Clonaggio del gene codificante per VP7 nel vettore di trasferimento

pENTR™/D-TOPO®

A partire dal genoma virale, una coppia specifica di primers è stata usata per la retro- trascizione al fine di amplificare il gene codificante la proteina capsidica virale VP7 di EHDV-6. Il prodotto dell'amplificazione è stato quindi sottoposto ad elettroforesi su gel di agarosio all’1% per confermarne l'effettiva presenza e successivamente è stato estratto dal gel mediante il kit commerciale QIAquick Gel Extraction (Qiagen), secondo il protocollo fornito dalla casa produttrice (Fig. 14).

Fig. 14. Gel relativo alla corsa elettroforetica del frammento di VP7 di EHDV-6. M: Marker 50 bp DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).

L’inserto ottenuto, mediante reazione di ligasi è stato inserito nel vettore di trasferimento pENTR™/D-TOPO® _{al fine di poter generare il baculovirus ricombinante.}

Lo screening delle colonie ottenuto ci ha permesso di isolare 4 cloni positivi (1, 4, 5 e 12) per la proteina VP7 (Fig.15).

Fig. 15. PCR di screening sulle colonie batteriche. Le colonie 1,4,5,12 risultano positive in quanto presentano una banda attesa di circa 1500 bp. M: Marker 50 bp DNA Ladder (Thermo Fisher

Scientific).

Il DNA plasmidico delle 4 colonie risultate positive è stato purificato ed il corretto orientamento dell’inserto verificato mediante digestione del DNA plasmidico con l’enzima di restrizione NotI.

Dopo il taglio enzimatico, nei 4 campioni è stata evidenziata, in seguito a corsa elettroforetica, un’unica banda del peso di circa 3500 bp (Fig.16) che conferma una corretta inserzione dell’inserto nel plasmidi pENTR/D-TOPO®_.

Dopo aver verificato la presenza della banda all'altezza prevista, il DNA plasmidico dei 4 campioni è stato sequenziato per avere una verifica più accurata.

Il sequenziamento della proteina capsidica virale VP7 è stato condotto utilizzando una specifica coppia di primers in grado di consentire lo studio dell’intero gene.

I risultati del sequenziamento e la successiva analisi filogenetica, effettuata confrontando i dati ottenuti con le sequenze presenti in banca dati (GenBank), hanno dimostrato che il gene VP7 clonato all’interno del vettore pENTR™/D-TOPO® _ha

un’omologia del 99,8% con la sequenza della proteina VP7 dello stipite virale di EHDV- 6. Successivamente, dopo aver scelto per il proseguimento degli esperimenti la colonia 5, è stata effettuata la traduzione della sequenza di VP7_colonia 5. Questa è stata quindi allineata tramite il programma online CLUSTAL 2.0 con la sequenza amminoacidica di VP7_EHDV-6, evidenziando la mancanza di eventuali mutazioni (Fig. 17).

vp7_colonia_5 MDTIAARALTVIKACNTLKEVRIVVESNVLEILGIAINRYNGLTLRSVTMRPTSQEQRNE vp7_EHDV-6 MDTIAARALTVIKACNTLKEVRIVVESNVLEILGIAINRYNGLTLRSVTMRPTSQEQRNE ************************************************************ vp7_colonia_5 MFFMCLDMVLAAANLNVGNISPDYIQNLATIGVLATPEIPYTMESANEIARMSGETGTWG vp7_EHDV-6 MFFMCLDMVLAAANLNVGNISPDYIQNLATIGVLATPEIPYTMESANEIARMSGETGTWG ************************************************************ vp7_colonia_5 PDRQPFGYFLTAAEVTQHGRFRLRAGQNITTAYVSSTLAQVSMNAGARGDIQALFQNQND vp7_EHDV-6 PDRQPFGYFLTAAEVTQHGRFRLRAGQNITTAYVSSTLAQVSMNAGARGDIQALFQNQND ************************************************************ vp7_colonia_5 PIMIYFVWRRIGTFSNAAGNAQDTPQGVTLNVGGVNMRAGVIVAYDGQAPVNVNNPGAGP vp7_EHDV-6 PIMIYFVWRRIGTFSNAAGNAQDTPQGVTLNVGGVNMRAGVIVAYDGQAPVNVNNPGAGP ************************************************************ vp7_colonia_5 GMIEIEVIYYLSLDKTMTQYPSLQAQIFNVYSYKNPLWHGLRAAILNRTTLPNNIPPIYP vp7_EHDV-6 GMIEIEVIYYLSLDKTMTQYPSLQAQIFNVYSYKNPLWHGLRAAILNRTTLPNNIPPIYP ************************************************************ vp7_colonia_5 PNDRENVLLLILLSALADAFSVLAPDFNLFGIVPIQGPINRAVAQNAYM vp7_EHDV-6 PNDRENVLLLILLSALADAFSVLAPDFNLFGIVPIQGPINRAVAQNAYM *************************************************

Fig. 17. Allineamento di sequenze amminoacidiche. In figura è riportato l’allineamento delle sequenze amminoacidiche della proteina VP7 dello stipite virale di EHDV-6 e della VP7 clonata all’interno del vettore pENTR™/D-TOPO®_.

