori di concentrazione e alla lunghezza in paia di basi di inserto e vettore, sono stati calcolati i volumi da utilizzare per la reazone di ligasi secondo il rapporto molare tra vettore ed inserto di 1:4. In un volume finale di 10 µl, quindi, sono presenti: 1 µl di T4 DNA ligasi (Sigma-Aldrich), che catalizza la reazione nel suo buffer d'elezione (Buffer 1X: 50mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM ditiotreitolo, 1mM ATP), inserto e vettore nelle proporzioni precedentemente calcolate. La reazione è avvenuta overnight a 22 °C.

Generazione delle cellule batteriche competenti

La trasformazione è un processo mediante il quale avviene l’ingresso di DNA esogeno all’interno delle cellule. Le cellule in grado di effettuare la trasformazione vengono dette naturalmente competenti.

Per la realizzazione delle cellule batteriche competenti per i nostri esperimenti abbiamo eseguito il trattamento con CaCl2 e sono state utilizzate le cellule

batteriche XL 10 GOLD (Invitrogen), conservate a -80 °C in glicerolo. Le cellule batteriche sono state seminate su piastre di LB-agar (Luria-Bertani) senza il supplemento di antibiotici e successivamente incubate a 37 °C overnight. Il giorno seguente è stata prelevata una singola colonia, la quale è stata inoculata e fatta crescere a 37 °C overnight in 5 ml di terreno liquido LB senza antibiotici.

Il terzo giorno 500 µl di sospensione batterica sono stati trasferiti in 9,5 ml di terreno LB senza antibiotici e messi ad incubare in agitazione (225 rpm) a 37 °C per 2 ore. Si è proceduto poi a centrifugazione per 10 minuti a 4000 rpm a 4 °C. Il pellet cellulare ottenuto è stato risospeso in 10 ml di 0,1M CaCl2 mantenendo il tubo

immerso nel ghiaccio per 30 minuti, al fine di ottenere la competenza batterica. Successivamente è stata effettuata una seconda centrifugazione con gli stessi parametri della precedente, ed infine le cellule batteriche sono state risospese in 1 ml di 0,1M CaCl2 addizionata di glicerolo al 15% (v/v) e quindi aliquotate e

conservate a -80 °C.

Trasformazione delle cellule batteriche competenti

Il prodotto della reazione di ligasi è stato utilizzato per la trasformazione delle cellule batteriche competenti. Pertanto il giorno seguente, una frazione della reazione di ligasi è stata trasferita in un'aliquota di 100 µl di cellule E.coli XL10 Gold competenti. La miscela di trasformazione è stata lasciata in ghiaccio per 30 minuti, e ha subito un successivo shock termico ponendola prima per 30 secondi a 42 °C e successivamente in ghiaccio per 2 minuti. Sono stati poi aggiunti 250 µl di di S.O.C. (2% triptone, 0.5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10

mM MgSO4, 20 mM glucosio) e la coltura è stata lasciata ad incubare in agitazione

(225 rpm) per 1 ora a 37 °C, consentendo l’espressione e la sintesi della proteina che conferisce la resistenza all’antibiotico di selezione (Kanamicina). A seguire, la sospensione batterica è stata seminata in piastre Petri contenenti LB-agar

addizionato con Kanamicina (100 ug/µl) e lasciate crescere a 37 °C overnight, al fine di selezionare i batteri trasformati. Il terreno selettivo permette la crescita delle sole cellule ricombinanti.

Caratterizzazione dei ricombinanti batterici

La reazione di PCR applicata direttamente sulle colonie batteriche, permette di individuare rapidamente le cellule trasformate con i vettori ricombinanti (Sandhu et al., 1989). Pertanto, alcune colonie ricombinanti (n° 15) sono state selezionate e da ciascuna è stata prelevata una piccola quantità di patina batterica che è stata prima stemperata in 5 µl di acqua distillata e poi addizionata alla mix della PCR. La DNA polimerasi utilizzata è stata la Platinum Tfi (Thermo Fisher Scientific), con le seguenti condizioni:

