LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
VETERINARIJOS FAKULTETAS
MAISTO SAUGOS IR KOKYBöS KATEDRA
RŪTA ZAGRABSKAITö
KALAKUTŲ GALŪNIŲ PAŽEIDIMŲ ĮTAKA RAUMENŲ
MITOCHONDRIJŲ FUNKCIJAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Prof. Gražina Januškevičien÷
PATVIRTINMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas: „Kalakutų galūnių pažeidimų įtaka raumenų mitochondrijų funkcijai“
1. Yra atliktas mano pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
Rūta Zagrabskait÷
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Rūta Zagrabskait÷
(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO
Gražina Januškevičien÷
(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros ved÷jo/jos vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į EDT IS
(gynimo komisijos sekretor÷s (-riaus) parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavard÷) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
Turinys
SANTRUMPOS IR PAAIŠKINIMAI... 5
ĮVADAS ... 7
Temos aktualumas ... 7
Darbo tikslas... 8
Darbo uždaviniai ... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA... 9
1.1. Laikymo ir auginimo sąlygų įtaka kalakutų sveikatingumui ir m÷sos kokybei ... 9
1.2. Kalakutų jud÷jimo bei skeleto sistemos susirgimai ... 10
1.2.1. Pododermatitas...10
1.2.2. Peroz÷ (varus – valgus)...12
1.2.3. Artritas – tendovaginitas...13
1.3. Ligų ir kitų faktorių įtaka raumenų morfologijai ir m÷sos kokybei... 13
1.4. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos... 16
1.5. Mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s struktūra ir funkcijos ... 17
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 19
2.1. Tyrimo atlikimo vieta ir kalakutų atranka tyrimams ... 20
2.2. Tyrimo atlikimo schema ... 20
2.3. Tyrimo metodai... 21
2.4. Kalakutų priešskerdiminis, poskerdiminis tikrinimas ... 21
2.5. Kalakutų atranka ir m÷ginių pa÷mimas ... 21
2.6. Padidinto laidumo (permeabilizuotų) raumeninių skaidulų paruošimas ... 22
2.7. Mitochondrijų kv÷pavimo greičio registravimas permeabilizuotose skaidulose... 22
2.8. Statistinis duomenų įvertinimas... 23
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 23
4
3.2. Mitochondrijų kv÷pavimo greičio registravimo schema permeabilizuotose kalakutų
raumenin÷se skaidulose ... 24
3.3. Mitochondrijų kv÷pavimo greičių palyginimas kalakutų šlaunelių ir krūtin÷lių permeabilizuotose raumenin÷se skaidulose ... 26
3.4. Mitochondrijų kv÷pavimo įvertinimas sveikų ir kojų patologijas tur÷jusių kalakutų krūtin÷l÷s raumenų permeabilizuotose skaidulose ... 27
3.5. Mitochondrijų kv÷pavimo įvertinimas sveikų ir kojų patologijas tur÷jusių kalakutų šlaunel÷s raumenų permeabilizuotose skaidulose ... 28
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
IŠVADOS... 37
PADöKOS ... 38
SUMMARY ... 39
LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40
5
SANTRUMPOS IR PAAIŠKINIMAI
ADP Adenozindifosfato rūgštis Antemortem Prieš skerdimą
ATP Adenozintrifosfato rūgštis (adenozin 5' trifosfatas) ATR Atraktilozidas
0
C Celsijaus laipsniai
CCCP Karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas Cyt c Citochromas c
COX Citochromo c oksidaz÷ D3 Cholekalciferolis
DFD Sausa, kieta, tamsi (angl. dry, firm, dark) DNR Dezoksiribonukleinin÷ rūgštis
E. coli Escherichia coli
(EB) Europos Parlamento ir Tarybos reglamentas (EEB) Europos Ekonomin÷ Bendrija
ES Europos Sąjunga et al., Ir kiti (lot., et alii)
FAD Flavino adenino dinukleotidas
