MATERIALI E METOD

Il lavoro sperimentale svolto può essere suddiviso in 4 fasi che verranno descritte nelle prime 4 parti di questo capitolo. Nella parte 5 verranno invece riportati i protocolli di tutte le analisi effettuate.

Introduzione

Il presente lavoro di tesi è parte di un Programma di Ricerca che vede la collaborazione tra la Facoltà di Medicina Veterinaria (Dipartimento di Patologia Animale Profilassi e Igiene degli Alimenti) di Pisa, la Facoltà di Agraria (Dipartimento di Agronomia e Gestione dell' Agroecosistema) di Pisa, la Facoltà di Medicina Veterinaria (Dipartimento di Tecnologia degli Alimenti, Nutrizione e Bromatologia) di Murcia (Spagna) e il Caseificio del Sig. Verano Bertagni (Pieve Fosciana-LU-). Inoltre parte del progetto è stata finanziata dalla Fondazione Cassa di Risparmio di Lucca. Il Dipartimento di Agronomia e Gestione dell' Agroecosistema si è occupato delle indagini relative alla distribuzione delle aziende che allevano ovini nel territorio della Garfagnana e dell’individuazione delle caratteristiche gestionali e strutturali di ciascuna azienda, al fine di una selezione di quelle più adatte per essere coinvolte in questo progetto di ricerca. In particolare sono stati valutati in maniera approfondita:

• la gestione degli allevamenti selezionati mediante visite aziendali che hanno permesso di rilevare lo stato di salute, lo stadio di lattazione e la stima dello stato di ingrassamento (BCS - Body Condition Score).

• l'efficienza riproduttiva degli allevamenti (età al primo parto; fertilità; calcolo dell'intervallo concepimento – parto)

• i piani alimentari (analisi del razionamento effettuato durante i periodi di stabulazione con campionamenti dei foraggi somministrati al fine di effettuare una valutazione delle Unità Foraggere Latte realmente ingerite dagli animali.

• la registrazione della durata del periodo di pascolamento con relativi campionamenti di erba.

Inoltre presso il suddetto Dipartimento sono state svolte mensilmente, sul latte massale le seguenti determinazioni analitiche:

• analisi chimiche (solidi totali, proteine grezze, lipidi totali, acidi grassi, ceneri)

• analisi tecnologiche (attitudine alla caseificazione con parametri lattodinamografici: r, K20, a30)

Su campioni di foraggio sono state eseguite analisi per la determinazione della composizione chimica secondo il sistema Weende e Van Soest.

In seguito sono state svolte le analisi sui formaggi prodotti (sostanza secca - SS, proteine grezze, lipidi totali, ceneri, acidi grassi, grado di proteolisi e lipolisi).

Il Dipartimento di Patologia Animale, Profilassi e Igiene degli Alimenti ha curato la parte oggetto di questa tesi, relativa a tutte le analisi microbiologiche su latte e formaggio e la messa a punto di uno starter autoctono mesofilo, come di seguito descritto in maniera dettagliata.

Il Dipartimento di Tecnologia degli Alimenti, Nutrizione e Bromatologia di Murcia ha invece curato la parte relativa alle analisi sul profilo di Tessitura, sul grado di proteolisi e sull'analisi sensoriale dei formaggi al termine della stagionatura.

5.1. PARTE 1

Descrizione delle aziende coinvolte nella ricerca

L’indagine condotta sul comparto produttivo del territorio, ha rilevato che in Garfagnana sono presenti 108 aziende che allevano ovini. L’allevamento ovino è presente in tutti i comuni garfagnini tranne che nel comune di Vergemoli; i comuni con la maggiore vocazione sono quelli di Pieve Fosciana, Villa Collemandina e Minucciano dove sono presenti più di 10 aziende (Figura 1).

