Costruzione del vettore pFast_VP2/VP

4.2.2.1 Generazione inserto VP2/SmaI e clonaggio in pFastBac® _{Dual sotto il promotore} p10

PCR per generare amplicone VP2/SmaI

La sequenza genica di VP2 è stata amplificata mediante PCR utilizzando come templato il plasmide generato e fornito dall’IAH di Pirbright (Regno Unito). I primers utilizzati per amplificare il gene sono stati progettati per introdurre dei siti di restrizione SmaI in entrambe le estremità dell’amplicone, e sono i seguenti:

VP2 SmaI Fwd 5'-TCCCCCGGGCGTTAAATTGTTCCAGGATGGATAGCGTT-3' VP2 SmaI Rev 5'-TCCCCCGGGGTAAGTGTGTTGTTCCAGGTAATCTCTGTC-3' Digestione enzimatica con SmaI

L’inserto generato, relativo al gene VP2, ed il plasmide pFastBac® _{Dual sono stati}

quindi digeriti con l’enzima SmaI (Fermentas, 10 u/µl), per permettere al gene VP2, durante la successiva reazione di ligasi, di inserirsi nel sito di restrizione SmaI presente a valle del promotore p10 all’interno del vettore pFastBac® _Dual.

Entrambe le reazioni sono state incubate per 2 ore a 25 °C.

A seguito della digestione, onde evitare che il vettore si richiudesse, le estremità 5’ e 3’ dello stesso sono state defosforilate usando l’enzima Fast AP Thermosensitive alkaline phosphatase (Thermo Fisher Scientific). Nella reazione, 1 µg di DNA del vettore è stato incubato per 10 minuti a 37 °C con 1 U di enzima e relativo tampone di reazione (10x) in un volume finale di 20 µl. L’ enzima è stato infine disattivato tramite incubazione della reazione a 75 °C per 5 minuti. Il vettore defosforilato e l’inserto digerito sono stati fatti correre su gel di agarosio allo 0,8 % e successivamente il DNA è stato purificato tramite QIAquick gel extraction kit (Qiagen).

Reazione di ligasi

L’inserto VP2 e il vettore pFastBac® _{Dual, entrambi digeriti con SmaI e purificati,}

sono stati quantizzati tramite spettrofotometro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific), prima di poter essere utilizzati nella reazione di ligasi, con un rapporto molare tra vettore e inserto di 1:4, al fine di generare un vettore contenente

l’inserto VP2 (pFast_VP2). La reazione è avvenuta overnight a 22 °C utilizzando l’enzima T4 DNA ligasi (Sigma-Aldrich).

Trasformazione delle cellule batteriche competenti

Il prodotto della reazioni di ligasi è stato utilizzato per la trasformazione delle cellule batteriche competenti One Shot MAX Efficiency® _DH10B-T1® _(Thermo

Fisher Scientific).

Aliquote di 50 µl di cellule batteriche competenti conservate a -80 °C sono state scongelate in ghiaccio per circa 5-10 minuti. Dopodiché 5 µl di reazione di ligasi sono stati aggiunti. Dopo un’incubazione di 30 minuti in ghiaccio, le cellule sono state poste a 42 °C per 30 secondi e successivamente in ghiaccio per altri 2 minuti (heat shocking). Le cellule batteriche così trattate, sono state quindi risospese in 250 µl di terreno S.O.C. (2% triptone, 0.5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosio) ed incubate in agitazione (225

rpm) per 1 ora a 37 °C. Infine, un aliquota della sospensione batterica è stata piastrata su piastre LB-agar contenenti l’antibiotico di selezione (Ampicillina 100 µg/ml). Le piastre cosi preparate sono state incubate overnight a 37 °C, al fine di selezionare i batteri trasformati.

PCR direzionale su colonie positive

Per verificare la presenza e la giusta direzionalità dell’inserto nel vettore su alcune colonie ricombinanti è stata eseguita una PCR di controllo usando una coppia di primers, di cui uno specifico per il promotore p10 ed un altro interno al gene codificante per VP2:

VP2

P10_Fwr 5'-GGACCTTTAATTCAACCCAACA-3’ VP2_Rev 5’-AGTGAAGCGTATCGAGAGGTTGCT-3' Determinare l'orientamento del gene target nel ricombinante è essenziale, in quanto la direzione sbagliata porterebbe all’espressione di una proteina non funzionale.

Le reazioni sono state eseguite usando il kit commerciale PCR SuperMix High Fidelity (Thermo Fisher Scientific).