FADH2 Flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma
FMN Flavino mononukleotidas
FMNH2 Flavino mononukleotidas, redukuota forma
g Gramas
Glu+mal Glutamtas + malatas
gr. Grup÷
in situ Esanti savo buvimo vietoje, pirmykšt÷je vietoje
k Kartas
kg Kilogramas
Ko-Q Kofermentas Q (ubichinonas) lux Liuksmetras
6
M. Raumuo (lot. Musculus) m2 Kvadratinis metras
MES 2-(N-morfolino) etanosulfonato rūgštis
mg Miligramas
min. Minut÷ ml Mililitras mm Milimetras mM Milimolis
n Imties dydis (ištirtų m÷ginių skaičius)
NADH Nikotino amido adenino dinukleotidas, redukuota forma
nm Nanometras
nmol Nanomolis
Nr. Numeris
p Statistinis patikimumas
pH Vandenilio jonų koncentracijos rodiklis postmortem Po skerdimo
ppm Milijonin÷ tūrio dalis (angl. parts per million) proc. Procentas
PSE Blyški, vandeninga, minkšta (angl. pale, soft, exudative) pvz. Pavyzdžiui
µg Mikrogramas
µM Mikromolis t.y. Tai yra
VMVT Valstybin÷ maisto ir veterinarijos tarnyba vnt. Vienetas
VADP Mitochondrijų kv÷pavimo greitis trečioje metabolin÷je būsenoje
V2 Mitochondrijų kv÷pavimo greitis antroje metabolin÷je būsenoje
7
ĮVADAS
Temos aktualumas
Pastaruoju metu Lietuvoje did÷ja kalakutų auginimas ir jų m÷sos produkcijos vartojimas. Pa-gal žem÷s ūkio ir maisto produktų rinkos informacin÷s sistemos bei statistikos departamento duo-menis kalakutienos ir jos gaminių pardavimas Lietuvos rinkoje 2011 metais sausio – balandžio m÷n. sudar÷ 1290,79 tonas ir lyginant su tuo pačiu laikotarpiu 2010 metais, padid÷jo 8,5 proc. Ma-noma šios m÷sos suvartojimas tur÷tų did÷ti. Tokia tendencija siejama su kintančiais mitybos įpro-čiais, sveiko maitinimosi rekomendacijomis. Kalakutiena viena iš sveikiausių dietinių m÷sos rūšių. Palyginus su kitomis m÷sos rūšimis, kalakutienoje rasta daugiausia sausųjų ir mineralinių medžia-gų, baltymų (Jukna et al., 2007).
Pastaruoju metu dauguma paukštienos, kartu ir kalakutienos, pagaminama pramonin÷s gamy-bos būdu. Nuolat kuriamos ir intensyvinamos gamygamy-bos technologijos. Taikant jas, intensyviai did÷-ja kalakutų svoris, kinta audinių morfologin÷ sud÷tis, did÷did÷-ja krūtin÷s raumenų išeiga. Stambiose pramonin÷se kalakutų fermose neįmanoma pagaminti natūralios ekologiškos kalakutienos (Juknevi-čius, Stankevičiūt÷, 2007). Paskutinių dešimtmečių kalakutų genetin÷ selekcija dirbtinai iškreip÷ šiuolaikinių išvestų m÷sinių kalakutų veislių fiziologiją, lyginant su laukiniais jų prot÷viais (Hafez, Hauck, 2005). Dirbtinai iškreipta fiziologija pasireiškia pakitusiu paukščių elgesiu, padid÷jusia kū-no mase, ypač krūtin÷s raumenų persivystymu, skeleto raumenų hipertrofija, padid÷jusiu jautrumu stresui, pakitusiu metabolizmu (Hafez, Hauck, 2005; Werner et al., 2005). Dauguma m÷sinių viš-čiukų, bei kalakutų turi jud÷jimo aparato sistemos sutrikimų. Šie sutrikimai gali būti susiję su paki-tusia didele kūno mase, struktūra, taip pat su paspart÷jusiu tam tikrų kūno dalių raumenų mas÷s au-gimu, ypač krūtin÷s ir šlaunų srityje, kuris n÷ra proporcingas paukščių skeleto išsivystymui (Crespo et al., 2000). Dažnai pasitaikantis modernių m÷sinių veislių paukščių gaištamumas yra susijęs su jud÷jimo aparato problemomis (Havenstein et al., 2003b). Šiuo metu Lietuvoje daugiausiai pramo-niniu būdu auginami didieji baltieji sunkaus m÷sinio tipo kalakutai. Viena iš populiarių ekstensyviai auginamų m÷sinių kalakutų veislių yra BUT Big – 6 linijos veisl÷, kuriai dažnai priskiriamos pro-blemos d÷l m÷sos kokyb÷s (Opalka et al., 2004).
