La ricerca di Listeria monocytogenes è stata eseguita secondo la norma ISO 11290- 1:1996 Amd.1:2004. Poiché Listeria monocytogenes può essere presente ma basse concentrazioni e spesso è accompagnata dalla presenza di numerosi microrganismi appartenenti ad altri generi, è necessario l’utilizzo di arricchimenti selettivi. L’utilizzo di terreni colturali contenenti ridotte concentrazioni di sostanze inibenti la crescita batterica, permette invece di ricercare anche quelle listerie stressate e poco vitali presenti nella matrice.
• Primo arricchimento (in terreno liquido selettivo con una ridotta concentrazione di agenti selettivi): 25 g di campione sono stati addizionati a 225 ml di Half Fraser broth (OXOID); il tutto è stato incubato a 30°C per 24 h.
• Secondo arricchimento (in terreno liquido selettivo con una normale concentrazione di agenti selettivi): 0,1 ml della coltura ottenuta dalla fase precedente è stato inoculato in 10 ml di Fraser broth (OXOID); il tutto è stato incubato a 37°C per 48 h.
• Piastratura ed identificazione delle colonie : le colture ottenute dal primo e dal secondo arricchimento sono state seminate in due terreni solidi: Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti (ALOA – Biolife srl) e Oxford agar (incubazione a 37°C per 48 h). Su ALOA agar le colonie riportabili a L.monocytogenes sono di colore verde-blu, circondate da un alone opaco; alcuni ceppi di L.monocytogenes, se stressati, mostrano un alone molto ristretto (anche assente). Su Oxford agar le colonie di
Listeria spp. sono piccole (1mm), grigie e circondate da un alone nero;
dopo 48 h le colonie diventano nere con possibili riflessi verdi, di circa 2 mm di diametro, con alone nero e cratere centrale.
• Prove di conferma : le colonie presuntive di L. monocytogenes ottenute dai terreni solidi sono state isolate per sub coltura e poi sottoposte ad appropriati test morfologici, fisiologici e biochimici.
In particolare, da ciascuna piastra di terreno selettivo, sono state selezionate 5 colonie riportabili a Listeria spp e sono state trapiantate su piastre di Tryptone Soya Yeast Extract Agar (TSYEA – Biolife srl) precedentemente asciugate, in modo da ottenere colonie isolate. Le piastre sono state incubate a 37°C per 18-24 h fino ad una crescita soddisfacente. Le colonie si presentano di 1-2 mm di diametro, convesse opache e incolore a bordi netti. Dalle colonie ottenute in purezza da TSYEA sono state eseguite le prove di conferma come di seguito descritte.
Prova della catalasi: è stata prelevata una colonia tra quelle isolate ed è stata stemperata in una goccia di soluzione di perossido di idrogeno
posta su un vetrino; l’immediato sviluppo di bolle di gas indica che la reazione è positiva.
Colorazione di Gram: Listeria spp è un microrganismo Gram-positivo di forma bastoncellare corto e sottile.
Test della mobilità: una colonia prelevata dal TSYEA è stata trapiantata in Tryptone Soya Yeast Extract Broth (TSYEB – Biolife srl), poi incubato a 25 °C per 8-24 ore sino all’intorbidamento; una goccia della brodocoltura è stata deposta su un vetrino porta oggetto, coperta con un vetrino copri oggetto ed osservata al microscopio: Listeria spp è caratterizzata da movimenti a capriola.
Test dell’emolisi: se le caratteristiche morfologiche e fisiologiche e la positività alla catalasi sono indicative per Listeria spp., è stata verificata la reazione di emolisi su agar sangue. A tale scopo una colonia prelevata dal TSYEA è stata inoculata con un ago da batteriologia in agar sangue, parallelamente ad un controllo positivo (L. monocytogenes) e ad uno negativo (L. innocua). Dopo incubazione a 37°C per 24 ore sono stati interpretati i risultati secondo il seguente schema:
- L. monocytogenes: banda di β-emolisi chiara e stretta;
- L. innocua: assenza di emolisi
- L. seeligeri: debole area di emolisi
- L. ivanovii: normalmente mostra un’area di emolisi molto larga e
chiara
Fermentazione degli zuccheri: un’ansata della coltura in TSYEB è stata inoculata in Rhamnose broth e Xylose broth (Fluka), incubati a 37°C per 5 giorni al massimo; la reazione positiva compare tra le 24-48 h ed è indicata dall’acidificazione del terreno, il cui indicatore vira al giallo.
Camp test: una piastra di agar sangue è stata inoculata con
Staphylococcus aureus e Rhodococcus equi, utilizzando un ago da
batteriologia, in modo da ottenere due linee parallele; le colonie da testare (ottenute da TSYEA) sono state seminate perpendicolarmente alle due linee di S.aureus e R. equi , senza toccarle. Sulla stessa piastra è stato seminato anche un controllo per Listeria monocytogenes, L.
innocua, L. ivanovii. Dopo incubazione a 37°C per 18-24 ore, si procede
alla lettura: viene considerata positiva la reazione tra i campioni testati ed i ceppi di S. aureus e R. equi quando, in prossimità dell’intersezione tra le linee di semina, compare una banda di β-emolisi. Per Rhodococcus
equi la reazione è positiva se la banda di emolisi è larga (da 5 a 10 mm)
e a forma di freccia, mentre è negativa se ha uno spessore inferiore al mm. Per Staphylococcus aureus la reazione positiva è caratterizzata dalla comparsa di un’area di β-emolisi di soli 2 mm, che compare all’interno dell’area di emolisi parziale determinata dal ceppo di S.
aureus; la presenza di una larga banda di emolisi non è caratteristica di L. monocytogenes.
La tabella 6 può essere utilizzata nell’interpretazione delle prove per l’identificazione di Listeria spp.
Tabella 6: Interpretazione delle prove per l’identificazione di Listeria spp (ISO 11290- 1:1996 Amd.1:2004).
Specie Emolisi RamnosioRiduzione degli zuccheriXylosio S. aureusCamp testR. equi
L.monocytogenes + + - + -
L.innocua - +/- - - -
L.ivanovii + - + - +
L.seeligeri (+) - + (+) -
L.welshimeri - +/- + - -
L.grayi sub grayi - - - - -
L.grayi sub
murrayi - +/- - - -
Legenda: (+) reazione debole +/- reazione variabile + > 90% di reazioni positive -- assenza di reazione
Esistono rari ceppi di L. monocytogenes che non presentano β emolisi o reazione positiva al Camp test nelle condizioni qui descritte.
Al fine di verificare la capacità dei terreni di arricchimento e di identificazione di supportare la crescita selettiva di L.monocytogenes, sono stati utilizzati, in parallelo, campioni di controllo positivo e negativo; tali controlli sono stati allestiti tramite l’inoculo del terreno di arricchimento selettivo primario di sospensioni diluite (10/100
microrganismi) di L.monocytogenes (controllo positivo) e di
Streptococcus spp (controllo negativo).