Consideriamo il moto laminare, assialsimmetrico e stazionario di un fluido attraverso un tubo di sezione circolare costante e di raggio R. Data la geometria del problema, è conveniente utilizzare le coordinate cilindriche(r, ϑ, z). Assu- miamo che vr = vϑ =0, l’unica componente non nulla nel campo di velocità e
quella in direzione z, vz.
Nell’applicare la teoria di Navier e Stokes il fluido è stato assunto newtoniano e assimilabile ad un continuo deformabile e il vaso come materiale elastico i cui campi di sforzi e deformazioni sono descritti con la teoria di Saint Venant - Kirchhoff.
É necessario scrivere le condizioni si continuità in coordinate cilindriche: per quando detto finora e per le assunzioni geometriche del problema le derivate parziali del vettore velocità vznelle direzioni delle coordinate cilindriche sono
nulle. Questo significa che la velocità dipende solo dal raggio. Lungo r l’equazione risultante è la seguente:
ρ ∂vr ∂t +vr ∂vr ∂ + vϑ r ∂vr ∂ϑ − v2ϑ r +vz ∂vr ∂z ! = −∂P ∂r +ρgr+ +µ 1 r ∂ ∂r r∂vr ∂r − v 2 r r + 1 r2 ∂2vr ∂ϑ2 − 2 r2 ∂vϑ ∂ϑ + ∂2vr ∂z2
2.2
Fondamenti sperimentali
Il modello computazionale da noi sviluppato si basa principalmente su alcuni studi svolti nel Dipartimento di Scienze Morfologiche e Chirurgiche dell’Università degli Studi dell’Insubria di Varese. In questo ateneo già da diversi anni si svolgono ricerche riguardo alla fisiologia e al funzionamento del sistema linfatico: in particolare vengono analizzati i vasi presenti nella membrana diaframmatica il cui movimento e regolazione sono influenzati dalla meccanica ventilatoria. In questo tessuto si posso identificare due popolazioni di vasi morfologicamente e fisiologicamente diversi: vasi rettilinei che fungono da collegamento tra le varie
2.2. Fondamenti sperimentali 20
aree e i vasi con loop che hanno dimensioni e variabilità intrinseca inferiori, e si trovano solo in determinate aree (figura2.3).
Figura 2.3:Immagine di un loop linfatico nel diaframma murino [19].
Tutti gli esperimenti sono stati svolti utilizzando cavie animali, in particolare ratti, in accordo con le linee guida dell’Animal Care and Use Committee of the Ministry of University and Research. Le cavie sono state anestetizzate e tramite tracheotomia è stato possibile inserire le cannule e gli accessi per la ventilazione meccanica e il collegamento con lo pneumotacografo. Il tidal volume e la fre- quenza respiratoria sono stati imposti automaticamente dalla macchina per la ventilazione sulla base del peso corporeo dell’animale mentre lo pneumotacogra- fo è collegato ad un amplificatore che permettesse di registrare in modo continuo i parametri respiratori.
Per visualizzare i vasi linfatici diaframmatici si utilizza un’iniezione intraperi- toneale di destrani fluorescenti (FITC; molecular weight 70,000 Da, Sigma Co. St. Louis, MO) che permettono una migliore identificazione. Inoltre, durante l’esperimento, il diaframma viene bagnato con soluzione salina per mantenere l’idratazione. Tutte le fasi vengono rilevate tramite tecniche di imaging, e utiliz- zando uno stereomicroscopio, dall’analisi di queste ultime è possibile stimare lo spessore del vaso e la velocità del fluido [20]. Il flusso rilevato non presenta sostanziali differenze tra i vasi lineari e i loop, nonostante i valori di velocità siano molto dispersi l’andamento di questo parametro decresce in maniera esponen-
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ziale all’aumentare del diametro. La cinetica dei loop, tuttavia, è molto diversa da quella dei vasi lineari: essa è infatti antioraria e la sua configurazione porta a pensare che siano presenti delle valvole secondarie che ne regolano il flusso; dalle seguenti considerazioni sembra che i loop fungano da riserva e successivamente riversino il liquido ai vasi rettilinei. Il liquido è raccolto durante l’espirazione, quando il tono del diaframma è inferiore, ed è poi spinto nei vasi lineari durante la fase d’inspirazione, quando le fibre muscolari si contraggono e favoriscono la spinta nel fluido.
I vasi linfatici del diaframma possono essere orientati in modo parallelo o per- pendicolare alle fibre muscolari e si riversano nei circoli. Le contrazioni della muscolatura liscia dei vasi sono quasi sempre assenti nei vasi lineari e nei loop di questa zona. Una caratteristica importante di questi vasi sono le interconnes- sioni con la membrana diaframmatica e con i tessuti muscolari circostanti, questi filamenti non solo prevengono il collasso del vaso ma trasmettono anche le con- trazioni muscolari ai vasi aiutando il movimento propulsivo del vaso influendo in modo significativo sulla pressione interna.
