Sezione di Microbiologia – Dipartimento di Scienze Chirurgiche R Diagnostiche Integrate (DISC)
www.microbiologia.unige.it
Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
2014
Neisseria meningitidis Patogenesi e Diagnosi
Oliviero E. Varnier
Sezione di Microbiologia dell ’ Università
Neisseria meningitidis
23
MALATTIA MENINGOCOCCICA: 7 NOTE
1.
La prima descrizione di una malattia meningococcia risale al 16°
secolo
2.
La prima identificazione della malattia è del 1805 (Vieusseux M et al. J Med Chir Pharmacol, 1805)
3.
Il primo isolamento di Neisseria meningitidis avvenne nel 1887 (Weichselbaum A. Fortschr Med, 1887)
4.
È la causa principale delle meningiti batteriche e delle sepsi negli USA e di epidemie nell’Africa sub-sahariana
5.
La vaccinazione dei soggetti a rischio è attualmente una delle migliori strategie di sanità pubblica per il controllo di una grave epidemia
6.
Vaccini coniugati simili a quello per Haemophilus influenzae di tipo
B sono in fase avanzata di sviluppo e di sperimentazione
Epidemiologia 1
v I sierogruppi B e C sono responsabili della maggior parte dei casi in Europa e nelle Americhe, mentre A e C sono predominanti in Asia e Africa.
v Il gruppo B ha causato il 68% dei casi in Europa dal 1993 al 1996 ed epidemie in paesi in via di sviluppo con un’incidenza di 5-50 casi per 100.000 persone.
v In assenza di un efficace vaccino per il gruppo B, un’epidemia più diffusa potrebbe avere morbilità e mortalità molto elevate.
v Nella “cintura delle meningiti” africana, che va dall’Etiopia al
Senegal, da oltre 100 anni il gruppo B è un dramma sanitario
ricorrente. L’incidenza della malattia meningococcica è molte volte
maggiore in questa regione che nei paesi industrializzati: la mortalità
è molto superiore al 10% in quanto i pazienti muoiono prima di
arrivare all’ospedale!
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Epidemiologia 2
v Le infezioni causate da Hib, S. pneumoniae, e N. meningitidis sono la causa dell’alta morbidità e mortalità nei bambini nell’Africa Sub-Sahariana.
• L’Hib causa da 100,000 a 160,000 decessi infantili ogni anno nella regione africana controllata dall’WHO.
• Lo S.pneumoniae causa da 250,000 a 400,000 morti pediatriche per anno.
• La N.meningitidis è responsabile di grandi epidemie (che causano migliaia di morti) in molti stati dell’Africa Orientale e Centrale.
v Le epidemie si osservano ogni 8-12 anni con incidenza da 500 a
1000 casi per 100.000 persone. La più grande epidemia mai
descritta è stata nel 1996 con 152.813 casi e 15,783 decessi.
Epidemia negli USA
" Negli ultimi decenni si sono
osservati da 0,9 a 1,5 casi
per 100.000 persone per
2.500-3.000 casi all’anno.
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Epidemiologia 3
" La malattia meningococcica si osserva durante tutto
l’anno, la maggior parte dei casi si ha durante l’inverno e l’inizio della primavera.
" L’incidenza della malattia è più elevata nei neonati, nei
quali non si sono ancora prodotti anticorpi neutralizzanti.
" L’incidenza diminuisce dopo l’infanzia, aumenta durante
l’adoloscenza e nella prima giovinezza.
