ELISA “Home-made
5.2 Virus-like particles (VLPs) di EHDV-
5.2.1 Costruzione del vettore pFast_VP2/VP5
Generazione inserto VP2/SmaI e clonaggio in pFastBac® Dual
La strategia di clonaggio adottata ha previsto la generazione di due diversi vettori di trasferimento: uno che presentasse i geni per VP2 e VP5 (pFast_VP2/VP5) ed un altro i geni per VP3 e VP7 (pFast_VP3/VP7).
I geni per ogni proteina sono stati inserite sequenzialmente considerando la disponibilità dei siti di restrizione. Pertanto, come primo passo il gene codificante per VP2 è stato inserito all’interno del vettore pFastBac® Dual, a valle del
promotore p10.
Nello specifico, la sequenza genica di VP2 è stata amplificata mediante PCR utilizzando come templato il plasmide ottenuto da Pirbright e dei primers che hanno introdotto dei siti di restrizione SmaI in entrambe le estremità dell’amplicone.
La presenza del segmento genico appropriato è stata controllata tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1% (Fig. 25). I risultati indicano un prodotto di circa 3000 bp, il che indica la corretta generazione dell’amplicone VP2/SmaI.
Fig. 25. Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto VP2/SmaI. M: Marker Mass Ruler™ High Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).
L’inserto generato, relativo al gene VP2, ed il plasmide pFastBac® Dual sono stati
quindi digeriti con l’enzima SmaI, per permetterne il clonaggio a valle del promotore p10. Il DNA quindi è stato purificato, quantizzato ed infine utilizzato nella successiva reazione di ligasi (come descritto in materiali e metodi), al fine di generare un vettore contenente l’inserto VP2 (pFast_VP2).
Essendo vettore ed inserto digeriti con lo stesso enzima l’amplicone potrebbe inserirsi in posizione inversa (3’-5’) alla desiderata e quindi la proteina virale non sarebbe espressa. Al fine di controllare il giusto orientamento dell’inserto e stato effettuato uno screening delle colonie positive tramite PCR direzionale (Fig. 26). Tramite questo approccio abbiamo isolato 3 cloni positivi per pFast_VP2.
Fig. 26. PCR di screening sulle colonie batteriche. Le colonie 1, 7 e 8 risultano positive per la presenza di VP2. M: Marker O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher Scientific).
Le colonie risultate positive alla PCR di screening sono state quindi purificate utilizzando il kit commerciale QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
Un ulteriore controllo è stato effettuato tramite digestione enzimatica con SmaI al fine di verificare la corretta dimensione dell’inserto relativo a VP2. Il risultato della
corsa elettroforetica ha confermato la presenza dell’inserto relativo a VP2 all’interno del vettore pFastBac® Dual (Fig. 27).
Fig.27. Elettroforesi del prodotto di digestione enzimatica con SmaI. M: Mass Ruler™ High Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).
Il sequenziamento ha infine confermato la corretta sequenza del gene VP2, l’assenza di mutazioni e la corretta posizione dei codoni di inizio e di terminazione della trascrizione.
Generazione inserto VP5/BamHI e clonaggio in pFast_VP2
In un secondo step, la sequenza genica di VP5 è stata amplificata mediante PCR utilizzando come templato il plasmide “pSC-B-amp/kan” e dei primer che hanno introdotto alle estremità il sito di restrizione per BamHI. La presenza della corretta generazione dell’inserto VP5 contenente il sito di restrizione BamHI è stata controllata tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1% confermando la generazione di un amplicone delle dimensioni attese (Fig. 28).
L’inserto relativo al gene VP5 ed il plasmide pFastBac_VP2, precedentemente generato, sono stati quindi digeriti con l’enzima BamHI, per permettere al gene VP5, durante la successiva reazione di ligasi, di inserirsi nel sito di restrizione BamHI e quindi a valle del promotore PH all’interno del vettore pFastBac® Dual (Fig. 29).
Fig. 29. Elettroforesi dei prodotti di digestione enzimatica con BamHI. M: Mass Ruler™ High Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).
