Gli ospiti suscettibil

EHDV è in grado di infettare varie specie di ruminanti selvatici e domestici, anche se storicamente è stato associato alla malattia in cervidi selvatici, in particolare nei cervi a coda bianca (Odocoileus virginianus) del nord America, ma risultano suscettibili anche cervo mulo, antilope, cervo a coda nera e cervo nobile.

Sono stati osservati anche gravi segni clinici in bovini infettati dal ceppo Ibaraki (EHDV-2) (Omori et al., 1969) e dai sierotipi 6 e 7 (Temizel et al., 2009; Yadin et al., 2008).

Anche le pecore europee sono state ritenute suscettibili d’infezione da EHDV ma, sebbene presentino viremia, l'infezione in queste rimane sub-clinica (Tomori, 1980; Thompson et al.,1988).

Il ruolo delle capre come ospite di EHDV è incerto. Anticorpi anti-EHDV sono stati rilevati mediante test AGID in capre provenienti da regioni in cui si erano verificati dei focolai di EHDV e questo quindi fa ipotizzare nella possibilità che queste, come le pecore, sviluppino una viremia di basso livello (Al-Busaidy e Mellor, 1991). Infatti, in uno studio effettuato in Indonesia, usando la siero-neutralizzazione, solo 1 su 88 capre ha mostrato anticorpi contro EHDV-5. Pertanto occorre fare ulteriori studi per chiarire il ruolo delle capre come ospite di EHDV (Gibbs e Lawman, 1977).

I maiali non sono suscettibili all'infezione da EHDV (Gibbs e Lawman, 1977) e poco si sa sulla suscettibilità dei cani. In un'indagine sierologica condotta in una zona con un'alta prevalenza di EHDV in cervi a coda bianca, non sono stati rilevati cani positivi a EHDV (Howerth et al., 1995). C'è ancora una notevole mancanza di informazioni circa la suscettibilità all'infezione da EHDV e il ruolo epidemiologico di molte specie di ruminanti sia domestiche che selvatiche.

La conoscenza attuale sulle specie sensibili a EHDV è riassunto nella seguente tabella 3.

Specie animali sensibili _infezione Tipo di Sierotipo _{Bibliografico} Riferimento

Bovino (Bos Taurus)

Naturale 2

House et al. (1998); Dulac et al.(1989); Pasick et al. (2001) Naturale 2 (Ibaraki) Omori et al. (1969); _{Ohashi et al. (1999)} Naturale 6 Temizel et al. (2009) Naturale 7 Yadin et al. (2008) Naturale 5 Sendow et al. (1991) Naturale 2, 5, 7, 8 Gard et al (1989) Naturale 1 Weir et al. (1997) Cervo a coda Bianca (Odocoileus

virginianus)

Naturale 2 Gaydos et al. (2004) Naturale 1 Murphy et al. (2006) Naturale 6 Allison et al. (2010) Antilope (Antilocapra Americana) Naturale sconosciuto Dubay et al. (2006); _{Dunbar et al. (1999)} Cervo mulo (Odocoileus hemionus) Naturale 1 Dubay et al. (2004)

Naturale 2 Noon et al. (2002a) Orice d'Arabia (Oryx leucoryx) Naturale sconosciuto Frolich et al. (2005) Mazama (Mazama gouazoubira) Naturale sconosciuto Deem et al. (2004) Pecora delle Montagne Rocciose

(Ovis canadensis canadensis) Naturale 2 Noon et al. (2002b) Orso nero

(Ursus americanus floridanus) Naturale sconosciuto Dunbar et al. (1998) Cervo nobile (Cervus elaphus)

Sperimentale 1 Gibbs e Lawman (1977) Daino (Dama dama)

Capriolo (Capreolus capreolus) Muntjacus (Muntiacus muntjac) Pecora (Ovis aries)

Capra (Capra hircus) Naturale 2 e 6 Al-Busaidy e Mellor (1991) 1 e 2 Nol et al. (2010)

Rinoceronte nero (Diceros bicornis) Naturale Fischer-Tenhagen et al. ₍₂₀₀₀₎ Rinoceronte bianco

(Ceratotherium simum) Naturale Fischer-Tenhagen et al. (2000) Gazzella subgutturosa

(Gazella subgutturosa) Naturale sconosciuto Albayrak et al. (2010) Bisonte Americano (Bison bison) Naturale 1e 2 Nol et al. (2010) Wapiti (Cervus elaphus Canadensis) Naturale 1e 2 Nol et al. (2010) Tab.3. Specie suscettibili a EHDV (EFSA, 2009).

