Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche

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Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche

Prof. Oliviero E. Varnier

VIRUS di EPSTEIN BAR

EBV

CENNI STORICI

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Nel 1961 un chirurgo che lavorava in Uganda, Denis Burkitt, presentò i risultati delle sue ricerche allo staff della Middlesex Hospital Medical School in Inghilterra.

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Riferì che l’incidenza di un particolare tipo di tumore in bambini africani presentava una distribuzione geografica in rapporto alle piogge e alla temperatura.

CENNI STORICI

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Tale malattia, che colpisce circa 8 bambini su 100,000 in alcune zone dell’Africa e della Nuova Guinea, presto fu conosciuta come linfoma di Burkitt.

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L’influenza del clima sull’incidenza del tumore suggeriva che un fattore biologico ancora sconosciuto doveva essere coinvolto.

CENNI STORICI

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Tre ricercatori, M.A. Epstein, Y.M. Barr and B.G. Achong, tentarono di individuare i possibili virus oncogeni in campioni di tessuto neoplastico inviati dall’Uganda in Inghilterra.

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Nel 1964 riuscirono ad individuare l’agente eziologico utilizzando il microscopio elettronico: si trattava di un nuovo virus appartenente alla famiglia ‘herpesviridae’.

CRONOLOGIA

! 1958 prima descrizione del linfoma di Burkitt nella zona malarica dell’Africa.

! 1964 Epstein e Barr ottengono linee cellulari di linfoma di Burkitt; prima descrizione di un herpes virus infettante tali cellule.

! 1968 EBV viene riconosciuto come agente eziologico della mononucleosi infettiva.

! 1969 dimostrazione della capacità di EBV di trasformare

linfociti in coltura; EBV può immortalizzare cellule in

coltura e causare tumori in primati non umani.

INTRODUZIONE

! Il virus EB (da Epstein e Barr, che per primi l’hanno isolato) è un herpesvirus ubiquitario responsabile della mononucleosi infettiva e, in tempi recenti, ritenuto uno dei fattori a rischio dello sviluppo del linfoma di Burkitt, del carcinoma nasofaringeo e di altre sindromi linfoproliferaive in soggetti immuno- compromessi.

! L’EBV è un potente mitogeno per le cellule B, che immortalizza in vitro.

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Proprietà del virus

! EBV è un gamma-herpesvirus con una morfologia simile a quella degli altri herpesvirus umani e un DNA virale di 184 kbp.

! Lo spettro d’ospite e il tropismo di tessuto di EBV sono determinati dalla limitata distribuzione del recettore cellulare, che è il recettore per il componente C3d del complemento (CR2 o CD21) e da un corecettore costituito dalle molecole di classe II del sistema HLA.

! Tali recettori sono espressi sulle cellule B dell’uomo e dei primati e sulle cellule epiteliali dell’orofaringe e del nasofaringe.

! Dopo 4-6 settimane di incubazione elevati titoli virali sono osservabili nei lavaggi orofaringei e nella saliva.

! La produzione di elevate quantità di virus è la conseguenza di attiva replicazione di EBV nei linfociti B (considerati il bersaglio elettivo), che infiltrano la mucosa orofaringea.

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Proprietà del virus

! L’infezione da EBV presenta due decorsi:

! un’infezione di tipo latente e

! una infezione di tipo replicativo.

! EBV, una volta entrato in un linfocita B quiescente, va incontro a latenza prima di iniziare un ciclo litico, mantenendosi in forma episomale circolare con proprietà simili al DNA cromosomale.

! I linfociti B infettati vanno quindi incontro a immortalizzazione, proliferando continuamente ed esprimono un limitato numero di geni virali, tra cui:

! 6 proteine nucleari della famiglia EBNA (EBV Nuclear Antigens)

! 3 proteine di membrana LMP (Latent Membrane Protein).

! A seconda del tipo di cellula infettata (linfociti B normali, cellule del linfoma di Burkitt, cellule del carcinoma nasofaringeo) la fase di latenza di EBV presenta caratteristiche differenti in relazione al tipo di proteine che vengono espresse.

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Proprietà del virus

L’attivazione del programma litico in vivo inizia quando, tramite mecanismi non ancora chiariti, vengono espressi:

! due geni precocissimi E (immediate early) designati BZLF1 e BRLF1, che codificano per proteine nucleari ad attività trascrizionale che regolano l’espressione di geni virali recoci (E, early) e di geni cellulari utili alla sintesi del DNA virale.

! L’attivazione dei geni precoci è seguita da un’attiva sintesi del DNA virale, all’espressione dei geni codificanti per le proteine tardive (L, late) e dall’assemblaggio dei virioni.

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Meccanismi patogenetici

! L’infezione da EBV è molto diffusa ed è trasmessa attraverso la saliva e le secrezioni faringee, direttamente o tramite lo scambio di utensili: bicchieri, posate, spazzolini ecc.

