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Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
prof. Oliviero E. Varnier
MICOBATTERI
TUBERCOLOSI
L'incidenza della tubercolosi in un Paese è direttamente proporzionale al tasso di povertà
La disponibilità di tecnologie avanzate in un Paese è direttamente proporzionale al tasso di ricchezza
PARADOSSO: dove esistono le tecniche
diagnostiche più sofisticate non c'è tubercolosi!
CLASSIFICAZIONE
I micobatteri appartengono alla famiglia delle Mycobac- teriaceae e sono inclusi nell’ordine degli Actinomycetales assieme aì corinebatteri, nocardie ed altri.
Il genere Mycobacterium comprende importanti patogeni per
l’uomo e gli animali e numerosi batteri ambientali, alcuni dei
quali possono causare patologie nell’ospite immunocompro-
messo.
CLASSIFICAZIONE
Il genere comprende oltre 100 specie: bacilli lunghi 2 - 4 μm on un diametro di 0,3-0,5 μm.
bacilli aerobi stretti,
Immobili e asporigeni con una caratteristica parete cel- lulare, ricca in lipidi complessi, polisaccaridi e glicolipidi.
Esternamente alla membrana plasmatica il peptidoglica- no, cui sono legati covalentemente:
arabinogalattani (polisaccaridi a lunga catena) lipoarabinomannani (LAM) e
lipomannani
Ultrastruttura di Mycobacterium tuberculosis e struttura della parete cellulare. A. Microfotografia al microscopio elettronico con ingrandimento della zona corrispondente alla parete cellulare.
CLASSIFICAZIONE
FATTORE CORDALE
CLASSIFICAZIONE
Gli acidi micolici sono acidi grassi a lunga catena che interagiscono con piccoli glicolipidi che rivestono la parete.
Esternamente alla parete ritroviamo zuccheri che formano una struttura simil-capsulare, in associazione con lipidi e glicolipidi rilasciati dal batterio.
La parete dei micobatteri è costituita da un doppio strato
lipidico, assimmetrico e complesso, che definisce una
struttura simile alla membrana esterna dei batteri
gram-negativi .
CLASSIFICAZIONE
Le caratteristiche della parete fanno sì che i micobatteri non si colorino con la colorazione di Gram, ma mediante la colorazione Ziehl-Nielsen, che evidenzia le proprietà tintoriali note come acido- alcol resistenza.
Tale proprietà consiste nella capacità dei batteri di
trattenere, una volta colorati con carbolfucsina, la
colorazione rossa anche quando sottoposti a
trattamenti decoloranti energici con acidi e alcol.
CLASSIFICAZIONE
I micobatteri si suddividono in: a lenta crescita e a rapida crescita
I micobatteri a lenta crescita comprendono numerose specie patogene per l’uomo e gli animali e le più importanti sono: M.
tuberculosis, M. leprae e M. ulcerans. Alcune specie causano infezioni granulomatose nell’ospite immunocompeten- te. Altre causano infezioni disseminate nell’ospite immunode- presso. Le specie più frequentemente isolate: M. avium intracellulare (MAI) complex MAC)
I micobatteri a rapida crescita comprendono specie pre- valentemente ambientali e non di interesse per la patologia umana, con alcune rare eccezioni:
M. chelone: può causare infezioni polmonari croniche;
M. fortuitum e M. abscessus, possono causare infezione dei
tessuti molli o infezioni disseminate nell’ospite immunocompro-
messo.
Micobatteri non tubercolari che possono essere isolati da campioni
Complesso Micobacterium tuberculosis
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Mycobacterium tuberculosis è l’agente eziologico della tuber- colosi, una malattia polmonare cronica dell’uomo negli ultimi millenni. Numerosi reperti (scheletri di oltre 8000 anni e mummie degli Egizi e Inca) hanno evidenziato lesioni ossee compatibili con l’infezione tubercolare.
Nei secoli la TB è stata una minaccia per l’uomo nelle aree ur- bane e densamente popolate, dove si sono verificati frequenti fenomeni epidemici responsabili della attuale pandemia.
