Negli ultimi anni, le malattie trasmesse da vettori artropodi, come zanzare e Culicoides, sono diventate sempre più importanti per la salute degli animali e dell'uomo. La presenza e la diffusione di virus a trasmissione vettoriale in paesi in cui non erano precedentemente presenti possono essere causati dagli scambi commerciali di animali, dal cambiamento del range geografico dei vettori dovuto al riscaldamento globale, o dall'introduzione casuale di piccoli numeri di vettori adulti infetti (Carpenter et al., 2011).
EHDV, membro del genere Orbivirus, famiglia Reoviridae, infetta principalmente il cervo a coda bianca, ma anche altri ruminanti selvatici e domestici (Mertens et al., 2005; Savini et al., 2011), ed analogamente agli altri membri del genere, è trasmesso da insetti vettori del genere Culicoides.
Precedentemente alle epidemie del 2006, verificatesi nel bacino del Mediterraneo, in particolare Marocco, Algeria, Tunisia, Israele e Turchia, la malattia causata da EHDV è stata considerata di importanza minore, soprattutto se paragonata alla Bluetongue, che rappresenta il prototipo del genere Orbivirus e che a partire dal 1990 è stata responsabile di numerose perdite economiche soprattutto per l’Europa. Infatti, a parte alcuni studi effettuati in aree in cui il virus circolava ed era in grado di causare segni clinici, la malattia emorragica epizootica non ha ricevuto molta attenzione in ambito Europeo da parte di ricercatori ed aziende farmaceutiche (Savini et al., 2011).
I focolai di EHDV-6 nei paesi dell'Africa e di EHDV-7 in Israele, hanno portato maggiore interesse verso questo virus dal punto di vista scientifico. Sia EHDV-6 che EHDV-7 erano infatti normalmente considerati sierotipi non patogeni per i bovini e responsabili soprattutto di infezioni nelle popolazioni dei cervi. Negli ultimi focolai, invece, entrambi i sierotipi sono stati in grado di causare malattia nel bovino causando notevoli perdite economiche negli allevamenti colpiti (Temizel et al., 2009; Maan et al., 2010). I fattori che hanno portato a questi focolai di EHD sono ancora sconosciuti e costituiscono un motivo di preoccupazione soprattutto considerando che BTV ed EHDV condividono diversi aspetti epidemiologici, primi fra tutti la diffusione tramite Culicoides. Il coinvolgimento del bovino, quindi, rappresenta sicuramente un
campanello di allarme per gli allevatori Europei soprattutto considerando le perdite economiche dovute alla riduzione della produzione di latte, come riportato dopo i casi di EHDV in Israele (Kedmi et al., 2010). Infatti per avere un'idea dei possibili danni economici che potrebbe causare un’epidemia in Europa di EHDV, è interessante citare un recente studio dell’American Dairy Science Association. Lo studio, ha confrontato la produzione lattea della popolazione bovina in Israele durante l’epidemia di EHD del 2006. Tale produzione è stata infine confrontata con quella relativa ad animali non infetti, stimando una perdita di 2.5 milioni di dollari per i soli 2 mesi di epidemia presi in esame (Kedmi et al., 2010).
I recenti focolai di EHDV verificati in nord Africa ed Asia Occidentale, sono simili a quelli di BTV avvenuti nella stessa zona tra la fine degli anni novanta e i primi anni 2000 che hanno poi portato alla diffuzione del virus in Europa attraverso la Turchia e la Grecia (Lorusso et al.,2013; Lorusso et al., 2014; Calistri et al., 2004). L’insieme di questi fattori lascia dedurre che come BTV, anche EHDV, possa seguire lo stesso persorso epidemiologico.
Inoltre, la co-circolazione di EHDV e BTV, riportata in diversi paesi nel corso del 2011- 2012, indica che entrambi i virus possono essere presenti contemporaneamente all'interno dello stesso ospite e popolazioni vettoriali (Sailleau et al., 2012; Toye et al., 2013; Viarouge et al., 2014).
Sebbene condividano una gamma simile di ospiti e vettori, i dati per EHDV ei suoi vettori sono molto più scarsi che per BTV. Al momento infatti non sono completamente note alcune informazioni epidemiologiche come il ruolo che gli animali selvatici e domestici potrebbe avere in termine di ospite principale e/o di reservoir per il virus. Inoltre, sarebbe importante chiarire la possibile competenza vettoriale delle diverse specie di Culicoides già presenti in Europa (Savini et al., 2011).