Iniziale denaturazione 94 °C, 2 min Denaturazione 94 °C, 30 sec

Per 35 cicli

Annealing 60 °C, 30 sec Estensione 72 °C, 2 min Estensione finale 72 °C, 10 min

La reazione, condotta in un volume di 25 µl, conteneva: 5 µl 5X PCR Reaction Buffer, 0.5 µl dNTPs mix 10 mM, 0.5 µl Tfi DNA Polymerase (5 U/µl), 0,8 µl 50 mM MgCl2, 0.5 µl primer forward, 0.5 µl primer reverse, portando a volume finale con acqua distillata. Inoltre, la reazione è stata eseguita con le seguenti coppie di primers:

VP7 His Rev 5'- GTAAGTTGAATTTGGGAAAACGTACAAATG-3' M13 Fwd 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'

Visto che il primer VP7 His Rev è interno all’inserto VP7 e l’altro primer, M13 Fwd, lega su uno specifico sito presente nel plasmide pENTR™/D-TOPO®_{, risulteranno}

positive solo le colonie in cui il gene è correttamente inserito. I prodotti di reazione sono stati quindi analizzati su gel di agarosio per evidenziare le bande delle dimensioni attese (1500 bp).

Le colonie risultate positive sono state usate per la purificazione del DNA plasmidico, che verrà prima sottoposto a controllo mediante digestione enzimatica e successivamente verrà sequenziato.

Purificazione del DNA plasmidico

Il DNA plasmidico delle colonie risultate ricombinanti è stato purificato utilizzando il kit commerciale QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), secondo il protocollo fornito dalla casa produttrice. Innanzitutto, le colonie batteriche positive sono state inoculate in terreno liquido LB contenete Kanamicina ed incubata a 37 °C in agitazione costante (225 rpm) overnight.

Successivamente, le sospensioni batteriche sono state centrifugate a temperatura ambiente a 10000 rpm per 5 minuti a 4 °C. Il pellet è stato risospeso in 250 µl di Buffer P1, contenente RNAasi A. Quindi, sono stati aggiunti 250 µl di Buffer P2 per effettuare una lisi alcalina, che è stata bloccata dopo 5 minuti d'azione aggiungendo 350 µl di Buffer N3. Una centrifuga a 13000 rpm per 10 minuti ha permesso di separare i detriti cellulari lisati rimasti sul fondo dal surnatante contenente il DNA. Quest’ultimo è stato trasferito sulla colonnina cromatografica a scambio anionico fornita col kit. Una breve centrifuga di un minuto aiuterà il DNA a legarsi alla resina. Successivamente è stato effettuato un lavaggio con Buffer PB (500 µl) e Buffer PE (750 µl), entrambi seguiti da 1 minuto di centrifuga. È stata infine avviata un'ultima centrifuga a secco e il DNA è stato eluito in una nuova provetta aggiungendo 50 µl di Buffer di eluizione EB, sempre accompagnando l'operazione con una centrifuga di un minuto. Il DNA plasmidico così ottenuto è stato sottoposto prima a restrizione enzimatica e successivamente a sequenziamento.

Restrizione enzimatica

Il DNA plasmidico ottenuto dalla purificazione precedentemente descritta è stato digerito con l’enzima di restrizione NotI (Biolabs), scelto per verificare che il vettore ricombinante contenga il frammento inserito, utilizzando il rispettivo tampone di reazione. La reazione di digestione è stata condotta a 37 °C per circa due ore. In seguito, i prodotti della restrizione sono stati analizzati mediante corsa elettroforetica in gel d’agarosio all’1% in tampone TBE 1X. Per verificare che il DNA plasmidico fosse stato tagliato correttamente è stato utilizzato un marker opportuno, MassRuler High Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific). Dopo

aver verificato la presenza della banda all'altezza prevista, il DNA plasmidico è stato fatto sequenziare per avere una verifica più accurata.

Sequenziamento

Per verificare la presenza del gene per VP7, l’assenza di mutazioni e la presenza dei codoni di inizio e di terminazione della trascrizione presenti nelle giuste posizioni, i campioni sono stati inviati alla BMR Genomics per il sequenziamento. Le sequenze ottenute sono state confrontate con quelle presenti in banca dati

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

4.1.3 Generazione del Baculovirus ricombinante ed espressione della proteina