LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA VETERINARIJOS FAKULTETAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBöS KATEDRA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETO VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBöS KATEDRA

ANITA ROKAITYTö

ĮVAIRAUS AMŽIAUS GALVIJŲ BANDŲ, SMULKINTOS JAUTIENOS IR

NEPASTERIZUOTO PIENO PRODUKTŲ UŽKRöSTUMAS

KAMPILOBAKTERIJOMIS IR JŲ RŪŠINö ĮVAIROVö

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: dr. M. Malakauskas

2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas ,,Įvairaus amžiaus galvijų bandų, smulkintos jautienos ir nepasterizuoto pieno produktų užkr÷stumas kampilobakterijomis ir jų rūšin÷ įvairov÷“

1. Yra atliktas mano pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

2013-01-25 Anita Rokaityt÷

(data) (autoriaus vardas ir pavard÷) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2013-01-25 Anita Rokaityt÷

(data) (autoriaus vardas ir pavard÷) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO 2013-01-25 Mindaugas Malakauskas

(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

Protokolo Nr.8; 2013 01 07

(aprobacijos data) (katedros ved÷jo vardas, pavard÷) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS

(gynimo komisijos sekretor÷s(-riaus) parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavard÷) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

ĮVADAS ... 7

1. LITERATŪROS APŽVALGA... 9

1.1 Kampilobakterijų morfologija ir fiziologija... 9

1.2. Kampilobakterijų paplitimas ir rūšin÷ įvairov÷ galvijų tarpe ... 10

1.2.1 Kampilobakterijų paplitimas galvijų tarpe... 10

1.2.2 Rūšin÷ kampilobakterijų įvairov÷ galvijų tarpe... 11

1.3. Kampilobakterijų paplitimas maisto grandin÷je ... 12

1.3.1 Paukštiena ... 12

1.3.2 Jautiena ... 13

1.3.3 Kiauliena ... 13

1.3.4 Pienas ir jo produktai ... 14

1.3.5 Vanduo... 15

1.4. Žmonių kampilobakterioz÷s epidemiologija... 15

1.4.1 Žmonių kampilobakterioz÷ ... 15

1.4.2 Žmonių kampilobakterioz÷s ryšys su galvijais ... 18

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS... 19

2.1 M÷ginių rinkimas ir kampilobakterijų išskyrimas ... 19

2.1.1 Įvairaus amžiaus pieninių galvijų išmatų m÷giniai... 19

2.1.2 Atv÷sintos smulkintos jautienos ir nepasterizuoto pieno m÷giniai... 21

2.2 Kampilobakterijų identifikavimas ... 21

2.2.1. DNR išskyrimas ... 21

2.2.2. Daugin÷ PGR ... 22

2.3 Matematin÷ duomenų analiz÷ ... 23

3. TYRIMŲ REZULTATAI... 24

3.1 Kampilobakterijų paplitimas įvairaus amžiaus pieninių galvijų grup÷se. ... 24

3.2 Kampilobakterijų paplitimas smulkintos jautienos ir nepasterizuoto pieno produktuose ... 30

4. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS ... 31

IŠVADOS ... 34

REKOMENDACIJOS ... 35

4 SUMMARY

Anita Rokaityt÷

PREVALENCE AND SPECIES DIVERSITY OF COMPYLOBACTER ISOLATES FROM CATTLE HERDS, MINCED BEEF AND UNPASTEURIZED MILK

Master thesis

Work instructor: dr. M. Malakauskas Lithuanian University of Health Sciences Faculty of Veterinary Medicine

Department of Food Safety and Quality Kaunas, 2013

The coverage of the work is 43 pages, 2 tables and 12 figures.

In recent years the specific attention is dedicated to the problem of campylobacteriosis, because it is registered as the most common zoonosis in the EU countries as well as in the world. According to the last decade researche results the poultry meat is considered as the most significant source of human campylobacteriosis. However recent investigations provide evidences that the ruminants also play important role in the epidemiology of this zoonosis. The investigations showed that the products of cattle often causes sporadic human campylobacteriosis cases or even the outbreaks which are caused by the consumption of unpasteurized milk or the usa of the surface water which is contaminated with the faeces from cattle farm as well as the direct contact with the cattles. In Lithuania there are no studies carried out on the prevalence of Campylobacter spp. in the cattle farms and contamination of the unpasteurized milk as well as the minced beef.

The aim of our study was to evaluate the occurence of Campylobacter spp. in cattle heards of different age and contamination the unpasteurized milk and the chilled minced beef sold at the retail level. Three different cattle farms were selected for the investigation and fecal samples were taken in 2011 from May till November. For the further investigation four particular supermarkets and three unpasteurized milk suppliers were selected which products i.e. chilled minced beef and unpasteurized milk were bought every other week from the October 2011 till October 2012.

Thermophilic Campylobacter spp. was isolated by both direct inoculations on mCCDA selective medium and after selective enrichment in Bolton broth. Multiplex-PCR method was used for detection and identification of thermophilic Campylobacter species described by Wang (2002) with minor changes.

The examination of different age cattles in dairy farms of the central part of Lithuania revealed that in average 78.5 % of cattle are carriers of Campylobacter spp. The quantitative results of the research showed that the age is an important factor for Campylobacter spp. prevalence in the feaces samples. The highest numbers of campyloabcters was found in the calf faeces (5.3 log10 cfu/g), the

5 lowest − in cattle faeces (3.7 log10 cfu/g). Screening of faeces samples by multilex-PCR for 5

Campylobacter spp. species (C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus and C. upsaliensis) revealed that the most often species found in the tested samples were C. jejuni (66.7 %) and C. coli (24.4 %) in all tested farms.

Testing of 73 unpasteurized milk samples for Campylobacter spp. revealed that only 3 samples (4.1 %) were contaminated by campylobacters. However Campylobacter spp. bacteria were not detected neither after direct plating nor after selective enrichment of the 95 chilled minced beef samples.

In this study, the relatively high prevalence of thermophilic Campylobacter spp. among cattles indicates that cattle farms are important reservoirs of Campylobacter spp. Therefore, in order to reduce consumer’s risk of catching campylobacteriosis through cattle products or contact with infected animals, efforts to reduce Campylobacter spp. prevalence on cattle farms must be taken for better public health ensurance.

6

SANTRUMPOS

µl – mikrolitrai µm – mikrometrai

ANOVA – dispersin÷ analiz÷ bp – bazių pora

DNR – deoksiribonukleorūgštis

EFSA – Europos maisto saugos tarnyba ksv – kolonijas sudarantys vienetai PGR – polimerazin÷ grandinin÷ reakcija PFGE – pulsin÷ lauko elektroforez÷ gelyje rRNR – ribosomin÷ ribonukleino rūgštis ŽŪB – žem÷s ūkio bendrov÷

7

ĮVADAS

Kampilobakterijos nuo pat 2005 m. išlieka dažniausiai nustatoma žmonių ūmaus žarnyno infekcinio susirgimo priežastis Europos Sąjungos (ES) šalyse. Palyginus 2009 ir 2010 metais užregistruotų žmonių kompilobakterioz÷s atvejų skaičių nustatyta, kad kampilobakterioz÷s susirgimų padaug÷jo 6,7 %. Šių susirgimų did÷jimo tendencija buvo pasteb÷ta net tarp 24 ES šalių. Dažniausiai kampilobakterioz÷ buvo siejama su broilerių m÷sa arba kitais m÷sos produktais. Lietuvoje kampilobakterioz÷ yra viena iš labiausiai paplitusių maistu plintančių žmonių zoonozių, ir sergamumo rodiklis siekia 32,9 atvejus 100000 gyventojų (EFSA, 2012).

Žmon÷ms kampilobakteriozę sukelia termofilin÷s kampilobakterijos. Dažniausiai tai būna Campylobacter jejuni, rečiau C. coli ir C. laris rūšys, tačiau yra ir kitų kampilobakterijų rūšių galinčių sukelti žmonių susirgimus (EFSA, 2012). Klinikinius virškinamojo trakto sutrikimus gali sukelti ir labai nedideli šių bakterijų kiekiai, tai yra, užsikr÷timo doz÷ gali būti tik 500 bakterijų, tačiau sergamumas taip pat priklauso ir nuo amžiaus, bendros fizin÷s būkl÷s bei kitų veiksnių. Vaikai gali susirgti kampilobakterioze ir užsikr÷tę ženkliai mažesniu bakterijų kiekiu (Kothary et Buba, 2001). Pagrindinis kampilobakterijų šaltinis žmon÷ms yra žalia ar nepakankamai gerai termiškai apdorota broilerių m÷sa. Tyrimais įrodyta, kad kampilobakterijų nešiotojai gali būti daugelis kitų gyvūnų rūšių, pvz. avių, kiaulių, galvijų, laukinių paukščių ir žinduolių, tod÷l galima teigti, kad naminiai paukščiai n÷ra vieninteliai svarbūs kampilobakterioz÷s šaltiniai žmon÷ms (Petersen et al., 2001).

Pastaraisiais metais atlikti tyrimai (Brown et al., 2004; Devane et al., 2005; Garrett et al., 2007) nustat÷ netiesioginį ryšį tarp galvijų ir žmonių susirgusių kampilobakterioze. Remiantis laboratoriniais tyrimais kampilobakterijos yra retai nustatomos ant galvijų skerdienų ar m÷sos produktų, tod÷l galima teigti, kad jautiena n÷ra svarbus infekcijos šaltinis žmon÷ms (Whyte et al., 2004). Nepaisant to, epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad nepasterizuotas pienas yra svarbus rizikos veiksnys susirgti kampilobakterioze (Studahl et al., 2000; Michaud et al., 2004). Be to, nepasterizuoto pieno vartojimas yra siejamas su šio susirgimo protrūkiais, tokiais kaip 2003 m. įvykęs Jungtin÷je Karalyst÷je ar 2005 m. Pensilvanijoje (Studahl et al., 2000; Schildt et al., 2006). Tačiau galvijų išmatomis užkr÷sta aplinka gali būti daug svarbesnis veiksnys kampilobakterioz÷s plitimui nei nepasterizuotas pienas ar jautiena (Nielsen 2002; Nygard et al., 2004).

Kadangi, Lietuvoje n÷ra pakankamai duomenų apie kampilobakterijų paplitimą galvijų bandose ir galvijų m÷sos užkr÷stumą šios zoonoz÷s suk÷l÷jais, atlikti tyrimai siekiant gauti daugiau duomenų apie pieninių galvijų bandų, nepasterizuoto pieno ir smulkintos jautienos užkr÷stumą kampilobakterijomis. Darbo tikslas: įvertinti kampilobakterijų paplitimą įvairaus amžiaus pieninių galvijų grup÷se bei atv÷sintos smulkintos jautienos ir nepasterizuoto pieno produktuose.

