la diluizione d’uso dell’anticorpo monoclonale coniugato con perossidasi; 4) la diluizione d’uso dei campioni di siero.

 Condizioni di adsorbimento dell’antigene

Per valutare le condizioni di adsorbimento dell’antigene, le micro-piastre (Nunc-Immunoplate MaxiSorp) sono state attivate con 100 µl/pozzetto di antigene r-VP7, alla concentrazione d’uso di 10 ug/ml, diluito in tampone carbonato-bicarbonato (0,1 M, pH 9.6) ed incubate in 3 differenti condizioni di tempo e di temperatura:

1. Overnight a temperature ambiente (TA, 25 °C ± 2 °C); 2. Overnight a +4 ± 2 °C;

3. 1 ora a 37 °C.

 Tempo di incubazione per la saturazione

La saturazione dei pozzetti è stata effettuata con una soluzione costituita da PBS addizionato di 0,05% di Tween 20 e 2% di albumina sierica bovina (BSA) (Sigma–Aldrich). Per valutare il miglior tempo di incubazione della soluzione saturante, le micro-piastre sono state incubate a TA in tre differenti condizioni (30 minuti, 1 ora e 2 ore).

 Diluizione d’uso dell’anticorpo monoclonale

Per valutare la corretta diluizione d’uso dell’anticorpo monoclonale anti- VP7 coniugato con perossidasi (Mabs-HRP), questo è stato addizionato alle micro-piastre (100 µl/pozzetto) in 4 diverse diluzioni (1:50; 1:100; 1:500; 1:1000) ed incubato a 37 °C per 1 ora.

 Diluizione d’uso dei campioni di siero

Infine, anche per i campioni di siero da testare è stata valutata la corretta diluizione d’uso. Questi sono stati addizionati alle micro-piastre (50 µl/pozzetto) in 6 diverse diluzioni (tq; 1:2; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128) ed incubati a 37 °C per 1 ora.

Sviluppo di un protocollo ELISA competitiva “Home-made” Brevemente, il protocollo adottato è stato il seguente.

Sono stati dispensati 100 µl di antigene per pozzetto, alla concentrazione d’uso di 10 ug/ml, diluito in tampone carbonato-bicarbonato. La piastra è stata coperta ed incubata in posizione statica. Al termine della fase di incubazione sono stati fatti un totale di 3 cicli di lavaggi della durata di 2 minuti ciascuno con 200 µl di PBS-0,5% Tween 20 (PBS-T).

Dopo i lavaggi, 300 µl di soluzione saturante (PBS-T addizionato con 2 % BSA) sono stati distribuiti in ogni pozzetto e quindi la piastra è stata incubata a temperatura ambiente per 1 ora. Al termine della fase di incubazione tre nuovi cicli di lavaggio sono stati effettuati.

Sono stati quindi dispensati 100 µl di ciascun campione di siero in esame, previa diluizione dello stesso immediatamente prima dell’uso nel tampone diluente. La piastra è stata successivamente coperta ed incubata a 37 °C per 1 ora in posizione statica, a cui sono seguiti tre ulteriori cicli di lavaggio.

Per ogni pozzetto sono stati dispensati 100 µl dell’anticorpo monoclonale coniugato con perossidasi (Mabs-HRP), previa diluizione dello stesso immediatamente prima dell’uso nel tampone diluente. La piastra è stata quindi coperta ed incubata a 37 °C per 1 ora in posizione statica.

Dopo un lavaggio finale, 100 µl del substrato cromogeno (TMB, 3,3',5,5'- tetrametilbenzidina) sono stati dispensati in ogni pozzetto. La piastra è stata quindi coperta ed incubata per 15-20 minuti a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. In tutti i pozzetti è stata arrestata la reazione enzimatica tramite l’aggiunta di 100 µl della soluzione di stop (1 M H2SO4). La misurazione della densità ottica (OD) dei

vari pozzetti è stata effettuata ad una lunghezza d’onda di 450 nm utilizzando un lettore di micro-piastre ELISA (Bio-Rad).

Sieri esaminati

Per convalidare il saggio ELISA sviluppato sono stati testati complessivamente 275 campioni di siero provenienti da diverse specie di ruminanti (Tab. 6). In particolare:

 74/275 campioni di siero di campo EHDV-positivi;  193/275 campioni di siero di campo EHDV-negativi;

 8/275 sieri positivi di bovini rappresentativi degli otto sierotipi EHDV (1-7 e IBAV).

Tutti i campioni di siero di campo testati sono stati messi a disposizione dalla banca sieri dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Abruzzo e del Molise (IZS-AM); mentre i campioni di siero di referenza degli 8 sierotipi EHDV ci sono stati gentilmente forniti dal Pirbright Institute (Laboratorio di riferimento OIE per EHDV nel Regno Unito).

Tipo di siero Numero totale Origine Specie animale

Sieri EHDV- positivi 82 74 Sieri di campo Bovini 15 Ovini 36 Impala 22 Dromedari 1 8 Sieri di Referenza Bovini

Sieri EHDV-

negativi 193 193 Sieri di campo

Bovini 64 Ovini 10

7 Impala 19 Dromedari 3

Tab. 6. Numero totale dei campioni di siero testati.

Al fine di ottenere una buona riproducibilità delle letture, tutti i sieri sono stati analizzati in duplicato. Inoltre, al fine di assicurare che il saggio non dia luogo a reazioni di cross-reattività, sono stati testati anche 50 sieri positivi per gli altri due virus appartenenti al genere Orbivirus: Bluetongue (BTV) e African horse sickness virus (AHSV).

