Studi sperimentali

Tramite metodi di studio sempre più avanzati e precisi si possono realizzare modelli e analizzare funzioni sempre più nel dettaglio. In particolare si è potuto

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osservare che i vasi linfatici hanno dei sistemi particolari per adattarsi e rispon- dere ai diversi stimoli meccanici a cui sono sottoposti.

Come già accennato, tramite marcatori fluorescenti si riesce a misurare e a trac- ciare il movimento dei liquidi e questo permette, inoltre, di studiare le proprietà dell’interstizio e le variazioni del liquido linfatico, su modelli murini, in diverse situazioni sia fisiologiche che patologiche.

I modelli a fluorescenza sono utili però solo per flussi scarsi e per variazioni poco rapide. Sono state sviluppate tecniche di imaging che permettono di registrare anche le rapide contrazioni dei linfatici collettori. Inoltre, tramite le colture cellu- lari è possibile creare dei modelli fisiologici utili per lo studio del tessuto in vivo e di singoli vasi.

Al fine di isolare i vasi linfatici di ratto bisogna mettere in pratica un determi- nato protocollo chirirgico, ma ciò nonostante è difficile riprodurre le situazioni patologiche umane utilizzando l’animale poichè le dimensioni ridotte fanno sì che la situazione simulata sia meno grave rispetto a quelle riscontrabili nel corpo umano. [26]

Il meccanismo di riempimento iniziale del vaso linfatico e il ruolo del movi- mento del tessuto cardiogeno nel promuovere la formazione e la propulsione della linfa sono attualmente ancora questioni controverse, in particolare se si considerano tessuti interstiziali in cui la pressione del fluido è ben al di sotto atmosferica. Per chiarire questi aspetti, tramite la tecnica della micropuntura si sono registrate, contemporaneamente, nel plesso linfatico diaframmatico che dre- na la cavità pleurica, la pressione interstiziale (Pint) e la pressione endolinfatica

(Plymph): infatti un’importante fonte di compressione e rilassamento del vaso è

rappresentata dallo spostamento del tessuto relativo all’attività respiratoria e cardiaca [25]. Lo studio sperimentale è stato svolto su quattro conigli adulti (peso corporeo 2,6±0,085 kg) e otto ratti (peso corporeo 367,5±4,8 g) di entrambi i sessi. Entrambi gli animali sono stati anestetizzati con una soluzione salina e successivamente durante l’esperimento venivano aggiunti boli anestetici che con- trollano il livello di anestesia sulla base dei riflessi corneali. Le cavie sono state poste in posizione supina, tracheotomizzate e lasciate respirare spontaneamente

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tramite una cannula endotracheale.

Le pressioni arteriosa e venosa sistemiche sono state monitorate durante l’espe- rimento tramite l’inserimento di una cannula nell’arteria carotidea e della vena giugulare.

La pelle e i muscoli intercostali esterni sono stati rimossi dal lato destro del torace per esperre le nervature e i muscoli intercostali interni. Per identificare la rete linfatica diaframmatica in vivo è stata utilizzata, tramite una cannula di acciaio, una soluzione fisiologica contenente destrani fluorescenti iniettata sia nella cavità pleurica che peritoneale (FITC, peso molecolare 70000 Da, Sigma Co. St. Louis, MO). Illuminando il campo con una lampada a mercurio a fluorescenza (HBO 50 W) i dotti linfatici sono stati rilevati con uno stereomicroscopio. L’immagine è stata poi catturata tramite un sistema a microscopio e una videocamera digitale, elaborata, digitalizzata e visualizzata [25].

Tramite micropuntura sono state rilevate contemporaneamente la pressione nel lume del vaso linfatico (Plymph) e nell’adiacente spazio interstiziale (Pint). Ogni

micropipetta prima dell’utilizzo viene calibrata. La misurazione di pressione tramite micropuntura, però, può causare due problemi principali:

• una volta che la micropipetta è stata inserita nel tessuto non vi è alcuna certezza sul posizionamento della punta: infatti l’iniezione può andare a disturbare la pressione idraulica transmurale e la pressione linfatica invalidando la pressione di lettura;

• la lettura della pressione potrebbe essere influenzata da possibili distorsioni di quest’ultima contro la parete del vaso.

Le pipette vengono quindi inserite lungo il proprio asse principale per evitare distorsioni contro la parete del vaso, ad una profondità di 20-30 µm. Inoltre, per evitare la rottura delle punte i movimenti del tessuto sono stati ridotti interrom- pendo la ventilazione e lasciando il polmone parzialmente espanso. Plymphe Pint

sono state rilevate contemporaneamente. Sono state ottenute sei coppie per un totale di 12 registrazioni.