8 Darbo uždaviniai:

• Įvertinti skirtingo amžiaus galvijų grupių užsikr÷timą kampilobakterijomis bei užsikr÷timo intensyvumą

• Nustatyti mažmenin÷je prekyboje parduodamo nepasterizuoto pieno ir smulkintos jautienos užkr÷stumą kampilobakterijomis

• Identifikuoti išskirtų kampilobakterijų rūšis polimeraz÷s grandinin÷s reakcijos metodu • Atlikti gautų rezultatų analizę

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Kampilobakterijų morfologija ir fiziologija

Kampilobakterijos yra 0,2−0,8 µm pločio ir 0,5−5,0 µm ilgio, gramneigiamos, sporų neformuojančios bakterijos. Šios bakterijos yra judrios, juda greitai ir charakteringai, sukdamosi spirale žiuželių pagalba. Susijungus dviems ar daugiau suformuoja "S" arba "V" formą, kuri primena kiro sparnus (Debruyne et al., 2005).

1 pav. Campylobacter jejuni. Nuotrauka daryta transmisiniu elektroniniu mikroskopu (http://www.wadsworth.org/databank/campylo.htm. Prieiga per internetą 2012-12-08)

Kampilobakterijos yra termofilin÷s bakterijos, kurių augimo temperatūros ribos yra gana siauros ir svyruoja tarp 30 °C ir 42 °C. Optimaliausia temperatūra joms augti yra 41,5 °C. Levin (2007) teig÷, kad šios bakterijos tur÷tų būti nurodytos kaip "termotolerantin÷s", nes jos neauga aukštesn÷je kaip 55 °C ir tod÷l neatitinka termofilinų bakterijų savybių. Bet šios bakterijos yra priskirtos prie termofilinių ne d÷l savo geb÷jimo augti esant aukštai temperatūrai, tačiau d÷l nesugeb÷jimo augti žemesn÷je kaip 30 °C temperatūroje (Garénaux et al., 2008).

Šaldymas−atšildymas turi reikšm÷s kampilobakterijų populiacijai. Esant nedideliam kampilobakterijų skaičiui jos inaktyvuojamos −15 °C temperatūroje, ne mažiau kaip per 72 valandas, tačiau šaldymas nesunaikina visų patogenų užkr÷stame maiste (Lee et al., 1998). Hazeleger ir kt. (1995) nustat÷, kad kampilobakterijos ilgiausiai išgyvena esant +4 °C temperatūrai ir kai pH svyruoja nuo 6,5 iki 7,5.

10 Skirtingai nuo kitų per maistą plintančių patogeninių bakterijų, kampilobakterijos yra mikroareofilai ir geriausiai auga atmosferoje, kur yra apie 10 % CO

2, 85 % N ir maždaug 5 % O2

(Humphrey et al., 2007), bei ant mitybin÷s terp÷s praturtintos 5−10 % krauju (Garénaux et al., 2008). Ant mitybin÷s terp÷s pas÷tų bakterijų kolonijos matomos po 48 val. Jos yra apvalios, iškilios, taisyklingos formos ir standžios konsistencijos. Kolonijų diametras apie 1−3 mm., iš pradžių jos yra bespalv÷s, bet v÷liau jos tampa balkšvai−pilkos.

Campylobacteriaceae šeimai priklauso 18 rūšių, šeši porūšiai ir du biovariantai. Iš jų dažniausiai žinduolių ir paukščių žarnyne kaip komensalai aptinkami C. jejuni ir C. coli (Gurtler et al., 2005). Kampilobakterijomis gali užsikr÷sti ir žmon÷s, tod÷l jos laikomos zoonotiniais patogenais (Park, 2002).

1.2. Kampilobakterijų paplitimas ir rūšin÷ įvairov÷ galvijų tarpe

1.2.1 Kampilobakterijų paplitimas galvijų tarpe

Įvairiuose literatūros šaltiniuose nurodomi skirtingi veiksniai, kurie gali įtakoti kampilobakterijų paplitimą galvijų tarpe (Besser et al., 2005; Ellis-Iversen et al., 2009; Grove-White et al., 2010), bet dažniausiai nurodomas galvijų amžius (Inglis et al., 2004; Kwan et al., 2008; Gillespie et al., 2009). Naujagimiai veršeliai ūkyje greitai užsikrečia kampilobakterijomis horizontaliu perdavimo keliu, ir keturių dienų laikotarpyje su išmatomis ima platinti kampilobakterijas. Didžiausia bakterijų koncentracija veršelių išmatose nustatoma per pirmuosius du m÷nesius. Tyrimais nustatyta, kad veršelių išmatose kampilobakterijų skaičius gali būti 10 ar net 100 kartų didesnis, nei pas vyresnio amžiaus galvijus (Nielsen 2002; Johnsen et al., 2006).

Kampilobakterijų kiekį gali įtakoti ir gyvulininkyst÷s tipas, kuris lemia galvijų laikymo ir priežiūros sąlygas. Siekiant užtikrinti mikrobiologinę pieno kokybę, pieniniams galvijams taikomos griežtesn÷s higienos normos, nei m÷siniams galvijams. Pieninių galvijų bandose kampilobakterijų paplitimas svyruoja nuo 0 % iki 100 % (Oporto et al., 2007; Gilpin et al., 2008; Pradhan et al., 2009), tuo tarpu m÷sinių galvijų bandoje nuo 5,4 % iki 83,0 % (Inglis et al., 2003; Berry et al., 2006; Oporto et al., 2007).

M÷siniai galvijai dažniausiai auginami iki 30 m÷nesių amžiaus ir tada yra skerdžiami, tuo tarpu pieninių galvijų amžiaus vidurkis yra gerokai ilgesnis. Iš atliktų išmatų tyrimų buvo nustatyta, kad galvijų žarnyne kampilobakterijų paplitimas skerdyklose svyruoja nuo 12,5 % iki 89,4 %, o galvijų ūkiuose nuo 12,0 % iki 100 % (Englen et al., 2007; Parisi et al., 2007; Kwan et al., 2008; Ragimbeau et al., 2008; Ellis-Iversen et al., 2009).

11 Galvijų užsikr÷timą kampilobakterijomis taip pat įtakoja š÷rimo tipas, pašarų kokyb÷, m÷šlo tvarkymo sistema, laukinių paukščių prieinamumas prie pašarų, vandens tiekimo sistema ir kt. (Wesley et al., 2000). Padidintos rizikos grupei užsikr÷sti kampilobakterijomis priskiriami galvijai, kurie laikomi didel÷mis bandomis ir/arba ganosi ganyklose (Ellis-Iverseno et al., 2009; Grove-White et al., 2010). Tiriant kampilobakterijų išskyrimo modelius galvijų ūkiuose buvo nustatyta, kad pavieniai gyvūnai gali nuolat platinti bakterijas su išmatomis dideliais kiekiais. Tuo tarpu kiti galvijai platina su pertraukomis (Inglis et al., 2004; Minihan et al., 2004; Gilpin et al., 2008; Kwan et al., 2008), arba visai neplatina, nes yra atsparūs kampilobakterijų kolonizacijai, nežiūrint didelio aplinkos užterštumo šiais patogenais (Minihan et al., 2004).

Tyrimais nustatyta, kad į aplinką daugiau kampilobakterijų išskiria sergantys, nusilpę galvijai, kurių sutrikusi medžiagų apykaita. Taip pat didesnį kiekį kampilobakterijų išskiria karv÷s po apsiveršiavimo (Grove-White et al., 2010). Galvijų bandose kampilobakterijų kiekiui įtakos turi ir sezoniškumas. Pieninių galvijų išmatose didžiausia kampilobakterijų koncentracija buvo nustatyta pavasarį ir vasarą, kai galvijai ganomi ganyklose (Kwan et al., 2008; Grove-White et al., 2010). Ganyklose užsikr÷timo kampilobakterijomis šaltinių įvairov÷ yra didesn÷, be to, pavasarį bakterijoms yra palankesn÷s sąlygos daugintis (Oporto et al., 2007; Grove-White et al., 2010).

1.2.2 Rūšin÷ kampilobakterijų įvairov÷ galvijų tarpe

Galvijų bandose dažniausiai yra paplitusi C. jejuni, kiek rečiau C. coli rūšis (Milnes et al., 2008; Ragimbeau et al., 2008; Ellis-Iversen et al., 2009; Chatre et al., 2010). Kwan ir kt. (2008) nustat÷, kad C. jejuni genotipų įvairov÷ yra didesn÷ pas suaugusius galvijus, nei pas jaunus veršelius. Be šių gerai žinomų žmogaus patogenų, galvijų žarnyne taip pat aptinkama C. fetus (Inglis et al., 2004), kurios du porūšiai galvijams gali sukelti lytinių organų infekcijas, ko pasekoje gali išsivystiti abortai. Be to, C. fetus žmon÷ms gali sukelti sunkų imunodeficitą. Galvijų tarpe nustatomos ir kitos kampilobakterijų rūšys, tokios kaip C. laris, C. hyointestinalis, C. upsaliensi, kurių svarba žmogaus sveikatai dar n÷ra pilnai išaiškinta (Debruyne et al., 2008). Gilpin ir kt. (2008) patvirtino, kad galvijų žarnyne tuo pačiu metu gali daugintis kelios skirtingos kampilobakterijų rūšys. Be to, skirtingoms Campylobacter spp. proporcijoms galvijų išmatose įtakos turi galvijo amžius (Bae et al., 2005).

12

1.3. Kampilobakterijų paplitimas maisto grandin÷je

1.3.1 Paukštiena

Įvairiuose literatūros šaltiniuose nurodoma, kad iš visų maisto produktų paukštiena yra pagrindinis susirgimo kampilobakterioze šaltinis žmon÷ms (Friedman et al., 2004; EFSA, 2012). Broileriai, auginami paukštid÷se, užsikrečia kampilobakterijomis fekaliniu–oraliniu keliu nuo sergančiųjų ir platina bakterijas gyvenamojoje aplinkoje (Allen et al., 2007). Paukščiai su išmatomis į aplinką išskiria didelius kiekius šių bakterijų, paprastai 108ksv/g. Didelį kampilobakterijų kiekį lemia paukščių kūno temperatūra (42 oC), kuri yra optimaliausia augti ir daugintis šioms bakterijoms (Stintzi et al., 2003). Tyrimais nustatyta, kad Campylobacter spp. didžiausia koncentracija paukščių organizme yra aklojoje ir storojoje žarnose ir jos dažnai yra išskiriamos iš gyvų paukščių prieš skerdimą (Lindmark et al., 2006; Allen et al., 2007; Klein et al., 2007; Lienau et al., 2007).

