U
NIVERSITÀ DI
P
ISA
Dipartimento di Scienze Veterinarie
Dottorato di ricerca in Scienze Veterinarie
XXX ciclo (2014-2015)
Settore scientifico-disciplinare: VET/05
Generazione di metodiche diagnostiche
ed immunizzanti per il virus della Malattia
Emorragica Epizootica (EHDV)
Dottoranda
Relatori
Dott.ssa Federica Pizzurro
Dott. Mario Forzan
Dott. Alessio Lorusso
A Domenico
“Love is the answer and you know that for sure”
INDICE
Abstract pag. 1
Lista delle tabelle e figure pag. 3
Introduzione pag. 6
1. La malattia emorragica epizootica (EHD) pag. 9
1.1 Il genere Orbivirus pag. 9
1.2 Excursus storico e distribuzione geografica di EHD pag. 10
1.3 Eziologia pag. 13
1.3.1 Tassonomia pag. 13
1.3.2 Morfologia ed organizzazione genomica pag. 15 1.3.2.1 Le proteine del capside esterno pag. 17 1.3.2.2 Le proteine del capside interno pag. 18 1.3.2.3 Le proteine minori pag. 18 1.3.2.4 Le proteine non strutturali pag. 19
1.3.3 Proprietà fisico-chimiche pag. 21
1.4 Ciclo replicativo pag. 21
1.4.1 Ingresso nella cellula pag. 21
1.4.2 Trascrizione pag. 22
1.4.3 Assemblaggio del virus pag. 22
1.4.4 Liberazione del virus dalla cellula pag. 23
1.5 Epidemiologia pag. 23
1.5.2 Patogenesi pag. 26
1.5.3 I vettori pag. 27
1.5.3.1 Tassonomia e biologia dei Culicoides pag. 28 1.5.3.2 Distribuzione geografica dei Culicoides pag. 30 1.5.3.3 Stagionalità vettoriale pag. 31
1.6 Aspetti clinici pag. 32
1.6.1 La malattia nel cervo pag. 32
1.6.2 La malattia nel bovino pag. 33
1.7 Impatto economico della malattia pag. 34
1.8 Diagnosi pag. 36
1.8.1 Isolamento ed identificazione virale pag. 36 1.8.2 Metodi molecolari: Rilevamento degli acidi nucleici pag. 37
1.8.2.1 RT-PCR pag. 37
1.8.2.2 Real-Time RT-PCR pag. 39
1.8.3 Metodi sierologici: Rilevamento degli anticorpi pag. 39 1.8.3.1 ELISA competitiva (c-ELISA) pag. 39 1.8.3.2 Saggio della siero-neutralizzazione (SN) pag. 39 1.8.3.3 Test di Fissazione del complemento (CTF) pag. 40 1.8.3.4 Immunodiffusione in gel di agar (AGID) pag. 40
1.9 Profilassi e controllo pag. 41
1.9.1 Sorveglianza e misure di controllo nelle aree endemiche pag. 41
1.9.2 Vaccinazioni pag. 42
1.9.3 Controllo dei vettori pag. 43
1.9.4 Monitoraggio e misure di controllo nelle aree libere da
2. Il sistema di espressione del Baculovirus pag. 46
2.1 Biologia del Baculovirus pag. 47
2.2 Tecnologia del vettore di espressione Baculovirus pag. 49 2.2.1 La tecnologia Gateway® e il vettore di trasferimento pag. 50
2.2.2 Il sistema di espressione Bac-to-Bac® pag. 52
3. Scopo del lavoro pag. 54
4. Materiali e Metodi pag. 56
4.1 Generazione di un saggio ELISA competitivo basato sulla
proteina ricombinante VP7 espressa in Baculovirus pag. 56 4.1.1 Linee cellulari e stipite virale pag. 56 4.1.2 Clonaggio del gene codificante la proteina VP7 pag. 57
Propagazione del virus, estrazione, retro-trascrizione ed
amplificazione del dsRNA virale pag. 57
Reazione di ligasi pag. 58
Generazione delle cellule batteriche competenti pag. 59
Trasformazione delle cellule competenti pag. 59
Caratterizzazione dei ricombinanti batterici pag. 60
Purificazione del DNA plasmidico pag. 61
Restrizione enzimatica pag. 61
Sequenziamento pag. 62
4.1.3 Generazione del Baculovirus ricombinante ed
espressione della proteina ricombinante r-VP7 pag. 62
Reazione di ricombinazione LR pag. 62
Trasfezione pag. 62
Titolazione virale mediante Plaque assay pag. 63
Amplificazione del Baculovirus ricombinante (r-Bac-VP7) pag. 65
- SDS-PAGE e colorazione con il blue di Coomassie pag. 66
- Western Blotting pag. 67
- Immunofluorescenza pag. 68
4.1.4 Sviluppo di cELISA “Home-made” pag. 69 Infezione delle Sf9 per la produzione dell’antigene r-VP7 pag. 69
Ottimizzazione della metodica cELISA pag. 69
- Condizioni di adsorbimento dell’antigene pag. 70 - Tempo di incubazione per la saturazione pag. 70 - Diluizione d’uso dell’anticorpo monoclonale pag. 70 - Diluizione d’uso dei campioni di siero pag. 70
Sviluppo di un protocollo ELISA competitiva “Home-made” pag. 71
Sieri esaminati pag. 71
Calcolo dei parametri diagnostici del test ELISA
“Home-made” pag. 72
Calcolo dell’indice di concordanza tra ELISA “Home-made”
ed ELISA commerciale pag. 74
4.2 Generazione di Virus-like particles (VLPs) di EHDV-6 pag. 77 4.2.1
4.2.1 Vettori plasmidici codificanti per le proteine strutturali
di EHDV-6 pag. 77
4.2.2 Costruzione del vettore pFast_VP2/VP5 pag. 78
4.2.2.1 Generazione inserto VP2/SmaI e clonaggio in
pFastBac® Dual sotto il promotore p10 pag. 78
- PCR per generare amplicone VP2/SmaI pag. 78 - Digestione enzimatica con SmaI pag. 78
- Reazione di ligasi pag. 78
4.2.2.1.1 - Trasformazione delle cellule batteriche competenti pag. 79 4.2.4.1.4 - Pcr direzionale su colonie positive pag. 79 4.2.4.1.6 - Digestione con SmaI pag. 80
4.2.2.2 Generazione inserto VP5/BamHI e clonaggio in
pFast_VP2 sotto il promotore PH pag. 81
4.2.4.2.6 - PCR per generare amplicone VP5/BamHI pag. 81
5.2.3.2.1 - Digestione enzimatica con BamHI pag. 81
- Reazione di ligasi pag. 81
- Trasformazione delle cellule batteriche competenti pag. 81 5.2.4.2.1
- Pcr direzionale su colonie positive pag. 82 5.2.4.2.2
- Digestione con SmaI, NotI, BamHI pag. 82
- Sequenziamento pag. 82
5.2.4
4.2.3 Costruzione del vettore pFast_VP3/VP7 pag. 83 5.2.5 4.2.3.1 Generazione inserto VP7/StuI e clonaggio in
pFastBac® Dual sotto il promotore p10 pag. 83
5.2.6 4.2.3.2 Generazione inserto VP3/SmaI e clonaggio in
pFast_VP7 sotto il promotore PH pag. 84
5.2.7
4.2.4 Generazione dei Bacmidi ricombinanti pag. 85 5.2.7.2 Trasformazione di E. coli DH10Bac™ pag. 85 5.2.7.3 Analisi del DNA dei bacmidi ricombinanti mediante PCR pag. 85
5.2.8
4.2.5 Generazione ed amplificazione dei Baculovirus
ricombinanti pag. 87
5.2.8.2 Trasfezione pag. 87
5.2.8.3 Rilevazione dell’mRNA virale nelle cellule infettate con Bac
VP2/VP5 e Bac VP3/VP7 pag. 88
5.2.9
4.2.6 Generazione e purificazione delle VLPs pag. 89 5.2.9.2 4.2.6.1 Analisi dell’espressione proteica pag. 90 5.2.9.3 - SDS-PAGE e colorazione con il blue di Coomassie pag. 90
5.2.9.4 - Western blotting pag. 91
5.2.9.5 4.2.6.2 Analisi al microscopio elettronico pag. 91
5. Risultati pag. 92
5.1 ELISA ricombinante competitiva “Home-made” pag. 92 5.1.1 Clonaggio del gene codificante per VP7 nel vettore di
trasferimento pENTR™/D-TOPO® pag. 92
5.1.2 Generazione del Baculovirus ricombinante ed
5.1.3 Sviluppo di cELISA “Home-made” pag. 99 5.2 Virus-like particles (VLPs) di EHDV-6 pag. 103
5.2.1 Costruzione del vettore pFast_VP2/VP5 pag. 103 5.2.9.6 Generazione inserto VP2/SmaI e clonaggio in pFastBac®
Dual pag. 103
5.2.9.7 Generazione inserto VP5/BamHI e clonaggio in pFast_VP2 pag. 105
5.2.2 Costruzione del vettore pFast_VP3/VP7 pag. 108 5.2.9.8 Generazione inserto VP7/StuI e clonaggio in pFastBac®
Dual pag. 108
5.2.9.9 Generazione inserto VP3/BamHI e clonaggio in pFast_VP7 pag. 110
5.2.3 Generazione dei Bacmidi ricombinanti pag. 112 5.2.4 Generazione ed amplificazione dei Baculovirus
ricombinanti pag. 113
5.2.5 Generazione e purificazione delle VLPs pag. 114
6. Conclusione e discussioni pag. 118
Riferimenti Bibliografici pag. 125
Abstract
Epizootic haemorrhagic disease (EHD) is an infectious non-contagious viral disease, affecting wild and domestic ruminants. The disease is caused by epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV), a member of the Reoviridae family within the Orbivirus genus. EHDV is an arbovirus since it is transmitted by insects of the genus Culicoides, which are its biological vectors.