Successivamente l’inserto VP5 e il vettore pFastBac_VP2, digeriti con BamHI, sono stati purificati e quantizzati, prima di poter essere utilizzati nella reazione di ligasi, al fine di generare il vettore contenente anche l’inserto VP5 (pFast_VP2/VP5). Un’aliquota della reazione di ligasi è stata così utilizzata per la trasformazione di cellule batteriche competenti e sulle colonie cresciute su piastra selettiva è stata condotta una PCR di controllo per verificare la presenza e la giusta direzionalità dell’inserto. Lo screening è stato effettuato su 11 colonie, con il risultato di 3 cloni sicuramente positivi (Fig. 30). Quanto ottenuto ci indica che l’amplicone relativo a VP5 si è inserito nel corretto orientamento.
Fig. 30. PCR di screening sulle colonie batteriche. Le colonie 2, 3 e 9 risultano positive per la presenza di VP5 M: Marker O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher Scientific).
Al fine di verificare che entrambi i geni VP2 e VP5 siano presenti, il vettore plasmidico neo-generato è stato sottoposto a tre diverse digestioni enzimatiche ossia; SmaI (VP2), e BamHI (VP5) ed infine NotI necessario a linealizzare l’intero vettore senza tagliare all’interno dei due geni virali. I dati ottenuti ci hanno confermato la presenza dei due inserti, VP2 e VP5, all’interno del vettore pFastBac®
Dual (Fig. 31). Inoltre un’ulteriore conferma è stata fornita dal sequenziamento condotto da BMR Genomics, che è anche servito a verificare l’integrità del gene relativo a VP5.
Fig. 31. Elettroforesi dei prodotti di digestione enzimatica con SmaI, NotI e BamHI. M1 e M2: Marker MassRuler™ High Range (Thermo fisher Scientific).
A questo punto della ricerca possiamo confermare la generazione del vettore di espressione in cui i geni codificanti per le proteine virali VP2 e VP5 sono stati clonati rispettivamente sotto il controllo del promotore p10 e PH, presenti all’interno del vettore pFastBac® Dual (pFast_VP2/VP5) (Fig. 32) che potrà essere
usato per generare il baculovirus ricombinante.
Fig. 32. Rappresentazione schematica del vettore di espressione pFast_VP2/VP5.
5.2.2 Costruzione del vettore pFast_VP3/VP7
Generazione inserto VP7/StuI e clonaggio in pFastBac® Dual
La strategia adottata ha previsto successivamente la generazione di un altro vettore di trasferimento contenente i geni per VP3 e VP7 (pFast_VP3/VP7) mediante clonaggio sequenziale.
Anzitutto il gene codificante per VP7 è stato inserito a valle del promotore p10 all’interno del vettore pFastBac® Dual. Al fine di ottenere ciò, il gene è stato
amplificato mediante PCR utilizzando dei primers specifici in grado di introdurre il sito di restrizione StuI alle sue estremità 5’ e 3’. La presenza di un prodotto di PCR delle dimensioni attese (circa 1100 bp) è stata quindi verificata tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio confermando la generazione dell’amplicone VP7/StuI (Fig. 33).
Fig. 33. Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto VP7/StuI. M: Marker O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher Scientific).
L’inserto generato ed il plasmide pFastBac® Dual sono stati quindi digeriti con
l’enzima StuI, per permettere all’inserto, durante la successiva reazione di ligasi, di inserirsi a valle del promotore p10.
Lo screening tramite PCR direzionali delle colonie batteriche trasformate (Fig. 34), per verificare il corretto orientamento dell’inserto, ci ha permesso di individuare, su 19 colonie screenate, 9 cloni positivi per pFast_VP7.
Fig. 34. PCR di screening sulle colonie batteriche. Le colonie 3, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 15 e 17 risultano positive per la presenza di VP7. M: Marker O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher
Le colonie risultate positive alla PCR di screening sono state quindi purificate e digerite enzimaticamente con StuI. I risultati ottenuti hanno confermato la presenza dell’inserto VP7 all’interno del vettore pFastBac® Dual. Inoltre, il
sequenziamento del vettore generato ha ulteriormente confermato la corretta sequenza del gene VP7, l’assenza di mutazioni e la corretta posizione dei codoni di inizio e di terminazione della trascrizione.
Generazione inserto VP3/BamHI e clonaggio in pFast_VP7
La sequenza genica di VP3 è stata amplificata mediante PCR utilizzando come templato il plasmide “pSC-B-amp/kan” che ne conteneva la sequenza e dei primer che hanno introdotto alle estremità dell’amplicone il sito di restrizione per BamHI. La presenza della corretta generazione dell’inserto VP3/BamHI è stata confermata tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio (Fig. 35) indicando un amplicone delle dimensioni attese.