Literatūroje duomenų apie įvairių susirgimų poveikį m÷sos kokybei n÷ra daug, nes m÷sos ko-kybiniai ir kieko-kybiniai tyrimų rodikliai dažniau atliekami naudojant sveiką arba sąlyginai sveiką žaliavą (Šalaševičien÷ ir kt., 2003).
Esant tam tikroms sunkiasvorių kalakutų kojų patologijoms, kaip pododermatitas, artritas, tendovaginitas, varus – valgus, paukščiai mažai juda, raumenys gali po truputį atrofuotis. Literatū-roje mažai duomenų apie m÷sinių paukščių kojų patologijų įtaką raumenų morfologijai ir m÷sos
8
kokybei. Dažniau pateikiama informacija apie šių ligų galimas priežastis ir rizikos veiksnius, pato-genezę, patologijų išsivystymo laipsnius. Lietuvoje pirmą kartą atliktas tyrimas vertinant m÷sinių BUT Big – 6 veisl÷s kalakutų (patinų) kojų patologijų galimą įtaką krūtin÷lių ir šlaunelių raumeni-nių skaidulų mitochondrijų kv÷pavimo aktyvumui įvairiose metabolin÷se būsenose.
Iki šiol gana mažas d÷mesys buvo skiriamas mitochondrijoms, kurios užima svarbią vietą energijos metabolizme. Pastarajame dešimtmetyje mitochondrijų esminis vaidmuo sveikame ir ser-gančiame organizme vis labiau pripažįstamas (Wicke et al., 2000; Gunter et al., 2004; Opalka et al., 2004; Werner et al., 2005). Mitochondrijos tiekia ne tik daugiausia ATP reikalingo ląstel÷s darbui kaip pvz. raumens susitraukimui ar Ca+2 jonų impulsacijai, bet ir prisideda keičiant Ca+2 jonų kon-centraciją citozolyje, taip pat gali įtakoti apoptoz÷s, nekroz÷s atsiradimą. Keletas mitochondrijų dis-funkcijų gali sukelti energijos sumaž÷jimą paveiktame raumenyje (Owens et al., 2000c; Gunter et al., 2004). Iš esm÷s trūksta duomenų apie mitochondrijų funkcijas produkcijos gyvūnų skeleto rau-menyse (Werner et al., 2005). Mitochondrijų funkcijų tyrimas permeabilizuotose t.y. apdorotose saponinu ir kolagenaze raumenin÷se skaidulose gali būti demonstruojamas respiratorine analize (Saks et al., 1998). Naudojant permeabilizuotas raumenų skaidulas, visa mitochondrijų populiacijos funkcija gali būti tiriama in situ (savo buvimo vietoje) be atskirų mitochondrijų izoliavimo iš audi-nio. Ši technika suteikia galimybę tiksliai kontroliuoti aplink mitochondrijas esančią terpę neiškrei-piant šių organelių natūralios morfologijos (Saks et al., 1998; Kuznetsov et al., 2003).
Darbo tikslas
Nustatyti kalakutų patinų kojų patologijų dažnumą ir įtaką krūtin÷lių ir šlaunelių raumenų mi-tochondrijų kv÷pavimo greičiui.
Darbo uždaviniai
1. Priešskerdiminio ir poskerdiminio tikrinimo metu nustatyti kalakutų galūnių pakitimus ir jų dažnumą.
2. Nustatyti mitochondrijų kv÷pavimo greitį sveikų ir galūnių pakitimus tur÷jusių kalakutų krūtin÷l÷s raumenyse.
3. Nustatyti mitochondrijų kv÷pavimo greitį sveikų ir galūnių pakitimus tur÷jusių kalakutų šlaunel÷s raumenyse.
4. Palyginti mitochondrijų kv÷pavimo greitį sveikų ir galūnių pakitimus tur÷jusių kalakutų krūtin÷l÷s ir šlaunel÷s raumenyse.