In recent years two serotypes of EHDV, namely EHDV-6 and EHDV-7, have been identified in several countries of the Mediterranean Basin causing important economic losses in cattle, especially due to the reduction of milk production. This event, along with the presence of the vector in most European countries, has raised concern about a possible spreading of EHDV in Europe.
On this eventuality, the availability of diagnostic assays and safe vaccines would represent a key aspect for the elaboration of adequate surveillance and control programs.
In this study, we report the development of a “Home-made” competitive ELISA (cELISA) based on the recombinant viral protein VP7(r-VP7) as antigen. The protein, generated by the baculovirus espression system, was tested on a total of 275 serum samples including: EHDV reference strains; EHDV seropositive and seronegative samples; BTV and African horse sickness virus (AHSV) positive samples. The accuracy, sensitivity and specificity of the developed assay were 93.1, 84.1 and 96.9%, respectively, indicating that it can be used as a valid diagnostic tool. The main advantage of the developed test was the use of rVP7 without complicated and time-consuming purification steps.
In order to develop a safe vaccine candidate EHDV-Virus-Like Particles (VLPs) were also generated. Genes encoding for the four major-capsid proteins of a field strain of EHDV-6, were isolated and cloned to generate two recombinant baculoviruses. The correct expression of genes was evaluated by monitoring the synthesis of each viral mRNA in infected insect cells and subsequently confirmed by Western Blot analysis. The generation of self-assembled VLPs of the correct morphology was confirmed by electron microscopy studies performed on the purified particles.
The results obtained in this study provide safe and valuable diagnostic and prevention tools for the prevention and control of EHDV.
Riassunto
La malattia emorragica epizootica (EHD) è una malattia infettiva virale non contagiosa che colpisce ruminanti selvatici e domestici. La malattia è causata dal virus della malattia emorragica epizootica (EHDV), membro della famiglia Reoviridae, genere Orbivirus. EHDV è un arbovirus in quanto trasmesso da insetti del genere Culicoides, i quali rappresentano i suoi vettori biologici.
Negli ultimi anni sono stati segnalati due sierotipi di EHDV, EHDV-6 e EHDV-7, in diversi paesi del bacino del Mediterraneo, dove hanno causato infezione nei bovini con importanti perdite economiche, soprattutto dovute alla riduzione della produzione di latte. Questo evento, insieme al fatto che il virus viene trasmesso da un vettore già presente nella maggior parte dei paesi Europei, ha sollevato preoccupazioni per una possibile diffusione di EHDV in Europa, che potrebbe seguire quindi lo stesso percorso del virus della Bluetongue (BTV).
Sulla base di questa eventualità, la disponibilità di saggi diagnostici e vaccini sicuri rappresenterebbe un aspetto fondamentale per adeguati programmi di sorveglianza e controllo.
In questo studio, riportiamo lo sviluppo di un saggio ELISA competitivo "Home-made"(cELISA) basato sulla proteina virale ricombinante VP7 (r-VP7) come antigene. La proteina, generata tramite il sistema di espressione del Baculovirus, è stata testata su un totale di 275 campioni di siero, tra cui: i ceppi di riferimento EHDV, campioni di EHDV positivi e negativi e campioni positivi per BTV e African Horse sickness virus (AHSV).
Accuratezza, sensibilità e specificità del saggio sviluppato sono stati rispettivamente 93.1%, 84.1% e 96.9%, indicando che tale saggio può essere quindi utilizzato come valido strumento diagnostico. Il principale vantaggio del test sviluppato è stato l'uso dell’antigene r-VP7 senza passaggi di purificazione complicati e dispensioni in termini di tempo.
Al fine di sviluppare un vaccino sicuro, sono state inoltregenerate le EHDV-Virus-Like Particles (VLPs). I geni codificanti le quattro proteine capsidiche principali di un ceppo di campo di EHDV-6 sono stati isolati e clonati per generare due Baculovirus ricombinanti. La corretta espressione dei geni è stata valutata monitorando la sintesi di ciascun mRNA virale in cellule d’insetto infettate e successivamente confermata mediante analisi Western Blot. La generazione di VLPs auto-assemblate con una corretta morfologia è stata confermata da studi di microscopia elettronica eseguiti sulle particelle purificate.
I risultati ottenuti in questo studio forniscono in definitiva strumenti diagnostici e di prevenzione sicuri e preziosi per la prevenzione e il controllo di EHDV.
Lista delle tabelle e figure
CAPITOLO 1. La malattia emorragica epizootica (EHD)
Figura 1 Distribuzione geografica di EHDV. pag. 12 Figura 2 Immagine al microscopio elettronico di EHDV. pag. 13 Tabella 1 Sierotipi EHDV ufficialmente riconosciuti. pag. 14 Figura 3a Struttura del capside degli Orbivirus. pag. 15 Figura 3b Schema dei segmenti genomici e relative proteine. pag. 16
Figura 4 I 10 segmenti di dsRNA. pag. 16
Tabella 2 I segmenti di BTV-10 e EHDV-1. pag. 20 Tabella 3 Specie suscettibili a EHDV. pag. 25 Figura 5 Il ciclo di vita dei Culicoides. pag. 30 Figura 6 Distribuzione geografica delle principali specie di
Culicoides coinvolte nella trasmissione di EHDV. pag. 31
Tabella 4 Sintesi delle metodiche molecolari sviluppate per
l’identificazione di EHDV. pag. 38
CAPITOLO 2. Il sistema di espressione del Baculovirus
Figura 7 Plasmide di trasferimento di Baculovirus. pag. 48 Figura 8 Produzione di un vettore di espressione Baculovirus
mediante ricombinazione omologa. pag. 50 Figura 9 Tecnologia Gateway®: rappresentazione schematica dei
sistemi di ricombinazione BP e LR. pag. 51 Figura 10 Riproduzione schematica della struttura del vettore
pENTR™/D-TOPO®. pag. 51
Figura 11 Rappresentazione schematica della generazione del Baculovirus ricombinante utilizzando il sistema d’espressione Bac-to-Bac®.
pag. 52 Figura 12 Rappresentazione schematica della struttura del vettore
CAPITOLO 4. Materiali e metodi
Tabella 5 Anticorpi utilizzati per il Western blotting. pag. 68 Tabella 6 Numero totale dei campioni di siero testati. pag. 72 Tabella 7 Tabella di contingenza 2 x 2. pag. 73 Tabella 8 Tabella per il calcolo del kappa di Cohen. pag. 75 Figura 13a/b Rappresentazione schematica della struttura dei vettori
Strataclone pSC-B-amp/kan (a) e pCR ®-Blunt (b). pag. 77
Tabella 9 Lista dei primers usati per PCR eseguite su cDNA virali. pag. 89
CAPITOLO 5. Risultati
Figura 14 Gel relativo alla corsa elettroforetica del frammento di VP7
di EHDV-6. pag. 92
Figura 15 PCR di screening sulle colonie batteriche. pag. 93 Figura 16 Gel relativo alla corsa dei plasmidi ricombinanti digeriti con
l’enzima NotI. pag. 93
Figura 17 Allineamento di sequenze amminoacidiche. pag. 94 Figura 18 Controllo cellulare costituto da cellule Sf9 non infettate(a).
