A. CARTA, P. CARTA, S. CASU, S. MIARI, G. MULAS, S.L. SALARIS, T.SECHI, MG USAI, S. SECHI Servizio Ricerca per la Zootecnia, AGRIS Sardegna
Parole chiave: QTL, paratubercolosi, cellule somatiche, nematodi. INTRODUZIONE
In anni recenti, gli allevatori ovini hanno dovuto affrontare nuovi scenari legati alla globalizzazione, alla riduzione dei sussidi alla produzione oltre che nuovi vincoli imposti dalla crescente importanza delle tematiche relative alla salubrità e sicurezza alimentare, al benessere animale e all’ambiente. In scenari come questi, in continua evoluzione, tra i caratteri oggetto di miglioramento genetico hanno acquisito sempre maggiore attenzione quelli relativi alla riduzione dei costi di produzione, alla sicurezza alimentare ed alla sanità degli animali e delle produzioni (ad esempio resistenza alla scrapie, ai nematodi gastrointestinali, alle infezioni mammarie). Le tecniche tradizionali di gestione delle malattie infettive e parassitarie negli allevamenti ovini implicano sia misure preventive (vaccini) che di controllo (uso di farmaci e/o eliminazione degli animali malati). La selezione di animali resistenti si configura come un approccio efficace e maggiormente sostenibile per la prevenzione e il controllo delle malattie. La base sulla quale è possibile operare per la selezione di animali resistenti ad una determinata malattia è l’esistenza di variabilità genetica nella suscettibilità. Negli ovini, benché, la variabilità genetica nella risposta alle malattie infettive e parassitarie sia ormai ben documentata (Bishop and Morris, 2007; Bishop, 2015; Benavides et al. 2016), l’approccio selettivo classico basato sul modello genetico infinitesimale, che pur ha portato risultati apprezzabili per la produzione di latte (Carta et al.,2009), ha limiti oggettivi nell’applicazione alla selezione per la resistenza alle malattie; in quanto, spesso, si tratta di caratteri a bassa ereditabilità e costosi e/o poco precisi da misurare. Negli ultimi anni la disponibilità di tecnologie high-throughput per l’analisi del genoma ha consentito di analizzare nel dettaglio il genoma degli animali e la descrizione più approfondita della variabilità genetica alle principali malattie degli animali da allevamento. Le nuove tecnologie hanno permesso, infatti, di leggere il genoma in un certo numero di posizioni in cui sono presenti mutazioni puntiformi (SNP). Queste mutazioni sono così densamente distribuite lungo il DNA da essere in stretto linkage con le possibili mutazioni causative di significato selettivo ed economico. L’individuazione di zone del genoma (Quantitative Trait Loci, QTL) e/o SNP strettamente legate al carattere oggetto di selezione o addirittura della mutazione causativa potrebbe consentire di selezionare gli animali sulla base di una, ormai routinaria, analisi del DNA senza bisogno di dover effettuare costose misure sull’intera popolazione oggetto di selezione. Nel presente lavoro verranno descritti i risultati ottenuti nell’ambito del progetto “Miglioramento genetico dei caratteri di efficienza produttiva e riproduttiva, resistenza alle patologie, valore caseario e nutrizionale del latte nella razza ovina sarda attraverso l’utilizzo delle moderne tecnologie genomiche e di metodiche innovative di misurazione dei fenotipi” (MIGLIOVIGENSAR),su una popolazione di ovini da latte per alcune tra le principali patologie di grande impatto sulle popolazioni ovine europee. I caratteri oggetto di studio sono stati la suscettibilità/resistenza alle mastiti, ai nematodi e alla paratubercolosi. Le mastiti (cliniche e subcliniche) nelle pecore da latte e le infestioni da strongili gastrointestinali (SGI) sono state classificate tra le principali malattie infettive degli ovini in relazione all’impatto economico, all’effetto sulla produzione e al benessere animale (Davies et al., 2009)
La mastite è un’infiammazione della mammella, di solito causata da microrganismi patogeni. Può comportare ingenti perdite economiche, dovute sia al costo dei trattamenti antibiotici che agli effetti sulla produzione quanti-qualitativa del latte. Numerosi lavori hanno dimostrato l’esistenza di variabilità genetica per la resistenza alle mastiti. Generalmente, sia nei bovini che negli ovini, il criterio diagnostico utilizzato è stato il contenuto in cellule somatiche del latte (CCS). L’incremento nel contenuto di cellule somatiche è una misura indiretta di infezione a livello della mammella, e la sua misura, facilmente realizzabile nel corso dei controlli funzionali routinari, presenta un’ereditabilità più alta dello stato sanitario della mammella (0.10 in media contro 0.05 della misura diretta) (Rupp and Foucras, 2010).