Non esistono al momento casi documentati di infezioni di EHD in Europa ed è difficile predire quale potrebbe essere il possibile danno al patrimonio zootecnico italiano ed europeo nel caso di introduzione del virus. Pertanto il monitoraggio dell'epidemiologia di EHD e lo sviluppo di validi strumenti diagnostici e di strategie di vaccinazione rappresentano degli elementi chiave per programmi adeguati di sorveglianza e controllo (Alshaikhahmed e Roy, 2016; Forzan et al. 2016; Spedicato et al., 2016; Spedicato et al., 2017).
Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare e valutare un saggio ELISA competitivo “Home-made” basato sulla proteina virale VP7, per la rilevazione di anticorpi anti-EHDV in campioni di siero. La proteina virale è stata generata mediante la tecnica del Baculovirus ricombinante. Questo sistema di espressione rappresenta una delle piattaforme più efficaci per produrre rapidamente elevate quantità di proteine ricombinanti, che mostrano proprietà biologiche simili alla controparte nativa (Luo e Sabara, 2005).
La proteina capsidica VP7 di EHDV, e degli Orbivirus in generale, risulta essere la migliore candidata come antigene per lo sviluppo di un saggio sierologico come l’ELISA in quanto immuno-dominate, siero-gruppo specifica ed altamente conservata tra i sierotipi EHDV, infatti mostra un'alta percentuale di identità a livello di aminoacidi (Mecham et al., 2003).
In questo studio la VP7 ricombinante è stata generata a partire da un ceppo di campo di EHDV-6 (MOR2006/05), isolato in Marocco nel 2006, che ha causato epidemie nei bovini in diversi paesi, e che è stato segnalato riassortare con altri ceppi EHDV. È importante ricordare che il suddetto ceppo, proprio perché isolato in un paese del bacino del Mediterraneo, potrebbe essere per l’appunto quello in grado di diffondere più facilmente nel sud dell’Europa.
Tale VP7 ricombinante è stata utilizzata nella sua forma non purificata, ottenuta infettando le cellule Sf9 con il Baculovirus ricombinante. Dopo aver proceduto all’effettuazione delle prove di ottimizzazione del saggio ELISA competitiva “Home- made”, questo è stato quindi convalidato con un ampio pannello di campioni di siero, compresi gli 8 sierotipi di riferimento per EHDV e dei sieri di campo, per un totale di 275 campioni di siero.
Allo scopo di confrontare i risultati ottenuti con l’ELISA “Home made”, tutti i campioni di siero sono stati analizzati anche con l’unico test ELISA disponibile in commercio al momento degli esperimenti (LSIVet™ Ruminant EHDV Serum ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific), al fine di rilevare la concordanza tra i dati messi a confronto. I risultati ottenuti con i due saggi sono stati quindi correlati mediante il calcolo del valore del kappa di Cohen, ottenendo un valore pari a 0.832, il quale ha evidenziato una “ottima” concordanza.
Del totale di campioni di siero analizzati, 74 sono risultati positivi tramite il test ELISA disponibile in commercio, inclusi gli 8 campioni di siero di bovino rappresentativi dei sierotipi EHDV; mentre 193/275 sono risultati negativi.
Il saggio ELISA competitivo “Home-made” ha invece riconosciuto con successo tutti e gli otto campioni di riferimento EHDV come campioni positivi; dei 74 campioni positivi, 61 sono risultati positivi mentre 187 su 193 dei campioni negativi sono stati riconosciuti come negativi.
I valori discordanti tra i due saggi riguardano 13 campioni di siero di campo risultati negativi con il nostro saggio e positivi con il test commerciale, e 6 campioni di siero di campo risultati positivi con il nostro saggio e negativi con il test commerciale.
Questi risultati discordanti sono stati di difficile interpretazione in quanto al limite del rilevamento della soglia di sensibilità del saggio “Home-made” e, soprattutto, tutti appartenenti a campioni derivati da impala e dromedari.
