SPETTROMETRIA DI MASSA

La cromatografia liquida dispone di molteplici rivelatori per l’indentificazione dei composti, basati su differenti principi di funzionamento. I più comuni sono basati sulla misura dell’assorbanza (rivelatore spettrofotometrico), sulla misura della fluorescenza e sulla misura dell’indice di rifrazione. Il rivelatore DAD (Diode Array Detector) ha un principio di funzionamento spettrofotometrico e misura l’assorbimento nell’UV e nel visibile restituendo lo spettro di assorbimento, caratteristico di ogni composto separato dal Sistema cromatografico. Il sistema informatico di elaborazione dei dati identifica e quantifica i composti dalla

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combinazione dello spettro di assorbimento, dell’intensità dell’assorbanza misurata e del tempo di ritenzione di ogni composto nella colonna cromatografica. Il rivelatore DAD presenta però diversi limiti per la quantificazione e l’identificazione dei composti, legati ad esempio al fatto che non è in grado di restituire lo spettro di assorbimento dei polifenoli legati agli zuccheri. Inoltre, l’identificazione dipende sempre sempre dal tempo di ritenzione e quindi dalla necessità di poter disporre degli standard dei composti cercati (López-Fernandez et al., 2020).

La possibilità di utilizzare l’uscita di un sistema cromatografico come ingresso dello spettrometro di massa, ne fa un potente rivelatore per l’identificazione dei composti ed è quindi un’alternativa ai rivelatori tradizionali. La spettrometria di massa permette di separare gli analiti in base al loro valore di massa/carica (m/z) e di frammentarli. Consente di determinare la massa molecolare esatta del composto analizzato e il suo profilo di frammentazione caratteristico e quindi permette di risalire alla formula di struttura del composto e identificarlo.

Più nello specifico l’identificazione avviene riconoscendo lo ione molecolare e gli ioni caratteristici che si sono formati, dai quali si possono intuire i processi di frammentazione che sono avvenuti durante la ionizzazione o durante la collisione (in presenza di CID) ragionando anche sui meccanismi di frammentazione standard.

Nell’interpretazione dello spettro di massa l’identificazione si basa anche sulla ricerca dei pattern isotopici ovvero sull’osservazione della presenza di più ioni molecolari associati allo stesso composto che differiscono per il valore di massa/carica (isotopi) e caratterizzati da uno specifico rapporto fra i loro valori di abbondanza (www.uniroma2.it, 2022).

Uno spettrometro di massa (figura 1.29) si compone di:

Figura 1.29 – Schema a blocchi di uno spettrometro di massa.

1. Sorgente di ionizzazione.

La sorgente di ionizzazione costituisce l’interfaccia tra la cromatografia liquida e la spettrometria di massa, consentendo di collegare l’uscita della cromatografia liquida all’ingresso dello spettrometro. La funzione principale della sorgente è la ionizzazione degli analiti, in modo da poterli spostare all’interno dello spettrometro e separare in fase gassosa in base al loro rapporto m/z. Esistono diverse tipologie di sorgente con principi di funzionamento diversi e classificabili in base all’intensità della frammentazione delle molecole nelle tipologie soft ionization e hard ionization. Nelle sorgenti che operano secondo una intensa ionizzazione (hard ionization) gli ioni ottenuti sono frammenti della molecola dell’analita. Le sorgenti di ionizzazione più comuni per l’uscita dalla cromatografia liquida sono la sorgente a fotoionizzazione a pressione atmosferica (APPI), la sorgente a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) e la sorgente a ionizzazione electrospray (ESI).

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La sorgente ESI (figura 1.30) opera una “ionizzazione morbida” che si traduce nella formazione di molecole protonate o deprotonate dell’analita, generando prevalentemente lo ione molecolare (M⁺).

Gli ioni molecolari dei diversi analiti vengono poi filtrati dall’analizzatore e rivelati dall’elettromoltiplicatore. Con la sorgente ESI, i picchi che verranno registrati sullo spettro di massa saranno in prevalenza dovuti agli ioni molecolari, consentendo un elevata sensibilità nella quantificazione. Per questo motivo è spesso abbinata agli spettrometri QTOF per la spettrometria di massa tandem, in cui attraverso il quadrupolo vengono scelti gli analiti da sottoporre agli esperimenti MS/MS isolando il loro ione molecolare per frammentarlo nella successiva camera di collisione.

Figura 1.30 – Sorgente di ionizzazione ESI (www.agilent.com, 2022).

Nella sorgente ESI l’eluito allo stato liquido uscente dalla colonna cromatografica viene spinto attraverso un ago per effetto della pressione di nebulizzazione e nebulizzato formando uno spray di microgoccioline costituite da solvente (fase mobile) e analiti ionizzati la cui carica dipende dalla tensione applicata dall’ago (figura 1.31). Le microgoccioline diventano progressivamente più piccole per l’evaporazione del solvente. Quando la repulsione elettrica interna alla microgocciolina dovuta agli analiti carichi supera la tensione superficiale, la microgocciolina scoppia formando una corrente di ioni che viene accelerata dal capillare al quale è applicata una tensione (Vcap) e indirizzata così verso l’analizzatore.