" Nonostante i casi diminuiscano nei giovani adulti, si hanno
più casi nel gruppo di età dai 23 ai 64 anni: dal 1992 al
1996, il 28% dei pazienti aveva da 12 a 29 anni
Patogenesi
" L’uomo è l’unico ospite naturale della N. meningitidis
" Il nasofaringe è il sito dal quale i meningococchi si
trasmettono mediante aereosol o secrezioni
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Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco
CAPSULA
Funzione Classificazione
Protegge dalla fagocitosi e batteriolisi
13 sierogruppi: A, B, C, E-29,H, I, K, L, M, W-135, X, Y, Z
Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco
Proteine esterne della membrana Componente Funzione
Porine
PorA/ PorB
Creano pori attraverso i quali passano piccoli soluti idrofilici
Opacity associated proteins
Opa Opc
Promuovono adesività alle cellule ospiti e ai leucociti
Promuovono adesività alle cellule ospiti
11 52
Sezione della Membrana Cellulare del Meningococco
Proteine esterne della membrana
Componente Funzione Lipo-
oligosaccaride Potente attività endotossi- ca
Pili Adesione iniziale alle cel- lule epiteliali ed endoteliali e agli eritrociti
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PATOGENESI
2. Invasione dell’ epitelio
3. Invasione del sangue
1. Colonizzazione del naso-faringe
4 disseminazione
PATOGENESI dell’INFEZIONE MENINGOCOCCICA
Liquor e Tessuti
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La Colonizzazione del Nasofaringe
1) I pili sono le principali adesine che possono legarsi al recettore CD46, una proteina cofattore di membrana;
2) di seguito, le “opacity associated pro- teins” (Opa e Opc) si legano ai r e c e t t o r i C D 6 6 e ( a n t i g e n e carcinoembrionale) e ad altre molecole.
3) questo legame stimola l’intrappolamento da parte delle cellule epiteliali dei meningococchi, che quindi attraversano l’epitelio mucosale mediante vacuoli fagocitari.
4) La sopravvivenza dei meningococchi nelle cellule epiteliali
può essere promossa da una proteasi IgA1 e da porB.
Colonizzazione
I meningococchi:
1. superano le difese dell’ospite
2. si attaccano alle cellule cilindriche epiteliali non cigliate della mucosa del nasofaringe,
3. si moltiplicano in esse (colonizzazione)
15 15
Meningococcemia
Il 5-10% degli adulti sono portatori nasofaringei asintomatici di ceppi di N.
meningitidis, la maggior parte dei quali non sono patogeni.
In un numero limitato di persone, la N. meningitidis penetra nella mucosa e arriva nel circolo sanguigno, causando una malattia sistemica.
Nella maggior parte delle persone, lo stato di portatore è un processo di immunizzazione che comporta una
risposta anticorpale protettiva.
FATTORI DI RISCHIO
Fattori favorenti la sopravvivenza intravascolare LA CAPSULA
" I meningococci comprendono organismi diversi: la maggior parte dei quali
sono batteri commensali nell’uomo.
" Solo una minoranza dei ceppi del nasofaringe causa una malattia invasiva.
" I meningococchi associati con la malattia invasiva producono una capsula,
che protegge dalla batteriolisi mediata dal complemento, dalla fagocitosi, dalla disidratazione durante la transmissione e contribuisce a evadere i meccanismi immunitari dell’ospite
.
17 17
Fattori di Rischio
" meccanismi di acquisizione di sostanze nutritive: ferro da
lattoferritina, transferrina ed emoglobina umane
" le adesine (i pili)
" liberazione di vescicole derivate dalla membrana esterna contenenti
lipooligosaccaride (endotossina), proteine della membrana esterna, fosfolipidi e polisaccaridi capsulari
Neisseria meningitidis – liberazione di endotossina dalla membrana esterna
Meningococchi vanno incontro ad autolisi con rilascio di DNA e componenti della parete cellulare, che inducono una cascata infiammatoria.
PATOGENESI
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VIRULENZA
" I meningococchi hanno la capacità di scambiare il
materiale genetico responsabile per la produzione della capsula e pertanto di passare dal sierogruppo B a quello C e viceversa:
" questo “scambio di capsula” può diventare un
importante meccanismo di virulenza con l’ampio uso di
vaccini che forniscono una protezione sierogruppo-
specifica .
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Eterogeneicità Antigenica delle Neisserie
21 21
SEPSI e MENINGITE
" Colonizzazione di Neisseria
meningitidis nel nasofaringe
" entrata nel circolo sanguigno
" Entrata nel liquido cefalora-
chidiano
Manifestazioni cutanee della Meningococcemia: petecchie
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DIAGNOSI
La classica diagnosi di laboratorio di malattia menin- gococcica su basa su:
" Esame colturale: scarsa sensibilità, in particolare quando
eseguito dopo l’inizio di una terapia antibiotica
" Esame microscopico dopo colorazione con Gram: è
importante e può essere utile
" Metodi non colturali: ricerca antigeni polisaccaridici:
rapidi, specifici, possono fornire una diagnosi gruppo
specifica. Possibili falsi positivi.