In uno studio successivo, effettuato dallo stesso gruppo di ricercatori precedente- mente citato, si valuta la variazione della geometria del vaso linfatico in base alle contrazioni esterne misurate nel tessuto vivo, facendo riferimento a vasi sia in direzione longitudinale che trasversale rispetto alle fibre muscolari [19].
Utilizzando la stessa procedura di preparazione dell’animale dell’esperimento precedente, si valuta la meccanica dei vasi; per semplicità non si analizzano i loop ma solo i tratti rettilinei. Per completezza è stato deciso di distinguere i vasi, oltre che sulla base dell’orientazione rispetto alla fibre muscolari, anche in base alla profondità in cui si posizionano:
• i vasi profondi decorrono sotto almeno uno strato di fibre muscolari; • i vasi superficiali decorrono sotto il mesotelio e quindi sopra le fibre
muscolari.
La lunghezza del vaso e la variazione di diametro sono state misurate a riposo, durante la contrazione massima ed al termine di essa; la contrazione
2.2. Fondamenti sperimentali 22
muscolare è indotta tramite iniezioni di KCl in due zone: una prossimale e una distale dalla fibra considerata (300 - 900 µm). Le variazioni di diametro sono state calcolate osservando la distanza tra due punti che possono essere identificati come appartenenti a due fibre muscolari parallele. Si è inoltre osservato che i vasi paralleli alle fibre sono di lunghezza maggiore e non presentano valvole mentre quelli trasversali sono più corti e con un diametro più ampio. Sia per quanto riguarda i vasi perpendicolari che quelli paralleli alle fibre muscolari il vaso non ritorna subito al valore di riposo a fine contrazione. Per la misura della pressione si utilizzano delle micropipette posizionate all’interno del vaso.
Figura 2.4:Valori di pressione interna media nei diversi vasi.
Dall’esperimento si evince che con iniezioni a una distanza inferiore ai 300
µm si ha una diminuzione della pressione interna al vaso di 11.3±3.1cmH2O
e di 22.5±2.6cmH2O nei vasi perpendicolari e paralleli alle fibre muscolari
rispettivamente. Per quanto riguarda i vasi profondi, invece, la risposta dipende dall’orientazione delle fibre, in quanto la pressione interna decresce di circa 10.5±5cmH2O se sono paralleli, mentre aumenta dello stesso valore se sono
perpendicolari. [19]
È interessante studiare in che modo la contrazione del diaframma in vivo influisce sulla circolazione linfatica ed è necessario capire se le variazioni di pressione
2.2. Fondamenti sperimentali 23
interna al vaso siano dovute all’attività estrinseca o intrinseca di quest’ultimo. Si è potuto osservare che il meccanismo estrinseco è responsabile di circa il 60 % del drenaggio di liquido rispetto al meccanismo intrinseco.
A conferma di questa affermazione, è stato effettuato un ulteriore studio nel quale si valuta il flusso del sistema linfatico nella pleura, prima in vivo durante contrazione isotonica intrinseca ed estrinseca e successivamente analizzando il comportamento del tessuto isolato.
Lo scopo di questo studio è capire in che modo i due meccanismi interagiscano tra di loro, si osserva, tramite microscopio e l’ausilio di microsfere, il movimento del flusso nei vasi e contemporaneamente si riproduce la contrazione dei tessuti muscolari circostanti. In particolare si valuta:
• come varia il flusso supportato da contrazioni spontanee dei muscoli lisci della parete del vaso oppure da stress locale del tessuto;
• l’interazione di questi due meccanismi e quale sia più efficacie per il trasporto di liquido nel diaframma.
Questo esperimento si contraddistingue dagli altri per il fatto che si studia il comportamento meccanico di campioni di diaframma isolati. Dopo un periodo di precondizionamento, è stato iniettato un bolo di particelle fluorescenti e il moto è stato ripreso con una telecamera; dopodiché la contrazione delle fibre muscolari striate è stata ottenuta tramite stimolazione elettrica volta a ottenere la massima contrazione isotonica. La stimolazione è trasmessa tramite un elettrodo di platino collegato ad un generatore comandato da un computer che permette di misurare la deformazione delle fibre muscolari.
Durante l’analisi dei risultati si è cercato di distinguere tra il contributo dato dalla contrazione intrinseca dei muscoli lisci del vaso e la contrazione estrinseca delle fibre muscolari scheletriche. Quando il vaso si contrae spontaneamente le micro- sfere avanzano ma permane un consistente retroflusso che rende l’avanzamento netto di poche decine di µm, invece quando viene stimolata la contrazione estrin- seca le microsfere sono spinte in avanti con una velocità maggiore, nonostante questo repentino aumento di velocità il numero di Reynolds rimane entro i limiti