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Laikymo ir auginimo sąlygų įtaka kalakutų sveikatingumui ir m÷sos kokybei
Kalakutai itin jautrūs aplinkos, š÷rimo sąlygoms. Gyvūnų sveikatingumui, m÷sos kokybei įta-kos turi daugelis veiksnių: genetika, amžius, laikymas ir priežiūra, pašaras, transportavimas, prieš-skerdiminiai bei poprieš-skerdiminiai veiksniai (Hambrecht, 2000). Iki 4 savaičių amžiaus kalakučiukai yra jautriausi laikymo sąlygoms: dr÷gmei, skersv÷jams, temperatūros svyravimams, apšvietimui (Gencoglan et al., 2009).
Selekcija ne tik įgalina gyvūnus geriausiai prisitaikyti prie žmogaus laikymo sąlygų, bet taip pat gali būti dirbtinai paveiktos natūralios organizmo savyb÷s pagal žmogaus poreikius pvz.: greitas augimas, aukšta reprodukcija, pakitusios elgesio savyb÷s (Hafez, Hauck, 2005). Išsiskiriantis šiuo-laikin÷s viščiukų broilerių ir kalakutų auginimo technologijos rezultatas yra ženkliai padid÷jusi kū-no mas÷ ir ypač krūtin÷s raumenų mas÷ (Havenstein et al., 2003b, Havenstein et al., 2003a). Moks-lininkas Havenstein et al., (2004) palyginęs 2003 metais ekstensyviai augintų kalakutų duomenis su jų auginimu 1966 metų duomenimis, kai buvo naudotos atitinkamai tų metų lesinimo technologijos, nurodo jog kalakutai reikiamą skerdimui masę pasiekia perpus greičiau. Veisiant intensyvaus pro-duktyvumo paukščius palaipsniui išstumiamos genetiniu požiūriu vertingos jų veisl÷s (Juknevičius, Stankevičiūt÷, 2007). Pastaraisiais dešimtmečiais pasaulyje paplitę sunkieji m÷siniai baltieji anglų BIG – 6 ir BUT – 9 linijų kalakutai. Jie greitai užauga, turi didelius priesvorius, o BIG – 6 veislei dažnai priskiriamos problemos d÷l m÷sos kokyb÷s (Opalka et al., 2004). Mokslininkai Juknevičius, Stankevičiūt÷, (2007) teigia, jog pramonin÷se kalakutų auginimo fermose neįmanoma pagaminti natūralios ekologiškos kalakutienos, kurios poreikis pastaraisiai metais did÷ja. Mokslininkų nuo-mone. pramoniniu būdu užaugintų kalakutų raumenų sistema dažnai yra pervystyta, jų m÷sa vande-ningesn÷. Intensyviai lesinant kombinuotaisiais lesalais, kalakutienoje daugiau susikaupia antimais-tinių medžiagų. Tuo tarpu ne pramoniniuose ūkiuose auginami kalakutai, turintys jud÷jimo laisvę ir turi gerai ištreniruotus krūtin÷s raumenis ir šlaunis, jų m÷sa yra tvirta, tačiau švelni, o kepant neten-ka tik mažos dalies sulčių. (Juknevičius, Stankevičiūt÷, 2007).
Optimizavus kalakutų laikymą bei priežiūrą, įmanoma išvengti daugelio jų ligų. Svarbu užtik-rinti tinkamas zoohigienines sąlygas visais auginimo periodais. Paukščiai turi tur÷ti galimybę laisvai jud÷ti, išskleisti sparnus nekliudydami vienas kito. Per didelis jų tankumas skatina stresą, kitas ligas (Baltuonien÷, Baltuonis, 2003). Atsižvelgiant į ES Reglamento (EEB) 1538/91 – IV skyriaus reika-lavimus, maksimalus leistinas tankis yra 6,25 kalakutų/m2 ploto (iki 7 savaičių amžiaus), be to turi būti ne mažiau kaip 6 m2 gyvūnui laikant juos laisvai. Taip pat laikant kalakutus laisvai, minimalus skerdimo amžius turi būti ne mažesnis kaip 140 dienų. Būtina užtikrinti nors minimalų 8 valandų