1.5.2 Patogenesi

La patogenesi di EHDV è simile a quella di BTV, che è stata ampiamente studiata e approfonditamente esaminata da Mclaughlin (Mclaughlin et al., 2003). In seguito all’infezione, il virus inizialmente replica nelle cellule endoteliali delle pareti dei vasi linfatici e sanguigni che drenano il sito dell'infezione (Sohn e Yuill, 1991). EHDV viene quindi disseminato, tramite il circolo sanguigno, nei siti secondari di replicazione, quali altri linfonodi e la milza.

Nel sangue il virus è associato ai linfociti e in particolare ai globuli rossi dove è presente in titoli più alti per un lungo periodo di tempo (Gibbs e Lawman, 1977, Aradaib et al., 1997). Studi in vitro hanno dimostrato che la replicazione di EHDV potrebbe essere di tipo monocita-dipendente (Stallknecht et al., 1997).

Come per gli altri virus trasmessi da vettori, la durata della viremia rappresenta un elemento chiave per la diffusione dell’infezione, pertanto è stata studiata sia in cervi che in bovini tramite infezioni naturali o indotte sperimentalmente. Anche se in alcuni casi è stato possibile isolare EHDV dagli animali per più di 50 giorni, di solito il virus infettivo non poteva essere rilevato oltre 3 settimane dall'infezione (Gaydos et al., 2002 a,b; Quist et al., 1997). Di 11 cervi a coda bianca, sperimentalmente infettati da EHDV- 2, 5 erano viremici al giorno 2 post-infezione (p.i.), dal 4° giorno tutti gli animali erano viremici, ma la viremia ha raggiunto il picco al 6° giorno con titoli superiori a 104,9 TCID50/ml di sangue. Due cervi erano ancora viremici al giorno 59, anche se con un titolo molto basso (<102,3 TCID50/ml). I segni clinici sono stati osservati tra i giorni 6 e 14, ma non sono stati riportati decessi (Gaydos et al., 2002b).

In un altro studio sperimentale che ha utilizzato EHDV-2, la viremia è stata rilevata in 3 di 16 cervi inoculati al 2° giorno p.i., e tutti gli animali erano viremici dal 4° giorno p.i. Il picco di viremia si è verificato tra il 4° e il 10° giorno post-infezione. Due cervi sono rimasti viremici fino al 56° giorno p.i., quando lo studio è stato concluso (Quist et al., 1997).

L’infezione con un determinato sierotipo di EHDV conferisce protezione solamente nei confronti dello stesso sierotipo, non fornendo quindi nessuna cross-protezione verso gli altri sierotipi esistenti di EHDV (Savini et al., 2011). Inoltre è accertato che l’infezione con EHDV non conferisce cross-protezione nei confronti di BTV e viceversa (Quist et al., 1997). Nel 1960 infatti morbilità e mortalità provocate dal virus Ibaraki, furono molto inferiori rispetto a quelle registrate nei focolai che si erano verificati

l'anno precedente poiché la maggior parte dei bovini presentava anticorpi contro il virus (Omori et al., 1969). La durata della protezione da infezione non è ancora stata determinata, ma dalle osservazioni fatte in corso di infezioni naturali, si pensa che possa persistere per tutta la vita dell’animale (Stallknecht et al., 1991).

EHDV è un virus trasmesso mediante vettori, tuttavia nei cervi a coda bianca è stata riportata una trasmissione del virus anche per via orizzontale (orale e fecale) (Gaydos et al., 2002a), ma non è possibile accertare come siano rilevanti epidemiologicamente questi altri percorsi di infezione.

La trasmissione transplacentare è stata dimostrata con l'isolamento di EHDV-2 (Ibaraki) da organi interni di feti abortiti (Ohashi, 1999).

L'isolamento di BTV dallo sperma è stato segnalato (Howard et al., 1985), anche se la presenza del virus nel seme sembra essere un evento raro (Melville et al., 1996). Non sono stati trovati segnalazioni sull'isolamento di EHDV nel seme, infatti l’infezione sperimentale di pecore tramite inoculazione con sperma da tori infetti da EHDV-2, 5 e 7 non ha portato ad infezione, tuttavia la sperimentazione è stata inconcludente poiché il virus è stato isolato solo dal sangue e non dal seme (Gard et al.,1989).

1.5.3 I vettori

EHDV, come BTV, viene trasmesso tra i suoi ospiti ruminanti attraverso la puntura di insetti ematofagi appartenenti al genere Culicoides.

I dati disponibili suggeriscono che le specie di Culicoides che trasmettono EHDV possano essere simili a quelle di BTV, ma non necessariamente le stesse. Di conseguenza, le interazioni virus-vettore, i siti di riproduzione vettoriale, la tassonomia, l’ecologia, la stagionalità e il controllo (Carpenter et al., 2008), e l'effetto delle variabili climatiche sui vettori è probabile che siano gli stessi (EFSA, 2007a; EFSA, 2008). Tuttavia, i livelli di competenza che le singole specie e popolazioni di vettori esprimono per EHDV, intesa come capacità di trasporto e trasmissione del virus, possono essere diverse a quelle di BTV.