5.1.2 Generazione del Baculovirus ricombinante ed espressione della proteina ricombinante r-VP7

Il DNA del plasmide ricombinante pENTR™/D-TOPO®_{_VP7 è stato utilizzato nel}

processo di trasfezione seguendo il protocollo BaculoDirect™ Baculovirus Expression System (Invitrogen) come descritto in Materiali e Metodi (4.1.3).

La comparsa, dopo 5 giorni dalla trasfezione, di effetto citopatico sulle cellule Sf9 (Fig.18 a,b) ha permesso di verificare la generazione del Baculovirus ricombinante (r- Bac-VP7), il quale è stato successivamente titolato mediante plaque assay (Fig. 19).

Fig. 18. a) Controllo cellulare costituto da cellule Sf9 non infettate. b) Cellule Sf9 dopo 5 giorni dalla trasfezione. L’immagine riporta la comparsa di effetto citopatico caratterizzato da lisi delle cellule, rigonfiamento cellulare e granulazione intra-citoplasmatica tipici da infezione da Baculovirus.

Il plaque assay, oltre a rivelare il titolo del virus, ha ulteriormente confermato la sua effettiva natura ricombinante, in quanto le placche formatesi sono risultate tutte bianche in seguito alla colorazione effettuata con Neutral Red (10%) ed X-gal (1mg/ml).

Fig. 19. Plaque assay su Sf21 per titolazione del Baculovirus ricombinante (r-Bac-VP7).

Al fine di verificare l'espressione della proteina ricombinante (r-VP7), il lisato di cellule Sf9, precedentemente infettate con r-Bac-VP7 con una MOI pari a 5 e raccolte 7 giorni dopo l’infezione, dopo essere stato opportunamente trattato, è stato analizzato mediante corsa elettroforetica in gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e verificato sia tramite colorazione con il blue di Coomassie che tramite Western Blotting. Inoltre l’espressione della proteina ricombinante è stata verificata anche attraverso il saggio dell’immunofluorescenza. Il campione è stato corso in presenza di un controllo negativo costituito da cellule Sf9 non infettate.

Come si può osservare dall’immagine relativa al gel (Fig. 20), nel lisato di cellule Sf9 infettate con r-Bac-VP7 (Pellet VP7) sono evidenti due bande proteiche, le quali corrispondono alla proteina VP7 presente sia sotto forma di monomero (42 kDa) che di trimero (circa 120 kDa), fenomeno generalmente comune per i virus appartenenti al genere Orbivirus (Limn and Roy, 2003).

Tali bande non sono presenti nel controllo cellulare (Ct Cell Sf9) costituito da Sf9 non infettate con r-Bac-VP7.

Fig. 20. SDS-PAGE e colorazione blue di Coomassie: VP7 e trimeri di VP7 in pellet di cellule Sf9 infettate con Baculovirus ricombinante. M: Sharpmass™ V plus (Euroclone). Ct Cell Sf9: Lisato di cellule non infettate con r-Bac-VP7. Pellet VP7: lisato di cellule Sf9 infettate con r-Bac-VP7.

L’analisi dell’espressione proteica è stata controllata anche tramite Western Blot al fine di verificare l'autenticità della banda proteica di VP7, come descritto in Materiali e Metodi. Dalla Fig. 21 si può verificare l’effettiva presenza della banda proteica all’altezza attesa, relativa alla proteina virale VP7. Sebbene il segnale risulti poco marcato, dal momento che tale banda risulta presente nel lisato delle cellule infettate con r-Bac-VP7 ed assente nel lisato cellulare delle Sf9 non infettate, i risultati ottenuti confermano l’espressione della proteina VP7 mediante Baculovirus.

Fig. 21. Risultato del Western Blotting. M: Sharpmass™ V plus (Euroclone).

Infine, l'espressione della proteina VP7 è stata confermata tramite il saggio dell’immunofluorescenza (Fig. 22) eseguito come descritto in Materiali e Metodi. Le cellule Sf9, dopo essere state infettate con r-Bac-VP7, sono state osservate al microscopio a fluorescenza.

La fluorescenza emessa dalla proteina r-VP7 è stata osservata sulle cellule usando un anticorpo monoclonale di topo anti-V5 seguito da un anticorpo secondario anti-mouse caprino coniugato con fluorocromo. In blu si osservano i nuclei cellulari per la presenza del DAPI nel mounting fluid.

5.1.3 Sviluppo di cELISA “Home-made”

In seguito alla produzione e al controllo dell’espressione della proteina r-VP7, questa è stata utilizzata, in concentrazione di 10 ug/ml, per l’attivazione delle micro-piastre (Nunc-Immunoplate MaxiSorp). Si è proceduto quindi all’effettuazione delle prove di ottimizzazione del saggio ELISA, e in considerazione dei risultati ottenuti è stato definito il protocollo ottimale dell’ELISA competitiva “Home-made”: