.microbiologia.unige.it
Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
2013
MALATTIE INFETTIVE E MICROBIOLOGIA CLINICA
Prof. Oliviero E. Varnier
icrobiologia.unige.it
Scuola di Scienze mediche e Farmaceutiche
2013
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus Providencia, Citrobacter Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Acinetobacter
Graziana Manno
Sezione di Microbiologia –Dipartimento di Scienze Chirurgiche R e Diagnostiche Integrate (Disc)
www.microbiologia.unige.it
Batteri Gram negativi opportunisti
Klebsiella, Enterobacter, Serratia, (gruppo KES) , Proteus, Providencia, Citrobacter Enterobacteriaceae
agenti etiologici di
INFEZIONI A LOCALIZZAZIONE EXTRAINTESTINALE
di tipo opportunistico e prevalentemente nosocomiali
Enterobatteri patogeni opportunisti
fanno parte della flora normale non sono in grado di dare patologia
in alcune condizioni predisponenti legate dell’ospite:
•Immunocompromissione: AIDS, malnutrizione, terapie immunosoppressive, etc
•salti di barriera: ferite, interventi chiurgici, manovre invasive, etc
si comportano da patogeni
Possono anche essere definiti microrganismi occasionalmente patogeni
Microrganismo ubiquitario habitat
• Ambientale acqua, suolo, piante,
• materiale in decomposizione
• mammiferi uomo, cavalli, suini
nell’uomo rappresenta un saprofita del nasofaringe e dell’intestino
Klebsiella spp.
individui sani
5 – 38% feci
1 – 6 % orofaringe
Klebsiella spp.
pazienti ospedalizzati
77% feci
19 % orofaringe 42% mani
colonizzazione
La colonizzazione e la comparsa di ceppi MDR (Multi Drug Resistant) è favorita dalla pressione selettiva degli antibiotici piuttosto e a fattori relativi alla ospedalizzazione Il personale ospedaliero può presentare elevate percentuali di colonizzazione
Klebsiella spp.
Il principale reservoir per la trasmissione di Klebsiella spp.
in ambiente ospedaliero è rappresentato da
Il tratto gastrointestinale dei pazienti le mani del personale sanitario
importanza del lavaggio delle mani e delle misure di prevenzione e controllo delle infezioni
Tassonomia del Genere Klebsiella spp.
1. Klebsiella pneumoniae
subsp. pneumoniae subsp. ozaenae
subsp. rhinoscleromatis
2. Klebsiella oxytoca 3. Klebsiella terrigena 4. Klebsiella planticola
5. Klebsiella ornithinolytica
Fattori di patogenicità di Klebsiella spp.
• Capsula (77 sierotipi)
• LPS (8 sierotipi)
• Adesine (pili tipo 1 e tipo3; fimbrie; adesine aggregative)
• Resistenza al siero
• Siderofori
Klebsiella spp. antigeni capsulari
Spessa capsula polisaccaridica essenziale per la virulenza di Klebsiella spp.
Protegge il batterio dalla fagocitosi da parte dei PMN Previene il kiling da parte dei fattori battericidi del siero
Non è stato possibile stabilire una chiara correlazione tra tipo capsulare e patologia
Alcuni studi evidenziano che il sierotipo K2 sia il tra i più comuni sierotipi coinvolti in UTI (Urinary –Tract –Infections)
Klebsiella spp. fenotipo mucoso
Klebsiella spp. E.coli
Klebsiella spp.
Pili (fimbrie)
adesine Tipo 1 : permettono l’adesione dei batteri al muco o all’epitelio respiratorio/urogenitale/intestinale
adesine Tipo 2: permettono l’adesione all’epitelio respiratorio e del tratto urogenitale
Resistenza al siero e LPS
Resistenza agli effetti battericidi del siero mediati dal complemento
Klebsiella spp. patologie
sono patogeni opportunisti
causano gravi patologie tipicamernte nosocomiali Setticemie
Polmoniti UTI
Infezioni dei tessuti molli
target di questi batteri sono principalmente pazienti immunocompromessi , ospedalizzati, con malattie predisponenti
Klebsiella granulomatosis
agente etiologico del granuloma inguinale malattia
granulomatosa che interessa i genitali e l’area inguinale
Malattia endemica nell’America Meridionale, Caraibi, Papua Nuova Guinea, India,Vietnam, Africa meridionale e
Australia
Klebsiella rhinoscleromatis Malattia granulomatosa del naso
Klebsiella ozaenae Rinite cronica atrofica
Enterobacter spp.