Fig. 35. Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto VP3/BamHI. M: Marker Mass Ruler™ High Range DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific).
L’inserto VP3/BamHI ed il plasmide pFastBac_VP7, precedentemente generato, sono stati quindi digeriti con l’enzima BamHI, per permettere all’inserto tramite la reazione di ligasi, di inserirsi a valle del promotore PH.
Un’aliquota della reazione di ligasi è stata così utilizzata per la trasformazione di cellule batteriche competenti e sulle colonie cresciute su piastra selettiva è stata condotta una PCR di controllo, per verificare la presenza e la giusta direzionalità
dell’inserto. Lo screening è stato effettuato su 9 colonie, con il risultato di 2 cloni sicuramente positivi (Fig. 36).
Fig. 36. PCR di screening sulle colonie batteriche. Le colonie 1 e 8 risultano positive per la presenza di VP3. M: Marker O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher Scientific).
La digestione di controllo effettuata sul plasmide ottenuto pFast_VP3/VP7 con gli enzimi StuI e SmaI, ha permesso di confermato la presenza e la giusta direzionale dei due inserti, VP3 e VP7 (Fig. 37). Inoltre un ulteriore conferma è stata fornita dal sequenziamento per verificare l’assenza di mutazioni all’interno della sequenza genica per VP3.
Fig. 37. Elettroforesi dei prodotti di digestione enzimatica con SmaI, NotI e BamHI. M1: Marker O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher Scientific). M2: Marker MassRuler™ High Range (Thermo Fisher Scientific).
A questo punto della ricerca possiamo confermare la generazione del vettore di espressione in cui i geni codificanti per le proteine virali VP3 e VP7 sono stati clonati rispettivamente sotto il controllo del promotore p10 e PH, presenti all’interno del vettore pFastBac® Dual (pFast_VP3/VP7) (Fig. 38), che sarà
utilizzato per generare l’altro baculovirus ricombinante.
Fig. 38. Rappresentazione schematica del vettore di espressione pFast_VP3/VP7.
5.2.3 Generazione dei Bacmidi ricombinanti
Dopo aver generato i due vettori pFast_VP2/VP5 e pFast_VP3/VP7, il passo successivo per realizzare i due baculovirus ricombanti, esprimenti le proteine del capside interno ed esterno, è stato quello di trasformare il DNA plasmidico purificato in E. coli DH10Bac™ E. per la trasposizione nel bacmide. Pertanto 5 μl del DNA plasmidico sono stati trasferiti in un'aliquota di 100 µl di cellule E.coli DH10Bac™, seguendo il protocollo fornito dal produttore (Thermo Fisher Scientific).
Dalle colonie positive ottenute sono state selezionate alcune colonie per verificare, tramite PCR, la presenza dei geni di interesse all’interno dei bacmidi ricombinanti, e quindi confermare che la trasposizione sia avvenuta correttamente (Fig. 39).
Fig. 39. Elettroforesi dei Bacmidi screenati con primers M13 (Fwr e Rev). M1: Marker MassRuler™ High Range (Thermo Fisher Scientific). O’RangeRuler™ 200 bp (Thermo Fisher Scientific). M2: Marker High Range™ (Fermentas).
5.2.4 Generazione ed amplificazione dei Baculovirus ricombinanti
Una volta confermato che i due Bacmidi ricombinanti contengono i geni di interesse, si è proceduto con la generazione dei Baculovirus ricombinanti tramite trasfezione nelle cellule d’insetto.
I DNA dei bacmidi ricombinanti sono stati quindi utilizzati nel processo di trasfezione tramite il reagente Cellfectin® (Thermo Fisher Scientific), come descritto in materiali e
metodi (4.2.5).
La comparsa, dopo 3 giorni dalla trasfezione, di effetto citopatico sulle cellule Sf21, ha permesso di verificare la generazione dei Baculovirus ricombinanti (Bac VP2/VP5 e Bac VP3/VP7), i quali sono stati successivamente titolati mediante plaque assay. Le placche isolate, infine, sono state raccolte ed amplificate per generare degli stock di Bac VP2/VP5 e Bac VP3/VP7con elevato titolo virale.