I campioni sono stati addizionati a 45 μl della mix di reazione e ai primers, quindi sono stati sottoposti ai seguenti parametri di reazione:

Iniziale denaturazione 94 °C, 30 sec Denaturazione 94 °C, 30 sec

Per 35 cicli

Annealing 60 °C, 30 sec

Estensione 72 °C, 1 min

Estensione finale 72 °C, 10 min

I prodotti di reazione sono stati successivamente analizzati su gel di agarosio per evidenziare le bande delle dimensioni attese. Le colonie risultate positive sono state usate per la purificazione del DNA plasmidico tramite il kit commerciale QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), secondo il protocollo fornito dalla casa produttrice. Digestione con SmaI

Una digestione di controllo per verificare la presenza dell’inserto relativo a VP2 all’interno del vettore è stata effettuata con SmaI sul DNA plasmidico estratto dalle colonie risultate positive alla PCR direzionale. Il prodotto di digestione è stato corso su gel di agarosio all’1% in presenza di apposito marker per verificare la dimensione del segmento genico.

Sequenziamento

Per verificare la presenza del gene VP2 nel giusto orientamento e la relativa assenza di mutazioni, il campione è stato sottoposto a sequenziamento presso la BMR Genomics. Le sequenze ottenute sono state confrontate con quelle presenti in banca dati (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

4.2.2.2 Generazione inserto VP5/BamHI e clonaggio in pFast_VP2 sotto il promotore PH PCR per generare amplicone VP5/BamHI

La sequenza genica di VP5 è stata amplificata mediante PCR utilizzando come templato il plasmide specifico generato e fornito dall’IAH di Pirbright (Regno Unito). I primers utilizzati per amplificare il gene sono stati progettati per introdurre dei siti di restrizione BamHI in entrambe le estremità degli ampliconi, e sono i seguenti:

VP5 BamHI Fwd 5'-CGCGGATCCGTTAAAAAGATCCAGTGCCGTTGCAAAATGG-3' VP5 BamHI Rev 5'-CGCGGATCCTAAGTTGAAGATCCGAATACCATCCGC-3' Digestione enzimatica con BamHI

L’inserto relativo al gene VP5 ed il plasmide generato pFastBac_VP2 sono stati quindi digeriti con l’enzima BamHI (Fermentas, 10 u/µl), per permettere al gene VP5, durante la successiva reazione di ligasi, di inserirsi nel sito di restrizione BamHI presente a valle del promotore PH all’interno del vettore pFastBac® _Dual.

Entrambe le reazioni sono state incubate per 2 ore a 37 °C. Vettore ed inserto sono stati trattati come descritto nel paragrafo 4.2.2.1 e successivamente il relativo DNA è stato purificato tramite QIAquick gel extraction kit (Qiagen).

Reazione di ligasi

L’inserto VP5 e il vettore pFastBac_VP2, entrambi digeriti con BamHI e purificati, sono stati quantizzati tramite spettrofotometro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific), prima di poter essere utilizzati nella reazione di ligasi, con un rapporto molare tra vettore e inserto di 1:4, al fine di generare un vettore contenente anche l’inserto VP5 (pFast_VP2/VP5). La reazione è avvenuta overnight a 22 °C utilizzando l’enzima T4 DNA ligasi (Sigma-Aldrich).

Trasformazione delle cellule batteriche competenti

Il prodotto della reazione di ligasi è stato utilizzato per la trasformazione delle cellule batteriche competenti One Shot MAX Efficiency® _DH10B-T1® _(Thermo

PCR direzionale su colonie positive

Per verificare la presenza e la giusta direzionalità dell’inserto nel vettore è stata eseguita su alcune colonie ricombinanti una PCR di controllo usando una coppia di primers, di cui uno specifico per il promotore PH ed un altro interno al gene codificante per VP5, e la PCR SuperMix High Fidelity (Thermo Fisher Scientific). I primers usati sono stati i seguenti:

VP5

PH_Fwr 5'- CGCGGATCCGTTAAAAAGATCCAGTGCCGTTGCAAAATGG-3’

VP5_Rev 5'-CGCGGATCCGTAAGTTGAAGATCCGAATACCATCCGC-3'

I prodotti di reazione sono stati quindi analizzati su gel di agarosio per evidenziare le bande delle dimensioni attese. Le colonie risultate positive sono state usate per la purificazione del DNA plasmidico tramite il kit commerciale QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), secondo il protocollo fornito dalla casa produttrice.

Digestione enzimatica con SmaI, NotI, BamHI

Il DNA plasmidico ottenuto è stato sottoposto ad una digestione di controllo con 3 differenti enzimi di restrizioni:

- SmaI, il quale permette di confermare la presenza dell’inserto VP2;

- NotI, il quale permette di verificare la lunghezza del vettore pFastBac® _Dual

con all’interno i due inserti VP2 e VP5;

- BamHI, che infine permette di verificare la presenza dell’inserto relativo a VP5.

Il prodotto di digestione è stato corso su gel di agarosio all’1% in presenza di apposito marker per verificare le dimensioni dei segmenti genici.

Sequenziamento

Per verificare la presenza del gene di VP5 in assenza di mutazioni, il campione è stato sottoposto a sequenziamento presso la BMR Genomics. Le sequenze ottenute sono state confrontate con quelle presenti in banca dati