Calcolo dei parametri diagnostici del test ELISA “Home made”

L’analisi dei parametri diagnostici è stata effettuata tramite il Software R Core Team (2016). Per la determinazione del valore di cut-off, valore soglia che discrimina i campioni positivi da quelli negativi, è stata applicata l’analisi della curva R.O.C. (Receiver Operating Characteristic) (McNeil e Hanley, 1984). La curva R.O.C. permette di identificare il valore soglia ottimale (il cosiddetto best cut-off), cioè il valore del test che massimizza la differenza tra i veri positivi (ovvero la proporzione di individui che hanno un valore alterato del test tra tutti quelli realmente affetti dalla malattia) e i falsi positivi (cioè la proporzione di individui che pur avendo un valore alterato del test non sono affetti dalla malattia di interesse). I campioni di

siero sono stati quindi classificati come positivi quando il loro valore OD era maggiore o uguale al valore soglia, negativi in caso contrario.

Inoltre, sulla base dell’approccio suggerito dall’OIE (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2009), gli altri parametri sierologici valutati sono stati: la sensibilità e specificità diagnostica, l’accuratezza, il valore predittivo positivo e negativo, la ripetibilità e riproducibilità. Gli intervalli di confidenza (IC95%) dei criteri sierologici sono stati calcolati attraverso un modello Bayesiano, utilizzando la distribuzione Beta.

I risultati sono stati riportati su una tabella di contingenza 2 x 2 (Tab. 7):

Stato vero

Positivi Negativi totale

Risultato del test ELISA

“Home- made”

Positivi A (veri positivi) B (falsi positivi) A + B

Negativi C (falsi negativi) D (veri negativi) C + D

totale A + C B + D A + B + C + D

Tab. 7. Tabella di contingenza 2 x 2.

Per il calcolo dei vari parametri sono state utilizzate le seguenti formule:

Sensibilità = (VP/ VP+FN) X 100 Specificità = (VN/VN+FP) X 100 Accuratezza = (VP+VN)/(TP+TN)

Valore predittivo positivo (PP) = VP/VP + FP x 100 Valore predittivo negativo (VPN) = VN/FN+ VN x 100

dove

 VP indica i veri positivi;  FN indica i falsi negativi;  VN indica i veri negativi;  FP indica i falsi positivi:  TP indica i totali positivi;

Inoltre sono stati calcolati i parametri di ripetibilità e riproducibilità.

Per la valutazione della ripetibilità, concordanza tra i risultati di misurazioni successive dello stesso misurando condotte nelle stesse condizioni di misurazione, sono state effettuate da uno stesso operatore due diverse misurazioni di 30 campioni di sieri (sia positivi che negativi), mantenendo le condizioni di misurazione invariate (stesso metodo di misurazione, stesso strumento di misura, medesimo luogo, medesime condizioni di utilizzo dello strumento e del misurando). I dati ottenuti sono stati utilizzati per il calcolo della ripetibilità ed il relativo intervallo di confidenza al 95%.

Per il calcolo della riproducibilità, cioè la concordanza tra i risultati di misurazioni successive dello stesso misurando condotte in condizioni di misurazione non omogenee, la misurazione di 30 campioni di sieri (sia positivi che negativi) è stata effettuata in doppio da due diversi operatori. I dati ottenuti sono stati utilizzati per il calcolo della riproducibilità ed il relativo intervallo di confidenza al 95%.

Calcolo dell’indice di concordanza tra ELISA “Home made” ed ELISA commerciale Tutti i campioni di siero sono stati testati anche con un kit ELISA presente in commercio (LSIVet™ Ruminant EHDV Serum ELISA Kit, Thermo Fisher Scientific) per confrontare i valori di densità ottica (OD). Il saggio ELISA commerciale è stato eseguito secondo le istruzioni del produttore:

 Distribuzione dei campioni e dei controlli: i campioni di siero e i controlli forniti dal kit sono stati testati ad una diluizione di 1:20, in doppio, usando come diluente il reagente B1. Sono stati distribuiti nella piastra 100 µl di ciascuno campione diluito, quindi la piastra è stata coperta con apposita cover ed incubata a 37 °C per 15 minuti;

 Lavaggio: sono stati effettuati 3 lavaggi di 300 µl/pozzetto utilizzando la soluzione di lavaggio (reagente A) diluita 1:10;

 Distribuzione del coniugato: è stato addizionato a ciascun pozzetto 100 µl di coniugato (reagente 4) diluito 1:100, quindi la piastra è stata coperta ed incubata a 37 °C per 30 minuti;

 Lavaggio: sono stati effettuati altri 3 lavaggi di 300 µl/pozzetto utilizzando la soluzione di lavaggio (reagente A) diluita 1:10;

 Sviluppo della reazione: è stato addizionato a ciascun pozzetto 100 µl di substrato (reagente C); la piastra è stata incubata a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 8 minuti, quindi sono stati addizionati 100 µl di soluzione di bloccaggio (reagente D) ed infine si è proceduto alla lettura a 450 nm.

Al fine di ottenere una buona riproducibilità delle letture, tutti i sieri sono stati analizzati in duplicato ed i corrispondenti valori di assorbanza sono stati mediati. I risultati ottenuti con i due test, l’ELISA “Home-made” e l’ELISA commerciale, sono stati correlati mediante il calcolo del valore del kappa di Cohen (Tab. 8), che è un indice di concordanza (Sprent and Smeeton, 2001). Il kappa di Cohen viene solitamente rappresentato con la seguente formula:

𝒌 =

Dove po è la concordanza osservata e pe è la concordanza dovuta all’effetto del caso.

Il calcolo, dopo aver raggruppato i dati in una tabella a doppia entrata, è stato effettuato nel modo seguente:

ELISA commerciale

positivi negativi totale

ELISA