M. tuberculosis appartiene al gruppo Mycobacterium tuberculo-
sis complex (MTBC), di cui fanno parte M. canettii, M. african-
um, M. microti e M. bovis: una singola specie con elevata
omologia.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
M. bovis è l’agente eziologico della TB negli animali; ha un ampio spettro d’ospite: infetta bovini, antilopi, foche, elefanti, leoni ecc. Raramente causa patologia nell’uomo, che si infetta assumendo alimenti contaminati, come il latte di bovini infetti.
M. microti è l’agente eziologico della TB nei roditori e non è patogeno per l’uomo.
Nel 1998 è stato completato il sequenziamento del genoma di M. tuberculosis H37Rv. Il genoma è costituito da 4.411.529 bp e codifica per 3.986 proteine.
Più recentemente è stato sequenziato completato un ceppo clinico di M. tuberculosis (ceppo CDC1551) e un ceppo di M. bovis.
È una specie geneticamente stabile con poca variabilità
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Analisi di genomica comparativa tra vari ceppi di MTBC hanno permesso di individuare regioni in cui maggiori sono le differenze tra questi e di definire i rapporti genetici edi evolutivi tra le varie specie e/o sottospecie.
È stato possibile costruire un albero genealogico
all’interno di MTBC e di dimostrare come le varie
subspecie si siano evolute attraverso un processo di
DELEZIONE GENICA, in cui frammenti di genoma
anche di diverse decine di kb SONO STATI PERSI.
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
QUALE È STATO L’EFFETTO DELLE DELEZIONI GENI- CHE SULL’ADDATTAMENTO ALL’OSPITE MAMMIFERO?
le tre subspecie che causano la TB nell’uomo, M.
tuberculosis, M. africanum e M. canettii, raramente o mai infettano gli animali.
M. microti è l’agente eziologico della TB nei roditori di cam-pagna, ma è assolutamente avirulento per l’uomo.
M. microti ha perso per delezione genica un fram- mento di genoma simile a quello responsabile della perdita di virulenza del ceppo BCG.
M. bovis presenta il maggior numero di delezioni
geni-che e paradossalmente presenta il più ampio
spettro d’ospite
EPIDEMIOLOGIA
EPIDEMIOLOGIA
TUBERCOLOSI
CARATTERISTICHE GENERALI
Mycobacterium tuberculosis è uno dei più antichi, com- plessi ed evoluti agenti infettivi per l’uomo, ed ha svilup- pato sofisticati meccanismi per evadere la risposta im- munitaria dell’ospite o per trarre vantaggio dalla stessa.
Una delle principali caratteristiche di M. tuberculosis è la sua capacità di:
resistere all’azione battericida dei macrofagi, mediante un meccanismo che prevede l’inibizione della fusione lisoso- ma-fagosoma.
Il micobatterio rimane così in un vacuolo non acidificato, in
cui sono assenti gli enzimi e molecole ad azione microbicida
e dove il micobatterio è in grado di replicarsi attivamente.
Fattori che Determinano la Possibilità di Contrarre la TBC
Il numero di organismi espulsi
La concentrazione degli organismi nell’aria determi- nata dal volume dello spazio e dalla ventilazione
Il tempo di esposizione all’aria contaminata L’immunità individuale
HIV+ maggiori probabilità di contrarre TBC
Quantificazione della Probabilità
Contatti stretti: familiari, compagni di camera, amici, colleghi di lavoro
Condivisione stabile di uno spazio confinato per molte ore algiorno
Contatti regolari: condivisione regolare dello stesso spazio chiuso
21-23%
Analisi microscopica di tessuto polmonare isolato da un topo infettato sperimentalmente con Mycobacterium tuberculosis
A. Infiltrato cellulare che si organizza in granuloma. I micobatteri risiedono prevalentemente nella parte centrale del granuloma, all’interno di macrofagi “schiuomosi”. B. Macrofagi
PATOGENESI: dalla ESPOSIZIONE alla MALATTIA
Esposizione ad un caso contagioso
FATTORI di VIRULENZA
Non sono stati ancora identificati le proteine e i fattori di virulen- za di M. tuberculosis, sebbene si ipotizzi un diretto coinvolgi- mento delle proteine codificate dalla regione di differenza 1 (RD1).