È anche probabile che i precisi requisiti di temperatura per la replicazione di EHDV nei vettori e i gradi relativi alla temperatura necessari affinché l’infezione sia trasmissibile nei vettori possano essere anche diversi da quelli di BTV. Tali differenze possono costituire la base delle differenze occasionali osservate nelle distribuzioni regionali e globali in atto tra EHDV e BTV, in particolare in Europa e nord America.

1.5.3.1 Tassonomia e biologia dei Culicoides

I Culicoides sono piccoli moscerini di tipo pungente-succhiante appartenenti alla famiglia Ceratopogonidae, la quale contiene circa 125 generi con all’interno più o meno 5500 specie.

Di questi generi, 4 sono noti per contenere specie che succhiano il sangue dei vertebrati: Austroconops, Culicoides, Forcipomyia subgenere Lasiohelea e Leptoconops. I Culicoides sono facilmente differenziati da questi altri tramite la caratteristica ala. Più di 1400 specie di Culicoides sono conosciute in tutto il mondo, delle quali circa il 96% sono obbligatoriamente ematofagi del sangue dei mammiferi (compresi gli esseri umani) e degli uccelli.

Il ciclo biologico dei Culicoides (Fig. 5) è costituito da 4 stadi larvali, lo stadio di pupa e quello di adulto.

Dopo il pasto di sangue, le uova maturano all’interno della femmina in un tempo variabile, dipendente dalla temperatura: a 27 °C la maturazione avviene in due giorni, ma può avvenire anche in tre o quattro giorni se la temperatura scende a 22 °C. Il loro numero è variabile a seconda della specie (C. imicola, per esempio, ne depone 162). Le uova sono molto resistenti alle condizioni ambientali, pertanto possono sopravvivere fino a due mesi a temperature minori di 6 °C e in zone in cui il clima è temperato possono resistere anche tutto l’inverno, ma di solito schiudono tra i 2 e i 7 giorni (Blanton e Wirth, 1979; Meiswinkel et al., 1994). I successivi 4 stadi larvali si differenziano soltanto nelle dimensioni, che aumentano passando da uno stadio all’altro. Le larve dei Culicoides misurano da 0,5 mm (L1) a 2 cm (L4). Il passaggio allo stato di pupa si ha solitamente in un periodo variabile da 10 a 30 giorni, in relazione alla temperatura ambientale e alla quantità di nutrienti presenti nell’ambiente, variando da una settimana nelle specie tropicali a circa due anni in alcune specie artiche. Le pupe, che rimangono in questo stadio da 2 giorni fino a quattro settimane, sono lunghe 2-4 mm e hanno un paio di antenne protoraciche con numerosi spiracoli che servono per la respirazione. Non necessitano di nutrimento e nella maggior parte delle specie compiono movimenti molto limitati (Meiswinkel et al., 1994).

La vita media degli adulti è di circa 20 giorni (Purse et al., 2015) ed eccezionalmente fino a 90-100 giorni (Mellor et al., 2000; Goffredo et al., 2016). I maschi si nutrono esclusivamente di liquidi zuccherini come quelli presenti nel

nettare dei vegetali, mentre le femmine si nutrono principalmente di sangue, anche se possono nutrirsi anch’esse di nettare (EFSA, 2007a). In condizioni di elevata temperatura e bassa umidità i Culicoides hanno sopravvivenza ridotta; soltanto pochi esemplari raggiungono lo stadio adulto e sono quindi in grado di trasmettere l’infezione virale.

La maggior parte dei Culicoides adulti sono crepuscolari, e il picco dell’attività di conseguenza è dal tramonto all’alba, ma anche in misura minore durante la notte (Mellor et al., 2000). Dopo periodi di precipitazioni, la sopravvivenza in ogni caso subisce un incremento notevole.

Inoltre anche il vento influisce sulla sopravvivenza (Mellor et al., 2000). Sebbene il range di volo dei Culicoides di solito è breve e la maggior parte delle specie si disperdono solo entro poche centinaia di metri dai loro siti di riproduzione (Kettle, 1984) o al massimo a 2-3 km (Lillie et al., 1981), sono in grado di essere dispersi passivamente a centinaia di chilometri di distanza, tramite i venti, a distanze molto maggiori (Hayashi et al., 1979; Bishop et al., 2000).

Gli adulti si infettano ingerendo sangue di animali viremici, il virus replica nelle ghiandole salivari e l’insetto rimane infetto per tutto il resto della vita, ma non è in grado di trasmettere il virus verticalmente alla progenie (Purse et al., 2015). Questo però non sempre avviene, in quanto è necessario che il virus riesca a superare le barriere difensive dell’insetto e quindi replicare nelle sue ghiandole salivari per poter essere trasmesso (Fu et al., 1999).