Habitat comune a Klebsiella spp. ad altri Enterobatteri Patogeno umano, degli insetti e delle piante
Tassonomia del genere complessa e spesso i sistemi di
identificazione di laboratorio hanno limiti nel discriminare tra i componenti
Enterobacter cloacae complex
E.hasburiae E.hormaechei E.kobei
E.ludwigii
E.nimipressuralis
Enterobacter aerogenes Enterobacter sakazaki Enterobacter agglomerans
Enterobacter gergoviae
Enterobacter spp.
Patogenicità
Membrana esterna lipide A (endotossina) Fonti di contaminazione ospedaliera
Mani del personale Endoscopi
Epidemie da prodotti contaminati nutrizione parenterale totale, fisiologica , termometri etc.
Enterobacter spp. patologie
Infezioni respiratorie
UTIs
Batteriemie
Infezioni dei tessuti molli - Endocarditi - Infezioni intra-addominali Osteomieliti -Infezioni SNC - Artrite settica - Infezioni oculari
Enterobacter sakazakii può causare gravi patologie nei neonati e nei bambini associato ad outbreaks per polveri per infanzia contaminate
Serratia spp.
Specie:
Serratia marcescens (unica specie riconosciuta come patogeno nosocomiale)
Serratia liquefaciens Serratia rubidaea Serratia odoriferae Serratia plymuthica
Ampiamente distribuite in natura , acqua, piante, suolo, piccoli mammiferi (roditori), insetti
Uomo : pazienti ospedalizzati (gli individui sani non si colonizzano con Serratia spp.)
Serratia spp. fattori di patogenicità
Fimbrie
Siderofori (enterobactina) Emolisine
Resistenza al siero Proteasi extracellulari
I ceppi non pigmentati di S.marcescens sono più resistenti agli antibiotici dei ceppi pigmentati
Serratia spp. patologie
Infezioni respiratorie UTIs
Setticemie Endocarditi
Infezioni cutanee Otiti
Infezioni oculari
Gruppo : Proteus spp. , Providencia spp.
Genere Proteus 5 specie
P.mirabilis, P.vulgaris specie più frequenti e di rilievo clinico Ubiquitari (acqua, suolo, piante) parte della flora normale del tratto intestinale dell’uomo
Bacilli pleiomorfi molto mobili per flagelli peritrichi P.mirabilis sciamatura nei terreni di coltura
Proteus spp.
Fattori di virulenza
Flagelli/ pili (6 tipi diversi)
attività ureasica che scinde l’urea in anitride carbonica e ammoniaca (la proliferazione di Proteus spp. causa forte alcalinizzazione delle urine, induce la precipitazione dei sali di magnesio e potassio sotto forma di cristalli e formazione di calcoli renali)
Infezioni
Dopo E.coli e Enterococcus spp. è la 3° causa più comune di cistiti , pielonefriti e prostatiti, 30 % delle UTIs
Meno frequentemente causa : Batteriemie
Meningoencefaliti neonatali Empiemi
Genere strettamente correlato al genere Proteus
Due specie principali
• P.rettgeri
• P.stuartii
Infezioni più frequenti sono UTIs nei portatori di protesi vescicali
Providencia spp.
Citrobacter spp.
Genere strettamente correlato a Escherichia e Salmonella Colonizza l’intestino dell’uomo de degli animali
Patogeno opportunista
UTIs – patogeno nosocomiale
Citrobacter koseri puo’ dar luogo a meningite e ascessi cerebrali neonatali
La resistenza agli antibiotici nei Gram negativi
Dovuta alla selezione di ceppi resistenti, in seguito all'esposizione ad un farmaco.
acquisita tramite mutazioni o mediante il trasferimento di materiale genetico da parte di batteri resistenti.
La diffusione dell'antibiotico resistenza è favorita dall'utilizzo esteso (e spesso improprio) degli antibiotici, in particolare quelli ad ampio spettro, che aumenta la pressione selettiva in grado di far emergere e diffondere i ceppi resistenti.
Time-line dall’introduzione degli antibiotici beta-lattamici e la comparsa di resistenza.