10
apšvietimo ilgumą ir intensyvumą. Plunksnų pešiojimo ir kanibalizmo profilaktikai tinka naudoti 6 – 10 lux apšvietimą arba spalvotą šviesą. Šviesiose patalpose kalakutai yra aktyvesni, daugiau lesa ir geria, intensyv÷ja ir ger÷ja jų oksidaciniai metabolizmo procesai, o tamsoje – priešingai, čiai yra pasyvūs, lesa mažiau, daugiau tupi, mažesnis jų fizinis aktyvumas, be to per didelis paukš-čių tankumas skatina stresą, kanibalizmą (Shepherd, Fairchild, 2010). Lesalai – vienas esminių fakto-rių, įtakojančių gyvūnų sveikatą ir gerovę, taip pat ir m÷sos produktų saugą ir kokybę, bei aplinkos apsaugą. Ypač jauniems paukščiukams, svarbi lesalų sud÷tis. Juose tur÷tų būti apie 22 proc. visa-verčių baltymų su dideliu metionino kiekiu. Metioninas gerina lesalo pasisavinimą, d÷l to did÷ja būsimos skerdenos išeiga (Lemme et al., 2002). Kalakutid÷se turi būti užtikrintas pašarų ir vandens prieinamumas, reikalinga periodiškai keisti pasenusį lesalą ir vandenį, nerekomenduojamas labai smulkus pašaras, nes jo smulkios dalel÷s sukelia respiratorinius susirgimus, o taip pat paukščiai les-dami ne tokį smulkų pašarą pasisotina l÷čiau (Kalač, 2005; Jones et al., 2005). Nesilaikant reko-mendacijų did÷ja rizikapasireikšti įvairioms ligoms.
1.2. Kalakutų jud÷jimo bei skeleto sistemos susirgimai
Hafez, Hauck (2005) teigia, jog kojų patologijų priežastys gali būti infekcin÷s ir neinfekcin÷s kilm÷s. Be to genetin÷s priežastys, vadyba, auginimo aplinka taip pat yra svarbūs rizikos faktoriai, kurie, m÷sai auginamų paukščių pulkuose, gali lemti jud÷jimo aparato sutrikimų pasireiškimą.
1.2.1. Pododermatitas
Kalakutų pododermatitas – tai p÷dų pagalv÷lių uždegimai arba p÷dų opos. Ši galūnių patolo-gija dažniausia atsiranda ventraliniame kojų pagalv÷lių viduryje, o stipraus pažeidimo atveju gali apimti visą p÷dą (Breuer et al., 2005). Pažeidimo laipsnis varijuoja nuo hiperkeratoz÷s iki stiprių erozijų ar opų (Hafez, Hauck, 2005). Pradžioje atsiranda proliferacin÷ hiperkeratoz÷ su paviršinio epitelio pažeidimais, v÷liau patologiniam procesui progresuojant, susidaro kelių milimetrų nekroz÷. Tokie pakitimai būna padengti hemoraginiais šašais, ant p÷dų matomi tamsūs ploteliai (Mayne et al., 2006). Labiausiai pažeidžiama p÷dų plantarin÷ sritis ir metatarsalinis minkštimas. Svariais, šiuos pakitimus predisponuojančiai faktoriais gali būti genetin÷ linija, spartus ekstensyvus paukščių augimas, auginamo pulko tankumas, pakratų kokyb÷. Mokslininkai Martland, (1984) ir Greene et al., (1985) masinį kontaktinių dermatitų pasireiškimą sieja su prasta kraiko kokybe, Mcllroy et al., (2005). Šią problemą sieja su dideliu pulko tankumu ir paukščių vyresniuamžiumi. Nors pododer-matitų požymiai paprastai pasireiškia kalakutams nuo 8 iki 12 savaičių amžiaus, tačiau Mayne ir kt.