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fuori fase. Si è ottenuto che la Plymphvaria da -4,1±0,9 mmHg a 3,5±1,1 mmHg

nei conigli e tra -0,6±0,8 mmHg e 0,9±0,7 mmHg nei topi. [25] I dati hanno rilevato una grande complessità funzionale della rete diaframmatica linfatica e suggeriscono che le oscillazioni causate dal muscolo cardiaco possono svolgere un ruolo importante per la formazione della linfa e per la propulsione della stessa ai tessuti interstiziali con pressione del tessuto subatmosferica.

Figura 2.6:Micropuntura durante respiro spontaneo in un ratto [25].

Uno studio sperimentale simile è stato condotto per studiare il ruolo svolto dalla sollecitazione meccanica dei tessuti nel sostenere la formazione e la propul- sione della linfa [18]. Lo scopo è quello di misurare la pressione idraulica dei linfatici che drenano i tessuti toracici (Plymph) e dello spazio interstiziale adiacente

(Pint) sia durante respiro spontaneo che durante ventilazione meccanica. Si è

valutato, quindi, il ruolo della tensione e/o compressione del tessuto durante espansione attiva e passiva del petto sulla base dei gradienti di pressione durante l’intero ciclo respiratorio. L’esperimento è stato svolto su 13 ratti maschi adulti (peso corporeo 317±10 g) e con un procedimento simile a quello descritto nel- l’esperienza precedente sono stati anestetizzati. Le pressioni sistemica arteriosa, venosa e esofagea sono state monitorate durante l’esperimento convertendo il segnale di pressione in un condizionatore di segnale che viene poi digitalizzato e visualizzato. L’animale viene sempre trattato con destrani fluorescenti FITC che permette di individuare più facilmente i vasi linfatici. Durante la respirazione spontanea, a fine espirazione Plymph e la corrispondente Pint risultano rispetti-

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vamente -2.5±1.1 mmHg e 3.1 ±0.7 mmHg; questi valori scendono a -21,1±

1.3 mmHg e -12.2±1.3 mmHg, rispettivamente, a fine inspirazione. Durante la ventilazione meccanica con aria a pressione alveolare a fine espirazione, Plymphe

Pint rimangono sostanzialmente invariate a fine espirazione, ma, in contrasto con

la respirazione spontanea, aumentano a fine ispirazione fino a 28,1±7,9 e 28,2

±6,3 mmHg, rispettivamente. Il gradiente di pressione transmurale idraulica (Plymph−Pint) è a favore della formazione della linfa durante l’intero ciclo respi-

ratorio della respirazione spontanea, ma non durante la ventilazione meccanica [18]. Pertanto, i dati suggeriscono che lo stress tissutale locale associato alla con- trazione attiva dei muscoli respiratori è necessario per supportare un drenaggio linfatico efficace dai tessuti toracici.

Per quanto riguarda invece lo studio delle valvole linfatiche bisogna tenere conto che sono essenziali per ridurre al minimo il riflusso della linfa e si pre- sume che si aprano e chiudano passivamente secondo il gradiente di pressione istantanea transvalvolare. É stato quindi effettuato uno studio che ipotizza che la valvola sia anche modulata dalla distensione del vaso, che potrebbero alterare la rigidità dei lembi [7]. Per verificare questa ipotesi, sono stati ideati protocolli per misurare i piccoli gradienti di pressione necessari per aprire o chiudere le valvole linfatiche e determinare se essi variano in funzione del diametro del vaso. I vasi linfatici sono stati isolati dal mesentere di ratto, cannulati, e pressuriz- zati utilizzando un sistema di servocomando. Il rilevamento di posizione del lembo della valvola è stato effettuato contemporaneamente al rilevamento dei cambiamenti di diametro e pressione endoluminale nei segmenti di vaso con due valvole; questo permette di rivelare i rapporti temporali tra questi parametri durante il ciclo di contrazione linfatico.

I tempi di movimento valvolare sono simili a quello delle valvole cardiache, ma solo quando il postcarico del vaso linfatico è elevato. I gradienti di pressione richiesti per aprire o chiudere una valvola sono stati determinati in segmenti con una sola valvola durante un lento aumento della pressione, sia dal lato di ingresso o uscita della valvola. Le prove sono state condotte su una vasta gamma di pressioni di base (e quindi diametri) in vasi passivi nonché a vasi con due

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livelli di tono imposto.

Sorprendentemente, il gradiente di pressione necessario per la chiusura della valvola varia circa 20 volte (0,1-2,2 cmH2o) come in un vaso passivo progres- sivamente dilatato. Allo stesso modo, il gradiente di pressione necessario per l’apertura della valvola varia di sei volte con la distensione del vaso. Infine, la prova funzionale supporta il concetto che il tono muscolare linfatico esercita un effetto indiretto sull’apertura della valvola [7].