Broilerių skerdena dažniausiai užteršiama patogenin÷mis kampilobakterijomis skerdimo proceso metu, atliekant plikinimą ar šalinant vidaus organus. Be to, šios bakterijos patenka ne tik ant skerdenos, bet užteršia plikinimo vandenį ir skerdimo liniją (Guerin et al., 2010). Po nuplikinimo skerdenų mikrobin÷ tarša gali padid÷ti 2−7 kartais. Skerdimo procesas laikomas svarbiu skerdenos kryžmin÷s taršos veiksniu, broileriams, kurie buvo neigiami kampilobakterijų atžvilgiu iki skerdimo (Johnsen et al., 2006). Taip pat nustatyta, kad užteršimo lygį įtakoja skerdžiamų paukščių amžius, metų m÷nuo, bei laiko tarpas iki skerdenos apdorojimo (EFSA, 2012). Patogeninių kampilobakterijų taršos lygis paukštienoje paprastai sumaž÷ja perdirbimo proceso metu, ypač jei m÷sa užšaldoma (Georgsson et al., 2006).

Didelį kampilobakterijų paplitimą paukštienoje lemia ne tik skerdimo proceso higienos pažeidimai, bet ir paukštienos maistin÷s medžiagos. Paukštienoje yra daugiau baltymų bei sausųjų ir mineralinių medžiagų, nei kitos rūšies gyvūnų m÷soje. Tyrimais nustatyta, kad kampilobakterijos geriau auga tuose terp÷se, kuriuose yra daugiau aminorūgščių. Be to, d÷l sąlyginai greitos medžiagų apykaitos, paukštiena subręsta greičiau, nei kitų gyvūnų m÷sa ir per pirmąsias 3–24 val. pH kinta nuo 5,67 iki 5,95. Tuo tarpu kampilobakterijų optimalus dauginimosi pH yra 6,5−7,5 (Garénaux et al., 2008).

Pagal ESFA (2012) pateiktus duomenis, šviežioje broilerių m÷soje dažniausiai yra nustatoma C. jejuni (34,2 %) ir kiek rečiau C. coli (27,3 %). Luber ir kt. (2005) tyrin÷jo šviežios paukštienos kulšeles ir pri÷jo išvados, kad kampilobakterijos ant paukštienos produktų yra pasiskirsčiusios netolygiai. Daugiausia kampilobakterijų yra ant produktų paviršiaus, tuo tarpu produkto gilesniuose audiniuose jų pasitaiko rečiau. Tod÷l ruošiant maistą viešojo maitinimo įstaigose ar namų sąlygomis, žmon÷s kampilobakterioze užsikr÷sti gali d÷l kryžmin÷s taršos nuo žalios paukštienos per kitus maisto

13 produktus, naudojant tuos pačius peilius, pjaustymo lenteles ar nuo gaminančio asmens rankų (Havelaar et al., 2005).

1.3.2 Jautiena

Atvežti į skerdyklą galvijai yra dažnai nustatomi kaip kampilobakterijų nešiotojai ir platintojai (Besser et al., 2005; Garrett et al., 2007), tačiau jautienoje ir jos produktuose šių bakterijų kiekis būna labai nedidelis. Pagal ESFA (2012) pateiktus duomenis, 2010 m. užkr÷stų šviežios jautienos m÷ginių buvo nustatyta 0,4 %, tuo tarpu paukštienos − 29,6 %. Jautienos skerdienos tarša kampilobakterijomis yra labai maža, nes skerdyklose skerdimo metu laikomasi aukštų higienos reikalavimų, d÷l kurių yra sumažinamas bendras užkr÷stumas bakterijomis (Minihan et al., 2004; Garrett et al., 2007). Be to, ant skerdienos likusių kampilobakterijų išlikimą mažina skerdienos atv÷sinimas ir užšaldymas bei didesn÷ deguonies koncentracija aplinkoje (Phillips et al., 2008). Kampilobakterijų augimo procesą taip pat slopina jautienos pH, nes 1−2 dienas po skerdimo pH siekia vidutiniškai 5,3−5,6 (iki 6,0) (Garénaux et al., 2008).

Remiantis literatūroje aprašytais tyriamis, maltoje m÷soje gali išlikti kampilobakterijos esant palankioms sąlygoms, bet laboratoriniais tyrimais kampilobakterijų nepavyko nustatyti maltoje jautienoje (Ghafir et al., 2007; Medeiros et al., 2008; Phillips et al., 2008). Tuo tarpu ant jautienos skerdienos termofilin÷s kampilobakterijos yra nustatomos, bet užkr÷stumas kampilobakterijomis yra nedidelis, ES 2010 m. neviršijo 2 %, pvz. Vokietijoje nustatyta – 1,9 %, Nyderlanduose – 0,3 %, Ispanijoje – 0 % (EFSA, 2012).

Patogenin÷s kampilobakterijos gali lokalizuotis tariamai sveikų galvijų tulžies pūsl÷je, ir skerdimo proceso metu su tulžimi patekti į kepenis (Acik et Cetinkaya 2005; Enokimoto et al., 2007). Remiantis literatūroje pateiktais duomenimis, užsikr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis didesn÷ rizika kyla vartojant jautienos kepenis, nei faršą. Nes tyrimais buvo nustatyta, kad skerdykloje paskerstų galvijų kepenų užkr÷stumas kampilobakterijomis siekia 1,4 % − 45 %, o esančių prekyboje net 12 % − 54 % (Little et al., 2008; Medeiros et al., 2008).

1.3.3 Kiauliena

Kiauliena yra dar vienas kampilobakterijų užkrato šaltinis. Kiaul÷ms kaip ir kitiems gyvūnams, užsikr÷tusiems kampilobakterijomis n÷ra ligos simptomų. Thakur ir kt. (2006) nurodo, kad nuo 50 % iki 100 % kiaulių yra kampilobakterijų nešiotojos ir išskiria į aplinką didelį šių patogenų kiekį su išmatomis (102 − 107 ksv/g). Kampilobakterijos į maisto grandinę gali patekti per kiaulių skerdienas, kuomet jos

14 auginamos skirtinguose fermose, tačiau skerdykloje yra laikomos kartu ir šiomis bakterijomis kiaul÷s užsikrečia fekaliniu−oraliniu keliu. Skerdienos užterštumas kampilobakterijomis pagrinde siejamas su skerdimo technologija. Dažniausiai kiaul÷s skerdžiamos, nenulupant odos, kuri nuplikoma tik skerdimo pradžioje, dalis kampilobakterijų gali išgyventi ir tokiu būdu būti pernešamos ant kitų paviršių (Moore et al., 2005).

Kampilobakterijų galima rasti kiaulių tonzil÷se, skrandžio turinyje, klubin÷je, aklojoje ir gaubtin÷je žarnose, taip pat limfiniuose mazguose (Hurd et al., 2008). Nustatyta, kad skirtingai, nei pas paukščius ar galvijus, kiaulių žarnyne dažniau yra paplitusi C. coli rūšis (50,2%), nei C. jejuni (36,7%) (EFSA, 2012). Wilson ir kt. (2008) nurodo, kad žmonių kampilobakteriozę retai sukelia C. jejuni, išskirtos iš kiaulienos. Be to, C. coli yra mažiau atspari stresui, nei C. jejuni, tod÷l jos greičiau žūsta kai kiaulienos skerdiena yra užšaldoma ar džiovinama (Madden et al., 2000). Taip pat chloruotas vanduo gali būti pakankamai efektyvus naikinant mažiau atsparias C. coli, tokiu būdu sumažinant bendrą Campylobacter spp. koncentraciją kiaulienoje (Hurd et al., 2008).

1.3.4 Pienas ir jo produktai

Žmon÷ms patogenin÷s kampilobakterijos dauginasi galvijų žarnyne ir jų patekimas į pieną dažniausiai būna d÷l fekalinio pieno užteršimo. Pieno užteršimas kampilobakterijomis gali atsirasti d÷l melžimo metu padarytų klaidų ar higienos reikalavimų nesilaikymo. Be to, karv÷s sergančios slaptu mastitu, kurio priežastis Campylobacter spp. genties bakterijos, išskiria šiuos patogenus melžimo metu su pienu. Tyrimais įrodyta, kad pieno užteršimą būtu galima sumažinti griežtai laikantis melžimo higienos reikalavimų ir pasterizuojant žalią pieną, kurio metu žūsta kampilobakterijos (Humphrey et al., 2007). Tačiau Newkirk ir kt. tyrin÷jo kampilobakterioz÷s protrūkius įvykusius d÷l pieno vartojimo nuo 1990 iki 2006 m., ir nustat÷, kad 31 (73,8%) atvejį suk÷l÷ nepasterizuoto ir net 11 (26,2%) pasterizuoto pieno vartojimas. Tod÷l negalima teigti, kad pieno pasterizacija visiškai sunaikina šias termofilines bakterijas.

Heuvelink ir kt. (2009) nustat÷, kad kampilobakterijų paplitimas žaliame piene svyruoja nuo 0% iki 27%, o bakterijų skaičius paprastai nesiekia 10 ksv/ml., bet šio bakterijų kiekio užtenka, kad žmon÷s užsikr÷stų ir susirgtu kampilobakterioze. Kalman ir kt. (2000) atliko tyrimus su kampilobakterijomis užkr÷stu pienu, ir nurodo, kad kambario temperatūroje laikant nepasterizuotame pieną C. jejuni jame išgyvena 24 val. ir net kelias savaites išlieka gyvybingos 4 oC temperatūros piene, nors jame ir nesidaugina.