Cellule Sf9 dopo 5 giorni dalla trasfezione (b). pag. 95 Figura 19 Plaque assay su Sf21 per titolazione del Baculovirus
ricombinante (r-Bac-VP7). pag. 96
Figura 20 SDS-PAGE e colorazione blue di Coomassie. pag. 97 Figura 21 Risultato del Western Blotting. pag. 98 Figura 22 Immunofluorescenza su cellule Sf9 infettate con r-Bac-VP7. pag. 98 Figura 23 Curva ROC del test ELISA “Home-made” calcolata su 275
campioni di siero. pag. 101
Figura 24 Distribuzione dei campioni di siero testati. pag. 101 Tabella 10 Risultati del confronto tra ELISA “Home made” ed ELISA
commerciale. pag. 102
Figura 25 Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto
VP2/SmaI. pag. 103
Figura 26 PCR di screening sulle colonie batteriche (VP2). pag. 104 Figura 27 Elettroforesi del prodotto di digestione enzimatica con
SmaI. pag. 105
Figura 28 Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto
Figura 29 Elettroforesi dei prodotti di digestione enzimatica con
BamHI. pag. 106
Figura 30 PCR di screening sulle colonie batteriche (VP5). pag. 107 Figura 31 Elettroforesi dei prodotti di digestione enzimatica con
SmaI, NotI e BamHI. pag. 107
Figura 32 Rappresentazione schematica del vettore di espressione
pFast_VP2/VP5. pag. 108
Figura 33 Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto
VP7/StuI. pag. 109
Figura 34 PCR di screening sulle colonie batteriche (VP7). pag. 109 Figura 35 Elettroforesi dei prodotti di PCR per generazione inserto
VP3/BamHI. pag. 110
Figura 36 PCR di screening sulle colonie batteriche (VP3). pag. 111 Figura 37 Elettroforesi dei prodotti di digestione enzimatica con
SmaI, NotI e BamHI. pag. 111
Figura 38 Rappresentazione schematica del vettore di espressione
pFast_VP3/VP7. pag. 112
Figura 39 Elettroforesi dei Bacmidi screenati con primers M13 (Fwr
e Rev). pag. 113
Figura 40 Analisi degli mRNA virali. pag. 114 Figura 41 SDS-PAGE e colorazione blue di Coomassie: VP2, VP3, VP5
e VP7 in VLPs prodotte. pag. 115
Figura 42 Western Blotting su VLPs purificate. pag. 116 Figura 43 Osservazione delle VLPs al microscopio elettronico. pag. 117 Figura 44 Osservazione al microscopio elettronico del virus EHDV-6, utilizzato come controllo positivo. pag. 117
INTRODUZIONE
Il virus della malattia emorragica epizootica del cervo (EHDV), appartenente come il virus della Bluetongue al genere Orbivirus, ne presenta le stesse caratteristiche morfologiche e strutturali. EHDV è trasmesso da insetti vettori biologici del genere Culicoides ed infetta in particolar modo il cervo a coda bianca, ma anche altri ruminanti selvatici e domestici (Mertens et al., 2005a; Savini et al., 2011).
A partire dal 2006, l'interesse per questo virus è cresciuto conseguentemente all’isolamento di tale agente infettivo in alcuni paesi del bacino Mediterraneo, quali Marocco, Algeria, Tunisia, Israele e Turchia, dove è stato responsabile dell’infezione nel bovino (Benazzou, 2006; Yadin et al., 2008; Temizel et al., 2009; Madani et al., 2011; Savini et al., 2011; Ben Dhaou et al., 2016).
A conferma dell’attenzione per questa malattia da parte degli organismi internazionali, questa è stata inserita durante la 76° Sessione Generale OIE tenuta nel maggio 2008 fra le malattie della lista della World Organization for Animal Health, le quali sono soggette a notifica obbligatoria negli stati membri dell’Unione Europea secondo la direttiva 92/119/CEE.
Esistono fondati timori sulla possibilità che EHDV possa raggiungere, a partire dal nord Africa, i paesi dell'Europa mediterranea, effettuando un percorso simile a quello che ha permesso al virus della Bluetongue di raggiungere negli anni 2000 il sud Europa e la parte centro-meridionale ed insulare del nostro paese. Tale eventualità è supportata dalla presenza del vettore competente, che è lo stesso per BTV, che a causa del riscaldamento globale non è più diffuso soltanto in paesi tropicali e subtropicali ma ha ormai raggiunto anche alcuni paesi del nord Europa.
Nonostante i tassi di mortalità non siano elevati, le perdite economiche dovute all’infezione da EHDV possono essere ingenti. Un rapporto pubblicato negli scorsi anni ha stimato le perdite economiche dovute all’epidemia di EHDV in bovini da latte in Israele nel 2006 pari a 2,491,000 dollari (in media 26,5 $ per bovina) (Kedmi et al., 2010). Le perdite hanno riguardato la produzione di latte e l’aumento di mortalità degli animali colpiti dall’infezione. Se tali perdite venissero rapportate al numero di bovini da latte presenti in Europa, potremmo avere un’idea del danno economico che
un’eventuale introduzione di EHDV potrebbe arrecare ai Paesi della UE. Risulta dunque importante monitorare l'epidemiologia di EHD ed attrezzarsi per lo sviluppo di nuovi prodotti diagnostici ed immunizzanti.
Un valido test sierologico per svelare la presenza dell'infezione da EHDV è il test ELISA che utilizza come antigene la proteina virale VP7. Tale proteina capsidica risulta essere la migliore candidata come antigene in un saggio ELISA competitivo indiretto (cELISA) in quanto immuno-dominate, siero-gruppo specifica ed altamente conservata tra i sierotipi EHDV (Mecham et al., 2003).
Nel saggio ELISA competitivo sviluppato in questo progetto, la proteina VP7 ricombinante, è stata generata attraverso il sistema di espressione del Baculovirus. In termini di sviluppo diagnostico, tale tecnica risulta essere molto specifica, in particolare quando si usano anticorpi monoclonali, ma anche di estrema facilità e velocità di utilizzo.
A seguito del rischio di introduzione di EHDV in Europa, oltre a nuovi strumenti diagnostici, sarà importante dotarsi di vaccini di nuova generazione. In questa tesi abbiamo quindi intrapreso lo sviluppo di un vaccino anti-EHDV basato sulla produzione di particelle simil virali o Virus-like Particles (VLPs).
Le VLPs sono virioni vuoti formati dall’auto-assemblaggio di una o più proteine strutturali del capside virale con un diametro che oscilla tra i 25-100 nanometri (Chackerian, 2007).
Essendo strutturalmente simili al virus da cui derivano e prive di genoma virale, le VLPs sono molto immunogene e spesso antigenicamente indistinguibili dal virus da cui derivano (Roy e Noad, 2008; Stewart et al., 2012; Zhao et al., 2013; Lua et al., 2014), ma anche molto sicure e pertanto particolarmente interessanti per lo sviluppo di vaccini innovativi (Maurer et a., 2005).
La tipica struttura densa e simil-cristallina delle VLPs è in grado di stimolare un’efficiente risposta dei linfociti B poichè la presenza ripetuta ed ordinata degli stessi epitopi garantisce il legame simultaneo con più di una molecola anticorpale sulla membrana dei linfociti B (Zeltins, 2013). Inoltre, la mancanza in esse di materiale genomico virale le rendono candidate ideali per protocolli di vaccinazione anche in soggetti considerati ad alto rischio (Kang et al., 2009).
Uno dei fattori importanti nella produzione di VLPs è la scelta del sistema ottimale di espressione proteica. La loro generazione può essere ottenuta infatti utilizzando batteri, lieviti, cellule d’insetti e di mammiferi o cellule vegetali. (Zeltins, 2013). Precedenti studi condotti su VLPs prodotte a scopo vaccinale per BTV, hanno dimostrato che queste possono conferire protezione nei soggetti trattati senza effetti collaterali (Roy et al., 1992; Stewart et al., 2012; Thuenemann et al., 2013), indicando che tali vaccini potrebbero essere un’alternativa sicura ed efficace ai vaccini vivi attenuati o inattivati convenzionali.
In questa tesi, al fine di generare VLPs di EHDV, i geni codificanti le quattro maggiori proteine strutturali (VP2, VP3, VP5 e VP7) sono stati clonati in vettori di espressione per la generazione di Baculovirus ricombinanti.
LA MALATTIA EMORRAGICA
EPIZOOTICA (EHD)
1
La malattia emorragica epizootica, internazionalmente conosciuta come Epizootic Hemorragic Disease (EHD), è una malattia infettiva virale trasmessa da insetti del genere Culicoides, che colpisce i ruminanti sia domestici che selvatici, ed in particolare i cervi a coda bianca (Odocoileus virginianus).
Il virus che ne è responsabile appartiene al genere Orbivirus, all’interno della famiglia Reoviridae (Maclachlan et al., 2004; Savini et al., 2011).
1.1 Il genere Orbivirus
Il genere Orbivirus è uno dei 15 generi presenti all’interno della famiglia Reoviridae, la quale include virus che infettano vertebrati, artropodi e piante.
In latino, Orbis significa “forma ad anello” riferendosi alla superficie delle particelle quando vengono osservate con la colorazione negativa al microscopio elettronico. Gli Orbivirus sono virus trasmessi da artropodi vettori, i quali possono essere, a seconda del virus, alcune specie di moscerini del genere Culicoides, zanzare, mosche nere, flebotomi o zecche (Wilson et al., 2008; Purse et al., 2005). Anche se gli Orbivirus non hanno la capacità di trasmettersi direttamente tra i vertebrati, possono replicare sia in artropodi che in vertebrati.