! Nei bambini l’infezione presenta un decorso subclinico inapparente, mentre nei giovani adulti “malattia del bacio” può presentare un decorso subclinico a diversi livelli di gravità.

! I linfociti B infettati da EBV vanno incontro ad attiva proliferazione in assenza di apoptosi, che viene inibita da alcune proteine virali.

! La proliferazione policlonale di linfociti B si accompagna a un’elevata produzione di immunoglobuline, tra cui IgM

! L’ingrossamento dei linfonodi, della milza e del fegato, tipico della mononucleosi infettiva, è causato dalla proliferazione massiva sia delle cellule B infette sia delle cellule T attivate.

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Meccanismi patogenetici

! La linfocitosi, che si osserva nel sangue periferico a partire dalla 2° settimana dall’infezione, è dovuta all’attivazione e alla proliferazione dei linfociti T, che appaiono come linfociti atipici.

! La risoluzione della malattia si osserva in seguito alla completa eliminazione delle cellule B infettate produttivamente da parte dei linfociti T citotossici, che riconoscono i peptidi virali esposti sui linfociti B.

! Tuttavia, una piccola percentuale di linfociti B memoria esprimenti gli antigeni EBNA non viene eliminata e rappresenta la sede di latenza di EBV, che persisterà per tutta la vita del paziente e darà avvio alla fase di riattivazione in seguito a stimoli opportuni.

EPIDEMIOLOGIA

! Quasi tutta la popolazione (90-95%) è infettata da EBV e questi soggetti, sebbene spesso asintomatici, liberano il virus occasionalmente per tutta la loro vita.

! Il virus viene trasmesso per contatto intimo.

! L’infezione è associata con fattori socioeconomici e nei paesi in via di sviluppo, la sieropositività si osserva più precocemente che nei paesi industrializzati.

! Fino all’80% degli studenti che iniziano il college negli USA è sieropositiva e molti dei studenti negativi diventeranno positivi durante il college.

! Il virus può essere trasmesso anche con le trasfusioni di sangue.

Mononucleosi Infettiva

! Come già osservato per altre infezioni primarie causate da herpesvirus, anche nel caso di EBV la maggior parte delle infezioni primarie presenta un decorso asintomatico.

! Le manifestazione cliniche della mononucleosi infettiva, che compaiono dopo 30-40 giorni dal contagio, sono rappresen- tate da:

! malessere generale, astenia, rialzo febbrile, faringite accompagnata da linfoadenopatia cervicale ed epato- splenomegalia.

! Raramente fatale nei soggetti sani, l’infezione può essere accompagnata da complicanze soprattutto di natura neurolo- gica, che comprendono la sindrome di Guillain-Barré e una meningoencefalite asettica.

! La malattia dura dalle 2 alle 4 settimane, ma in alcuni

MONONUCLEOSI INFETTIVA

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•  Linfoma di Burkitt - circoscritto all’Africa Centrale - eziologia multifattoriale

- l’infezione da EBV è necessaria ma non è sufficiente

•  Carcinoma nasofaringeo - in alcune regioni della Cina

•  Linfomi B - in pazienti immunosoppressi

TUMORI CAUSATI DAL VIRUS di EPSTEIN-BARR

B-cell

EBV

B-cell

Iniziazione

MALARIA

Attivazione policlonale e immuno- soppressione Attivazione policlonale

B-cell

Pool allargato

EVENTO GENETICO

BL

Traslocazioni cromosomiche

c-myc da 8 al locus delle catene pesanti in 14 c-myc da 8 al locus delle catene leggere in 2 o 22

EBV e il Linfoma di Burkitt (BL)

B-cell B-cell

B-cell

B-cell B-cell B-cell

B-cell B-cell

MALNUTRIZIONE

HIV

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Il tipico virione erpetico è costituito da quattro componenti strutturali:

§  NUCLEO (core, Ø 75 nm):

ð  contiene una molecola di DNA lineare a doppia elica (ds)‏

§  CAPSIDE PROTEICO (Ø 90-110 nm):

ð  di forma icosaedrica circonda il core

ð  costituito da 162 capsomeri prismatici

§  TEGUMENTO (20-40 nm di spessore):

ð  zona amorfa ed asimmetrica di materiale proteico disposta attorno al capside

§  PERICAPSIDE:

ð  membrana esterna di natura fosfolipidica di origine cellulare arricchita di glicoproteine virus-specifiche che sporgono dalla superficie (spikes)‏

MORFOLOGIA

EBV: ANTIGENI

! Antigeni precoci: sono proteine non strutturali, la cui sintesi non dipende dalla replicazione del DNA virale.

! Antigeni tardivi: sono i componenti strutturali del capside virale (antigeni del capside) e dell’involucro virale (pericapside). Sono prodotti in abbondanza nelle cellule con infezione virale produttiva.