Žalio pieno vartojimas dažnai yra siejamas su žmonių kampilobakterioz÷s protrūkiais. Tačiau reguliarus žalio pieno vartojimas lemia individualaus imuniteto susidarymą prieš kampilobakterijas

15 (Friedman et al., 2004). Tai įrodo organizme susidarę IgG antikūniai prieš kampilobakterijų antigenus. Be to, piene esantys komponentai, tokie kaip oligosacharidai yra susiję su apsauga prieš kampilobakteriozę, ypač maitinamiems kūdikiams. Nustatyta, kad C. jejuni in vitro slopina moters pienas, konkrečiai α 1,2−oligosacharidas, kuris jungiasi su žmonių H antigenu esančiu raudonųjų kraujo kūnelių membranoje. Tod÷l, galima teigti, kad α 1,2−oligosacharidas esantis moters piene slopina Campylobacter spp. adheziją ir kolonizaciją žarnyne, ir užtikriną apsaugą maitinamiems kūdikiams nuo kampilobakterioz÷s. Vis d÷lto, nepasterizuotas karvių pienas sukelia protrūkius ar pavienius kampilobakterioz÷s susirgimus vaikams ir suaugusiems žmon÷ms, nes α 1,2−oligosacharido karvių piene yra mažai arba jo visai n÷ra (Ruiz-Palacios et al., 2003).

Belgijoje ir Italijoje buvo atlikti išsamūs tyrimai su kampilobakterijomis užkr÷stais pieno produktais. Tyrimų metu buvo nustatyti 4,1 % užkr÷stų sūrio produktų, kurie buvo pagaminti iš žalio arba mažai termiškai apdoroto karvių pieno (ESFA, 2012). Nedidelį kampilobakterijų paplitimą pieno produktuose įtakoja šių produktų žemas pH, gamybos metu pridedamos biologiškai aktyvios medžiagos bei pieno rūgšties bakterijų išskiriamos rūgštys ir metabolitai. Vis d÷lto, kai pirminis užkratas produktuose yra didelis, pvz. česnakiniame svieste, C. jejuni gali išgyventi iki 18 dienų šaldytuvo temperatūroje (Zhao et al., 2000).

1.3.5 Vanduo

Kampilobakterijų randama taip pat ir kitose maisto žaliavose ir produktuose, nei paukštiena, kiauliena, jautiena ar nepasterizuotas pienas. Žmonių kampilobakterijoz÷s protrūkių priežastimi dažnai laikomas nešvaraus, termiškai neapdoroto lietaus vandens vartojimas. Pagrindin÷ geriamojo vandens užkr÷timo priežastis būtu sergančių kampilobakterijoze gyvulių ir paukščių fekalijų patekimas į naudojamą vandens šaltinį. Be to, prieš vartojimą plaunant daržoves ar vaisius su tokiu vandeniu, kampilobakterijos gali patekti ant šviežių vaisių ir daržovių bei sukelti žmonių kampilobakteriozę (Brandi et al., 2004).

1.4.

Žmonių kampilobakterioz÷s epidemiologija

1.4.1 Žmonių kampilobakterioz÷

Žmon÷ms kampilobakteriozę sukelia termofilin÷s kampilobakterijos. Dažniausiai tai būna C. jejuni, C. coli ir C. laris rūšys, tačiau yra ir kitų kampilobakterijų rūšių galinčių sukelti žmonių susirgimus (EFSA, 2012).

16 Tyrimais nustatyta, kad daugiau nei 90 % visų žmonių kampilobakterioz÷s susirgimų priežastys yra užterštos vištienos bei jautienos ir pieno produktų vartojimas įskaitant ir tuos atvejus, kurie kilo d÷l kryžminio užteršimo iš šių šaltinių. Likusių susirgimų priežastys nurodomos kaip tiesioginis kontaktas su avimis, laukiniais paukščiais, naminiais augintiniais bei užterštu vandeniu (žr. 2 pav.). Nors galima tiesiogin÷ infekcija nuo žmogaus žmogui, tačiau tai neturi didel÷s epidemiologin÷s reikšm÷s (Friedman et al., 2004).

2 pav. Svarbiausi žmonių užsikr÷timo C. jejuni šaltiniai (Wilson et al., 2008)

Žmonių kampilobakteriozei būdingas sezoniškumas, kuris pasireiškia skirtingais vasaros m÷nesiais priklausomai nuo geografin÷s vietov÷s (White et al., 2009). Pagal sezoniškumą Lietuvoje 2007−2009 m. sergamumo kampilobakterioze vidurkio pakilimas buvo geguž÷s m÷nesį, o susirgimų pikas−rugpjūčio m÷nesį (EFSA, 2012). Infekcijos atvejų skaičiaus did÷jimas priklauso ir nuo klimato pokyčių, pvz. did÷jančios temperatūros ar lietaus kiekio (Lake et al., 2009; Stark et al., 2009; White et al., 2009; Jore et al., 2010). Susirgimų kampilobakterioze pasitaiko visose amžiaus grup÷se, tačiau dažniau jaunesniems nei penkerių metų vaikams ir pacientams, kurių amžius yra nuo 15 iki 29 metų (Baker et al., 2007; White et al., 2009; Nakari et al., 2010). Viena iš priežasčių, kod÷l vaikai dažniau serga kampilobakterioze, nurodoma jų didesn÷ kūno temperatūra, nei suaugusių (Louis et al., 2005). Be to, tyrimais nustatyta, kad vyresnio amžiaus žmon÷s gali sirgti dažniau d÷l vaistų vartojimo ar ligų, kurios slopina skrandžio rūgščių išsiskyrimą (Gillespie et al., 2009; Doorduyn et al., 2010). Sergamumas kampilobakterioze skiriasi ne tik skirtinguose amžiaus grup÷se, bet skiriasi ir tarp lyčių. Nustatyta, kad vyrai dažniau serga kampilobakterioze, nepriklausomai nuo amžiaus grup÷s (Louis et al., 2005; Baker et al., 2007; White et al., 2009).

Kampilobakterijos sukelia uždegiminį enteritą, kuris iš pradžių vystosi plonosiose žarnose, o v÷liau pereina į storąsias. Inkubacinis periodas gali trukti 1−7 dienas, tačiau daugeliui žmonių klinikiniai simptomai pasireiškia per 3 dienas. Palyginus su kitomis per maistą plintančiomis infekcijomis kampilobakterioz÷s inkubacinis periodas yra ilgesnis nei daugelio kitų (Wassenaar et al., 2007). Ligos

17 patogenezę nulemia didelis kampilobakterijų adhezinis ir invazinis aktyvumas. Kampilobakterijų prisitvirtinimą prie gleivin÷s lemia paviršiniai saviti adhezijai ir žiuželiai. Jos lengvai prasiskverbia pro gleives, epitelinių ląstelių membranas ir greitai kolonizuoja plonąsias žarnas, sukeldamos gleivin÷s pokyčius ir paburkimą.

3 pav. C. jejuni invazija į plonųjų žarnų epitelio ląsteles.

Nuotraukose A pavaizduota kaip po užsikr÷timo pra÷jus 4-6 val., C. jejuni (raudonos rodykl÷s) skverbiasi į epitelines ląsteles esančias (B) tarp plonųjų žarnų kriptų (m÷lynos rodykl÷s). Kampilobakterijai įsiskverbus į epitelį paskui jos žiuželį (geltonos rodykl÷s) skverbiasi ir kitos. Nuotraukos padarytos su aukštos raiškos elektroniniu mikroskopu (Krause-Gruszczynska et al., 2007)

Patogeniškumui svarbūs ir gaminami termolabilūs bei termostabilūs enterotoksinai, kurie išsilaisvina žuvus kampilobakterijoms ir turi gramneigiamų bakterijų endotoksinų savybes. Kampilobakterioz÷ sukelia stiprų žarnų pažeidimą, kurį lemia arba tiesioginis bakterinių toksinų poveikis, arba kaip uždegimin÷ reakcija į bakterijų įsiskverbimą į žarnų epitelio ląsteles (3 pav.).

Sergantiems kampilobakterioze būdingas gausus, dažnai su krauju, viduriavimas, ūmūs pilvo skausmai ir karščiavimas. Tačiau 30 % pacientų, liga prasideda su simptomais primenančiais peršalimą tokiais kaip karščiavimas, galvos skausmas ir svaigimas, raumenų skausmas. Nors didelę dalį pacientų pykina, tik apie 15 % pacientų vemia (Skirrow et al., 2000; Wassenaar et al., 2007). Paprastai, viduriavimas praeina po 3−4 dienų, bet Campylobacter spp. galima rasti išmatose dar kelias savaites (Kapperud et al., 2003). Komplikacijos pasitaiko retai. Kai kuriems žmon÷ms kampilobakterioz÷ gali komplikuotis artritais (sąnarių uždegimais), kitiems išsivysto reta liga Miller Fisher sindromas ar Guillain-Barre sindromas, kuris prasideda pra÷jus keletui savaičių po viduriavimo ir pažeidžia nervų sistemą. Šis sindromas išsivysto tuomet, kai ligonio imunin÷ sistema ima atakuoti savo paties nervus, d÷l to jie kelioms savait÷ms paralyžiuojami. Tokiu atveju ligonį reikia intensyviai gydyti. Guillain-Barre ir

18 Miller Fisher sindromus dažniausiai lemia C. jejuni bakterijos. Tačiau ne visos C. jejuni paderm÷s gali sukelti šias komplikacijas (Takahashi et al., 2005).

1.4.2 Žmonių kampilobakterioz÷s ryšys su galvijais

Campylobacter spp. genotipavimas leidžia žmonių kampilobakterioz÷s suk÷l÷jus priskirti prie konkrečių šaltinių.Tod÷l įmanoma palyginti bakterijų izoliatus iš kampilobakterioze susirgusių žmonių organizmo ir nuo galimo infekcijos šaltinio. Išnagrin÷jus rizikos veiksnius, susijusius su C. jejuni genotipu, buvo gauta papildoma informacija apie tai, kokį vaidmenį atlieka galvijai žmonių kampilobakterioz÷je. Pulsinio lauko gelyje elektroforez÷s (PFGE) metodu buvo nustatytas kampilobakterijų, išskirtų iš žmonių ir galvijų, genotipų panašumus, tod÷l galime teigti, kad galvijai taip pat yra Campylobacter spp. rezervuaras žmon÷ms (Devane et al., 2005; Johnsen et al., 2006; Garrett et al., 2007; Gilpin et al., 2008).