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Figura 1.31 – Nebulizzazione della sorgente ESI.

(Tratto da: Mass Spectrometry in Grape & Wine Chemistry. Flamini R. e Traldi P. John Wiley & Sons INC., Publication – Wiley Series on Mass Spectrometry, D.M. Desiderio and N.M. Nibbering, Series Editors, 2010).

2. Analizzatore di massa

È il componente attraverso il quale avviene la separazione degli ioni generati sulla base del loro rapporto m/z.

Nel caso dell’analisi dei polifenoli possono essere usati diversi tipi di spettrometri di massa che differiscono per il tipo di analizzatore. I più comuni sono l’analizzatore magnetico, l’analizzatore a quadrupolo, l’analizzatore a trappola ionica e l’analizzatore a tempo di volo (TOF Time Of Flight).

L’analizzatore a quadrupolo (figura 1.32) è costituito da quattro elettrodi paralleli di sezione cilindrica o iperbolica. I due elettrodi oppositi hanno potenziale uguale, mentre elettrodi adiacenti hanno potenziale di uguale valore, ma di verso opposto. Il potenziale applicato a ciascuna delle due coppie di elettrodi risulta dalla combinazione di una tensione continua e di una alternata a frequenza alta e modulabile. Gli ioni degli analiti che entrano nel quadrupolo, in funzione della frequenza del potenziale degli elettrodi e del loro rapporto m/z possono acquisire una traiettoria stabile ed uscire dal quadrupolo oppure oscillare fino ad attraversare gli elettrodi ed essere persi. Modulando la frequenza della tensione è possibile filtrare gli ioni del valore massa/carica voluto.

Figura 1.32 – Analizzatore a quadrupolo.

(Tratto da: Mass Spectrometry in Grape & Wine Chemistry. Flamini R. e Traldi P. John Wiley & Sons INC., Publication – Wiley Series on Mass Spectrometry, D.M. Desiderio and N.M. Nibbering, Series Editors, 2010).

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L’analizzatore a tempo di volo (TOF) è costituito da un tubo all’interno del quale gli ioni sono accelerati e indirizzati verso il rivelatore da un campo elettrico di intensità nota. Poiché la velocità varia in modo inversamente proporzionale alla massa, gli ioni più leggeri impiegano meno tempo ad arrivare al rivelatore. Misurando il tempo che le particelle impiegano per raggiungere il rivelatore posto ad una distanza nota, viene calcolato il loro rapporto massa/carica. Poiché la forza di accelerazione del campo elettico varia nello spazio, ioni situati in posizioni diverse acquistano velocità diverse a parità di valore m/z. Per ovviare a questo problema gli analizzatori a tempo di volo possono essere dotati di un riflettore (reflectron), ovvero una piastra che utilizza un campo elettrostatico costante per riflettere il fascio di ioni verso il rivelatore e compensare le differenze di energia cinetica (figura 1.33).

Negli spettrometri di massa con sorgenti di ionizzazione ESI, definite anche continue, gli ioni introdotti nell’analizzatore TOF vengono accelerati lungo l’asse perpendicolare della loro direzione iniziale (figura 1.33).

Figura 1.33 – Schema dello spettrometro di massa a quadrupolo/tempo di volo Q/TOF.

(Tratto da: Mass Spectrometry in Grape & Wine Chemistry. Flamini R. e Traldi P. John Wiley & Sons INC., Publication – Wiley Series on Mass Spectrometry, D.M. Desiderio and N.M. Nibbering, Series Editors, 2010).

3. Rivelatore.

Con la gran parte degli analizzatori utilizzati il rivelatore è un elettromoltiplicatore.

4. Calcolatore.

Dall’elaborazione del segnale proveniente dal rivelatore genera lo spettro di massa, ovvero un grafico costituito da un insieme di linee verticali o picchi, ognuna delle quali rappresenta l’abbondanza di uno ione frammento caratterizzato dal valore massa/carica indicato.

5. La pompa a vuoto.

Il vuoto creato all’interno dello spettrometro di massa serve ad evitare le interferenze altrimenti dovute agli urti tra gli ioni e le molecole dei gas atmosferici presenti all’interno dello spettrometro).

65 6. Esapoli e ottopoli

In uno spettrometro di massa sono presenti anche esapoli e ottopoli. Sono componenti che operano con un principio di funzionamento simile a quello del quadrupolo per guidare e focalizzare il fascio di ioni tra un analizzatore e il successivo (www.uniroma2.it, 2022).