Klebsiella pneumoniae resistente ai carbapenemi
Resistente a praticamente tutti gli antibiotici (pan-resistenza), tra i quali i carbapenemi, considerati oggi una delle ultime risorse per la terapia delle infezioni da batteri Gram negativi multi-resistenti.
Causa gravi infezioni quali cistiti, pielonefriti, polmoniti e batteriemie in grado di evolvere rapidamente in shock settico, mettendo a serio rischio la vita del
paziente, con una mortalità che supera il 50%.
I batteri non-fermentanti (il glucosio)
(Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Acinetobacter, e altri )
Bacilli Gram negativi non-fermentanti per assenza delle vie metaboliche fermentative (sono quindi quasi tutti aerobi obbligati)
Tutti mobili per flagelli polari
Diffusissimi nell’ambiente per la loro capacità di utilizare come fonti di carbonio una grande varietà di composti organici
Tassonomia complessa in continua evoluzione con vari rimaneggiamenti classificativi nel tempo
• Suolo
• Acqua (sorgiva/marina)
• Piante,animali
Diversi habitats
Patogeno umano opportunista Patogeno delle piante
Deterioramento alimenti
• Biotrasformazione
Enzimi Alginato Acidi grassi
• Bioremediation
• Biocontrollo
• Biofertilizzazione
Industria
Biotecnologie ambientali
P. aeruginosa
P. aeruginosa
un “successo biologico”
(adattabilità e tipo di crescita)
dovuto ad un’ampia versatilità genetica
Genoma 6.3 milioni pb
PA01
P.aeruginosa morfologia
Bacilli diritti o debolmente ricurvi Dimensioni 0,5-1,0 x 1,5-5,0 µm Mobili, con flagelli polari
Gram-negativi Aerobi obbligati
Alcuni ceppi possiedono abbondante capsula mucosa costituita da alginato
Microrganismi ubiquitari, si trovano:
• suolo
• materiale organico in decomposizione
• vegetazione
• acqua
• fiori recisi
• lavandini
• toilette
• strofinacci da pavimento
• attrezzature per dialisi
• respiratori di terapia intensiva
• soluzioni disinfettanti a base di ammonio quaternario
P.aeruginosa habitat
• Patogeni per piante, animali e uomo
• Possono causare infezioni opportunistiche, in soggetti con difese organiche compromesse e nell’ospite immunocompetente
• Causa frequente di infezioni nosocomiali Causa patologia in caso di:
• lesioni traumatiche
• ustioni
• impianti protesici
• interventi esplorativi o chirurgici
• utilizzazione di droghe per via endovenosa
• immunocompromissione dell’ospite
P.aeruginosa patogenicità
La virulenza di P.aeruginosa è multifattoriale Adesine
Capsula polisaccaridica Tossine
Endotossina Esotossina A Esoenzima S Enzimi
Elastasi
Fosfolipasi C Piocianina
P.aeruginosa fattori di patogenicità
COMPONENTI STRUTTURALI
ADESINE
L’adesione è mediata da pili e da adesine non piliari
CAPSULA POLISACCARIDICA
Costituita prevalentemente da alginato permette l’adesione alle cellule (fibrosi cistica ed altre malattie respiratorie) ed impedisce la fagocitosi
Favorisce l’adesività alla superficie di protesi vascolari
Alginato
Alginato è un polimero lineare di beta-D-mannuronato e alpha-L-guluronato
Sostanza che serve nell’industria come addensante per cibi (es gelati), nell’industria tessile e della carta.