Le PCR eseguite sui cDNA generati dagli RNA estratti dalle Sf9 infettate separatamente con i due baculovirus ricombinanti hanno dimostrato l’effettiva presenza dei geni relativi alle proteine VP2, VP3, VP5 e VP7 (Fig. 40).
Fig. 40. Analisi degli mRNA virali. Analisi dei campioni di RT-PCR: prodotti di PCR generati da cDNA di VP2 (750 bp), VP3 (450 bp), VP5 (990 bp) e VP7 (650 bp). M: MassRuler™ Low Range DNA ladder (Thermo Fisher Scientific).
5.2.5 Generazione e purificazione delle VLPs
L'assemblaggio delle VLPs richiede un'espressione simultanea delle proteine virali capsidiche interne ed esterne. Pertanto, le cellule d’insetto Sf9 sono state co-infettate con entrambi i Baculovirus ricombinanti, utilizzati ad una MOI di 2,5 per il Bac VP2/VP5 e una MOI di 5 per il Bac VP3/VP7. L’uso di diverse MOIs è dovuto al fatto che durante gli esperimenti di infezione abbiamo notato che l’espressione di VP5 in cellule di insetto corrispondeva ad una elevata tossicità così come riportato per VP5 di BTV (Forzan et al., 2007). Le cellule sono state raccolte a 72 ore dopo l'infezione, con una mortalità cellulare di circa 70-80%, e sono state sottoposte ad un processo di lisi (descritto in materiali e metodi 4.2.6) prima della successiva fase di purificazione effettuata mediante centrifugazione su un cuscino di saccarosio al 40%.
Al fine di verificare l’espressione delle quattro proteine capsidiche virali, le VLPs purificate sono state sottoposte a corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide (SDS- PAGE) e successivo protocollo sia di colorazione con il blue di Coomassie che di Western Blotting, come descritto nei materiali e metodi (4.2.6.1).
Il campione è stato corso in presenza di un controllo negativo costituito dal lisato di cellule Sf9 non infettate, e un controllo positivo costituito dalle VLPs gentilmente donateci dal Prof.ssa Matsuo.
Fig. 41. SDS-PAGE e colorazione blue di Coomassie: VP2, VP3, VP5 e VP7 in VLPs prodotte. M: SeeBlue® Plus2 Pre-Stained (Thermo Fisher Scientific). Ct negativo: Lisato di cellule Sf9 non infettate. Ct positivo: VLPs (Matsuo).
Dall’osservazione dell’immagine relativa al gel (Fig. 41), le bande di VP5 (59 KDa) e VP7 (38,1 KDa) risultano evidenti, ma lo stesso non può essere affermato per le bande delle proteine virali di VP2 (112.6 KDa) e VP3 (103.1 KDa), in quanto il segnale relativo a queste ultime è risultato molto debole.
Per poter confermare l’espressione di tali proteine, sono state condotte quindi ulteriori analisi attraverso Western Blotting, il quale ha confermato la presenza di tutte e quattro le proteine capsidiche virali. Nonostante gli anticorpi utilizzati erano rivolti contro le proteine di EHDV-1, questi sono stati in grado di identificare le proteine del sierotipo 6 di EHDV, come mostrato in Fig. 42.
Fig. 42. Western Blotting su VLPs purificate. M: Sharpmass™ V plus (Euroclone). Ct negativo: Lisato di cellule Sf9 non infettate. Ct positivo: VLPs (Matsuo).
Al fine di poter verificare il corretto assemblaggio delle proteine capsidiche ricombinanti in VLPs è stato necessario procedere con la microscopia elettronica a trasmissione. Questa indagine è indispensabile perché nonostante le proteine vengano esposte non è scontato che riescano ad assemblarsi correttamente quando espresse tramite Baculovirus. Le immagini ottenute durante l’osservazione delle VLPs (Fig. 43) hanno confermato l’assemblaggio delle 4 proteine strutturali di EHDV-6 in VLPs, nella stessa dimensione, morfologia ed organizzazione del virus autentico, utilizzato come controllo positivo (Fig. 44).
Fig. 43. Osservazione delle VLPs al microscopio elettronico.
Fig. 44. Osservazione al microscopio elettronico del virus EHDV-6, utilizzato come controllo positivo.