Neseniai Danijoje buvo atlikti atvejo-kontrol÷s tyrimai, kurie nagrin÷jo kampilobakterioz÷s skirtingą riziką kaimo ir miesto vietov÷se. Remiantis išsamiais tyrimais, susirgimo rizika yra didesn÷ tarp žmonių, ypač vaikų, gyvenančių kaimo vietov÷se nei miestuose (Ethelberg et al., 2005). Pasak Švedijoje atliktais tyrimais, kampilobakterioz÷s sergamumas taip pat yra susijęs su did÷jančiu atrajotojų tankumu, nes su išmatomis kampilobakterijos patenka į aplinką bei užteršia vandens telkinius (Nygård et al., 2004). Kaip pavyzdžiui Kanadoje, po stiprios liūties iš galvijų ūkio užterštas kampilobakterijoms vanduo pateko į miesto vandentiekį ir suk÷l÷ didelio masto kampilobakterioz÷s protrūkį (Clark et al., 2003). Taip pat yra nustatyta padid÷jusi rizika susirgti kampilobakterioze žmon÷ms, kurie kontaktuoja su ūkiuose auginamais gyvūnais (Michaud et al., 2004; Doorduyn et al., 2010), įskaitant galvijus (Kapperud et al., 2003; Neimann ir kt. 2003). Gilpin ir kt. (2008) įrod÷, kad tiesioginis kontaktas su viduriuojančiais veršeliais arba galvijų fekalijomis yra dažna kampilobakterioz÷s infekcijos priežastis ūkio darbuotojams ar vaikams gyvenantiems ūkyje.

19

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

2.1 M÷ginių rinkimas ir kampilobakterijų išskyrimas

2.1.1 Įvairaus amžiaus pieninių galvijų išmatų m÷giniai

Tyrimo metu buvo pasirinktos trys skirtingos Lietuvos žem÷s ūkio bendrov÷s, kuriose iš skirtingo amžiaus galvijų grupių buvo imami išmatų m÷giniai 2011 m. geguž÷s − rugpjūčio m÷n. laikotarpyje.

4 pav. Tirtų ūkių geografin÷ pad÷tis.

A-ŽŪB ,,Daug÷liškis“, B-ŽŪB ,,Bernatoniai“, C-ŽŪB ,,Sudargas“

Tyrimo metu tirtos žem÷s ūkio bendrov÷s viena nuo kitos išsid÷sčiusios 141 kilometro. spinduliu. Labiausiai nutolusi Šakių rajone esanti ŽŪB ,,Sudargas“. Tuo tarpu Kauno apskrityje esančios bendrov÷s ,,Daug÷liškis“ ir ,,Bernatoniai“, viena nuo kitos nutolusios 32 kilomentrų atstumu (4 pav.).

Daug÷liškių ŽŪB iš viso laiko 850 galvijų, iš jų 700 karvių, 100 telyčių ir 50 veršelių iki 3 m÷n. amžiaus. Bendrov÷je galvijai laikomi palaidi, bet suskirstyti į grupes pagal amžių ir fiziologinę būseną. Veršeliai iki 10 d. laikomi vienut÷se, v÷liau grup÷mis po 25 iki 3 m÷n. amžiaus, po to dar kartą pergrupuojami po 10 − 15 telyčių garde. Telyčių grup÷s laikomos garduose iki s÷klinimo (12 −14 m÷n.), paskui v÷l vyksta pergrupavimas. Galvijai neganomi ir visus metus laikomi tvartuose, kur šeriami silosu ir kitu žiemos racionu.

20 Bernatonių ŽŪB iš viso laiko 1500 galvijų, iš jų 1100 karvių, 250 telyčių ir 150 veršelių iki 3 m÷n. amžiaus. Galvijų grup÷s suskirstytos pagal amžių ir fiziologinę būseną. Veršeliai iki 5 d. laikomi vienut÷se, v÷liau grup÷mis po 25 iki 3 m÷n., po to dar kartą pergrupuojami po 10−15 telyčių garde. Tvartiniu laikotarpiu telyčių grup÷s laikomos garduose iki s÷klinimo, paskui v÷l vyksta pergrupavimas. Be to, telyčios ir veršingos karv÷s bendrov÷s ūkyje turi tiesioginį kontaktą su prieaugliu. Vasaros metu prieauglis nuo 6 m÷n. amžiaus ir užtrūkusios karv÷s laikomos lauko stovyklose. Melžiamos karv÷s po rytinio melžimo išleidžiamos į lauke esančią aikštelę mocionui, o po pietų suvaromos atgal. ŽŪB galvijai šeriami savos gamybos pašarais.

Sudargo ŽŪB iš viso laiko 820 galvijų, iš jų 380 karvių, 230 telyčių ir 210 veršelių iki 2 m÷n. amžiaus. Galvijų grup÷s suskirstytos pagal amžių ir fiziologinę būseną. Veršeliai iki 14 d. laikomi vienut÷se, v÷liau grup÷mis po 3−4 iki 2 m÷n. amžiaus. Tada buliukai parduodami, o telyčait÷s laikomos grup÷mis po 10−15 iki s÷klinimo, paskui v÷l vyksta pergrupavimas. Telyčios vasaros metu turi iš÷jimą į lauko stovyklą. Tuo tarpu karv÷s ištisus metus laikomos bendrov÷s ūkiuose ir šeriamos savos gamybos pašarais.

Surinkti m÷giniai buvo tiriami LSMU VA Maisto saugos ir kokyb÷s katedros laboratorijoje. Bakterijos buvo išskiriamos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kiekvieno m÷ginio buvo imama po 10 g išmatų ir užpilama 90 ml Bolton sultiniu bei homogenizuojama 1 min. peristaltine maišykle. Tolimesniam tyrimui į l÷kšteles paruoštas su selektyvia mCCDA terpe buvo pas÷ta po 0,1 ml individualaus m÷ginio. Užs÷tos l÷kštel÷s buvo inkubuojamos 37 oC temperatūroje 48 valandas mikroaerofilin÷mis sąlygomis (10% CO

2, 85% N ir 5% O2). Po inkubavimo buvo

atrenkamos mCCDA l÷kštel÷s su kampilobakterijoms būdingomis kolonijomis, kurios v÷liau patikrinamos mikroskopu, vertinant bakterijų morfologiją ir judrumą. Po to, iš kiekvienos l÷kšteles buvo atrenkama iki 2 būdingų kampilobakterijoms kolonijų ir pers÷jama į l÷kšteles su kraujo agaru (5% arklio kraujo) ir inkubuojama 37 oC 48 val. Po inkubavimo gryna kultūra buvo saugoma −80oC temperatūroje smegenų širdies sultinyje su 30 % glicerolio priedu.

Kiekvienas m÷ginys atitinkamai buvo pagausinamas Bolton sultinyje. Į sterilius m÷gintuv÷lius su 9 ml selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu buvo įdedama po 1 g išmatų. Maišeliai su pagausinimo sultiniu buvo inkubuojami mikroaerofilin÷mis sąlygomis, 42 oC temperatūroje 24 valandas. Po inkubavimo 0,1 ml pagausinimo sultinio buvo s÷jama į l÷kšteles su mCCDA agaru. Preliminarus kampilobakterijų nustatymas ir išgryninimas atliekamas taip pat kaip buvo aprašyta anksčiau.

Po inkubacijos buvo atliktas kiekybinis kampilobakterijų nustatymas atrinktuose m÷giniuose vadovaujantis LST EN ISO 10272 − 2: 2006 „Maisto produktų ir pašarų mikrobiologija. Bendrasis kampilobakterijų aptikimo ir skaičiavimo metodas. Kolonijų skaičiavimo metodas.”

21

(

)

[

]

Σa – visų suskaičiuotų kolonijų suma;

n1 − pirmojo skiedimo neatmestų l÷kštelių suma;

n2 – antrojo skiedimo neatmestų l÷kštelių suma;

d – skiedimo laipsnis, atitinkantis pirmąjį skiedinį; V − užs÷tos medžiagos tūris l÷kštel÷je mililitrais.

2.1.2 Atv÷sintos smulkintos jautienos ir nepasterizuoto pieno m÷giniai

Tyrimams buvo pasirinkti keturi skirtingi prekybos centrai ir trys skirtingi nepasterizuoto pieno tiek÷jai, kurių gaminiai, t.y., atv÷sinta smulkinta jautiena ir nepasterizuotas pienas, buvo perkami kas antrą savaitę prekybos centruose ir miesto turgaviet÷se neįsp÷jant pardav÷jų nuo 2011 m. spalio m÷n. iki 2012 m. spalio m÷n.

Kampilobakterijos buvo išskiriamos tiesiogiai s÷jant ant mCCDA agaro ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kiekvienas m÷ginys atskirai (10 g atv÷sintos smulkintos jautienos ir 10 ml nepasterizuoto pieno) buvo užpilamas 90 ml Bolton sultiniu ir smulkinta jautiena homogenizuojama 1 min. peristaltine maišykle, o pieno m÷ginys išmaišomas. Tolimesnis s÷jimas buvo atliekamas taip pat kaip buvo aprašyta ankščiau.

Kiekvienas m÷ginys atitinkamai buvo pagausinamas Bolton sultinyje. Į sterilius homogenizavimo maišelius su 90 ml selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu buvo įdedama 10 g atv÷sintos smulkintos jautienos arba 10 ml nepasterizuoto pieno. Maišeliai su pagausinimo sultiniu buvo inkubuojami mikroaerofilin÷mis sąlygomis, 42 oC temperatūroje 24 valandas. Po inkubavimo 0,1 ml pagausinimo sultinio buvo s÷jama į l÷kšteles su mCCDA agaru. Preliminarus kampilobakterijų nustatymas ir išgryninimas atliekamas taip pat kaip buvo aprašyta anksčiau.

2.2 Kampilobakterijų identifikavimas

2.2.1. DNR išskyrimas

Nuo l÷kštel÷s su kraujo agaru surenkama pilna kilpel÷ grynos kampilobakterijų kultūros ir perkeliama į m÷gintuv÷lį su 500 µl distiliuoto vandens. Taip paruoštas tirpalas yra kaitinamas termomikseryje 100 oC, 10 min., po to 5 min. centrifuguojama 14000 aps./min. Supernatantas perkeliamas į naują m÷gintuv÷lį, o išskirta DNR iškarto naudojama PGR, arba užšaldoma −20 oC iki tyrimo.