La paratubercolosi è una malattia infettiva dei ruminanti provocata dal Mycobacterium avium subsp paratuberculosis (Map) che può
causare ingenti perdite, stimate in Australia fino al 7% annuo negli allevamenti infetti (Bush et al., 2006). Oltre all’impatto diretto sulla produttività dell’allevamento ovino, moltissimi lavori hanno evidenziato l’associazione tra Map e morbo di Chron: un’enterite umana a decorso molto simile (Sechi and Dow, 2015). Inoltre, negli ultimi anni è stato ipotizzato il coinvolgimento del Map in altre malattie umane (sclerosi multipla, diabete di tipo 1) (Niegowska et al., 2016). In Europa, la prevalenza negli allevamenti infetti della paratuberculosi ovicaprina risulta superiore al 20% (Nielsen and Toft, 2009). In Italia non si hanno dati su ampia scala sulla prevalenza negli ovini. L’eliminazione degli animali infetti e la vaccinazione, la cui efficacia non è ancora stata confermata, sono le principali tecniche di controllo di questa patologia. L’esistenza di una componente genetica che influenza la suscettibilità alla malattia è stata confermata sia nei bovini (Shook et al., 2012) che negli ovini con valori di ereditabilità medi (0.29) (Sechi et al, 2010). Una delle maggiori limitazioni per lo studio della resistenza genetica alla paratubercolosi è la difficoltà di reperire fenotipi affidabili (Sechi et al., 2012). La paratubercolosi ha un periodo di incubazione di alcuni anni e i diversi test diagnostici, oltre che costosi se eseguiti su grossi numeri, non mostrano sensibilità elevate, oltre a dare risultati diversi a seconda dello stadio della malattia (Nielsen and Toft, 2008). Alla luce di queste problematiche la definizione di zone del genoma che influenzano la resistenza/suscettibilità a tale patologia risulterebbe estremamente vantaggiosa.
Gli SGI sono la principale malattia parassitaria degli ovini al pascolo, con perdite che possono anche risultare ingenti. Nella pratica comune il controllo è effettuato attraverso la somministrazione di antielmintici, usati talvolta in maniera poco razionale con conseguente rischio di comparsa di fenomeni di farmacoresistenza e/o persistenza di residui nel latte o nella carne (Scala, 2014). Da diversi decenni è nota l’esistenza di meccanismi di resistenza/suscettibilità genetica ai nematodi (Knight et al., 1973) e sono ormai numerosi i lavori che hanno messo in luce l’esistenza di QTL o zone del genoma che influenzano la resistenza (126 marcatori o intervalli di marcatori associati con la resistenza, Benavides et al., 2016). Per quanto riguarda la quantificazione della resistenza agli SGI, la misura più frequentemente utilizzata è la conta delle uova fecali (FEC) una misura indiretta della carica parassitaria.
MATERIALI E METODI
Popolazione - I dati sono stati raccolti tra il 2000 e il 2012 su una popolazione costituita da 963 pecore backcross (G0) SardaXLacaune e da 2 generazioni di discendenti (G1-G2), ottenute dall’accoppiamento con 33 arieti del Centro Arieti della razza Sarda (maggiori dettagli in Carta et al., 2014).