Esame Microscopico dopo Colorazione con Gram
Neisseria meningitidis (freccia) nel liquor (Gram, x1000). Diplococchi Gram-negativi intracellulari
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Esame Colturale per N. meningitidis e tipizzazione del sierogruppo B mediante agglutinazione con sieri specifici
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Ricerca di Antigeni Batterici
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TEMPI DI REFERTAZIONE DELLA DIAGNOSTICA CLASSICA
Primi due casi
" 15 marzo 2004 ore 05:00: decesso di PO
ore 10.00: decesso di DMS
" 16 marzo 2004 ore 12:00: autopsie e raccolta campioni
" 17 marzo 2004 ore 09:00: isolamento di N.meningitidis da
liquor, saliva e tamponi nasali
" 18 marzo 2004 0re 09:00: tipizzazione N.meningitidis tipo B
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LightCycler Real Time PCR per N.meningitidis
29 29
Identificazione di N.meningitidis
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Identificazione di N.meningitidis mediante
Analisi della Temperatura di Melting
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Tipizzazione di Neisseria meningitidis di tipo B
N. meningitidis B - melting curve analisys
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Tipizzazione di Neisseria meningitidis di tipo C
Neisseria meningitidis C - melting curve analisys
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CASI CLINICI
" Nel marzo 2004 sono deceduti in Genova due bambini di
19 (PO) e 21 (DMS) mesi, che frequentavano lo stesso asilo nido nel comune di S. Olcese
" Identico il breve decorso della malattia: comparsa di
febbre elevata, evoluzione ingravescente con vomito,
petecchie ed exitus.
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35
PROTOCOLLO MEALATTIE INFETTIVE CONTAGIOSE
Sulla base del sospetto clinico di malattia infettiva contagiosa, l’Autorità Giudiziaria dispone l’autopsia nominando un articolato gruppo di periti, al fine di:
1. Identificare l’agente infettivo
2. Escludere altre cause di morte:
a) avvelenamento b) intossicazione
c) altra malattia pediatrica
TEAM APPROACH
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PRELIEVI DA EFFETTUARSI IN CORSO DI AUTOPSIA PRIMA DELLA RIMOZIONE O ALL’ATTO DELL’APERTURA DEGLI ORGANI:
2.A Per esami tossicologici 2.B Per esami Microbiologici 2.C Per indagini metaboliche
2.B Per esami microbiogici 1) un campione di sangue
2) un campione di midollo osseo ottenuto mediante puntato sternale o biopsia della cresta iliaca
3) un campione di contenuto gastrico 4) un campione di feci
5) tampone faringeo 6) tampone bronchiale 7) tampone polmonare
Meningite meningococcica (P.O.)
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Meningite meningococcica (DM.)
Courtesy of Ezio Fulcheri
Surrenalite Emorragica Bilaterale
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Encefalo e Meningi
DIAGNOSI
Meningite acuta da Neisseria meningitidis di gruppo B con edema cerebrale, surrenalite emorragica bilaterale e petecchie alla cute ed alle mucose; stasi poliviscerale ed edema polmonare terminale.
PROTOCOLLO OPERATIVO DIAGNOSTICO
1. prelievi da effettuarsi prima del riscontro autoptico
v Un tampone nasale per ciascuna narice v Un tampone orofaringeo
v Un tampone anale
v Liquido cefalorachidiano (ottenuto sterilmente con puntura lombare)
2. prelievi da effettuarsi in corso di autopsia prima della rimozione o all’atto dell’apertura degli organi
3. il riscontro diagnostico con procedura congiunta
anatomo-patologica e medico legale
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Casi Clinici con Sospetta Meningite Batterica
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20 Casi di Sospetta Meningite Batterica
v 20 casi di sospetta meningite batterica: 12 maschi e 8 femmine di età da 4 mesi ad 80 anni
v 9 deceduti
v Neisseria meningitidis è stata identificata in 7 pazienti: 3 ceppi erano di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C
v Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 3 pazienti.
v Mycobacterium tuberculosis è stato identificato in 1 paziente.
v 3 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi:
v S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata v IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis
v ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale
Tempi di Refertazione della Diagnostica Molecolare
v Il 17 maggio 2004, alle ore 15.30, è stata autorizzata la raccolta dei seguenti campioni per eseguire gli esami microbiologici: liquor, tampone narice destra e sinistra.