TOSSINE
ENDOTOSSINA
L’endotossina lipopolisaccaridica è il principale antigene della parete cellulare
Il lipide A, componente dell’endotossina, media i diversi effetti biologici della sindrome setticemica
ESOTOSSINA A
E’ tra i principali fattori di virulenza rilasciati in ambiente extracellulare da ceppi patogeni di P.aeruginosa
Responsabile:
• della necrosi tissutale nelle ustioni
• dell’insufficienza respiratoria nelle infezioni polmonari
ENZIMI
ELASTASI
E’un’endopeptidasi che può digerire numerose proteine umane tra cui:
• elastina
• collagene
• fibrina
• IgG
• IgA
• componenti del complemento
• transferrina
FOSFOLIPASI C
Enzima termolabile che degrada lipidi e lecitina facilitando il danno tissutale
ENZIMI
PIOCIANINA
Pigmento verde/blu prodotto da P.aeruginosa
Catalizza la produzione di superossido e perossido d’idrogeno (forme tossiche dell’ossigeno)
Possiede attività antibatterica nei confronti di Staphylococcus aureus ed E.coli
piocianina (verde/blu) si osserva dopo esposizione delle colture
alla luce solare
pioverdina (verde) esposizione agli UV fluoresceina (gialla)
piorubina (rosso-marrone) piomelanina (nero)
P. aeruginosa pigmenti diffusibili
EPIDEMIOLOGIA
Presenti nell’ambiente, hanno richieste nutrizionali minime Tollerano temperature comprese tra 4°C e 42°C
Resistenti ad antibiotici e disinfettanti
Commensale nelle prime vie respiratorie e nel materiale fecale
SINDROMI CLINICHE
Infezioni polmonari
Infezioni della cute (ferite, ustioni) Infezioni delle via urinarie
Infezioni dell’orecchio Infezioni dell’occhio
Batteriemia ed endocardite Meningite
P.eruginosa capacità di persistenza e di causare infezioni croniche
Il BIOFILM
è un aggregato di cellule microbiche (anche di diverse specie) associate e tenacemente adese ad una superficie e incluse in una matrice polimerica extracellulare da esse prodotta.
i biofilm sono dotati di particolari funzioni adatte alla colonizzazione di superfici sia biotiche sia abiotiche e sono stati osservati in tutti gli ecosistemi naturali
I biofilm si compongono:
per il 15% di cellule batteriche
per l’85% di materiale della matrice.
Formazione del Biofim
Le caratteristiche strutturali dei biofilm incidono sull’istaurarsi di infezioni batteriche croniche, (quale l'endocardite valvolare, Fibrosi Cistica , etc.),
e la tendenza delle microcolonie a distaccarsi dal biofilm può produrre emboli infettivi che, attraversando i capillari, possono portare a gravi conseguenze.
IMP I batteri all’interno del biofim sono protetti e quindi resistenti alle difese dell’ospite e agli agenti antibatterici
I BIOFILM COINVOLTI NELLE PATOLOGIE DELL’UOMO I biofilm sono agenti eziologici di svariate malattie che di frequente
interessano la patologia umana
Infezioni o malattia Biofilm (specie batterica principale)
Carie dentali Cocchi Streptococchi
Otite media Ceppi di Haemophilus influenzae Infezioni muscoloscheletriche Cocchi Gram-positivi (es.
stafilococchi)
Infezioni del tratto gastro-intestinale Batteri enterici (es. Escherichia coli) Endocardite Streptococchi gruppo viridans
Polmonite associata a fibrosi cistica P. aeruginosa, Burkholderia cepacia
Biofilm come contaminanti di strumenti e presidii medici
Dispositivi contaminanti Biofilm (specie batterica principale) Lenti a contatto Cocchi gram-positivi e P. aeruginosa Dispositivi per dialisi Flora batterica e fungina mista
Cateteri urinari E. coli e altri bacilli gram-negativi Dispositivi endotracheali Flora batterica e fungina mista Cateteri venosi S. epidermis
Valvole cardiache meccaniche S. aureus e S. epidermidis Inneschi vascolari Cocchi Gram-positivi Dispositivi ortopedici S. aureus e S. epidermidis Protesi di vari organi S. aureus e S. epidermidis
Pseudomonas aeruginosa ambientale
PA colonizzazione asintomatica
P.aeruginosa Infezione Cronica in Fibrosi Cistica
Adattamento batterico
• Fenotipi batterici
• produttori di alginato
• Auxotrofi
• Ipermutabili
• Small Colony Variant
Aumento carica batterica –Infezione sintomatica
Malattia polmonare
• modificazioni superficiali
(biofilm, virulenza,
resistenza agli antibiotici)
Pressione delle difese dell’ospite
Aumentati trattamenti antibiotici