Dati fenotipici - Per la resistenza alle mastiti sono stati analizzati i dati di CCS raccolti ogni quindici giorni sugli animali in lattazione. Il valore giornaliero delle CCS è stato poi trasformato logaritmicamente attraverso la formula di Ali e Shook (1980) in score delle cellule somatiche (SCS). Il valore per lattazione dello score (LSCS) è stato ottenuto come media aritmetica dei SCS giornalieri. Per la resistenza ai nematodi, il fenotipo considerato è stato la misura delle FEC. In presenza di infestione naturale, monitorata attraverso prelievi mensili di animali campione, sono stati raccolti i prelievi fecali dell’intero gregge in ordine di 1 a 3 volte all’anno. Il dato di FEC così ottenuto è stato log-trasformato, e corretto per gli effetti ambientali ottenendo un valore di FEC per lattazione (LFEC). Per la quantificazione della resistenza/suscettibilità alla paratubercolosi, la cui diagnosi risulta più difficoltosa e per la quale diversi sono i criteri diagnostici proposti in letteratura (Sechi et al., 2012), si è proceduto alla misura di diversi caratteri. Innanzitutto, venivano sempre registrati gli animali che presentavano sintomatologia clinica. A partire dal 2006, la diagnosi veniva confermata con l’esame isto-patologico di campioni di tessuti di organi bersaglio prelevati alla morte degli animali con sintomatologia clinica. L’esame anatomo-istopatologico è stato eseguito annualmente, su tutti gli animali riformati, che venivano macellati al termine della 4° lattazione. Ogni anno, e a
CONGRESSO NAZIONALEXXII
S.I.P.A.O.C.
CUNEO
13 - 16 settembre 2016
partire dal 2006 con cadenza semestrale, è stato effettuato un prelievo di sangue sull’intero gregge per la successiva analisi sierologica. L’analisi sierologica sui campioni raccolti è stata eseguita mediante Kit ELISA IDVET ID Screen®. I valori di densità ottica di ciascun campione sono stati espressi come “rapporto S/P” (Sample to Positive Ratio) che corrisponde al valore della densità ottica del campione considerato in rapporto ai valori degli standard positivo e negativo inseriti nella piastra. In conclusione, tenendo presente che la definizione corretta dello stato sanitario di un animale è di primaria importanza per gli studi genetici, si è scelto di utilizzare per le successive analisi due caratteri: uno, continuo, relativo alla sola analisi sierologica (la media dei valori di rapporto S/P ottenuti dall’analisi ELISA, mOD) e uno, binario, relativo al risultato dell’esame anatomo-istologico (HS). Il carattere HS è stato considerato positivo (HS=1) se l’esame anatomo-istologico eseguito a 4 anni oppure al momento della morte per sospetta paratubercolosi aveva indicato lesioni caratteristiche di paratubercolosi, negativo (HS=0) in assenza di lesioni. Poiché l’analisi istologica, realizzata a partire dal 2006 sugli animali con sintomatologia clinica, ha sempre confermato la presenza di lesioni caratteristiche, anche in assenza di risultato anatomo-istologico per gli animali registrati come clinicamente affetti, il valore di HS è stato considerato positivo. Per la successiva analisi dei QTL, i fenotipi raccolti sono stati corretti per i principali fattori di variazione. Analisi dei QTL - La popolazione è stata genotipizzata con l’OvineSNP50 Beadchip (Illumina Inc). I fenotipi corretti sono stati analizzati con un approccio che combina le informazioni di linkage entro famiglia e quelle di linkage disequilibrium a livello di popolazione. Inoltre, l’analisi delle componenti principali è stata utilizzata per sintetizzare la probabilità di identità per discendenza (IBD) tra gli aplotipi fondatori (Usai et al., 2014). Per ogni posizione analizzata, è stata applicata una regressione multipla sulle componenti principali estratte dalla matrice di IBD tra gli aplotipi fondatori portati dagli arieti sardi utilizzati. Le soglie di significatività a livello del genoma (GW) sono state calcolate applicando la correzione di Bonferroni al p-value nominale del test F per ogni posizione. Gli SNP risultati significativi entro l’intervallo di 1 Mb sono stati considerati un unico QTL.