v Il DNA è stato estratto dai 3 campioni, ed è stata eseguita una amplificazione genica per l’identificazione di Neisseria meningitidis mediante Real Time PCR LightCycler specifica per le sequenze del gene “Capsular transport ctrA”.
v Tutti i tre campioni analizzati sono risultati positivi per la presenza di sequenze specifiche di N. meningitidis.
v Il 17 maggio 2004, alle ore 18.39, circa tre ore dopo la raccolta dei campioni, i risultati sono stati comunicati telefonicamente e via e-mail alle autorità sanitarie regionali.
v Il 18 maggio 2004, alle ore 10.00, circa 18 ore dal prelievo dei campioni, la ripetizione delle prove di tipizzazione sui ceppi isolati di Neisseria meningitidis con sieri tipo-specifici è risultata positiva per il gruppo C
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Tempi di Refertazione della Diagnostica Molecolare
LIGHTCYCLER REAL TIME PCR
v L’assenza di Neisseria meningitidis nel liquor del paziente SC è stata confermata 3 ore dalla raccolta del campione di liquor e ha evitato una inutile profilassi.
v L’identificazione di Neisseria meningitidis e la tipizzazione del ceppo (C) nel campione di liquor del paziente FG sono state completate in meno di 4 ore.
v N.meningitidis è stata diagnosticata nel liquor del paziente FA con esame microscopico dopo colorazione con Gram e ricerca degli antigeni. È stata fatta la profilassi in circa 500 persone esposte e sono stati chiusi due uffici ed una scuola. Poiché la clinica non correlava con la diagnosi, una aliquota del campione di liquor è stata inviata ai nostri laboratori e dopo 3 ore abbiamo refertato la presenza di S.pneumoniae.
LightCycler Real Time PCR per N.meningitidis, Streptococcus pneumoniae e Haemophylus influenzae tipo B
H. influenzae DNA Gyrase (gyrA) Tm
gyrA F AAATCAgCgCgTgTTgT 53.4°C
gyrA R CCATCATAgTTTggCgAgAA 54.1°C
gyrA FL gCTgCAATgCgTTATACCgAAgT--FL 61.1°C
gyrA LC CgTATgCAAAAAATTACgCAAgCATTACT--PH 63.7°C
S. pneumoniae Pneumolysin gene (ply) Tm
ply F TgCAgAgCgTCCTTTggTCTAT 59.6°C
ply R CTCTTACTCgTggTTTCCAACTTgA 59.2°C
N.meningitidis Capsular transport ctrA Tm
ctrA F gCTgCggTAggTggTTCAA 58,9°C
ctrA A TgTCgCggATTTgCAACTAA 58,2°C
ctrA FL TTCgTACTACATTgCCACgTgTCAgC X 64,4°C
ctrA LC CACATTCgTATCCTgCACATTTgCC p 64,3°C
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DIAGNOSI di Meningite Batterica
LightCycler RealTime PCR per:
• Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis
• Tipizzazione di N.meningitidis A, B e C
• Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae
• Identificazione di Mycobacterium spp
• Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium
• Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato
• Tipizzazione di Borrelia afzelii, Borrelia garinii, e B. burgdorferi sensu stricto
• Identificazione e quantificazione di Listeria monocytoge-nes
PROTOCOLLO OPERATIVO DIAGNOSTICO TEAM APPROACH
Microbiologia – Università v Claudio Giacomazzi
v Maddalena Perotti v Isabella Martini
v Jennifer McDermott
Anatomia Patologica - Università v G. Gaggero
v M. Mora
v Ezio Fulcheri
Medicina Legale – Università v Benedicta Astengo
v Francesco Ventura
Malattie Infettive – Università v Claudio Viscoli
v Matteo Bassetti v Gabriella Pagano
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DOMANI: MENINGITIDIS MULTIPLEX DETECTION
" Meningitis is one of the most terrifying diseases.
" It can be fatal in hours yet its early symptoms resemble self-
limiting conditions like flu and colds…..
MENINGITIDIS MULTIPLEX DETECTION
1.Streptococcus pneumoniae 2. Neisseria meningitidis
3. Streptococcus gruppo B 4. Haemopjlus influenzae 5. Listeria monocytogenes