Una penetrazione efficiente richiede la presen- za di altre proteine accessorie: gp25, gp 42/38 e gp85, che mediano l’interazione con le mole- cole MHCII (co-recettori)‏

Il processo che conduce alla replicazione inizia con l’interazione delle glicoproteine virali gp350/220 con uno specifico recettore cellulare di membrana: CR2/CD21 recettore della frazione C3d del complemento

Dopo la fusione il nucleocapside si libera del pericapside e rimane avvolto dal tegumento.

Viene rilasciato all’interno del citoplasma

REPLICAZIONE VIRALE 1

EBV aderisce alle cellule legando il recettore del componente C3d del sistema del complemento (CD21). Il legame è mediato dalla glicoproteina virale gp350/220, che è coinvolta nella penetrazione del virus. Mole- cole gp350/220 multiple cross- legano CD21 determinando il patching e in seguito il capping dei complessi ligando-recettore.

Quindi il virus penetra nella cellula

REPLICAZIONE VIRALE

DIAGNOSI

nei casi di mononucleosi infettiva la diagnosi viene effettuata in base alla caratteristica triade di sintomi (il quadro clinico permane per un periodo di 1-4 settimane dalla comparsa)‏

1) Febbre 2) Faringite 3) Linfoadenopatia e dalla presenza di anticorpi eterofili

! Test di Paul-Bunnel positivo

(Mono Test, test di emoagglutinazione di emazie ovine o equine)

•  risultati falsi positivi 3% dei casi

•  risultati falsi negativi 10-15% dei casi

In caso di Mono Test negativo si procede con una diagnosi di conferma/differenziale (per distinguere l’infezione da EBV da mononucleosi di altra origine)‏

! Diagnosi sierologica indiretta

! Diagnosi diretta

! isolamento del virus

! identificazione del DNA virale

DIAGNOSI INDIRETTA 1

RICERCA DI ANTICORPI DIRETTI VERSO:

!   VCA (Viral Capsid Antigens) antigeni capsidici

! gp110 e gp350 del pericapside e del nucleocapside

! IgM: compaiono precocemente e scompaiono dopo 4-6 settimane

! IgG: compaiono nella fase acuta con un picco dopo 2-4 settimane e declinano lentamente persistendo per tutta la vita

!   EA (Early Antigens) antigeni precoci:

! Precocissimi: BZLF1

! Precoci: BALF2, BHRF1, BMRF1 e BSMLF1)‏

! IgG: prodotte durante le fasi iniziali dell’infezione sia in fase acuta che cronica

!   EBNA (Epstein Barr Nuclear Antigens) antigeni nucleari

! IgG: compaiono diverse settimane o mesi dopo l’infezione e persistono

Tabella 38.2 Profi lo sierologico delle infezioni da EBV B-95

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Riattivazione

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Infezione pregressa

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Infezione cronica

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Infezione acuta

EBNA EA IgG

VCA IgG VCA IgG

IgM

DIAGNOSI INDIRETTA 2

sintomi

VCA-IgG EBNA-IgG EA-IgG

DIAGNOSI DIRETTA

ISOLAMENTO DEL VIRUS

! EBV infetta e immortalizzare linfociti umani in coltura

! Esame indaginoso non utilizzato in diagnostica

IDENTIFICAZIONE DEL DNA VIRALE

! mediante PCR in campioni di saliva, sangue intero, tessuto linfoide

VACCINO

! L’allestimento di un vaccino verso EBV risulterebbe di utilità per diversi gruppi di persone sieronegative:

!   pazienti che devono essere sottoposti a trapianto di midollo o di organo solido

!   individui che vivono in aree geografiche a rischio di elevata incidenza di linfoma di Burkitt o di carcinoma nasofaringeo

! Diversi studi sperimentali sono ancora in corso per valutare la sicurezza e l’efficacia di alcuni vaccini:

! per prevenire l’infezione primaria

! contro la proteina gp220/350, capace di indurre risposta immunitaria sia umorale che citotossica (dati preliminari hanno evidenziato la comparsa di Ab neutralizzanti nei soggetti a cui era stato somministrato il vaccino)‏

! per generare una risposta immunitaria terapeutica via CTL

! contro il peptide sintetico parte dell’antigene EBNA 3A

TERAPIA

! Mononucleosi infettiva

! acicloguanosina a dosi elevate (substrato della deossinucleoside kinasi virale e inibitore della DNA polimerasi): beneficio marginale

! inibisce la replicazione virale

! riduce l’eliminazione del virus

! non ha nessuna efficacia sui sintomi della malattia (causati dalla RI dell’ospite)‏

! corticosteroidi: nei pazienti con complicanze gravi

! Linfoma di Burkitt

! chemioterapia (il linfoma si presenta con localizzazione multifocale)‏

! resezione chirurgica e radioterapia (riduzione della massa tumorale)‏

! Carcinoma nasofaringeo

! ablazione chirurgica della lesione in associazione ad applicazioni di radioterapia

!   PTLD

! riduzione della terapia immunosoppressiva

! chemioterapia (antracicline, mifepristone e acido retinico)

! infusione di linfociti T citotossici EBV-specifici autologhi (prevenzione)‏

! fine