RISULTATI
Gli animali genotipizzati e con fenotipo per la resistenza alle mastiti sono stati 2.354. Il valore medio di SCC nei 13 anni della prova è stato di 578.000 cell/ml mentre il valore medio di LSCS 4.09. Dall’analisi dei QTL sono state identificate tre regioni significative al 5% genome wise (GW) associate alla resistenza alle mastite nei cromosomi 2, 3 e 4 (Fig. 1). Sul cromosoma 3 Rupp et al., (2015) hanno individuato una mutazione causativa del gene Socs2 associata ad una maggiore sensibilità alle infezioni mammarie. Dai risultati disponibili a oggi, tuttavia, tale mutazione, non sembra essere associata al QTL identificato nella nostra popolazione, in quanto non in segregazione negli aplotipi di razza sarda analizzati.
Fig. 1 – Regioni genomiche associate alla resistenza alle mastiti (LSCS).
La resistenza ai nematodi gastrointestinali è stata valutata utilizzando come criterio la conta delle FEC, il cui valore medio è stato di 290 uova/g. Sono state identificate regioni significative al 5% GW in 10 cromosomi (Fig.2).
Il segnale identificato sul cromosoma 20, dove è presente il Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC), è risultato estremamente significativo confermando i molti studi che hanno evidenziato zone del genoma associate alla resistenza agli SGI in prossimità del MHC (Stear et al., 2009; Benavides et al., 2016).
Fig. 2 – Regioni del genoma associate con la resistenza ai SGI (FEC).
Tra le altre regioni, quella identificata sul cromosoma 12 conferma un QTL identificato sulla stessa popolazione con l’uso dei microsatelliti (Sechi et al., 2010).
Sul cromosoma 15, dove è stata identificata un’ulteriore regione significativa, è presente il gene MUC15 che codifica per una glicoproteina appartenente al gruppo delle mucine. MUC15, assieme ad altre mucine, forma strutture filamentose che fanno parte del glicocalice, potrebbe quindi essere coinvolta nella costituzione di una barriera fisica per i microrganismi patogeni (Pallesen et al., 2008; Hasnain et al., 2010).
Fig. 3 – Regioni del genoma associate con la resistenza alla paratubercolosi espressa come media della densità ottica dell’analisi sierologica (mOD).
Per quanto riguarda la paratubercolosi, 237 animali su 2042 hanno presentato sintomatologia clinica; il 16% degli animali sottoposti ad analisi isto-patologica al termine della 4° lattazione ha mostrato lesioni caratteristiche della malattia; il valore medio del rapporto S/P (mOD) è stato 33.
L’analisi di associazione tra zone del genoma ovino e resistenza alla paratubercolosi espressa come media del rapporto S/P dell’analisi sierologica (mOD), hanno evidenziato un’unica regione al 5% GW sul cromosoma 20 (Fig.3), che presenta però un segnale molto forte.
Fig. 4 – Regioni del genoma associate con il carattere di presenza di lesioni tipiche di paratubercolosi (HS).
La presenza di una forte associazione tra la regione genomica sul cromosoma 20 e la resistenza alla paratubercolosi è confermata, anche se in misura meno evidente ma sempre al 5% GW, anche dal secondo carattere preso in considerazione, la presenza o meno di lesioni all’esame istologico post-mortem (HS). Alcuni lavori hanno già evidenziato il legame tra alcuni marcatori presenti nella regione del MHC e la suscettibilità alla paratubercolosi negli ovini (Reddacliff et al., 2005) anche se in successivi studi di associazione su scala genomica nei bovini, questa relazione non è stata confermata (Purdie et al., 2011).
S.I.P.A.O.C.
Società Italiana di Patologia e Allevamento degli Ovini e dei Caprini
S.I.P.A.O.C.
