S. COLUSSI1, S. PELETTO1, P. MODESTO1, S. GIAMMARTINO1, L. BERTOLOTTI2, M.G. MANIACI1, V. CAMPIA1, A.
QUASSO3, R. DESIATO1, S. ROSATI2, P.L. ACUTIS1.
1 Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta, Torino, Italia; 2 Università degli Studi di Torino, Torino, Italia; 3 Dipartimento di Prevenzione ASL AT, Asti, Italia.
Parole chiave: CCR5, selezione genetica, Artrite-Encefalite caprina INTRODUZIONE
Il virus Maedi Visna (MVV) e il virus dell’Artrite-Encefalite caprina (CAEV) determinano una malattia virale contagiosa tipica di ovini e caprini; appartengono alla famiglia Retroviridae, genere Lentivirus, a cui è ascrivibile anche il virus dell’immunodeficienza acquisita dell’uomo (HIV). I Lentivirus dei piccoli ruminanti causano un’infezione persistente nell’organismo ospite, caratterizzata da un lungo periodo di incubazione, decorso cronico e progressivo, associata a valori di sieropositività elevati, talvolta del 100%. Nell’uomo sono stati descritti alcuni marcatori genetici coinvolti nella modulazione della suscettibilità all’HIV: tra questi il gene CCR5 codificante per il principale co-recettore per HIV-1 nelle fasi iniziali dell’infezione. In particolar modo è stata descritta una delezione caratteristica di 32 pb presente nella regione codificante, che determina l’incapacità di esprimere un recettore funzionante a livello della membrana cellulare, a cui consegue un’elevata resistenza all’infezione virale; inoltre mutazioni a carico delle regioni regolatrici sono state associate sia ad un differente livello di espressione del recettore, sia ad una differente suscettibilità verso il virus. Negli ovini è stata invece individuata una delezione di 4 pb nella regione del promotore di CCR5 che determina un’alterazione dei siti di legame per fattori trascrizionali riducendo, in ovini omozigoti deleti, fino a 3.9 volte l’espressione di tale recettore e dimezzando la carica provirale.
Sulla base di queste conoscenze è stato effettuato uno studio del gene CCR5 nei caprini, su animali provenienti da focolaio in modo da poter verificare se taluni dei polimorfismi rilevati fossero coinvolti nel conferire resistenza/ suscettibilità al CAEV.
MATERIALI E METODI
In collaborazione con l’ASL di Asti sono stati campionati due focolai costituiti da caprini di razza Camosciata: focolaio 1 di 57 capi e focolaio 2 di 50 capi. Il focolaio 2 è risultato caratterizzato da una carica provirale media nettamente inferiore al focolaio 1, correlata all’età media dei capi. Per tale motivo si è proceduto al campionamento di un terzo focolaio costituito da 37 capi che ha sostituito il focolaio 2 nello studio di associazione.
Dai campioni di sangue periferico è stato estratto il DNA, il gene CCR5 è stato analizzato mediante quattro PCR al fine di coprire le seguenti regioni: promotore, Esone 1, Introne, Esone 2 (comprendente la CDS), regione 3’ UTR. Ciascun amplificato è stato sottoposto a sequenziamento e le sequenze ottenute sono state analizzate mediante il Software Seqman. È stata inoltre condotta un’analisi funzionale dei polimorfismi rilevati nelle differenti regioni geniche utilizzando a tale scopo differenti software (TFBIND, ALGGEN-PROMO, MATCH e JASPAR) per individuare siti putativi di interazione con fattori di trascrizione. Ciascun animale è stato valutato mediante test ELISA multiepitopo e mediante PCR Real-Time specifica per la determinazione della carica provirale. Il livello di carica provirale è servito per ottenere la definizione di caso. In questo studio, infatti, il caso rappresenta l'animale che possiede un livello di carica provirale, espresso in numero di copie in 50 nanogrammi di campione per DNA genomico estratto, superiore al 75° percentile della distribuzione dei suoi valori (pari a 720 copie/50 ng). È stata condotta, quindi, un'analisi volta a rilevare l'associazione statistica tra le varianti genetiche da un lato e lo status di caso dall'altro, attraverso test di Fisher e test Chi-square e il calcolo dei relativi OR (odds ratio) tramite regressione logistica. Per lo studio di associazione è stato
utilizzato il software plink (v 1.07), mentre l’analisi dei dati è stata condotta mediante il software Stata 10.