Purtroppo questo punto di debolezza del saggio sierologico non è stato possibile risolverlo per la mancanza di ulteriori campioni biologici da utilizzare per poter garantire una migliore convalida del saggio relativamente alle altre specie animali. Inoltre, al fine di rendere chiaro il quadro, è importante evidenziare che sulla base di quanto riportato dalle istruzioni del produttore del saggio ELISA disponibile in commercio, e da noi utilizzato per il confronto, questo è stato convalidato solamente con campioni di siero di bovino e cervidi. Pertanto, sulla base di questa mancanza di prove riguardati altre specie animali, questa discordanza di dati potrebbe non essere dovuta alla mancanza di sensibilità e specificità del saggio “Home-made”.
Questo approccio per lo sviluppo di un saggio ELISA era stato già usato per EHDV in due precedenti studi: Mecham e Wilson, (2004) avevano realizzato un test ELISA utilizzando la proteina VP7 ricombinante non purificata, successivamente saggiato con solo due campioni di siero rappresentativi dei sierotipi EHDV-1 e 2; mentre Luo e Sabara (2005) per la convalida del loro saggio ELISA, basato sulla VP7 ricombinante purificata, avevano usato otto campioni di siero positivi per EHDV-1.
Il saggio ELISA competitivo da noi sviluppato, ha dato maggiore supporto ai dati scientifici finora disponibili, in quanto è stato saggiato su un maggior numero di campioni di siero e soprattutto su tutti gli 8 sierotipi ad oggi riconosciuti di EHDV. Infine, un altro dato ottenuto con tale saggio ELISA “Home-made”, è stata la mancanza di reazioni di cross-reattività nel momento in cui sono stati testati i sieri positivi di vari
sierotipi rappresentativi di BTV e AHSV. La mancanza di rilevamento di cross- reattività, quindi la mancanza di falsi positivi, ha permesso di ottenere una specificità del test pari al 96.9% (IC 93.4%‐98,5%). Questo dato risulta essere importante soprattutto alla luce del fatto che EHDV e BTV possono avere sintomatologia sovrapponibile e potrebbero anche ritrovarsi a co-circolare in una stessa area geografica. Pertanto la sola diagnosi clinica della malattia non permette di identificare con sicurezza l’agente patogeno e discriminarlo da BTV. La diagnosi definitiva deve quindi basarsi su un saggio immunologico altamente specifico che permetta la determinazione nel siero degli anticorpi specifici verso EHDV.
In generale quindi, i vantaggi di questo saggio ELISA “Home-made” sono correlati all'assenza di step di purificazione dell'antigene e alla riduzione dei tempi di esecuzione del saggio stesso, pur mantenendo ottime prestazioni e ridotti costi di realizzazione. Inoltre, visto il sistema di espressione, la proteina ricombinante può essere facilmente prodotta in grandi quantità in pochi giorni.
Pertanto questo saggio ELISA “Home-made” risulta di semplice e veloce esecuzione, necessita però di ulteriori prove con un numero maggiore di sieri per completare la fase di validazione, ma è sicuramente ipotizzabile un suo possibile utilizzo nella diagnostica di routine di piccoli laboratori presenti nei paesi in cui EHD non è endemica, permettendo così uno screening sierologico rapido e sensibile.
Come dimostrato per BTV, un’adeguata campagna di vaccinazione preventiva potrebbe giocare un ruolo primario nel controllo di EHDV se la malattia dovesse entrare in Europa. Attualmente, l'unico vaccino disponibile per controllare EHD è un vaccino vivo attenuato (Aradaib et al., 2009), sviluppato ed utilizzato in Giappone contro EHDV-2 (IBAV) a seguito dei focolai avvenuti nel 1980, durante i quali è stato dimostrato efficace e sicuro, almeno fino al 1997, a causa dell’emergenza di sierotipi più virulenti (Ohashi et al., 1999).
L’uso di virus like particles (VLPs) come immogeni sicuri è stato proposto e studiato per diversi virus (Roy e Noad, 2009; Gwon et al., 2016; Mayo et al., 2017; Watanabe et al., 2017). Le VLPs sono sub-unità vaccinali altamente efficienti che mimano l'organizzazione e la conformazione dei virus nativi ma mancano del genoma virale. La possibilità di sviluppare VLPs è nata dalla capacità delle proteine capsidiche del virione di auto-assemblarsi in strutture che sono morfologicamente identiche a quelle delle particelle infettive (Roy, 1992). Finora sono state generate diverse VLPs, derivanti dal
Baculovirus, per virus umani e animali, con e senza envelope, a DNA o RNA, in cui la loro struttura varia da singole a multiple proteine capsidiche (Roy e Noad, 2009). Pertanto, la produzione di VLPs come candidati per un vaccino per EHDV viene considerato un approccio promettente.