Pertanto la distribuzione globale e stagionale delle singole specie di Orbivirus è condizionata dalla presenza dei loro rispettivi vettori biologici competenti (Shope et al., 1959; Purse et al., 2005).
Sulla base delle differenze di reattività sierologica, sono riconosciute 22 specie di Orbivirus e all'interno di ogni specie si differenziano diversi sierotipi (Mertens et al., 2004; Maan et al., 2007b).
All'interno di questo genere i virus di interesse veterinario più importanti sono BTV e EHDV che colpiscono ruminanti domestici e selvatici, ed i virus della peste equina (AHSV) e dell’encefalosi equina, che colpiscono gli equidi (Maclachlan e Guthrie, 2010). Tuttavia, negli ultimi anni, un altro Orbivirus che rappresenta un rischio crescente risulta essere anche il virus della malattia emorragica epizootica del cervo (EHDV).
1.2 Excursus storico e distribuzione geografica di EHD
La malattia fu segnalata per la prima volta nell’agosto del 1955, quando centinaia di cervi a coda bianca si ammalarono negli Stati del New Jersey e del Michigan (USA) (Shope et al., 1955; Shope et al., 1959). Tuttavia informazioni acquisite durante quegli studi rivelarono che focolai della malattia erano già stati osservati periodicamente negli USA fin dal 1890 e diagnosticati come Black tongue (Lingua nera), sulla base di uno dei segni clinici più gravi della malattia nei cervi (Shope et al., 1959).
Altri focolai simili furono registrati negli stati di New Jersey, Washington, Michigan e South Dakota, durante i mesi di agosto e settembre della fine degli anni 1950. La malattia pertanto venne denominata come epizootica in virtù dell’ampia distribuzione dei suoi focolai.
Nel 1959 una malattia caratterizzata da febbre e stomatite, interessò molti bovini in Giappone e successivamente in Thailandia e Corea, ma fu inizialmente confusa con altre malattie epizootiche dei bovini, e denominata “Ibaraki disease”. Negli anni a seguire, la caratterizzazione sierologica del virus Ibaraki permise di stabilire che questo rientrava nel sierotipo 2 di EHDV (Yadin et al., 2008). Tale sierotipo ha continuato a causare sporadicamente epidemie di EHD tra il bestiame nell'Estremo Oriente (Uchinuno et al., 2003; Kitano, 2004).
Dal dicembre del 1995 fino a marzo 1996 ed all’inizio dell’estate del 1997, si sono verificati in sud Africa periodi particolarmente piovosi, oltre le medie stagionali, che hanno determinato condizioni particolarmente favorevoli per la sopravvivenza dei Culicoides, e di conseguenza delle malattie da loro trasmesse. Infatti durante questo periodo diversi focolai di una malattia atipica nei bovini si manifestarono in molte parti del paese. I segni clinici erano simili a quelli della Bluetongue e di EHD. Entrambi i virus responsabili di tali malattie furono isolati da bovini e da culicoidi, e successivamente gli isolati virali furono tipizzati come sierotipi 2, 3, 6 e 8 di BTV. Solo in una fattoria fu isolato EHDV da bovini e culicoidi. Test successivi confermarono la presenza di EHDV in Sud Africa (Barnard et al., 1998).
Nel 1998, in Iowa e Missouri (USA), un grave focolaio colpì una popolazione di cervi dalla coda bianca e in quell’occasione casi di EHD furono diagnosticati anche in bovini (Gaydos e Nettles, 1998).
Durante l’autunno del 1999, un’epidemia di EHD, causata dal sierotipo 1, scoppiò in una popolazione di cervi dalla coda bianca in USA, interessando tutta la costa est del paese, dalla Georgia al New Jersey (Doster, 1999).
Nel settembre 2006, i servizi veterinari israeliani registrarono un’inusuale sindrome nei bovini di alcune fattorie site nella valle del Giordano. Successivamente la malattia si diffuse da nord a sud lungo il fiume sino alla Galilea settentrionale ed il mar Morto. Dall’inizio di ottobre, la malattia si diffuse anche in direzione est ed ovest, interessando fattorie della valle di Jezre’el e gli altipiani del Golan. Diversi focolai apparvero anche sulle coste del mediterraneo. L’ipotesi iniziale fu che si trattasse di febbre effimera bovina. Le lesioni tuttavia non erano compatibili con tale ipotesi, ma piuttosto rimandavano alla BT. L’assenza di malattia nella popolazione ovina portò finalmente a prendere in considerazione EHD e l’infezione venne confermata attraverso RT-PCR utilizzando primers specifici per il segmento 7 del virus (Yadin et al.,2008).
Nello stesso anno una malattia simile venne segnalata in nord Africa (Algeria, Marocco e Tunisia). Isolati di EHDV ottenuti da sangue e linfonodi di bovino, furono inviati all’Institute for Animal Health di Pirbright (Regno Unito). A seguito della tipizzazione, gli isolati provenienti da Algeria, Marocco e Tunisia risultarono appartenere al sierotipo EHDV-6 e quelli israeliani al sierotipo EHDV-7 (Maan et al., 2010).
Nel luglio 2007 un’epidemia di EHD della durata di 7 settimane interessò la popolazione bovina nella regione di Mugla in Turchia. La malattia risultò atipica per quella regione e successivamente altri casi furono segnalati sino alla fine dell’agosto 2007 in altre parti della Turchia (Istanbul, Izmir, Canakkale). Sulla base dei sintomi clinici si avanzò il sospetto di EHD, infatti sempre mediante RT-PCR e analisi delle sequenze, il virus responsabile fu tipizzato come EHDV sierotipo 6 (Temizel et al., 2009).
Pertanto, i focolai da EHDV riportati in Algeria, Tunisia, Marocco, Israele, Giordania e Turchia tra il 2006 e il 2007 erano causati da due diversi sierotipi, il sierotipo 6 (EHDV 318) e il sierotipo 7, entrambi patogeni per il bovino. Non si hanno informazioni sulle origini di questi stipiti virali.
Epidemie di EHD, hanno continuato a verificarsi regolarmente dal 2008 al 2015 nelle popolazioni di cervi a coda bianca in gran parte dell'America settentrionale ad est delle Montagne Rocciose (Beringer et al., 2000; Murphy et al., 2006; Mead et al., 2012; Dudley, 2013; Pybus et al., 2014). La malattia si è anche verificata sporadicamente in
antilocapre americane e in pecore delle Montagne Rocciose, e di recente è stata segnalata nei mazama in Brasile e in yak mantenuti in cattività in Colorado (Favero et al., 2013; Van Campen et al., 2013).
Nel 2015 sono stati notificati focolai di EHD in Israele (Hazafon e Jerusalem) e in Tunisia (Mahdia) (Promed, archive number: 20151015.3718085 e 20151002.3685159); e nel 2016 negli USA, South Dakota e Michigan (Promed, archive number: 20161027.4588725 e 20161004.4534320, 2016).
Fig. 1. Distribuzione geografica di EHDV (efsa.maps.arcgis.com).
Ad oggi, EHDV è presente in America, Africa, Australia ed Asia (Fig. 1) (OIE, 2009; CFSPH, 2016). EHDV-1 e EHDV-2 sono, fino ad ora, i soli sierotipi presenti in nord America. Due sierotipi designati EHDV-4 e EHDV-318 (oggi classificato come EHDV-6) sono enzootici in Sudan. In Nigeria, sono stati isolati da Culicoides spp (Moore, 1974) EHDV-3 (oggi classificato come EHDV-1) e EHDV-4. In Australia sono presenti 4 sierotipi: EHDV-5, EHDV-6, EHDV-7 e EHDV-8. Infine in nord Africa, Medio Oriente e Turchia circolano EHDV-6 e EHDV-7 (Aradaib et al., 2004).
1.3 Eziologia
1.3.1 Tassonomia
L’agente della malattia emorragica epizootica (EHD) (Fig.2) appartiene alla famiglia Reoviridae, genere Orbivirus e condivide molte caratteristiche morfologiche e strutturali con gli altri membri del genere, in particolare con il virus della Bluetongue (BTV) e il virus della peste equina africana (AHSV) (Maclachlan e Osburn, 2004). Inizialmente una prima classificazione riconosceva 10 diversi sierotipi di EHDV comprendenti i sierotipi da 1 a 8, EHDV-318 e il virus Ibaraki (Mertens et al., 2005a). Successivamente analisi sierologiche e molecolari, hanno suggerito di includere EHDV-3 in EHDV-1, EHDV-EHDV-318 in EHDV-6 e il virus Ibaraki in EHDV-2, riducendo i sierotipi a 7, come elencati in tabella 1 (Maan et al., 2010; Maan et al., 2016).