La presenza maggiore della malattia si rileva alla fine della stagione estiva, per poi scomparire con il sopraggiungere dei primi freddi, quando la temperatura delle ore crepuscolari scende al di sotto dei 12 °C. Infatti nelle regioni tropicali questi insetti rimangono attivi per tutto l’anno mentre nelle regioni a clima temperato lo sono soltanto durante la stagione estiva e in autunno per poi cessare la diffusione del virus con i premi freddi.

Fig.5. Il ciclo di vita dei Culicoides (Purse et al., 2005).

1.5.3.2 Distribuzione geografica dei Culicoides

Le specie di Culicoides coinvolte nella trasmissione di EHDV hanno una differente distribuzione geografica, tra queste le più importanti sono riportate in figura 6 (Stott, 2004).

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) sono 4 i criteri da prendere in considerazione per etichettare un artropode come vettore competente di un Arbovirus:

1) isolare il virus da insetti con addome privo di sangue fresco;

2) dimostrare in laboratorio che l'insetto può infettarsi mediante un pasto di sangue infetto;

3) dimostrare in laboratorio che l'insetto infetto è in grado di trasmettere il virus ad un ospite vertebrato suscettibile tramite la sua puntura;

4) dimostrare che l'insetto può venire a contatto con ospiti suscettibili in condizioni naturali (WHO, 1967).

Delle specie vettore di EHDV identificate e sospettate solo C. sonorensis, diffuso in nord America, soddisfa i quattro criteri definiti dall'OMS, mentre le altre specie solo una parte.

C. imicola è una specie afro-asiatica, ma si è affermata in tutta l'Europa meridionale ed è ormai diffusa in Portogallo, Spagna, Baleari, Francia continentale del sud, Corsica, Italia ed isole (Sardegna, Sicilia), Grecia continentale e diverse isole greche adiacenti alla Turchia (Mellor et al., 2008).

C. obsoletus e C. punctatus sono specie paleartiche settentrionali appartenenti ai complessi Obsoletus e Pulicaris. Queste specie sono diffuse in gran parte del nord e del centro Europa (Mellor et al., 2008; Purse et al., 2005).

C. schultzei è diffuso in Africa e in Medio Oriente, ma in Europa è stato registrato a sud della Grecia continentale (Mellor et al., 2008).

Fig. 6. Distribuzione geografica delle principali specie di Culicoides coinvolte nella trasmissione di EHDV.

1.5.3.3 Stagionalità vettoriale

Nelle malattie trasmesse da vettore, i picchi dei focolai generalmente coincidono con il picco di abbondanza della popolazione vettoriale (Mellor et al., 2000; Purse et al., 2005; Yonguc et al., 1982; Mellor e Boorman, 1995; Mellor, 1994).

Per la Bluetongue questo non è sempre vero, infatti in nord Europa, dove l'infezione è trasmessa da specie del complesso C. obsoletus, C. dewulfi, C. chiopterus ed eventualmente da specie del complesso C. pulicaris, il cui picco di popolazione si verifica tra la fine della primavera e l'inizio dell’estate (Birley e Boorman, 1982; Takken et al., 2008; Fassotte et al., 2008), la maggior parte dei casi di BTV si verificano alla fine dell'estate e l’inizio dell'autunno. Ciò potrebbe essere una conseguenza delle basse temperature che si verificano in queste

regioni che riducono la sopravvivenza del virus da una stagione vettoriale all’altra a un livello molto basso. Inoltre, con il cambiamento climatico globale in atto, sembra esserci una stretta correlazione tra l'aumento della temperatura ambientale e il rischio di infezioni da EHDV (Van Campen et al., 2013).

In nord America la ripartizione di EHDV, come di BTV, rispecchia la distribuzione di C. sonorensis, cioè la maggior parte dei casi di BT e EHD si verificano alla fine dell'estate e dell'autunno (Stallknecht e Howerth, 2004), contemporaneamente all'abbondanza di tali insetti vettori (Gerry e Mullens, 2000; Gerry et al., 2001). Tuttavia, ci sono alcuni casi di malattia in New Jersey (USA) e in Canada occidentale che sono fuori dal normale range per questa specie vettore (Stallknecht e Howerth, 2004; Chalmers et al., 1964; Shapiro et al., 1991). È quindi probabile che in tali luoghi differenti specie di Culicoides abbiano la capacità vettoriali per EHDV, come è stato visto con l'introduzione di BTV-2 in Florida negli anni 90, dove il vettore principale era C. insignis e non più C. sonorensis (Mecham e Nunamaker, 1994; Tanya et al., 1992).