22

2.2.2. Daugin÷ PGR

Kampilobakterijos buvo identifikuojamas iki rūšies naudojant šiek tiek pakeistą Wang ir kt. (2002) aprašytą metodą ir pradmenis (žr. 1 lent.). Naudojant pradmenis 23SF ir 23SR susidar÷ 650 bp fragmentas, kuris būdingas visoms kampilobakterijų rūšims (nusako Campylobacter gentį). C. jejuni rūšiai būdingo amplifikuoto fragmento ilgis 323 bp, C. coli – 126 bp, C. lari – 251 bp, C. upsaliensis – 204 bp ir C. fetus – 435 bp. Tyrimams buvo naudojamas pradmenų oligonukleotidų mišinys hibridizuojantis su C. jejuni hipO genu (pradmenys CJF ir CJR), C. coli glyA genu (pradmenys CCF ir CCR), C. lari glyA genu (pradmenys CLF ir CLR), C. upsaliensis glyA genu (pradmenys CUF ir CUR) ir su C. fetus sapB2 genu (pradmenys CFF ir CFR). Bendras PGR reakcijos mišinio kiekis vienam m÷giniui buvo 25 µl. Kiekvienas PGR mišinys buvo ruošiamas iš 2 µl 2 mM deoksinukleozido trifosfato mišinio, 2,5 µl 10X reakcijos buferio, 2,5 µl 25 mM MgCl

2, 0,25 µl HotStart Taq DNR polimeraz÷s

(MBI, Fermentas), 0,75 µl 100 µM pradmenų mišinio, kuris sudarytas iš 23S rRNR C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis ir C. fetus pradmenų, 2,5 µl chromosomų DNR ir distiliuoto H

2O iki 25 µl. PGR

produktai buvo analizuojami elektroforez÷s gelyje. Po 11 µl kiekvieno PGR produkto buvo perkeliama į 1,3% TopVision™ LM GQ agaroz÷s gelio su 0,05 µl/ml etidžio bromidu atskirus šulin÷lius (MBI, Fermentas). DNR fragmentų dydžiui nustatyti buvo naudojami GeneRulerTM100 bp DNA Ladder (MBI, Fermentas) molekuliniai žymenys. PGR rezultatai atlikus elektroforezę buvo vertinami padarius nuotraukas UV spindulių šviesoje.

1 lentel÷. Pradmenų fragmentai naudoti daugin÷s PGR tyrime (Wang et al., 2002)

Pradmuo

Fragmen-tas (bp) Seka (5′-3′) Genas

Geno lokalizacija

(bp)

CJF 323 ACTTCTTTATTGCTTGCTGC C. jejuni hipO 1662-1681

CJR GCCACAACAAGTAAAGAAGC 1984-1965

CCF 126 GTAAAACCAAAGCTTATCGTG C. coli glyA 337-357

CCR TCCAGCAATGTGTGCAATG 462-444

CLF 251 TAGAGAGATAGCAAAAGAGA C. lari glyA 318-337

CLR TACACATAATAATCCCACCC 568-549

CUF 204 AATTGAAACTCTTGCTATCC C. upsaliensis

glyA 63-82

CUR TCATACATTTTACCCGAGCT 266-247

CFF 435 GCAAATATAAATGTAAGCGGAGAG C. fetus sapB2 2509-2532

CFR TGCAGCGGCCCCACCTAT 2943-2926

23SF 650 TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG C. jejuni 23S

rRNA 3807-3829 23SR ATCAATTAACCTTCGAGCACCG 4456-4435

23

2.3 Matematin÷ duomenų analiz÷

Matematiškai duomenys apdoroti statistiniais, Microsoft Office Excel 2007 bei SPSS 16.0 programiniais paketais.

Vertinant skirtumus tarp nepriklausomų, neparametrinius duomenis turinčių imčių, buvo skaičiuojamas chi-kvadratas. Skirtumai tarp imčių besiskiriančių pagal vieną požymį buvo vertinami skaičiuojant vienfaktorinę ANOVA. Statistinis modelis ap÷m÷ galvijų ūkius ir skirtingo amžiaus grupes. Skirtumai tarp grupių ir faktorių buvo analizuoti, naudojant Bonferoni ir Games-Howel daugialypius palyginimus. Skirtumai buvo įvertinti statistiškai reikšmingi, kai P≤ 0,05.

24

3. TYRIMŲ REZULTATAI

3.1 Kampilobakterijų paplitimas įvairaus amžiaus pieninių galvijų grup÷se.

Tyrimo metu iš viso buvo ištirta 200 skirtingo amžiaus galvijų išmatų m÷giniai ir 157 m÷giniuose buvo rastos bakterijos priklausančios Campylobacter spp. genčiai. Kampilobakterijos buvo nustatytos visuose tirtuose pieninių galvijų ūkiuose. Iš visų tirtų pieninių galvijų m÷ginių 78,5 % buvo užkr÷sti termofilin÷mis kampilobakterijomis, o iš jų 7,0 % bakterijos buvo išskirtos tik po pagausinimo Bolton sultinyje (žr. 5 pav.). 70,0 70,0 75,0 5,0 7,5 8,3 75,0 77,5 83,3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

A ūkis B ūkis C ūkis

%

Po tiesioginio s÷jimo Po pagausinimo Viso užkr÷stų m÷ginių

5 pav. M÷ginių skaičius, kuriuose aptiktos kampilobakterijos

Dažniausiai kampilobakterijomis užkr÷sti galvijai buvo nustatyti C ūkyje, − 83,3 %, kiek rečiau B ir A ūkiuose, atitinkamai 77,5 % ir 75,0 % (žr. 2 lent.). Remiantis tyrimo rezultatais nustat÷me, kad ūkis neturi įtakos kampilobakterijų paplitimui (p>0,05).

25 2 lentel÷. Tirtuose ūkiuose paimtų m÷ginių užkr÷stumas kampilobakterijomis

Ūkis M÷ginių sk. Užkr÷stų m÷ginių sk. išskirtų tiesiogiai % Užkr÷stų m÷ginių sk. po pagausinimo % Viso užkr÷stų m÷ginių sk. % A 60 42 70,0 3 5,0 45 75,0 B 80 56 70,0 6 7,5 62 77,5 C 60 45 75,0 5 8,3 50 83,3 Viso: 200 143 71,5 14 7 157 78,5

Veršelių išmatų m÷giniuose kampilobakterijos buvo dažniau nustatomos, nei telyčių ar karvių m÷giniuose. Didžiausias Campylobacter spp. paplitimas veršelių tarpe buvo nustatytas A ir C ūkiuose, atitinkamai 89,4 % ir 100 %. Tačiau B ūkyje Campylobacter spp. dažniau užsikr÷tusios buvo telyčios (p<0,05), nei veršeliai. Be to, B ūkyje šios bakterijos buvo vienodai paplitusios tarp veršelių ir karvių (p>0,05). Campylobacter spp. iš veršelių buvo išskirtos po tiesioginio s÷jimo. Rečiausiai Campylobacter spp. aptinkamos buvo tarp karvių ūkiuose A ir C. Reikšmingas Campylobacter spp. užsikr÷timo skirtumas buvo nustatytas A ir C ūkiuose tarp veršelių ir karvių (p<0,05). Taip pat visuose tirtuose ūkiuose nustatytas reikšmingas užsikr÷timo kampilobakterijomis skirtumas tarp telyčių ir karvių (p<0,05), tai yra, karv÷s buvo užsikr÷tusios kampilobakterijomis dažniau, nei telyčios.

Rezultatai parod÷, kad galvijų amžius yra svarbus veiksnys, prisidedantis prie dažno Campylobacter spp. paplitimo bandoje (p<0,05) (žr. 6 pav.).

89,4 85,0 53,2 70,0 85,0 70,0 100,0 90,0 60,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

V erš eliai Telyč ios K arvės V erš eliai Telyč ios K arvės V erš eliai Telyč ios K arvės

A ūkis B ūkis C ūkis

%

26 Didžiausiu Campylobacter spp. kiekiu buvo užsikr÷tę veršeliai, t.y. vidutiniškai 5,3 log10 ksv/g.

Tuo tarpu mažiausias bakterijų kiekis t.y. vidutiniškai 3,7 log10 ksv/g buvo nustatytas pas suaugusius

galvijus (žr. 7 pav.). 5,62 4,64 5,49 4,37 4,48 4,82 3,55 4,17 3,23 0 1 2 3 4 5 6

A ūkis B ūkis C ūkis

lo g 1 0 k s v /g

Veršeliai Telyčios Karv÷s

7 pav. Kampilobakterijų kiekis (vidurkis log10 ksv/g) skirtingų galvijų amžiaus grupių išmatų

m÷giniuose

Tyrimo metu buvo identifikuojamos 5 Campylobacter spp. rūšys (C. jejuni, C. coli, C. lari, C. fetus ir C. upsaliensis). Tirtuose ūkiuose dažniausiai buvo paplitusios C. jejuni (66,7%) ir C. coli (24,4%). Kitos Campylobacter spp. rūšys kaip C. fetus ir C. lari buvo nustatomos gerokai rečiau, atitinkamai 12,2 % ir 3,2 % tirtų m÷ginių. Tyrimo metu C. upsaliensis rūšies bakterijos nebuvo aptiktos nei viename ūkyje ir nei vienoje tirtoje galvijų amžiaus grup÷je. Be to, ne visos kampilobakterijos buvo identifikuotos iki rūšies (16,7%), nes buvo nustatyta tik Campylobacter gentis.

C ūkyje, skirtingai nuo A ir B ūkio, rečiau buvo nustatomos C. fetus, o C. lari visai nebuvo aptiktos tirtuose m÷giniuose. Tačiau C ūkyje dažniau buvo aptinkamos kitos neidentifikuotos Campylobacter spp. rūšys (žr. 8 pav.).

27 68,9 55,7 78,0 17,8 31,1 22,0 4,4 4,9 0,0 15,6 18,0 2,0 8,9 26,0 14,8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 A ūkis B ūk is C ūk is C . jejuni C . c oli C . lari C . fetus C . s pp

%

8 pav. Campylobacter spp. rūšin÷ įvairov÷ tirtuose ūkiuose

Tirtuose skirtingo amžiaus galvijų grup÷se dažniausiai buvo paplitusi C. jejuni (67,0%) ir C. coli (22,0%). Mažiausiai paplitusi C. lari (2,8%), o tarp karvių ši kampilobakterijų rūšis visai nebuvo nustatyta (žr. 9 pav.). 18,5 2,4 17,4 21,3 77,5 23,9 5,9 6,8 12,4 72,2 23,7 0,0 17,1 16,2 51,4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

C . jejuni C . c oli C . lari C . fetus C . s pp V erš eliai T elyč ios K arvės

%

28 Tirtuose veršelių grup÷se nustatyta, kad dažniausiai paplitusi C. jejuni (51,4%). Tarp veršelių ypač didelis C. jejuni užsikr÷timas nustatytas C ūkyje (70,0%). Skirtingai nuo kitų galvijų amžiaus grupių veršelių grup÷je dažnai nustatyta C. fetus (17,4%). A ūkyje C. coli ir C. fetus paplitimas veršelių tarpe vienodas (23,5%). Tuo tarpu B ūkyje C. fetus 4 kartus dažniau paplitusi, nei C. coli. Tačiau C ūkyje veršelių grup÷je visai nebuvo nustatyta C. fetus. Veršelių tarpe rečiausiai paplitusi C. lari (7,1%), kuri buvo aptikta tik B ūkyje (žr. 10 pav.).