Sierotipi
EHDV-1 New Jersey
EHDV-2 Alberta, Ibaraki and CSIRO 439 EHDV-3 Ib Ar 22619 a EHDV-4 Ib Ar 33853 EHDV-5 CSIRO 157 EHDV-6 CSIRO 753 EHDV-7 CSIRO 775 EHDV-8 DPP 59
a EHDV-3 (Ib Ar 22619) e EHDV-1 costituiscono
lo stesso sierotipo (Savini et al., 2011)
Tab.1. Sierotipi EHDV ufficialmente riconosciuti (Savini et al., 2011).
Tramite analisi filogenetica dei segmenti 3 e 9, è stato possibile suddividere gli stipiti di EHDV in base alla loro origine geografica in stipiti orientali “Eastern” (Asia, Australia) e stipiti occidentali “Western” (America, Africa, Medio Oriente) (Anthony et al., 2009; Allison et al., 2010).
Sulla base delle conoscenze attualmente disponibili, sembra non esserci alcuna correlazione tra la virulenza e sierotipo. Infatti, per esempio, il virus Ibaraki, classificato come EHDV-2 (Sugiyama et al., 1989), è altamente patogeno per i bovini (Omori et al., 1969), a differenza degli stipiti di EHDV-2 del nord America che invece non lo sono. Allo stesso modo, EHDV-318 (ora classificato come EHDV-6) e EHDV-7 hanno causato malattie nei bovini in nord Africa e Israele, mentre gli stessi sierotipi non sono stati in grado di causare malattia in Sudan e Australia. In linea generale, sembra che gli stipiti occidentali tendano ad essere più patogeni degli stipiti orientali (Anthony et al., 2010).
1.3.2 Morfologia ed organizzazione genomica
Studi filogenetici hanno rivelato che i membri del genere Orbivirus sono strettamente correlati tra loro, in particolare BTV e EHDV (Mecham e Dean, 1988). BTV, come prototipo degli Orbivirus, è stato ampiamente studiato geneticamente, strutturalmente e a livello molecolare, pertanto molte delle sue caratteristiche possono essere considerate analoghe a quelle di EHDV (Rao et al, 2017).
Le particelle virali di EHDV hanno un diametro compreso tra 70 e 80 nm, sono sprovviste di envelope e presentano una simmetria icosaedrica. Il capside è costituito da due strati proteici concentrici, uno interno e l’altro esterno (Fig. 3a).
Il genoma virale è costituito da 10 segmenti di RNA a doppio filamento mono-cistronici, ad eccezione del nono e del decimo segmento per i quali analisi bioinformatiche hanno dimostrato la presenza di due open reading frame (ORF) sovrapposte (Fig. 3b) (Belhouchet et al., 2011; Ratinier et al., 2011).
Fig.3. Struttura del capside degli Orbivirus (a); Schema dei segmenti genomici e relative proteine (b). (Swiss Institute of Bioinformatics - http://viralzone.expasy.org)
I 10 segmenti genomici codificano quindi per 12 proteine virali: cinque non strutturali (NS1, NS2, NS3/NS3a e NS4 ed NS5) e sette strutturali (VP1-VP7) (Roy et al., 2017). I segmenti genomici 1, 3, 4, 6 e 7 sono quelli altamente conservati, con più del 90% di omologia fra gli stessi segmenti di stipiti diversi di EHDV (Aradaib e Ali, 2004). I segmenti del genoma sono numerati da 1 a 10 in base alla loro migrazione su SDS-PAGE (Fig. 4).
Fig.4. I 10 segmenti di dsRNA (Roy, 2007).
I dettagli completi su ogni segmento, le proteine codificate e la funzione di ciascuna proteina sono riassunti in tabella 2 (Roy, 2007; Anthony et al., 2009).
1.3.2.1 Le proteine del capside esterno
Lo strato esterno è costituito da 60 trimeri, costituiti a loro volta da 180 molecole per particella di VP2 e un totale di 360 molecole di VP5 per particella virale, il tutto all’interno di 120 strutture globulari.
VP2 rappresenta “i picchi a forma di vela” che si trovano sopra i trimeri di VP5 ed è la proteina più esposta, responsabile dell'attacco iniziale del virus ai recettori delle cellule ospiti, facilitandone così l'ingresso (Hassan e Roy, 1999, Hassan et al., 2001; Anthony et al., 2009). I dati della sequenza e l'analisi immunologica hanno dimostrato che VP2 è la proteina più variabile, attribuendola alla specificità del sierotipo (Maan et al., 2007b). Inoltre, l'allineamento delle sequenze di VP2 dei diversi sierotipi ha mostrato la presenza di regioni specifiche caratterizzate da una più elevata variabilità, suggerendo che queste regioni potrebbero servire come epitopi mirati per gli anticorpi neutralizzanti (Ghiasi et al., 1987).
È stato dimostrato che VP2 ha una forte affinità alla glicoforina A dei globuli rossi, spiegando così il loro ruolo nella trasmissione del virus da parte dei vettori Culicoides nei vertebrati durante il pasto di sange (Hassan e Roy, 1999). Inoltre, le particelle di virione prive di VP2, ma in cui rimane presente la VP5, perdono la capacità di legarsi alle cellule dei vertebrati e agli eritrociti (Huismans et al., 1987).
VP5, è la seconda proteina del capside esterno, ha un ruolo essenziale per la penetrazione del virus nelle cellule ospiti ed è in grado di incrementare la risposta anticorpale nei confronti della VP2.
Sperimentalmente è stato dimostrato che VP5 ha un ruolo nella penetrazione del virus possibilimente destabilizzando le membrane endosomiali (Owens et al., 2004; Forzan et al., 2004; Forzan et al., 2007).
1.3.2.2 Le proteine del capside interno
Il capside interno del virus è costituito da 2 proteine maggiori VP3 e VP7. La superficie del core ha un diametro di 73 nm con simmetria icosaedrica, in cui lo strato esterno è costituito da 780 molecole di proteina VP7, le quali formano 260 trimeri che appaiono come proiezione a nastro sulla superficie del nucleo.
VP7 è la principale proteina virale immuno-dominante. Poiché VP7 è antigenicamente specifica per ciascuna delle specie di Orbivirus, rappresenta l’antigene ideale per la progettazione di saggi diagnostici siero-gruppo specifici. Lo strato sottostante del core è costituito da 120 copie della proteina VP3, disposte in 60 dimeri, in contrasto con lo strato VP7, ha una struttura sferica con un aspetto angolare dovuto alla variazione dello spessore dei gusci proteici. I dimeri di VP3 servono da impalcatura per la deposizione dello strato costituito dai trimeri di VP7 (Grimes et al., 1998).
1.3.2.3 Le proteine minori
Internamente allo strato costituito dai dimeri di VP3, si trovano le proteine VP1, VP4 e VP6, definite proteine minori. Studi di diffrazione ai raggi X indicano che tali proteine sono attaccate, come un complesso di transcriptasi, alla superficie interna del sub-core costituito da VP3, ai vertici dell’icosaedro, e sono organizzate in una struttura altamente ordinata (Gouet et al., 1999).
La VP1 corrisponde all’RNA polimerasi RNA-dipendente virale (Mertens, 2009) necessaria per la trascrizione del genoma virale in mRNA. È costituita da 302 aminoacidi ed con una massa di circa 149.9 kDa (Anthony et al., 2009).
La VP4 è un complesso di 2 enzimi: l’enzima guanilil-trasferasi, responsabile del capping dell’mRNA e catalizzatore della reazione che trasferisce una guanina sul terminale 5' dell'mRNA; e l’enzima metil-transferasi, responsabile della metilazione dell’mRNA. La proteina, formata da 644 aminoacidi, è idrofilica ed ha una massa di circa 75.98–76.17 kDa (Anthony et al., 2009).
La VP6 lega l'RNA a singola e doppia catena ed ha attività di elicasi per la separazione dei 2 filamenti di RNA e di ATPasi per l’energia necessaria al processo (Mertens et al., 2005b). Le sue dimensioni sono variabili, da 359 a 362 aminoacidi con una massa di circa 40 kDa. Questi dati sono riferiti a stipiti isolati in nord-America, Africa e Medio-Oriente, mentre negli stipiti australiani e giapponesi la
stessa proteina è leggermente più piccola (337 aminoacidi con una massa di circa 37.2 kDa) (Anthony et al., 2009).
1.3.2.4 Le proteine non strutturali
NS1 è la proteina responsabile della formazione di strutture tubulari, di lunghezza variabile fino a 4 µm, osservabili nel citoplasma delle cellule infette durante la replicazione del virus. La funzione di tali strutture è tutt’ora ignota, ma sono considerate fortemente caratteristiche degli Orbivirus (Owens et al., 2004). NS2 è presente in forma fosforilata ed è un costituente del sito di replicazione ed assemblaggio del virus (virus inclusion bodies, VIB). Essa ha la capacità di legare l’RNA a singolo filamento (ssRNA) e questo fa pensare ad un suo ruolo attivo nella replicazione del virus. Insieme ad altre proteine virali, si pensa sia coinvolta nel reclutamento dell’mRNA durante l’incapsidamento (Modrof et al., 2005).