La regione RD1 è un frammento di genoma di 10,7 kb che codifica per numerosi geni, tra cui in particolare Esat-6 e cfp10.
Tale regione è assente nel ceppo vaccinico M. bovis BCG ed è stato dimostrato come l’attenuazione di quest’ultimo sia dovuta all’assenza di RD1. Infatti l’inserimento della regione RD1 nel genoma di BCG ha come risultato un aumento della virulenza del ceppo BCG ricombinante.
la proteina ESAT-6, codificata dalla regione RD1, potrebbe indurre la formazione di pori nelle membrane dei vacuoli del macrofago in cui il micobatterio si moltiplica.
PATOGENESI
Gli acidi micolici possono essere organizzati in strutture complesse quando legati covalentemente con arabinogalatta- ni o altri zuccheri.
Il trealosio dimicolato (TDIM), anche noto come FATTORE CORDALE, è uno dei più importanti ed esercita una potente azione biologica.
Presenta un ’ attività immunostimolatoria, stimola la secrezione di citochine ed è coinvolto nel meccanismo di patogenesi che sfocia con il danno tissutale tipico della TB.
È coinvolto nella protezione da stress ambientali, contribuisce alla bassa permeabilità della parete cellulare che conferisce una natura- le resistenza ai farmaci ed è coinvolto nella protezione dagli stress ossidativi e nella persistenza nei tessuti dell’ospite immunocompe tente.
La porzione esterna della parete è ricca in glicolipidi complessi e fenolici, che sono delle cere non polari rilasciate dalla cellula e svolgono una importante azione biologica
RAPPORTO OSPITE-PARASSITA
L ’ interazione dei micobatteri con il sistema immunitario innato e acquisito, ha un ruolo fondamentale nel rapporto ospite-parassita.
Alcuni componenti della parete interagiscono con recettori presenti sulla superficie delle cellule del sistema immunitario, tra cui i i recettori Toll-like (TLR). È stato dimostrato che il LAM interagisce con il TLR2, così come alcune proteine di parete.
è stata dimostrata l’induzione di apoptosi, che consente a micobatteri di evadere la risposta dell’ospite o di modulare l’intensità della risposta immunitaria.
M. tuberculosis induce una intensa risposta cellulare specifica diretta verso gli antigeni secreti dal micobatterio durante le prima fasi dell’infezione. Le proteine Esat-6 e CFP10 sono due tra gli antigeni più immunogenici di M. tuberculosis, tanto da essere utilizzati come base per la diagnosi indiretta di infezione da M. tuberculosis.
PATOGENESI
La 1° infezione: la risposta specifica
Da 2 a 4 settimane dopo l’infezione si sviluppano 2 ulteriori risposte:
1.
la risposta che distrugge i tessuti (ipersensibilità di tipo-ritardato) 2. La risposta attivante i macrofagi (immunità cellulo-mediata)3. ed è l’equilibrio tra queste 2 risposte che determina la forma di tubercolosi che si svilupperà successivamente
1 LA RISPOSTA CHE DAANNEGGIA I TESSUTI
RISPOSTA IMMUNITARIA
La caratterizzazione immunologica della risposta immunitaria che si sviluppa in risposta all’infezione da M. tuberculosis è piuttosto complessa.
La risposta cellulare è caratterizzata dalla presenza di linfociti CD4, che secernono citochine pro-infiammatorie (IFN-γ) e da linfociti CD8 ad azione citotossica.
Non è stato possibile ad oggi evidenziare dei correlati immunologici di protezione, vale a dire un tipo di risposta immunitaria specifica correlabile con il controllo dell’infezione.
L ’ assenza di tali informazioni rende ancora più difficile lo
sviluppo di un nuovo vaccino contro la TB.
PATOGENESI
La moltiplicazione del batterio richiama cellule del sistema immunitario, che mediante la secrezione di chemochine e citochine inducono uno stato infi ammatorio che causa una necrosi caseosa e danno tissutale che sfocia nella comparsa delle tipiche caverne presenti a livello del parenchima polmonare: questa è la classica forma di TB polmonare, clinicamente evidente e che rappresenta la forma contagiosa dell’infezione.