RISULTATI E CONSIDERAZIONI
I risultati in tabella 1 evidenziano come utilizzando il test Chi- square gli SNPs potenzialmente associati ad elevata carica provirale siano 11. Tra i 17 polimorfismi considerati, applicando il test di Fisher, un solo SNP (rs925) risulta associato, mentre solo un altro (rs3167) presenta un valore di p value vicino alla significatività statistica. Dato il numero limitato dei soggetti in studio e date le caratteristiche della malattia, si è ritenuto opportuno valutare il possibile ruolo dello SNP rs925 nell'influenzare la suscettibilità alla carica provirale, tenendo conto del possibile effetto confondente dell'età. L'analisi di associazione è stata ulteriormente approfondita considerando all'interno del modello moltiplicativo la presenza dell'età degli animali come covariata. I valori ottenuti con la regressione logistica evidenziano come anche per l'aggiustamento per età sia presente un'associazione tra lo SNP rs925 e carica provirale con un incremento di 9 volte del rischio di presentare un'elevata carica provirale in presenza di mutazioni in eterozigosi rispetto al genotipo wild type (C/C). Lo studio caso-controllo ha messo in evidenza un'associazione potenzialmente interessante tra lo SNP rs925 e la probabilità di avere elevata carica provirale. In base allo studio funzionale, la mutazione rilevata è ubicata a livello del promotore, 499 pb a monte del trascriptional start site (TSS), ciò potrebbe pertanto riflettersi sui livelli di trascrizione: in tal caso il polimorfismo identificato potrebbe esercitare un ruolo nel modulare la trascrizione e modificare i livelli di trascritto dando esito ad una overespressione del co-recettore. L'analisi bioinformatica effettuata utilizzando i software ALGGEN- PROMO, MATCH, JASPAR ha permesso di predire FOXD3 quale fattore di trascrizione in grado di interagire selettivamente con il promotore contenente la variante polimorfica rs925-A. Nell'uomo è riportato un ruolo regolatorio di FOXD3 nell'infezione da HIV: in seguito ad infezione nei macrofagi e nelle cellule della microglia questo fattore di trascrizione regola in modo negativo l'attività del promotore del gene OTK18 codificante una proteina ad azione antiretrovirale [1]. Ulteriori approfondimenti, sono al momento in corso mediante l’utilizzo di saggi EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay) al fine di determinare se, in condizioni sperimentali, avviene il legame tra FOXD3 e la regione promotore di CCR5 in cui si localizza il polimorfismo rs925. I risultati ottenuti indicano quindi che è possibile diminuire la suscettibilità delle greggi caprine al CAEV selezionando negativamente gli animali portatori della mutazione rs925. Eliminare animali predisposti ad avere elevata carica provirale potrebbe inoltre limitare la diffusione del virus poiché si può ipotizzare che questi animali siano anche i più efficienti nel trasmettere l’infezione.
THE GENE CCR5 AS AN AID IN THE CONTROL OF CAPRINE ARTHRITIS-ENCEPHALITIS.
KEY WORDS: CCR5, GENETIC SELECTION, CAPRINE ARTHRITIS-ENCEPHALITS
BIBLIOGRAFIA
Buescher JL, Martinez LB, Sato S, Okuyama S, Ikezu T. J Neuroimmune Pharmacol. 2009 Mar;4(1):103-15.
S.I.P.A.O.C.
Società Italiana di Patologia e Allevamento degli Ovini e dei Caprini
S.I.P.A.O.C.
Società Italiana di Patologia e Allevamento degli Ovini e dei Caprini
Tabella 1: la tabella riporta i p value del test di Fisher (Pf) e del test Chi-square (Px), il numero del cromosoma (CHR), il nome dello SNP, la sua posizione nucleotidica (BP), il nome dell'allele minore (A1), dell'allele maggiore (A2) e i valori di frequenza allelica nei casi (F_A) e nei controlli (F_UN), il valore stimato di odds ratio (OR)
CHR SNP BP A1 F_A F_U A2 Pf CHISQ Px OR
5 rs925 5171 A 0.45 0.25 C 0.04 5.999 0.01 2.42 5 rs3167 7412 C 0.29 0.13 T 0.06 5.855 0.02 2.57 5 rs1394 5638 T 0.43 0.25 C 0.07 4.57 0.03 2.25 5 rs2170 6415 C 0.43 0.25 T 0.07 4.57 0.03 2.25 5 rs3203 7448 C 0.43 0.25 T 0.07 4.57 0.03 2.25 5 rs4553 8598 T 0.43 0.25 C 0.07 4.57 0.03 2.25 5 rs2791 7034 T 0.45 0.27 C 0.07 5.34 0.02 2.19 5 rs3023 7266 C 0.27 0.13 T 0.1 4.303 0.04 2.35 5 rs5089 9332 A 0.27 0.13 G 0.1 4.303 0.04 2.35 5 rs1059 5305 T 0.43 0.27 C 0.11 3.998 0.05 2.04 5 rs2573 6816 C 0.27 0.15 A 0.17 3.591 0.06 2.01 5 rs186 4421 in 0.38 0.25 del 0.21 2.71 0.1 1.8 5 rs226 4463 A 0.38 0.25 G 0.21 2.705 0.1 1.8 5 rs5110 9353 C 0 0.02 G 0.48 0.39 0.53 0 5 rs3876 8121 C 0.16 0.12 T 0.58 0.268 0.60 1.47 5 rs4918 9161 T 0.16 0.12 C 0.58 0.268 0.60 1.47 5 rs551 4788 G 0.16 0.13 C 0.79 0.11 0.74 1.23