Figura 1. Distribuzione degli allevamenti ovini in Garfagnana per comuni

Dall’indagine condotta è emerso che nelle 108 aziende sono allevati 2813 capi con una media di 26 capi per azienda. Questo dato fa capire che l’allevamento ovino in Garfagnana è costituito da piccole realtà produttive; solo il 14% delle aziende presenta più di 50 capi, mentre il 41% sono aziende molto piccole, addirittura con meno di 10 capi (Figura 2).

Figura 2. Distribuzione delle aziende in base al numero di capi allevati

Le razze ovine allevate in Garfagnana sono essenzialmente due, la Massese e la Garfagnina. Quest’ultima sta vivendo una fase di recupero, dopo un periodo in cui aveva rischiato l’estinzione.

In riferimento all’indirizzo produttivo, la maggior parte delle aziende (38%) persegue una produzione mista (carne, latte), il 35% produce solo carne e il 25% solo latte (Figura 3). Dall’indagine sono emerse anche due realtà produttive particolari, un’azienda destinata alla sola produzione della lana e una che produce solo per l’autoconsumo.

Agli allevamenti con più di 50 capi ai quali è stato somministrato un questionario, in modo da individuare le caratteristiche gestionali e strutturali più diffuse in Garfagnana.

Un primo screening dei dati raccolti ha evidenziato che gli allevamenti di pecore di razza Massese hanno un livello tecnico leggermente superiore agli allevamenti di Garfagnine; in particolare nei primi è presente una cisterna di raccolta del latte.

Le aziende sono tutte a conduzione diretta, senza salariati, dove la forza lavoro è fornita dal proprietario, a tempo pieno o parziale, e dai suoi familiari.

Le strutture sono per lo più in muratura e generalmente i pascoli utilizzati sono naturali.

Dal pool dei 50 allevamenti sono stati selezionati 5 allevamenti sui quali è stato sviluppato il progetto di ricerca. Dei 5 allevamenti, 3 allevano pecore di razza Massese mentre gli altri 2 allevano pecore di razza Garfagnina.

La prima fase della sperimentazione ha previsto una valutazione della gestione aziendale nei 5 allevamenti selezionati.

L’indagine è stata realizzata attraverso visite aziendali che hanno permesso di accertare in maniera diretta gli eventuali problemi e di suggerire i miglioramenti da apportare.

Protocollo Sperimentale

In ognuna delle 5 aziende oggetto di studio, è stato condotto un campionamento di latte massale, con cadenza mensile, su cui sono state fatte le seguenti determinazioni analitiche:

 analisi igienico–sanitarie: contenuto in cellule somatiche (CCS) effettuato mediante metodo fluoro opto elettronico -n°/ml- (Fossamatic 90, FossElectric-Denmark); carica batterica totale (CBT).

 analisi microbiologiche (coliformi totali, E. coli, stafilococchi coagulasi positivi, lattococchi e lattobacilli).

Queste analisi sono servite per valutare le caratteristiche qualitative e igienico- sanitarie del latte. Quando tali caratteristiche sono state ritenute idonee (dati non inseriti in questo lavoro di tesi) si è proceduto alla prima caseificazione del latte

massale delle aziende testate. Il latte delle due razze è stato caseificato separatamente.

5.2. PARTE 2

Analisi eseguite sul latte e sul formaggio pecorino senza aggiunta di starter

Da ognuna delle 5 aziende oggetto di studio, prima della caseificazione, è stato prelevato un campione di latte massale, sul quale sono state effettuate le seguenti analisi: contenuto in cellule somatiche (CCS) effettuato mediante metodo fluoro opto elettronico (n°/ml) (Fossamatic 90, FossElectric-Denmark); carica batterica totale mesofila (CBT), determinazione quantitativa di coliformi totali, E. coli e stafilococchi coagulasi positivi; determinazione quantitativa e qualitativa di lattococchi e lattobacilli.