Società Italiana di Patologia e Allevamento degli Ovini e dei Caprini
CONSIDERAZIONI FINALI
I risultati ottenuti sono molto promettenti per l’applicazione della selezione genetica per la resistenza alle malattie. Di estremo interesse risultano le regioni genomiche evidenziate sul cromosoma 20 per la resistenza agli SGI e alla paratubercolosi, sia per l’elevato segnale che per la presenza nelle regioni interessate di numerosi geni implicati nella risposta immunitaria. Attualmente sono in corso ulteriori analisi volte a identificare, nelle zone risultate maggiormente associate ai caratteri di interesse, i geni e, possibilmente, i polimorfismi causativi della variabilità dei caratteri studiati. In particolare, è stato completamente sequenziato il genoma di 8 triplette di animali, aventi alta probabilità di portare le differenti varianti geniche che influenzano in maniera significativa i diversi caratteri di interesse. L’analisi bioinformatica delle sequenze di questi animali nelle regioni target consentirà di identificare, tra le varianti genomiche che presentano genotipi in accordo con quanto atteso nella identificazione dei trio, quelle contenute in geni o sequenze regolatrici associate all’espressione del carattere oggetto di studio i cui effetti dovranno poi essere confermati nella popolazione in selezione.
Ringraziamenti - Lavoro finanziato dalla Regione Autonoma della Sardegna, progetto di ricerca “MIGLIOVIGENSAR”.
CHROMOSOMAL REGIONS ASSOCIATED TO DISEASE RESISTANCE IN SHEEP: POSSIBLE APPLICATIONS.
KEY WORDS: QTL, PARATUBERCULOSIS, MILK SOMATIC CELLS, NEMATODES.
BIBLIOGRAFIA
1) Ali, A. K. A., and G. E. Shook (1980) An optimum transforma-tion for somatic cell concentration in milk. J. Dairy Sci. 63:487-490.
2) Benavides, M. V., Sonstegard, T. S., & Van Tassell, C. (2016) Genomic Regions Associated with Sheep Resistance to Gastrointestinal Nematodes. Trends in parasitology, 32(6), 470-480.
3) Bishop, S.C., Morris C.A. (2007) Genetics of disease resistance in sheep and goats, Small Ruminant Research , Volume 70 , Issue 1 , 48 - 59
4) Bishop, S.C., 2015 Genetic resistance to infections in sheep. Veterinary Microbiology, 181: (1-2), 2-7
5) Bush, R., Windsor, P. and Toribio, J.-A. (2006), Losses of adult sheep due to ovine Johne's disease in 12 infected flocks over a 3-year period. Austr Vet Journal, 84: 246– 253.
6) Carta A, Casu S, Salaris S. (2009) Current state of genetic improvement in dairy sheep, Journal of Dairy Science, 92(12) 5814-33
7) Carta A., Usai MG, Sechi T., Miari S., Sechi S., Salaris SL, Mulas G., Barillet F., Elsen JM, Casu S. (2014) Exploring the genetic variation between Sarda and Lacaune dairy sheep breeds by genome wide association study on economic traits, 10th WCGALP, Vancouver, Canada, August 17-22, 2014.
Davies, G., Genini, S., Bishop, S. C., & Giuffra, E. (2009). An assessment of opportunities to dissect host genetic variation in resistance to infectious diseases in livestock. Animal, 3(03), 415-436.
8) Knight RA, Vegors HH, Glimp HA, (1973) Effects of breed and date of birth of lambs on gastrointestinal nematode infections. Am J Vet Res 34:3, 323-327
9) Hasnain SZ, Wang H, Ghia JE, Haq N, Deng Y, Velcich A, Grencis RK, Thornton DJ, Khan WI (2010) Mucin gene deficiency in mice impairs host resistance to an enteric parasitic infection. Gastroenterology 138:1763–1771
10) Niegowska M, Rapini N, Biet F, Piccinini S, Bay S, et al. (2016) Seroreactivity against Specific L5P Antigen from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in Children at Risk for T1D. PLoS ONE 11(6): e0157962.