41,2 23,5 0 23,5 17,6 42,9 7,1 7,1 28,6 21,4 70,0 25,0 0 0 25,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80

C. jejuni C. coli C. lari C. fetus C. spp

%

A ūkis B ūkis C ūkis

10 pav. Veršelių užsikr÷timas kampilobakterijų rūšimis tirtuose ūkiuose

Telyčių grup÷se dažniausiai buvo aptinkama C. jejuni (77,5%). Taip pat telyčių tarpe dažniau nustatoma ir C. coli, išskyrus A ūkį. Palyginus su kitais ūkiais, A ūkyje dažniau buvo nustatyta C. fetus (17,6%). Be to, A ūkyje veršelių grup÷je nebuvo nustatyta C. lari, tačiau telyčių grup÷je jos labiau paplitusios už C. coli., bet mažiau už C. fetus. C ūkyje telyčių tarpe nebuvo nustatytos nei C. lari, nei C. fetus (žr. 11 pav.).

29 76,5 5,9 11,8 17,6 5,9 61,8 38,2 5,9 _2,9 14,7 94,4 27,8 0 0 16,7 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

C. jejuni C. coli C. lari C. fetus C. spp

%

A ūkis B ūkis C ūkis

11 pav. Kampilobakterijų rūšių pasiskirstymas tarp tirtų skirtingų ūkių telyčių

Karvių amžiaus grup÷je dažniausiai nustatytos C. jejuni (72,2%) ir C. coli (23,8%). Tačiau visai neaptikta C. lari. A ūkyje nustatytos tik C. jejuni ir C. coli. B ūkyje karvių grup÷je dažnai buvo nustatyta C. fetus (42,9%) (žr. 12 pav.). 100,0 27,3 0 0 0 50,0 35,7 0 42,9 7,1 66,7 8,3 0 8,3 41,7 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 100,0

C. jejuni C. coli C. lari C. fetus C. spp

%

A ūkis B ūkis C ūkis

30

3.2Kampilobakterijų paplitimas smulkintos jautienos ir nepasterizuoto pieno produktuose

Tyrimo metu iš viso buvo ištirti 168 m÷giniai: 73 nepasterizuoto pieno ir 95 atv÷sintos smulkintos jautienos. Iš visų tirtų nepasterizuoto pieno produktų m÷ginių, kampilobakterijos išskirtos tik iš 3 m÷ginių (4,1%) po tiesioginio s÷jimo ant mCCDA agaro. Tuo tarpu atv÷sintos smulkintos jautienos m÷giniuose Campylobacter spp. bakterijų nebuvo rasta nei po tiesioginio s÷jimo, nei po selektyvaus pagausinimo.

Atlikus iš pieno išskirtų kampilobakterijų identifikavimą iki rūšies taikant daugin÷s PGR metodiką buvo patvirtinta, kad išskirtos bakterijos priklauso Campylobacter genčiai, tačiau tai yra kita ar kitos rūšys nei mes siek÷m nustatyti daugin÷s−PGR metodu.

31

4. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS

Pastaraisiais metais kampilobakterioz÷s problemai skiriamas ypatingas d÷m÷sys, kadangi tai dažniausia registruojama zoonoz÷ tiek ES šalyse, tiek ir pasaulyje. Remiantis pastarųjų keliolikos metų tyrimų rezultatais naminių paukščių m÷sa yra laikoma svarbiausia žmonių kampilobakterioz÷s priežastimi (Georgsson et al., 2006; Allen et al., 2007; Doorduyn et al., 2010). Tačiau pastaruoju metu vis daugiau tyrimų pateikia įrodymų, kad atrajotojai taip pat atlieka svarbų vaidmenį šios zoonoz÷s epidemiologijoje (Devane et al., 2005; Garrett et al., 2007; Karenlampi et al., 2007). Tyrimais įrodyta, kad su galvininkyste siejamos maisto žaliavos ar produktai dažnai sukelia sporadinius žmonių susirgimų atvejus ar net protrūkius. Kuriuos dažniausiai lemia nepasterizuoto pieno ar fekalijomis iš galvijų ūkių užteršto paviršinio vandens vartojimas, ar net tiesioginis kontaktas su galvijais (Friedman et al., 2004). Tod÷l kampilobakterijų paplitimo tyrimai yra aktualūs, o Lietuvoje kampilobakterioz÷s paplitimas galvijų ūkiuose bei jų produkcijoje visai netyrin÷tas. Tod÷l buvo atlikti tyrimai siekiant įvertinti šių bakterijų paplitimo ypatumus Lietuvos galvijų bandose, o taip pat ir parduodamos jautienos ir nepasterizuoto pieno užkr÷stumą kampilobakterijomis.

Vidurin÷s juostos klimato ES šalyse kampilobakterioz÷ yra sezoninis susirgimas, pasireiškiantis daugiausiai vasaros m÷nesiais. Lietuvoje kampilobakterioz÷s pakilimas nustatytas geguž÷s m÷nesį, o susirgimų pikas − rugpjūčio m÷nesį (EFSA 2012). Kampilobakterijų aktyvumo padid÷jimas atšilus orui pasteb÷tas ne tik tarp žmonių, bet ir tarp galvijų. Pieninių galvijų išmatose didžiausia kampilobakterijų koncentracija buvo nustatyta pavasarį ir vasarą. (Kwan et al., 2008; Grove-White et al., 2010). Tod÷l atliekant galvijų bandų užsikr÷timo kampilobakterijomis tyrimus buvo nuspręsta išmatų m÷ginius imti geguž÷s − rugpjūčio m÷nesiais, kai tik÷tina didžiausia kampilobakterijų koncentracija galvijų išmatose.

Šio tyrimo rezultatai atskleid÷ didelį (nuo 75% iki 83,3%) kampilobakterijų paplitimą tirtuose pieninių galvijų ūkiuose. Kitose šalyse atliktų panašių tyrimų duomenys parod÷, kad kampilobakterijų paplitimas pieniniuose galvijų ūkiuose gali būti labai skirtingas ir galvijų užsikr÷timas gali svyruoti nuo 0 % iki 100 % (Porto et al., 2007; Gilpin et al., 2008; Pradhan et al., 2009). Mūsų tyrimo metu nustat÷me, kad vidutiniškai tirtuose ūkiuose net 78,5 % galvijų yra kampilobakterijų nešiotojai. Tod÷l galime teigti, kad Lietuvoje kampilobakterijų paplitimas galvijų bandose yra gana didelis.

Taip pat mūsų tyrimas parod÷, kad tirti ūkiai, nepaisant skirtingo galvijų laikymo bei š÷rimo būdo, neturi reikšmingos įtakos kampilobakterijų paplitimui. Tačiau buvo nustatyta reikšminga (p<0,05) amžiaus įtaka didesniam jaunesnio amžiaus galvijų užsikr÷timui kampilobakterijomis. Karvių amžiaus grup÷je buvo nustatytas reikšmingai (p<0,05) mažesnis kampilobakterijų paplitimas. Be to, Nielsen (2002) taip pat nustat÷, jog galvijų amžius turi didelę įtaką kampilobakterijų paplitimui, tai yra, karv÷s būna ženkliai rečiau užsikr÷tusios kampilobakerijomis.

32 Naujagimiai veršeliai apsikrečia kampilobakterijomis būdami vyresni nei 4 dienų amžiaus, o šių bakterijų išskyrimo su išmatomis piką pasiekia 1−2 m÷n. amžiaus. Kampilobakterijų skaičius veršelių išmatose palaipsniui maž÷ja dažniausiai iki 7 m÷n., kartais ir vyresnio amžiaus (Stanley ir Jones 2003). Mūsų tyrimo rezultatai taip pat parod÷, kad galvijų amžius yra svarbus veiksnys kampilobakterijų skaičiui galvijų išmatose. Tuo tarpu tokių veiksnių kaip atskirų ūkių įtaka kampilobakterijų paplitimui nustatyta nebuvo. Veršelių išmatose kampilobakterijų skaičius buvo apie 0,7 log ksv/g didesnis nei telyčių, ir daugiau, nei 1,5 log ksv/g didesnis už karvių. Tyrimo rezultatai beveik sutampa su Nielsen (2002) paskelbtais rezultatais, kuriuose teigiama, kad veršeliai turi daugiau nei 2 log10 vienetų didesnę

kampilobakterijų koncentraciją išmatose, nei karv÷s. Mūsų tyrimo metu telyčių išmatose buvo apie 0,8 log vienetų didesn÷ kampilobakterijų koncentracija, nei karvių. Kitų autorių straipsniuose taip pat nurodoma, kad didesni skaičiai kampilobakterijų nustatomi telyčių išmatose nei karvių (Stanley et al., 1998; Inglis et al., 2004; Kwan et al., 2008; Ellis-Iversen et al., 2009).

Tyrimo metu nustatytas aukštas kampilobakterijų paplitimas pieniniuose galvijų ūkiuose, rodo, kad galvijai yra svarbūs Campylobacter spp. rezervuarai. Tod÷l galime teigti, kad Lietuvos pieniniai galvijų ūkiai gali būti žmonių užsikr÷timo kampilobakteriozę šaltiniai, ypač nesilaikant asmens higienos reikalavimų po kontakto su šiais gyvūnais arba nesilaikant keliamų reikalavimų pieno bei jautienos gamybai.

Nežiūrinti didelio pieninių galvijų bandų užsikr÷timo kampilobakterijomis, atv÷sinta smulkinta jautiena ir nepasterizuotas pienas daug rečiau užkr÷sti šiomis bakterijomis. Tyrimai atskleid÷, kad tik nedidel÷ dalis parduodamo nepasterizuoto pieno (4,1%) yra užkr÷sta kampilobakterijomis. Nepasterizuoto pieno tyrimai buvo atlikti ir kitose šalyse, ir gauti panašūs rezultatai: Pensilvanijoje 2,2 % (Jayarao et al., 2006), Airijoje 1,6 % (Whyte et al., 2004), Pakistane 10,2 % (Hussain et al., 2007), kiek daugiau užkr÷stų m÷ginių nustatyta Japonijoje 27,3 % (Yang et al., 2003). Mūsų tyrimo metu išskirtos kampilobakterijos nepriklaus÷ nei C. jejuni, nei C. coli rūšims. Tačiau, Yaman ir Elmali (2004), atliktuose nepasterizuoto pieno tyrimuose nustat÷ 5,0 % užkr÷stus m÷ginius Campylobacter spp. atžvilgiu ir visos rūšys buvo identifikuotos kaip C. jejuni. Tuo tarpu Hussain ir kt. (2007), atliktuose tyrimuose nustat÷ 10,2 % užkr÷stų nepasterizuoto pieno m÷ginių, iš jų 92,4 % buvo rastos C. jejuni ir 7,6 % C. coli rūšies bakterijos.