Sul formaggio pecorino prodotto senza l’utilizzo di starter sono state eseguite al momento della caseificazione (0) e poi a 2, 7, 14, 21 e 35 giorni di maturazione le seguenti analisi: CBT; determinazione quantitativa di coliformi totali e stafilococchi coagulasi positivi; determinazione quantitativa e qualitativa di lattococchi e lattobacilli.

Per ogni campione di latte e formaggio è stata effettuata anche la determinazione del pH.

In previsione dell’impiego dei batteri lattici per la messa a punto di uno starter autoctono, è stata allestita una ceppoteca comprendente i ceppi isolati dal latte e dal formaggio conservati a – 80°C. A tale scopo sono stati scelti quelli riportabili ai due generi di batteri lattici (lattococchi e lattobacilli) in base alle caratteristiche morfologiche delle colonie, all’osservazione al microscopio dopo colorazione di Gram e al risultato negativo della prova della catalasi.

5.3. PARTE 3

Selezione della flora lattica e allestimento dello starter autoctono

Al fine di selezionare i migliori ceppi da utilizzare per la messa a punto di uno starter autoctono mesofilo, i batteri lattici isolati, selezionati in base alle caratteristiche precedentemente elencate e conservati a -80°C, sono stati rivitalizzati su terreno nutritivo e successivamente sottoposti a identificazione fenotipica e genotipica e alle seguenti prove di caratterizzazione tecnologica:

- su ogni singolo ceppo: curva di acidificazione, resistenza al cloruro di sodio al 2,5%; 5% e 7,5%, prove dell’ amminopeptidasi e di proteolisi.

- sui ceppi in combinazione: prove di inibizione reciproca, di acidificazione e di resistenza al cloruro di sodio al 2,5%; 5% e 7,5%.

In base al risultato delle analisi sopra elencate sono stati selezionati i singoli ceppi e poi le migliori combinazioni di questi.

Con la combinazione di ceppi che ha fornito i migliori risultati è stato allestito lo starter in forma di lattoinnesto.

Il lattoinnesto così preparato, dopo il prelievo di un campione per la determinazione quantitativa di lattobacilli e lattococchi, è stato successivamente portato al caseificio, in regime di refrigerazione, per l’esecuzione della caseificazione sperimentale.

5.4. PARTE 4

Caseificazione sperimentale e analisi sul formaggio pecorino a latte crudo prodotto con l’aggiunta di uno starter autoctono

Il latte di ciascuna razza (Garfagnina e Massese) è stato suddiviso in due aliquote uguali, in una è stato aggiunto il lattoinnesto autoctono, nell’altra il lattoinnesto con starter commerciale. Il latte caseificato con il lattoinnesto commerciale costituisce il CONTROLLO.

Sono stati prelevati campioni di latte di massa, sia crudo che termizzato, e campioni di formaggio a 0, 2, 7, 14, 21, 28, 42 e 60 giorni di stagionatura, sui quali è stato misurato il pH e sono state effettuate le seguenti analisi microbiologiche:

• determinazione della carica batterica mesofila totale (CBT)

• determinazione quantitativa dei coliformi totali

• determinazione di E. coli

• determinazione di stafilococchi coagulasi positivi

• determinazione di Pseudomonas spp.

• determinazione quantitativa dei lattococchi

• determinazione quantitativa dei lattobacilli

• Ricerca di Listeria monocytogenes

• Ricerca di Salmonella enterica

Sul formaggio a fine stagionatura (60 giorni) sono state effettuate anche le seguenti analisi:

• Analisi del Profilo di Tessitura (TPA)

• Determinazione delle frazioni Nitrogenate (WSN, TCASN, PTASN)

• Analisi sensoriale mediante Panel test sui 4 formaggi prodotti:

1. Pecorino caseificato con latte di pecore di razza Garfagnina e starter autoctono

2. Pecorino caseificato con latte di pecore di razza Garfagnina e starter commerciale

3. Pecorino caseificato con latte di pecore di razza Massese e starter