L’esperienza nel campo delle VLPs maturata con BTV (French et al., 1990; Roy et al., 1994) è un buon punto di partenza per la produzione di VLPs anche per EHDV.
A differenza dei vaccini vivi modificati, l'uso di EHDV-VLPs come immunogeni, eviterebbe il rischio di trasmissione dei ceppi vaccinali e il riassortimento genetico tra ceppi vaccinali e il virus wild-type di campo. Questo è un vantaggio notevole in virtù del fatto che EHDV ha un genoma segmentato e pertanto i suoi segmenti genomici, in un ospite infettato contemporaneamente da un ceppo vaccinale e un ceppo di campo, potrebbero impacchettarsi casualmente creando dei virioni riassortanti con caratteristiche intermedie tra i due virus parentali. Tale meccanismo di riassortamento potrebbe conferire un vantaggio selettivo e quindi i virus ricombinanti verrebbero favoriti dalla selezione.
Inoltre, a differenza dei vaccini inattivati, un vaccino basato sulle VLPs sarebbe compatibile con l'uso della strategia DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) per la sorveglianza continua. Nello specifico, la strategia DIVA permette di differenziare gli animali infetti da quelli vaccinati. Questo è possibile tramite lo sviluppo di vaccini “marcati” in cui si possa, tramite un’adeguata ELISA, distinguere il ceppo vaccinale da quello wild type circolante. In genere questo può essere ottenuto con diversi approcci sperimentali che prevedono lo sviluppo di test ELISA specifici in grado di rilevare anticorpi contro proteine virali che sono assenti nel vaccino marcatore (Capua et al., 2003).
In questo lavoro di tesi è stata riportata la generazione di VLPs di EHDV a partire sempre dal ceppo di campo di EHDV-6 (MOR2006/05) isolato in Marocco nel 2006. I segmenti del genoma che codificano le proteine virali strutturali VP2, VP3, VP5 e VP7 sono stati clonati in vettori di trasferimento per la generazione di due Baculovirus ricombinanti, ognuno dei quali esprimenti due proteine virali capsidiche. La corretta espressione dei geni EHDV è stata inizialmente valutata monitorando la sintesi di ciascun mRNA virale nelle cellule Sf9 infettate e successivamente è stata confermata tramite analisi SDS-PAGE con Blue di Coomassie e Western Blot. Infine il corretto auto- assemblaggio di queste proteine ricombinanti in VLPs è stato verificato
definitivamente da analisi al microscopio elettronico che hanno mostrato una corretta morfologia e dimensione delle VLPs, risultata anche simile a quella delle VLPs generate per BTV (French et al., 1990a-b; Hewat et al., 1992; Stewart et al., 2010) e a quella di EHDV.
Abbiamo quindi dimostrato che l'espressione di tutte e quattro le proteine strutturali virali di EHDV permette loro di auto-assemblarsi in particelle non infettive e morfologicamente corrette, che potrebbero essere utilizzati in modo sicuro, senza rischio di infezione, per lo sviluppo di test diagnostici o strategie di vaccinazione. Le VLPs sviluppate sono quindi dei candidati potenziali per un possibile vaccino verso EHDV negli animali e sono anche conformi alla strategia DIVA in quanto nessuna delle proteine non strutturali, che potrebbero essere utilizzati come target in un saggio diagnostico, sono presenti all’interno delle VLPs stesse. I test sierologici che rivelano anticorpi contro le proteine non strutturali possono quindi differenziare gli animali infetti e da quelli vaccinati con le VLPs.
Una prospettiva futura potrebbe prevedere la produzione delle EHDV-VLPs in quantità sufficienti per effettuare degli studi immunologici su modelli murini, allo scopo di verificare la capacità delle VLPs nell’indurre una risposta immunitaria.
In conclusione, i risultati ottenuti in questo studio sono importanti a livello di ricerca di base e offrono interessanti spunti per il futuro, per una sempre migliore strategia di prevenzione e controllo verso il virus della malattia emorragica epizootica, al fine di non trovarsi impreparati nel caso di una possibile futura sua incursione.