NS3 e NS3(a) sono 2 piccole proteine non strutturali di membrana, implicate nel rilascio delle particelle virali dalla cellula infetta (Anthony et al., 2009). Queste proteine sono codificate da 2 distinti siti d’inizio su un singolo Open Reading Frame (ORF) nel segmento genomico 10 (Mertens et al., 2005b).
Infine, di recente, sono state identificate due nuove proteine virali non strutturali, NS4 ed NS5, il cui ruolo non è ancora del tutto chiaro (Stewart et al., 2015).
Segmento Proteina aa BTV-10
aa
EHDV-1 Localizzazione Funzione
1 VP1 1,302 1,302 Nucleo interno RNA polimerasi
2 VP2 956 971 Capside esterno (spike) Legame recettoriale Entrata virus Emagglutinina Neutralizzazione specifica 3 VP3 901 899 Strato sub-core (scaffold)
Impalcatura per trimeri di VP7 Interagisce con complesso di transcriptasi e RNA genomico 4 VP4 654 644 Nucleo interno Capping dell’mRNA Catalizzatore di reazione di trasferimento di una guanina sul terminale 5' dell'mRNA
Metilazione dell’mRNA
5 VP5 526 527 Capside esterno
(globulare) Penetrazione del virus
6 NS1 552 551 Non strutturale
Potenziatore della sintesi proteica Coinvolto nella
maturazione del virus
8 NS2 357 373 Non strutturale
Recluta RNA a singolo filamento (ssRNA) Forma corpi inclusi
citoplasmatici
Sito per l'assemblaggio del core 9 VP6 328 360 Core interno Elicasi virale Adenosina trifosfatasi (ATPse) RNA packaging NS4 77-79 - Core interno Interazione host-virus Contrastare la risposta antivirale dell'ospite (Ratinier et al., 2011) 10 NS3 NS3A 229 216 228 - Non strutturale Glicoproteine Proteine di membrana Interagisce con le proteine di membrana dell’ospite
Tab. 2. I segmenti di BTV-10 e EHDV-1. Adattato da Fields Virology, 5 Eds., capitolo Orbiviruses (Roy, 2007, Anthony et al., 2009).
1.3.3 Proprietà fisico-chimiche
Le proprietà fisico-chimiche di EHDV sono simili a quelle di altri membri del genere Orbivirus (BTV, AHSV, EEV) (Coetzer e Guthrie, 2004). Il virus risulta estremamente instabile ad alte temperature, pertanto è inattivato a 50 °C per 3 ore e a 60 °C per 15 minuti. È sensibile a pH compreso tra 6 e 8. Al contrario è resistente ai solventi lipidici come l’etere e il cloroformio.
È facilmente inattivato dal β -propiolattone, 2% w/v glutaradeide, acidi, alcali (2% idrossido di sodio), 2-3% di ipoclorito di sodio, iodofori e composti fenolici. Ma è molto stabile nei campioni di sangue e tessuto a 4, 20 e 70 °C. È inattivato a 20 °C, ma a causa del suo genoma costituito da RNA a doppio filamento (dsRNA) è resistente all'irradiazione ultravioletta e
γ
(OIE, 2009).1.4 Ciclo replicativo
Studi effettuati principalmente su BTV hanno chiarito il meccanismo di replicazione degli Orbivirus nella cellula di mammifero.
1.4.1 Ingresso nella cellula
In tutti gli Orbivirus, la proteina VP2 è quella maggiormente esposta (Lewis e Grubman, 1991; Anthony et al., 2009). Le parti strutturalmente più esposte della proteina (spikes) si estendono al di sopra del corpo principale del virione e sono responsabili dell’attacco del virus alla superficie cellulare e dell’endocitosi del virione mediata dal recettore di membrana della cellula ospite. I recettori di superficie della cellula non sono ancora stati identificati, mentre sappiamo che le particelle del core virale si legano ai glicosamminoglicani (Mertens et al., 2008).
Uno dei possibili meccanismi di penetrazione del virus nella cellula è quello di endocitosi pH-dipendente mediato dalla clatrina. Le proteine VP2 e VP5, che costituiscono il capside esterno, hanno entrambe un ruolo in questo meccanismo. Il rilascio del core dall’endosoma ed il suo passaggio nel citoplasma è intimamente connesso con il processo di uncoating. Il basso pH all’interno dell’endosoma è responsabile del ri-arrangiamento o degradazione di VP2, il virione si sveste quindi della VP2. Il basso pH è responsabile anche delle modificazioni strutturali di VP5, probabilmente ne espone le sue eliche amfipatiche, che permettono alla proteina di
permeabilizzare la membrana endosomiale attraverso il suo peptide ammino-terminale.
A causa del legame alla membrana di VP5, la proteina stessa è ritenuta all’interno dell’endosoma e solo il core trascrizionalmente attivo è liberato nel citoplasma ad iniziare la trascrizione e la successiva sintesi delle proteine virali (Forzan et al., 2004; Forzan et al., 2007; Roy, 2008b).
1.4.2 Trascrizione
Il core virale è un complesso multi-enzimatico composto da due proteine maggiori (VP7 e VP3) e dalle tre proteine minori enzimaticamente attive (VP1, VP4, VP6), con l’aggiunta dei dieci segmenti di dsRNA (Roy, 1995; Roy, 2008a)
Il genoma di EHDV rimane dentro il core e solo gli mRNA sintetizzati ex novo vengono rilasciati dal core parentale e sono utilizzati come templato sul quale sarà formato l’RNA genomico a doppio filamento, a partire dal quale, verranno tradotte le proteine virali. È importante dire che, oltre a essere trascrizionalmente attivo, il core generato in vitro tramite trattamento proteolitico atto ad eliminare VP2 e VP5 mantiene il potere infettante per l’insetto vettore e le linee cellulari da esso derivate, indicando che esso può anche mediare l’attacco alle cellule e la penetrazione del virus (Mertens et al., 2008).
La trascrizione avviene quindi dentro il core virale integro, dove gli enzimi virali trascrivono i dieci segmenti del genoma producendo copie di mRNA multiple non poliadenilate di ogni segmento. Gli mRNA, dotati di cap al 5’ e metilati, vengono in seguito tradotti in proteine virali nel citoplasma delle cellule infette.
1.4.3 Assemblaggio del virus
Le proteine neoformate nel citoplasma interagiscono con l’mRNA virale sequestrato nei corpi inclusi citoplasmatici per formare le nuove particelle virali.
I corpi inclusi sono costituiti prevalentemente dalla NS2, sintetizzata abbondantemente e responsabile del reclutamento delle proteine del core e dei trascritti di nuova sintesi. Si pensa che i corpi inclusi siano anche la sede deputata all’incapsidamento del genoma ed all’assemblaggio del core.
Tuttavia le proteine del capside esterno, VP2 e VP5 non sono reclutate dall’NS2 ed il loro assemblaggio non sembra quindi avvenire all’interno dei corpi inclusi citoplasmatici (Roy, 2017).
1.4.4 Liberazione del virus dalla cellula
Le conoscenze sul meccanismo di rilascio del virus dalla cellula sono attualmente incomplete e riguardano prevalentemente BTV. L’analisi tramite microscopia elettronica della membrana cellullare di cellule infette rivela che i virioni sono rilasciati sia attraverso un processo di budding, come particelle provviste di un rivestimento envelope-simile che verrà perso rapidamente data la sua instabilità, sia come particelle nude attraverso una “estrusione” dalla membrana cellulare (Hyatt et al., 1989; Roy, 2008b).
Il processo di estrusione avviene in punti localizzati sulla membrana cellulare e sembra non avere effetti sulla vitalità delle cellule. Negli stessi punti inoltre, è stata osservata una grande concentrazione della proteina NS3 e questo fa pensare ad un suo ruolo nel processo.
Le particelle virali rilasciate e quelle che rimangono sulla superficie cellullare, anche dopo l’uscita, mantengono un’associazione con il citoscheletro della cellula (Roy, 2007).
1.5 Epidemiologia
EHDV, analogamente a BTV, è un Arbovirus trasmesso principalmente da insetti vettori ematofagi appartenenti al genere Culicoides, i quali rappresentano i vettori biologici del virus (Savini et al., 2011). Si presuppone quindi che le caratteristiche epidemiologiche dell'infezione da EHDV rispecchino quelle da BTV (Madani et al., 2001; Savini et al., 2011).
Le epidemie di EHD si manifestano tipicamente tra tarda estate ed inizio autunno. In natura la persistenza del virus dipende da diversi fattori: in climi che permettono la sopravvivenza del vettore per tutto l’anno, il virus può resistere mediante cicli di trasmissione che coinvolgono ospiti vertebrati e vettori; invece, nei climi dove il vettore ha sopravvivenza limitata ad alcuni mesi, si pensa che questo possa essere re-introdotto nelle stagioni successive attraverso la movimentazione di animali e/o vettori infetti. In aggiunta a ciò, il virus potrebbe persistere durante la stagione invernale (over-wintering) per una bassa e non rilevata attività dei culicoidi oppure in animali a lunga viremia ed in feti in via di sviluppo (Stott, 2004).