11) Nielsen, SS., and Toft, N. (2008) Ante mortem diagnosis of paratuberculosis: a review of accuracies of ELISA, interferon-γ assay and faecal culture techniques. Vet microbiology, 129(3), 217-235.
12) Nielsen, SS, and Toft N., (2009) A review of prevalences of paratuberculosis in farmed animals in Europe. Prev vet med 88.1: 1-14.
13) Pallesen LT, Pedersen LR, Petersen TE, Knudsen CR, Rasmussen JT. (2008) Characterization of Human Mucin (MUC15) and Identification of Ovine and Caprine Orthologs Journal of Dairy Science , Volume 91 , Issue 12 , 4477 - 4483 Reddacliff, L. A., Beh, K., McGregor, H., & Whittington, R. J. (2005). A preliminary study of possible genetic influences on the susceptibility of sheep to Johne's disease. Austr vet journal, 83(7), 435-441. 14) Purdie, A. C., Plain, K. M., Begg, D. J., De Silva, K., &
Whittington, R. J. (2011). Candidate gene and genome- wide association studies of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in cattle and sheep: a review. Comp. Immunol. Microb., 34(3), 197-208.
15) Rupp, R., and Foucras, G. (2010) Genetics of mastitis in dairy ruminants, in Breeding for Disease Resistance in Farm Animals, eds S. C. Bishop, R. F. E. Axford, F. W. Nicholas, and J. B. Owen (Wallingford, UK: CABI Publishing), 183–212.
16) Rupp R, Senin P, Sarry J, Allain C, Tasca C, Ligat L, et al. (2015) A Point Mutation in Suppressor of Cytokine Signalling 2 (Socs2) Increases the Susceptibility to Inflammation of the Mammary Gland while Associated with Higher Body Weight and Size and Higher Milk Production in a Sheep Model. PLoS Genet 11(12): e1005629.
17) Scala A. (2014) Gli strongili gastro-intestinali delle pecore: cosa sono, cosa fanno e quanti ne abbiamo, LAR 20 (4: S1), 70-74
18) Sechi LA, Dow CT (2015) Mycobacterium paratuberculosis Zoonosis -The Hundred Year War – Beyond Crohn’s Disease, Front Immunol, 6:96
19) Sechi S., Salaris S., Ligios C., Ponti N., Foucras G., Casu Sara (2011) Genetic parameters for antibody response to MAP in natural infected flock. IJAS volume 10: supplement 1
20) Sechi S., Ponti N., Carta A., Casu S., Maestrale C., Ligios C., Foucras G. (2012) Studio dei fattori genetici associati alla resistenza alla paratubercolosi ovina: uso di diversi test diagnostici per la classificazione del fenotipo degli animali negli allevamenti infetti, LAR 19 (5:S1), 27 21) Sechi, S.; Casu, S.; Usai, M. G.; Mulas, G.; Sanna, G.;
Pipia, A. P.; Carta, A. & Scala, A. (2010), Verifica di un QTL per la resistenza ai nematodi identificato nel cromosoma 12 ovino attraverso la densificazione della mappa genetica e l’utilizzo di un’ulteriore generazione di discendenti, LAR 16 (5:S1), 104
22) Shook, GE, Chaffer, M., Wu, X. L., & Ezra, E. (2012). Genetic parameters for paratuberculosis infection and effect of infection on production traits in Israeli Holsteins. Animal genetics, 43(s1), 56-64.
23) Usai MG, Casu S., Sechi T. et al. (2014) Genome wide association study on milk production traits in a nucleus flock of Sarda breed sheep using a novel method combining linkage and linkage disequilibrium mapping, Accepted ORAL presentation at the 10th WCGALP. Vancouver, BC, Canada, August 17-22, 2014
CONGRESSO NAZIONALEXXII
S.I.P.A.O.C.
CUNEO
13 - 16 settembre 2016