Jeigu pieninių galvijų žarnyne yra kampilobakterijų, melžimo metu šiomis bakterijomis gali būti užkrečiamas ir pienas. Tinkama higiena melžimo metu gali sumažinti užsikr÷timo lygį, tačiau tai n÷ra visiškai veiksminga kontrol÷s priemon÷. Vienintelis būdas užtikrinti, kad žmon÷s būtų apsaugoti nuo užsikr÷timo kampilobakterijomis per pieną, yra pieno pasterizacija (Humphrey et al., 2007). Tačiau Newkirk ir kt. (2011) nustat÷, kad neretai net ir pasterizuotas pienas gali sukelti kampilobakterioz÷s protrūkius.

33 Mūsų tyrimo metu atv÷sintos smulkintos jautienos m÷giniuose Campylobacter spp. bakterijų nebuvo rasta. Jautienos m÷ginių tyrimai 2010 m. buvo atlikti ir kitose ES šalyse, ir gauti panašūs rezultatai: Vokietijoje 1,9 %, Nyderlanduose 0,3 %, tuo tarpu Ispanijoje, Liuksemburge ir Vengrijoje nebuvo aptikos termofilin÷s kampilobakterijos (EFSA, 2012). Tačiau tyrimų rezultatai ne visada gali būti palyginami d÷l naudojamų skirtingų m÷ginių ÷mimo, išskyrimo bei identifikavimo metodų. Remiantis tyrimo rezultatais galima teigti, kad Lietuvos prekybos centruose pardavin÷jama atv÷sinta smulkinta jautiena n÷ra svarbus Campylobacter spp. šaltinis žmonių kampilobakterioz÷s epidemiologijoje.

34

IŠVADOS

1. Tyrimo metu nustatytas didelis kampilobakterijų paplitimas pieniniuose galvijų ūkiuose (78,5%).

2. Pieniniuose galvijų ūkiuose nustatyta reikšminga (p<0,05) amžiaus įtaka kampilobakterijų paplitimui, tuo tarpu pačio ūkio įtakos nenustatyta (p>0,05).

3. Karvių amžiaus grup÷je buvo nustatytas reikšmingai (p<0,05) mažesnis kampilobakterijų paplitimas (61,1%), nei telyčių (86,7%) ar veršelių (86,4) grup÷se.

4. Veršelių išmatose buvo apie 0,7 log10 ksv/g didesnis kampilobakterijų kiekis nei telyčių

m÷giniuose ir daugiau, nei 1,5 log10 ksv/g didesnis, nei karvių m÷giniuose.

5. Tyrimais nustatyta, kad C. jejuni yra dominuojanti termofilin÷ kampilobakterijų rūšis įvairaus amžiaus galvijų grup÷se (66,7%), tuo tarpu C. coli yra daug rečiau paplitusi (24,4%). Tik nedidel÷ dalis m÷ginių (8,9%) užkr÷sti kitomis termofilin÷mis kampilobakterijų rūšimis, kurios n÷ra labai svarbios žmonių kampilobakterioz÷s epidemilogijoje.

6. Lietuvos mažmenin÷je prekyboje esantis nepasterizuotas pienas yra retai (4,1%) užkr÷stas termofilin÷mis kampilobakterijomis, bet gali būti svarbus žmonių užsikr÷timo šaltinis, ypač nesilaikant reikalavimų keliamų maisto produktų laikymui bei tvarkymui.

7. Lietuvos prekybos centruose pardavin÷jama atv÷sinta smulkinta jautiena n÷ra užkr÷sta

35

REKOMENDACIJOS

1. Lankantis galvijų auginimo ūkiuose būtina laikytis asmens higienos reikalavimų siekiant išvengti užsikr÷timo kampiloabkterioze arba išplatinti šį patogeną.

2. Melžimo metu būtina laikytis higienos reikalavimų, kadangi tolimesniuose etapuose žalias pienas gali tapti kampimlobaterioz÷s protrūkio priežastimi.

36

LITERATŪROS

SĄRAŠAS

1. Acik, M.N. and Cetinkaya, B. The heterogeneity of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli strains isolated from healthy cattle. Lett Appl Microbiol. 2005. 41 P. 397-403.

2. Allen, V.M., S.A. Bull, J.E. Corry, G. Domingue, F. Jorgensen, J.A. Frost, R. Whyte, A. Gonzalez, N. Elviss, T.J. Humphrey. Campylobacter spp. contamination of chicken carcasses during processing in relation to flock colonisation. International Journal of Food Microbiology. 2007. 113 P. 54–61.

3. Bae, W., Kaya, K.N., Hancock, D.D., Call, D.R., Park, Y.H. and Besser, T.E. Prevalence and antimicrobial resistance of thermophilic Campylobacter spp. from cattle farms in Washington State. Appl Environ Microbiol. 2005. 71 P. 169-174.

4. Baker, M.G., Sneyd, and Wilson, N.A. Is the major increase in notified campylobacteriosis in New Zealand real? Epidemiol. Infect. 2007. 135 P.163-170.

5. Berry, E.D., Wells, J.E., Archibeque, S.L., Ferrell, C.L., Freetly, H.C. and Miller, D.N. Influence of genotype and diet on steer performance, manure odor, and carriage of pathogenic and other fecal bacteria. II. Pathogenic and other fecal bacteria. J Anim Sci. 2006. 84 P. 2523-2532.

6. Besser, T.E., Lejeune, J.T., Rice, D.H., Berg, J., Stilborn, R.P., Kaya, K., Bae, W. and Hancock, D.D. Increasing prevalence of Campylobacter jejuni in feedlot cattle through the feeding period. Appl Environ Microbiol. 2005. 71 P. 5752-5758.

7. Brown, P.E., Christensen, O.F., Clough, H.E., Diggle, P.J., Hart, C.A., Hazel, S., Kemp, R., Leatherbarrow, A.J., Moore, A., Sutherst, J., Turner, J., Williams, N.J., Wright, E.J. and French, N.P. Frequency and spatial distribution of environmental Campylobacter spp. Appl Environ Microbiol. 2004. 70 P. 6501-6511.

8. Chatre, P., Haenni, M., Meunier, D., Botrel, M.A., Calavas, D. and Madec, J.Y. Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from cattle between 2002 and 2006 in France. J Food Prot. 2010. 73 P. 825-831.

9. Clark, C.G., Price, L., Ahmed, R., Woodward, D.L., Melito, P.L., Rodgers, F.G., Jamieson, F., Ciebin, B., Li, A. and Ellis, A. Characterization of waterborne outbreak-associated Campylobacter jejuni, Walkerton, Ontario. Emerg Infect Dis. 2003. 9 P. 1232-1241.

10.Damborg, P., Olsen, K.E., Møller Nielsen, E. and Guardabassi, L. Occurrence of Campylobacter jejuni in pets living with human patients infected with C. jejuni. J Clin Microbiol. 2004. 42 P. 1363–1364.

37 11.Debruyne, L., Gevers, D. and Vandamme, P. Taxonomy of the family Campylobacteraceae. In Campylobacter ed. Nachamkin, I., Szymanski, C.M. and Blaser, M. Washington D.C.: ASM Press. 2008. 13 P. 3-25.

12.Devane, M.L., Nicol, C., Ball, A., Klena, J.D., Scholes, P., Hudson, J.A., Baker, M.G., Gilpin, B.J., Garrett, N. and Savill, M.G. The occurrence of Campylobacter subtypes in environmental reservoirs and potential transmission routes. J Appl Microbiol. 2005. 98 P. 980-990.

13.Doorduyn, Y., VAN DEN Brandhof, W.E., VAN Duynhoven, Y.T., Breukink, B.J., Wagenaar, J.A. and VAN Pelt, W. Risk factors for indigenous Campylobacter jejuni and Campylobacter coli infections in The Netherlands: a case-control study. Epidemiol Infect. 2010. 7 P. 1-14.

14. EFSA. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in.2010 The EFSA Journal. 2012. 8 P. 1309.

15. Ellis-Iversen, J., Pritchard, G.C., Wooldridge, M. and Nielen, M. Risk factors for Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in young cattle on English and Welsh farms. Prev Vet Med. 2009. 88 P. 42-48.

16. Englen, M.D., Hill, A.E., Dargatz, D.A., Ladely, S.R. and Fedorka - Cray, P.J. Prevalence and antimicrobial resistance of Campylobacter in US dairy cattle. J Appl Microbiol. 2007. 102 P. 1570-1577.

17. Enokimoto, M., Kubo, M., Bozono, Y., Mieno, Y. and Misawa, N. Enumeration and identification of Campylobacter species in the liver and bile of slaughtered cattle. Int J Food Microbiol. 2007. 118 P. 259-263.

18. Ethelberg, S., Simonsen, J., Gerner-Smidt, P., Olsen, K.E. and Molbak, K. Spatial. Distribution and registry-based case-control analysis of Campylobacter infections in Denmark, 1991-2001. Am J Epidemiol. 2005. 162 P. 1008-1015.

19. Friedman, C.R., Hoekstra, R.M., Samuel, M., Marcus, R., Bender, J., Shiferaw, B., Reddy, S., Ahuja, S.D., Helfrick, D.L., Hardnett, F., Carter, M., Anderson, B., Tauxe, R.V. Emerging Infections Program FoodNet Working Group. Risk factors for sporadic Campylobacter infection in the United States: a case-control study in FoodNet sites. Clinical Infectious Diseases. 2004. 38 P. 285–296.

20.Garenaux, A., Guillou, S., Ermel, G., Wren, B., Federighi, M. and Ritz, M. Role of the Cj1371 periplasmic protein and the Cj0355c two-component regulator in the Campylobacter jejuni NCTC 11168 response to oxidative stress caused by paraquat. Res Microbiol. 2008. 159 P. 718-726.

21.Garrett, N., Devane, M.L., Hudson, J.A., Nicol, C., Ball, A., Klena, J.D., Scholes, P., Baker, M.G., Gilpin, B.J. and Savill, M.G. Statistical comparison of Campylobacter jejuni subtypes from human cases and environmental sources. J Appl Microbiol. 2007. 103 P. 2113-2121.