1.5.1 Gli ospiti suscettibili
EHDV è in grado di infettare varie specie di ruminanti selvatici e domestici, anche se storicamente è stato associato alla malattia in cervidi selvatici, in particolare nei cervi a coda bianca (Odocoileus virginianus) del nord America, ma risultano suscettibili anche cervo mulo, antilope, cervo a coda nera e cervo nobile.
Sono stati osservati anche gravi segni clinici in bovini infettati dal ceppo Ibaraki (EHDV-2) (Omori et al., 1969) e dai sierotipi 6 e 7 (Temizel et al., 2009; Yadin et al., 2008).
Anche le pecore europee sono state ritenute suscettibili d’infezione da EHDV ma, sebbene presentino viremia, l'infezione in queste rimane sub-clinica (Tomori, 1980; Thompson et al.,1988).
Il ruolo delle capre come ospite di EHDV è incerto. Anticorpi anti-EHDV sono stati rilevati mediante test AGID in capre provenienti da regioni in cui si erano verificati dei focolai di EHDV e questo quindi fa ipotizzare nella possibilità che queste, come le pecore, sviluppino una viremia di basso livello (Al-Busaidy e Mellor, 1991). Infatti, in uno studio effettuato in Indonesia, usando la siero-neutralizzazione, solo 1 su 88 capre ha mostrato anticorpi contro EHDV-5. Pertanto occorre fare ulteriori studi per chiarire il ruolo delle capre come ospite di EHDV (Gibbs e Lawman, 1977).
I maiali non sono suscettibili all'infezione da EHDV (Gibbs e Lawman, 1977) e poco si sa sulla suscettibilità dei cani. In un'indagine sierologica condotta in una zona con un'alta prevalenza di EHDV in cervi a coda bianca, non sono stati rilevati cani positivi a EHDV (Howerth et al., 1995). C'è ancora una notevole mancanza di informazioni circa la suscettibilità all'infezione da EHDV e il ruolo epidemiologico di molte specie di ruminanti sia domestiche che selvatiche.
La conoscenza attuale sulle specie sensibili a EHDV è riassunto nella seguente tabella 3.
Specie animali sensibili infezione Tipo di Sierotipo Bibliografico Riferimento
Bovino (Bos Taurus)
Naturale 2
House et al. (1998); Dulac et al.(1989); Pasick et al. (2001) Naturale 2 (Ibaraki) Omori et al. (1969); Ohashi et al. (1999) Naturale 6 Temizel et al. (2009) Naturale 7 Yadin et al. (2008) Naturale 5 Sendow et al. (1991) Naturale 2, 5, 7, 8 Gard et al (1989) Naturale 1 Weir et al. (1997) Cervo a coda Bianca (Odocoileus
virginianus)
Naturale 2 Gaydos et al. (2004) Naturale 1 Murphy et al. (2006) Naturale 6 Allison et al. (2010) Antilope (Antilocapra Americana) Naturale sconosciuto Dubay et al. (2006); Dunbar et al. (1999) Cervo mulo (Odocoileus hemionus) Naturale 1 Dubay et al. (2004)
Naturale 2 Noon et al. (2002a) Orice d'Arabia (Oryx leucoryx) Naturale sconosciuto Frolich et al. (2005) Mazama (Mazama gouazoubira) Naturale sconosciuto Deem et al. (2004) Pecora delle Montagne Rocciose
(Ovis canadensis canadensis) Naturale 2 Noon et al. (2002b) Orso nero
(Ursus americanus floridanus) Naturale sconosciuto Dunbar et al. (1998) Cervo nobile (Cervus elaphus)
Sperimentale 1 Gibbs e Lawman (1977) Daino (Dama dama)
Capriolo (Capreolus capreolus) Muntjacus (Muntiacus muntjac) Pecora (Ovis aries)
Capra (Capra hircus) Naturale 2 e 6 Al-Busaidy e Mellor (1991) 1 e 2 Nol et al. (2010)
Rinoceronte nero (Diceros bicornis) Naturale Fischer-Tenhagen et al. (2000) Rinoceronte bianco
(Ceratotherium simum) Naturale Fischer-Tenhagen et al. (2000) Gazzella subgutturosa
(Gazella subgutturosa) Naturale sconosciuto Albayrak et al. (2010) Bisonte Americano (Bison bison) Naturale 1e 2 Nol et al. (2010) Wapiti (Cervus elaphus Canadensis) Naturale 1e 2 Nol et al. (2010) Tab.3. Specie suscettibili a EHDV (EFSA, 2009).
1.5.2 Patogenesi
La patogenesi di EHDV è simile a quella di BTV, che è stata ampiamente studiata e approfonditamente esaminata da Mclaughlin (Mclaughlin et al., 2003). In seguito all’infezione, il virus inizialmente replica nelle cellule endoteliali delle pareti dei vasi linfatici e sanguigni che drenano il sito dell'infezione (Sohn e Yuill, 1991). EHDV viene quindi disseminato, tramite il circolo sanguigno, nei siti secondari di replicazione, quali altri linfonodi e la milza.
Nel sangue il virus è associato ai linfociti e in particolare ai globuli rossi dove è presente in titoli più alti per un lungo periodo di tempo (Gibbs e Lawman, 1977, Aradaib et al., 1997). Studi in vitro hanno dimostrato che la replicazione di EHDV potrebbe essere di tipo monocita-dipendente (Stallknecht et al., 1997).
Come per gli altri virus trasmessi da vettori, la durata della viremia rappresenta un elemento chiave per la diffusione dell’infezione, pertanto è stata studiata sia in cervi che in bovini tramite infezioni naturali o indotte sperimentalmente. Anche se in alcuni casi è stato possibile isolare EHDV dagli animali per più di 50 giorni, di solito il virus infettivo non poteva essere rilevato oltre 3 settimane dall'infezione (Gaydos et al., 2002 a,b; Quist et al., 1997). Di 11 cervi a coda bianca, sperimentalmente infettati da EHDV-2, 5 erano viremici al giorno 2 post-infezione (p.i.), dal 4° giorno tutti gli animali erano viremici, ma la viremia ha raggiunto il picco al 6° giorno con titoli superiori a 104,9 TCID50/ml di sangue. Due cervi erano ancora viremici al giorno 59, anche se con un titolo molto basso (<102,3 TCID50/ml). I segni clinici sono stati osservati tra i giorni 6 e 14, ma non sono stati riportati decessi (Gaydos et al., 2002b).
In un altro studio sperimentale che ha utilizzato EHDV-2, la viremia è stata rilevata in 3 di 16 cervi inoculati al 2° giorno p.i., e tutti gli animali erano viremici dal 4° giorno p.i. Il picco di viremia si è verificato tra il 4° e il 10° giorno post-infezione. Due cervi sono rimasti viremici fino al 56° giorno p.i., quando lo studio è stato concluso (Quist et al., 1997).
L’infezione con un determinato sierotipo di EHDV conferisce protezione solamente nei confronti dello stesso sierotipo, non fornendo quindi nessuna cross-protezione verso gli altri sierotipi esistenti di EHDV (Savini et al., 2011). Inoltre è accertato che l’infezione con EHDV non conferisce cross-protezione nei confronti di BTV e viceversa (Quist et al., 1997). Nel 1960 infatti morbilità e mortalità provocate dal virus Ibaraki, furono molto inferiori rispetto a quelle registrate nei focolai che si erano verificati
l'anno precedente poiché la maggior parte dei bovini presentava anticorpi contro il virus (Omori et al., 1969). La durata della protezione da infezione non è ancora stata determinata, ma dalle osservazioni fatte in corso di infezioni naturali, si pensa che possa persistere per tutta la vita dell’animale (Stallknecht et al., 1991).
EHDV è un virus trasmesso mediante vettori, tuttavia nei cervi a coda bianca è stata riportata una trasmissione del virus anche per via orizzontale (orale e fecale) (Gaydos et al., 2002a), ma non è possibile accertare come siano rilevanti epidemiologicamente questi altri percorsi di infezione.
La trasmissione transplacentare è stata dimostrata con l'isolamento di EHDV-2 (Ibaraki) da organi interni di feti abortiti (Ohashi, 1999).
L'isolamento di BTV dallo sperma è stato segnalato (Howard et al., 1985), anche se la presenza del virus nel seme sembra essere un evento raro (Melville et al., 1996). Non sono stati trovati segnalazioni sull'isolamento di EHDV nel seme, infatti l’infezione sperimentale di pecore tramite inoculazione con sperma da tori infetti da EHDV-2, 5 e 7 non ha portato ad infezione, tuttavia la sperimentazione è stata inconcludente poiché il virus è stato isolato solo dal sangue e non dal seme (Gard et al.,1989).