VACCINO BCG:IL BACILLO DI CALMETTE E GUÉRIN
Il bacillo di Calmette e Guérin (BCG) è ancora oggi l’unico vaccino disponibile contro la TB.
Il BCG è un vaccino vivo attenuato, ottenuto da Calmette e Guérin mediante passaggi seriali in terreno di patata biliata a partire da un ceppo virulento di M. bovis.
Durante il processo di attenuazione, il ceppo BCG ha perso numerosi frammenti di genoma, che prendono il nome di regioni di differenza (RD).
Poiché il passaggio dei ceppi è avvenuto anche dopo l’isolamento del ceppo vaccinico da Calmette e Guérin, si è assistito alla perdita di frammenti di genoma anche in epoche successive, tanto che oggi si conoscono ceppi diversi di BCG, che normalmente prendono il nome dalle case farmaceutiche che li producono, i quali presentano un diverso pattern di RD.
La più importante delle regioni RD è la RD1, che contiene una regione del genoma che codifica per i geni Esat-6 e cfp10, e più in generale per il
VACCINO
A partire dal 1921, anno della prima immunizzazione con BCG, sono state somministrate in tutto il mondo centinaia di milioni di dosi di BCG.
Il vaccino BCG si somministra subito dopo la nascita per via sottocutanea e dopo un mese si verifica l’avvenuta immunizzazione mediante il test della tubercolina.
Nel corso del secolo scorso è stato possibile evidenziare pregi e difetti del vaccino. Il vaccino si è dimostrato sostanzialmente sicuro e il basso costo ha reso possibile l’attuazione di procedure di immunizzazione anche nei paesi più poveri.
Il vaccino BCG si è inoltre dimostrato efficace nel prevenire le forme, spesso fatali, di TB disseminata (miliare) e di meningite tubercolare nei bambini
.
VACCINO
Studi in paesi ad alta endemia di TB hanno dimostrato come
l’efficacia di BCG nel prevenire le forme di TB attiva sia scarsa e spesso quasi zerol’interferenza di micobatteri ambientali con lo sviluppo di una risposta immuni- taria, che potrebbe essere responsabile dello svanire col tempo della risposta immunitaria indotta dal vaccino e dell ’ inefficacia di strategie di richiamo (boosting);
BCG, ceppo attenuato ma vitale, non dovrebbe essere somministrato per ragioni di sicurezza nei soggetti con infezione da HIV, che rappresentano una popolazione particolarmente a rischio per lo sviluppo della TB.
Poiché le persone vaccinate con BCG sviluppano una positività alla
tubercolina, questo test non può essere efficacemente utilizzato, in
una popolazione vaccinata, per valutare la prevalenza dell’infezione
in una data comunità o individuare i contatti (persone che, vivendo a
contatto con un soggetto cui è stata diagnosticata una TB attiva,
NUOVI VACCINI
Negli ultimi anni, per un rinnovato investimento nella ricerca sulla TB, abbiamo assistito allo sviluppo di nuovi vaccini sperimentali.
Sono state implementate diverse strategie di vaccinazione:
vaccini a subunità, costituiti da due o più antigeni ricombinanti e
purifi cati di M. tuberculosis, somministrati con sostanze adiuvanti;
ceppi di Vaccinia virus ricombinanti che esprimono antigeni
dominanti di M. tuberculosis;
ceppi di BCG ricombinanti che iperesprimono antigeni domi-
nanti o che sono stati modificati per renderli più immunogenici.
I risultati ottenuti con alcuni di questi vaccini sono buoni in modelli
preclinici animali e si spera che gli studi clinici possano fornire una
valida alternativa al vaccino BCG.
HOSPITAL ALLI CAUSAI
DIAGNOSI
La diagnosi di infezione da M. tuberculosis, così come per gli altri agenti di infezione, viene classicamente distinta in diagnosi microbiologica o diretta e in diagnosi immuno- logica o indiretta.