Fenotipi di P.aeruginosa in Fibrosi Cistica
A e B
Ceppi mucoidi
Ceppi SCV
C Pigmentati e D non- pigmentati
Burkholderia cepacia complex
Gruppo di batteri non fermentanti descritti come patogeni delle piante Presenti nell’ambiente in prevalenza nella rizosfera delle piante
Utilizzati come biopesticidi e biofertilizzanti
Importanti patogeni opportunisti per i pazienti immunocompromessi e particolarmente per i pazienti con Fibrosi Cistica
Dotati di grande versatilità metabolica e elevata resistenza ai disinfettanti a agli antimicrobici
Capaci di formare biofilm batterico
Burkholderia pseudomallei
specie endemica nel sud-est asiatico, in India, Africa e Australia Si riscontra nel suolo, nell’acqua e nella vegetazione
Infezione per via percutanea , causa colonizzazione asintomatica infezioni chiamate MELIOIDOSI con forme cutanee (ascessi) e infezioni polmonari se contratta per via inalatoria
Stenotrophomonas maltophilia
• Patogeno opportunista
• Ospiti preferenziali i soggetti con meccanismi di difesa immunitaria deficitari
• Infezioni nosocomiali: batteriemie, polmoniti con elevati gradi di complicanze e morte
• Contaminazione ospedaliera di cateteri, soluzioni disinfettanti, apparecchiature per la ventilazione meccanica
• Intrinsecamente resistente ai carbapenemi e aminoglicosidi e resistente agli antibiotici beta-lattamici
• Emergenza di ceppi resistenti al Trimetoprim/Sulfametossazolo
Acinetobacter
Sono grossi coccobacilli gram – negativi, strettamente aerobi e ossidasi negativi
Saprofiti ubiquitari sopravvivono sia in superfici umide (es
apparecchiature per la ventilazione meccanica) sia asciutte (cute umana)
Diffusi nel suolo, acqua, alimenti
Possono far parte della flora normale di una piccola percentuale di persone sane e possono proliferare e divenire numerosi durante l’ospedalizzazione
Acinetobacter
Genere diviso in due gruppi
Glucosio ossidanti A.baumannii (causa la maggior parte delle infezioni) Glucosio non-ossidanti A.lwoffii
Patogeni opportunisti
In ambito nosocomiale si trasmettono per contatto diretto o indiretto Resiste per lungo tempo nell’ambiente anche 30 giorni
Causano
Infezioni respiratorie, UTI,Infezioni di ferite
I pazienti più a rischio sono quelli che ricevono antibiotici a largo spettro, con recente intervento chirurgico o in ventilazione respiratoria
Trattamento antibiotico difficile per A.baumannii a causa della multiresistenza agli antibiotici inclusi i carbapenemi.
Diagnosi microbiologica di laboratorio dei Gram negativi
Materiale patologico feci, sangue, urine, tamponi rettali, altri liquidi biologici, etc
Semina diretta in terreni liquidi (emocolture) o solidi (agarizzati) ricchi (agar sangue) e
selettivi/differenziatori (MacConkey)
Incubazione 12-24 h a 35/37°C
Crescita batterica - Scelta delle colonie su agar
trapianto per ottenere una coltura pura (da materiale polimicrobico es feci)
Identificazione a livello di specie con metodiche convenzionali fenotipiche (biochimiche/sierologiche)
Identificazione molecolare (PCR) o proteomica (Malditoff)
Saggio di sensibilità agli agenti antibatterici
Identificazione - scelta delle colonie
La capacità di fermentare il lattosio è considerata una delle caratteristiche chiave nell’identificazione microbiologica degli Enterobatteri.
Lattosio pos
Lattosio neg Agar MacConkey
Identificazione di specie
metodiche biochimiche convenzionali I
Identificazione di specie
metodiche biochimiche convenzionali automatizzate
Identificazione di specie metodiche non-convenzionali
Identificazione molecolare : PCR mediante primers specie specifici per determinati geni batterici
Real time PCR
Sequenziamento della subunità 16S
Spettrometria di massa
E’ una tecnica analitica che consente di misurare in maniera estremamente accurata il peso molecolare di macromolecole di interesse biologico e di determinare la loro identità in base al rapporto massa/carica.
Metodo rapido, accurato ed economico per l’identificazione di batteri, micobatteri, lieviti e funghi.
Questa tecnologia costituisce un’alternativa
valida e interessante ai metodi di microbiologia classica e di biologia molecolare ed è applicabile in differenti aree della diagnostica clinica e della ricerca.