1.5.3 I vettori
EHDV, come BTV, viene trasmesso tra i suoi ospiti ruminanti attraverso la puntura di insetti ematofagi appartenenti al genere Culicoides.
I dati disponibili suggeriscono che le specie di Culicoides che trasmettono EHDV possano essere simili a quelle di BTV, ma non necessariamente le stesse. Di conseguenza, le interazioni virus-vettore, i siti di riproduzione vettoriale, la tassonomia, l’ecologia, la stagionalità e il controllo (Carpenter et al., 2008), e l'effetto delle variabili climatiche sui vettori è probabile che siano gli stessi (EFSA, 2007a; EFSA, 2008). Tuttavia, i livelli di competenza che le singole specie e popolazioni di vettori esprimono per EHDV, intesa come capacità di trasporto e trasmissione del virus, possono essere diverse a quelle di BTV.
È anche probabile che i precisi requisiti di temperatura per la replicazione di EHDV nei vettori e i gradi relativi alla temperatura necessari affinché l’infezione sia trasmissibile nei vettori possano essere anche diversi da quelli di BTV. Tali differenze possono costituire la base delle differenze occasionali osservate nelle distribuzioni regionali e globali in atto tra EHDV e BTV, in particolare in Europa e nord America.
1.5.3.1 Tassonomia e biologia dei Culicoides
I Culicoides sono piccoli moscerini di tipo pungente-succhiante appartenenti alla famiglia Ceratopogonidae, la quale contiene circa 125 generi con all’interno più o meno 5500 specie.
Di questi generi, 4 sono noti per contenere specie che succhiano il sangue dei vertebrati: Austroconops, Culicoides, Forcipomyia subgenere Lasiohelea e Leptoconops. I Culicoides sono facilmente differenziati da questi altri tramite la caratteristica ala. Più di 1400 specie di Culicoides sono conosciute in tutto il mondo, delle quali circa il 96% sono obbligatoriamente ematofagi del sangue dei mammiferi (compresi gli esseri umani) e degli uccelli.
Il ciclo biologico dei Culicoides (Fig. 5) è costituito da 4 stadi larvali, lo stadio di pupa e quello di adulto.
Dopo il pasto di sangue, le uova maturano all’interno della femmina in un tempo variabile, dipendente dalla temperatura: a 27 °C la maturazione avviene in due giorni, ma può avvenire anche in tre o quattro giorni se la temperatura scende a 22 °C. Il loro numero è variabile a seconda della specie (C. imicola, per esempio, ne depone 162). Le uova sono molto resistenti alle condizioni ambientali, pertanto possono sopravvivere fino a due mesi a temperature minori di 6 °C e in zone in cui il clima è temperato possono resistere anche tutto l’inverno, ma di solito schiudono tra i 2 e i 7 giorni (Blanton e Wirth, 1979; Meiswinkel et al., 1994). I successivi 4 stadi larvali si differenziano soltanto nelle dimensioni, che aumentano passando da uno stadio all’altro. Le larve dei Culicoides misurano da 0,5 mm (L1) a 2 cm (L4). Il passaggio allo stato di pupa si ha solitamente in un periodo variabile da 10 a 30 giorni, in relazione alla temperatura ambientale e alla quantità di nutrienti presenti nell’ambiente, variando da una settimana nelle specie tropicali a circa due anni in alcune specie artiche. Le pupe, che rimangono in questo stadio da 2 giorni fino a quattro settimane, sono lunghe 2-4 mm e hanno un paio di antenne protoraciche con numerosi spiracoli che servono per la respirazione. Non necessitano di nutrimento e nella maggior parte delle specie compiono movimenti molto limitati (Meiswinkel et al., 1994).
La vita media degli adulti è di circa 20 giorni (Purse et al., 2015) ed eccezionalmente fino a 90-100 giorni (Mellor et al., 2000; Goffredo et al., 2016). I maschi si nutrono esclusivamente di liquidi zuccherini come quelli presenti nel
nettare dei vegetali, mentre le femmine si nutrono principalmente di sangue, anche se possono nutrirsi anch’esse di nettare (EFSA, 2007a). In condizioni di elevata temperatura e bassa umidità i Culicoides hanno sopravvivenza ridotta; soltanto pochi esemplari raggiungono lo stadio adulto e sono quindi in grado di trasmettere l’infezione virale.
La maggior parte dei Culicoides adulti sono crepuscolari, e il picco dell’attività di conseguenza è dal tramonto all’alba, ma anche in misura minore durante la notte (Mellor et al., 2000). Dopo periodi di precipitazioni, la sopravvivenza in ogni caso subisce un incremento notevole.
Inoltre anche il vento influisce sulla sopravvivenza (Mellor et al., 2000). Sebbene il range di volo dei Culicoides di solito è breve e la maggior parte delle specie si disperdono solo entro poche centinaia di metri dai loro siti di riproduzione (Kettle, 1984) o al massimo a 2-3 km (Lillie et al., 1981), sono in grado di essere dispersi passivamente a centinaia di chilometri di distanza, tramite i venti, a distanze molto maggiori (Hayashi et al., 1979; Bishop et al., 2000).
Gli adulti si infettano ingerendo sangue di animali viremici, il virus replica nelle ghiandole salivari e l’insetto rimane infetto per tutto il resto della vita, ma non è in grado di trasmettere il virus verticalmente alla progenie (Purse et al., 2015). Questo però non sempre avviene, in quanto è necessario che il virus riesca a superare le barriere difensive dell’insetto e quindi replicare nelle sue ghiandole salivari per poter essere trasmesso (Fu et al., 1999).
La presenza maggiore della malattia si rileva alla fine della stagione estiva, per poi scomparire con il sopraggiungere dei primi freddi, quando la temperatura delle ore crepuscolari scende al di sotto dei 12 °C. Infatti nelle regioni tropicali questi insetti rimangono attivi per tutto l’anno mentre nelle regioni a clima temperato lo sono soltanto durante la stagione estiva e in autunno per poi cessare la diffusione del virus con i premi freddi.
Fig.5. Il ciclo di vita dei Culicoides (Purse et al., 2005).
1.5.3.2 Distribuzione geografica dei Culicoides
Le specie di Culicoides coinvolte nella trasmissione di EHDV hanno una differente distribuzione geografica, tra queste le più importanti sono riportate in figura 6 (Stott, 2004).
Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) sono 4 i criteri da prendere in considerazione per etichettare un artropode come vettore competente di un Arbovirus:
1) isolare il virus da insetti con addome privo di sangue fresco;
2) dimostrare in laboratorio che l'insetto può infettarsi mediante un pasto di sangue infetto;
3) dimostrare in laboratorio che l'insetto infetto è in grado di trasmettere il virus ad un ospite vertebrato suscettibile tramite la sua puntura;
4) dimostrare che l'insetto può venire a contatto con ospiti suscettibili in condizioni naturali (WHO, 1967).
Delle specie vettore di EHDV identificate e sospettate solo C. sonorensis, diffuso in nord America, soddisfa i quattro criteri definiti dall'OMS, mentre le altre specie solo una parte.
C. imicola è una specie afro-asiatica, ma si è affermata in tutta l'Europa meridionale ed è ormai diffusa in Portogallo, Spagna, Baleari, Francia continentale del sud, Corsica, Italia ed isole (Sardegna, Sicilia), Grecia continentale e diverse isole greche adiacenti alla Turchia (Mellor et al., 2008).
C. obsoletus e C. punctatus sono specie paleartiche settentrionali appartenenti ai complessi Obsoletus e Pulicaris. Queste specie sono diffuse in gran parte del nord e del centro Europa (Mellor et al., 2008; Purse et al., 2005).
C. schultzei è diffuso in Africa e in Medio Oriente, ma in Europa è stato registrato a sud della Grecia continentale (Mellor et al., 2008).
Fig. 6. Distribuzione geografica delle principali specie di Culicoides coinvolte nella trasmissione di EHDV.
1.5.3.3 Stagionalità vettoriale
Nelle malattie trasmesse da vettore, i picchi dei focolai generalmente coincidono con il picco di abbondanza della popolazione vettoriale (Mellor et al., 2000; Purse et al., 2005; Yonguc et al., 1982; Mellor e Boorman, 1995; Mellor, 1994).
Per la Bluetongue questo non è sempre vero, infatti in nord Europa, dove l'infezione è trasmessa da specie del complesso C. obsoletus, C. dewulfi, C. chiopterus ed eventualmente da specie del complesso C. pulicaris, il cui picco di popolazione si verifica tra la fine della primavera e l'inizio dell’estate (Birley e Boorman, 1982; Takken et al., 2008; Fassotte et al., 2008), la maggior parte dei casi di BTV si verificano alla fine dell'estate e l’inizio dell'autunno. Ciò potrebbe essere una conseguenza delle basse temperature che si verificano in queste