La prima viene utilizzata per evidenziare soggetti con TB
attiva, mentre la seconda viene utilizzata per evidenziare i
soggetti infettati con M. tuberculosis, ma non è in grado di
distinguere tra soggetti sani (infezione latente) e soggetti
malati (infezione attiva).
PROMOZIONE E ASSISTENZA COMUNITARIA
RISULTATI TB
15 comunitá sotto controllo 2400 persone monitorate 2169 PPD (Mantoux)
408 esami microscopiciZiehl Nielsen 380 esami colturali Lowenstein
21 pazienti tratatti
DIAGNOSI DIRETTA
CAMPIONI: la diagnosi microbiologica si basa normalmente sulla ricerca di M. tuberculosis nel campione biologico (espettorato, lavaggio bronco alveolare, urine, linfonodo ecc.).
DECONTAMINAZIONE: i campioni biologici polimicrobici, quali ad esempio espettorati, devono essere decontaminati mediante trattamento con soluzioni contenenti idrossido di sodio, cui il bacillo è resistente, per eliminare la flora microbica presente e concentrati per incrementare le possibilità di isolare il bacillo.
PAUCIBACILLARE: è infatti importante ricordare che pazienti con
TB attiva possono eliminare anche solo pochi bacilli, che
moltiplicandosi molto lentamente nei terreni di coltura, verrebbero
rapidamente sopraffatti dalla presenza di altri batteri nel campione
biologico. Anche per tali motivi, la diagnosi microbiologica viene
DIAGNOSI DIRETTA: ESAME MICROSCOPICO
Il campione è analizzato al microscopio dopo colorazione con Ziehl-Nielsen.
La presenza di batteri AAR è indicativa di una infezione attiva da micobatteri patogeni, sebbene sia necessario identificare i micobatteri e distinguerli da altri batteri acido-alcol resistenti (actinomiceti, nocardie).
I micobatteri si presentano al microscopio come dei bacilli rossi su sfondo blu, allungati (A) e nel caso di M. tuberculosis spesso organizzati in piccoli gruppi di 3-10 bacilli (aggregati, B).
L’analisi microscopica presenta importanti vantaggi: semplicità, rapidità di esecuzione, basso costo e permette di evidenziare i soggetti contagiosi. È stato calcolato che nei Paesi ad alta endemia di TB, l’analisi microscopica consenta di evidenziare circa il 60% dei pazienti con TB attiva.
DIAGNOSI DIRETTA: ESAME COLTURALE
Il metodo diagnostico più sensibile è rappresentato dalla coltura. Nei laboratori attrezzati, una 2° aliquota del campione è utilizzata per le colture.
Si procede all’inoculo di un terreno solido (Lowestein-Jensen), costituito da tuorlo d’uovo, glicerolo e verde di malachite come inibitore della crescita di altri batteri (B).
La crescita dei micobatteri e in particolare di M. tuberculosis è molto lenta e sono necessari 45 giorni di incubazione per definire negativa una coltura.
Figura D: colonie di micobatteri in terreni solidi.
DIAGNOSI DIRETTA: AUTOMAZIONE E IDENTIFICAZIONE
Al fine di evidenziare più rapidamente i micobatteri in coltura, sono stati sviluppati dei sistemi automatizzati costituiti da terreni liquidi, in grado di evidenziare la crescita dei micobatteri mediante la misurazione del consumo di ossigeno o di altri metaboliti come ad esempio acidi grassi marcati radioattivamente (C 14) e più recentemente coniugati con molecole chemiluminescenti.
L’utilizzo di tali sistemi di coltura ha permesso di ridurre il tempo necessario per iidentificare I micobatteri in coltura con la maggior sensibilità possibile (20-30 giorni).
I ceppi isolati in coltura liquida devono essere tipizzati mediante Real Time PCR, che consentono di identifacre mutazioni associate alla resistenza ai farmaci (isoniazide, rifampicina, fluorochinoloni e farmaci iniettabili.
Le manipolazione delle colture liquide e solide deve essere effettata in laboratori con livello 3 di Biosicurezza(BSL3)
DIAGNOSI MOLECOLARE
La diagnosi molecolare di M. tuberculosis o di micobatteri è oggi uno strumento utile, che consente di diagnosticare rapidamente (< 12 ore) con elevata specificità la presenza di micobatteri nei campioni biologici.
