Tecnologia del vettore di espressione Baculovirus

I primi vettori Baculovirus ricombinanti progettati per esprimere geni esogeni tramite il promotore della poliedrina e la sequenza codificante la proteina esogena, sono stati prodotti utilizzando un approccio di ricombinazione omologa di base (O'Reilly et al., 1992; Summers e Smith, 1987).

Questo metodo ha previsto la costruzione di un plasmide batterico di trasferimento, contenente il gene esogeno affiancato da sequenze derivate dalla regione poliedrina del genoma virale (Fig. 7); e successivamente, la co-transfezione di cellule di Spodoptera frugiperda (Sf21 o Sf9), con una miscela di questo plasmide di trasferimento e il DNA genomico estratto da preparazioni purificate di AcMNPV di tipo selvatico (Fig. 8).

La ricombinazione omologa tra le sequenze che fiancheggiano il gene esogeno di interesse nel plasmide di trasferimento, e le sequenze a monte e a valle del gene poliedrina nel genoma di AcMNPV, porta alla produzione nelle cellule d’insetto co- trasfettate di molecole di DNA virale ricombinante. Inoltre, l'infezione delle cellule d’insetto con AcMNPV porta alla chiusura dell'espressione genica dell'ospite consentendo un elevato tasso di produzione di mRNA e quindi di proteine ricombinanti.

Naturalmente, questo è un evento relativamente raro, con una frequenza stimata dell’0,1% (Smith et al., 1983a). Pertanto, diventa necessario separare la piccola minoranza della progenie virale ricombinante dalla grande maggioranza della progenie virale parentale non ricombinante tramite plaque assay.

A partire dal 1990, diversi ricercatori hanno iniziato ad affrontare i vincoli tecnici associati all'isolamento dei vettori Baculovirus per migliorare il sistema, sviluppando un'ampia varietà di modifiche dell'approccio di base.

Fig. 8. Produzione di un vettore di espressione Baculovirus mediante ricombinazione omologa.

2.2.1 La tecnologia Gateway® _{e il vettore di trasferimento}

La tecnologia Gateway®_{, brevettata e commercializzata da Invitrogen fin dagli anni ’90,}

permette di clonare sequenze di DNA da utilizzare per analisi funzionali e di espressione.

I vantaggi della tecnologia Gateway® _{sono numerosi: trasferimento rapido ed efficiente}

di sequenze di DNA in vettori per l’espressione di proteine; possibilità di trasferire nel vettore diversi tipi di DNA (prodotti di PCR, cloni di cDNA, frammenti di restrizione); possibilità di trasferire un gran numero di sequenze di DNA in vettori di destinazione. Il sistema prevede una clonazione basata sulle proprietà di ricombinazione sito- specifiche del batteriofago lambda (Hartley et al., 2000).

Il sistema di ricombinazione di lambda coinvolge due componenti: le sequenze di ricombinazione del DNA e le proteine che mediano la reazione di ricombinazione (Hartley et al., 2000). La ricombinazione avviene tra siti specifici di attacco (att) sulle molecole di DNA che interagiscono. È un processo conservativo (non ci sono aggiunte o perdite di nucleotidi) e non è necessaria una sintesi di DNA. Le sequenze che fiancheggiano i siti di ricombinazione vengono scambiate, quindi, in seguito alla reazione, i siti att risultano essere sequenze ibride che comprendono le sequenze donate da ciascun vettore d’origine. Lo scambio si verifica tra sequenze omologhe di 15 bp presenti nella regione centrale dei due siti, mentre le altre sequenze contengono i siti di legame per le proteine che mediano la ricombinazione, diverse a seconda si tratti di ciclo litico (BP clonase enzyme mix = bacteriophage λ integrase Int + E.coli

integration host factor IHF) o lisogeno (LR clonase enzyme mix = bacteriophage λ excisionase Xis + Int + IHF) (Fig. 9).

Fig. 9. Tecnologia Gateway®_{: rappresentazione schematica dei sistemi di ricombinazione BP e LR.}

Il vettore pENTR™/D-TOPO® _{(Thermo Fisher Scientific) (Fig. 10), è stato utilizzato per}

il clonaggio della proteina virale VP7. Il vettore presenta siti attL che permettono la clonazione ricombinante del gene di interesse in un vettore di destinazione per produrre un clone di espressione; un gene per la resistenza ad un antibiotico (Kanamicina) per la selezione dei plasmidi in E. coli e un sito di origine pUC per la replicazione in elevato numero di copie e il mantenimento del plasmide nella cellula ospite.

2.2.2 Il sistema di espressione Bac-to-Bac®

Il Baculovirus Bac-to-Bac® _{Expression System (Thermo Fisher Scientific) è un sistema}

rapido ed efficiente, che sfrutta le proprietà della trasposizione sito-specifica del transposone Tn7 per semplificare e migliorare il processo di generazione del bacmide ricombinante.

Il componente principale del sistema è per l’appunto il vettore pFastBac™ in cui i geni di interesse saranno clonati. La seconda componente principale del sistema sono gli E. coli DH10Bac ™, utilizzati come ospiti per il vettore pFastBac™. Le cellule DH10Bac™ contengono un vettore shuttle del Baculovirus (Bacmide) con un sito di destinazione mini-attTn7 e un plasmide helper (pMON7124). Una volta che il plasmide di espressione pFastBac™ viene trasformato nelle cellule DH10Bac™, la trasposizione avviene tra l'elemento mini-Tn7 presente sul vettore pFastBac™ e il sito target mini- attTn7 presente sul Bacmide, generando così un Bacmide ricombinante. Questa reazione di trasposizione avviene in presenza di proteine specifiche fornite dal plasmide helper. Una volta eseguita la reazione di trasposizione, si procede con l’isolamento del DNA del Bacmide ricombinante, successivamente utilizzato per trasfettare le cellule d’insetto e quindi generare il Baculovirus ricombinante (Fig.13).

Fig. 11. Rappresentazione schematica della generazione del Baculovirus ricombinante utilizzando il sistema di espressione Bac-to-Bac® _{(Thermo Fisher Scientific).}

Per la realizzazione delle VLPs è stato utilizzato il vettore pFastBac® _{Dual (Thermo}

Fisher Scientific) (Fig.12), la cui particolarità è riscontrabile nella presenza di due diversi promotori del Baculovirus, atti all’espressione contemporanea di 2 proteine virali. Il primo, il promotore Poliedrina (PH), ed il secondo, il promotore p10, sono organizzati con diverso orientamento assicurando quindi l’espressione simultanea di due proteine esogene all’interno di uno stesso Baculovirus (Harris e Polayes, 1997). Tale vettore è stato utilizzando seguendo il protocollo del Baculovirus Bac-to-Bac®

Expression System (Thermo Fisher Scientific) (Ciccarone et al., 1997).