Le caratteristiche dei micobatteri spiegano la mancata sensibilità
La diagnosi molecolare può essere eseguita direttamente nel campione biologico o nella colonia isolata in coltura. Nel primo caso si ricerca normalmente M. tuberculosis, che è di gran lunga il principale micobatterio di interesse nella patologia umana, mediante tecniche di amplificazione genica che ricercano sequenze di DNA specifiche per M. tuberculosis.
La specificità di tali sistemi diagnostici è molto elevata,
La PCR,nonostante sia ingrado di amplificare 10-50 micobatteri, non è sensiubile nell’analisi di campioni clinici.
L’identificazione molecolare può essere eseguita amplificando delle sequenze di DNA condivise tra i micobatteri (ad esempio un frammento di DNA che codifica per la proteina HSP65 o per l’rRNA 16S) e procedere successivamente al
Diagnostica
Prima e Dopo TERAPIA
DOTS Directed Observed Therapy Short-course
Il protocollo terapeutico suggerito dall’OMS prende il nome di DOTS e consiste nell’assunzione simultanea di:
3 farmaci (isoniazide, pirazinamide e rifampicina) per i primi 2 mesi 2 farmaci (isoniazide e rifampicina) per i restanti quattro mesi
.
Il trattamento con più farmaci contemporaneamente si rende necessario per evitare la selezione di resistenze nel corso della terapia.
È stato calcolato, ad esempio, che la frequenza di mutanti primari è di circa 1 ogni 105 per l’isoniazide, 1 ogni 106 per la streptomicina e 1 ogni 107 per la rifampicina.
La lenta crescita del micobatterio e i lunghi periodi di trattamento fanno sì che la comparsa di resistenze ai singoli farmaci sarebbe frequente nel caso di terapia con un singolo antibiotico. Viceversa, poiché la probabilità di resistenza ai farmaci è moltiplicativa, l’utilizzo di più farmaci fa sì che la frequenza passi da 10-5 nel caso dell’ isoniazide a 10-18 nel caso di somministrazione con i suddetti tre farmaci contemporaneamente.
ottobre 2007 e marzo 2008
missione in ECUADOR:
la tubercolosi
L'esame colturale su terreno solido (tecnica già disponibile ai tempi di R. Koch) è l'unica tecnica diagnostica attualmente disponibile nei Paesi in via di sviluppo
Terreno
SOLIDO (LJ) Terreno LIQUIDO
(Bactec) Terreno LIQUIDO
(MGIT) Biologia molecolare
MODS: MICROSCOPIC-OBSERVATION DRUG-SUSCEPTIBILITY
October 12, 2006, New England Journal of Medicine:
“…è più sensibile, rapido ed economico da eseguire degli
attuali test disponibili.”
www.modsperu.org La filosofia
ThLa filosofia di MODS è laboratorio libero a basso costo: tutti I componenti sono disponibili e si possono facilmente acquistare. Non ci sono segreti brevettati.
MODS GENERALITÀ
Tecnica messa a punto presso la Universidad Cayetano Heredia di Lima, Perú.
Si basa su due caratteristiche ben conosciute dei micobatteri
:
M. tuberculosis cresce più rapidamente in terreno líquido che nel solido
“Aggregati ” caratterístici di M. tuberculosis possono essere visti con il microscopio invertito osservando il terreno liquido
RISULTATI
Presenza o assenza di M. tuberculosis nel campione
Sensibilità/resistenza a rifampicina
Sensibilità/resistenza a isoniazide
in 10-15 giorni!
Sputum decontamination
NaOH- NALC Vortex and stand for 15 minutes
Fill tube to 14ml
PBS
Centrifuge 15 min 3000g
7H9 PANTA OADC
Culture and direct susceptibility
testing
MODS
Drug-free control Isoniazid
Rifampicin
900µl / well
1 2 NEG 3 4 5 / POS control control
Caviedes L, et al. Rapid, efficient detection and drug susceptibility testing of Mycobacterium