11
mokslininkų tyrimais pasteb÷ta, kad plantariniai p÷dų pažeidimai gali prasid÷ti nuo labai ankstyvo kalakutų amžiaus, t.y. pradeda vystytis jau 6 savaičių amžiaus. Iš pradžių p÷dų pažeidimai plika akimi būna beveik nematomi ir pasireiškia ant pagalv÷lių epidermio kaip neryškios hemoragin÷s d÷mel÷s (Mayne et al., 2006). V÷liau stipriai pažeistos p÷dos būna ištinusios, užpildytos pūliais su nekrozuojančia mase. Uždegimas gali plisti ir pereiti į sausgyslių makštis, išsivystyti artritas – ten-dovaginitas, antkaulio uždegimas (Schmidt et al., 2003). Paukščiai, esant stipriam kojų p÷dų pažei-dimui stengiasi daugiau gul÷ti, gali pasireikšti jud÷jimo sutrikimai (Pagazaurtundua, Warris, 2006). Mokslininkų Julian ir Gazdzinski (2000) teigimu, dirginimas išmatomis ar pakratais sukelia p÷dų epidermio sustor÷jimą, t.y. akantozę ir hiperkeratozę. Jei išmatos nuolat kontaktuoja su p÷dų pagal-v÷l÷mis, jas šiek tiek pažeidžiant, tai lemia išemin÷s nekroz÷s ir opų atsiradimą, o paukščiai patiria skausmą d÷l ko kenčia. Manoma jog per dr÷gni, ypač šiaudų pakratai, kai kraiko dr÷gnumas viršija 35 proc. minkština kojų p÷dų epidermį (Kamyab, 2001; Mayne et al., 2005). Be to per didelis iš-matų pH, siejamas su lesinimu pašaru turinčiu sojos, taip pat įtakoja epidermio minkšt÷jimą. Su-minkšt÷jusi, pažeista oda, apsauginio odos sluoksnio nebuvimas, sudaro galimybę prasiskverbti įvairiems mikroorganizmams, tokiems kaip: Streptococcus, Staphylococcus, Proteus spp., E. coli (Fedhaus, Sieverding, 2001b). Mokslininko Schmidt (2003) teigimu, pro nepažeistą odą Staphylo-coccus aureus neprasiskverbia. Nepakankamai v÷dinamose m÷sinių paukščių fermose padid÷ja san-tykin÷ oro tarša, ypač amoniaku, dulk÷mis, kartu padid÷ja ir pakratų dr÷gnis (Korfmann, 2003). Harms et al., (1977) ir Harms, Simpson, (1975) tyrimai parod÷, jog papildų su biotinu naudojimas sumažina pododermatitų riziką tik paukščių jauniklių pulkuose laikytuose ant sausų pakratų, ir netu-r÷jo įtakos esant dr÷gniems pakratams.
Mokslininkas Hafez et al. (2004) atliko tyrimas su 5 komercinių linijų veisl÷s m÷siniai kala-kutais (Kelly Bronze, Nicholas 300, BUT 9, Nicholas 700, BUT-Big 6) išsiaiškinant kokų patologi-jų dažnumą, atsižvelgiant į komercines šių paukščių auginimo ir lesinimo sąlygas ir skirtingą kūno mas÷s vystymąsi. Gauti rezultatai parod÷, jog kalakutų veislių linijos tur÷jo statistiškai reikšmingus ryšius pasireiškiant įvairaus laipsnio (0 – 3) pododermatitams. Nustatyta patikima koreliacija tarp kūno mas÷s ir įvairaus laipsnių pododermatitų išsivystymo. Trečio laipsnio pododermatitai statistiš-kai reikšmingai dažniau pasireišk÷ m÷siniams kalakutų didžiųjų baltųjų (Big 6) (37%) linijos kala-kutams. Kiti tyrimų rezultatai parod÷, kad lesalų energetin÷s vert÷s pak÷limas ir jų praturtinimas biotinu įtakojo pododermatitų pasireiškimo sumaž÷jimą (Hafez et al., 2004). Sergamumas podo-dermatitais m÷sinių kalakutų pulke gali siekti iki 100 proc. (Hafez et al., 2005; Shepherd, Fairchild, 2010). Paukščiai, esant stipriai išreikštam pododermatitui, gali šlubuoti, nekoordinuotai vaikščioti, kas neigiamai veikia jų fizinį aktyvumą, kalakutai stengiasi daugiau gul÷ti, darosi pasyvūs, d÷l jun-tamo skausmo ir diskomforto sumaž÷ja lesalų suvartojimas ir pasisavinimas, o tai sumažina mas÷s priaugimą (Bilgili et al., 2006). Mokslininkų nuomone, pododermatitų atsiradimą predisponuoja itin
12
maistingi, baltymingi lesalai, ypač sojos, kas lemia didesnį azoto išsiskyrimą, o šio pasekoje susida-ro dideli kiekiai amoniako (Bilgili et al., 2006; Nagaraj et al., 2006). Kai kurių mokslininkų many-mu pododermatitų plitimas ir jų sunkumas priklauso nuo biotino ir cinko trūkumo lesaluose, taip pat pantoteno rūgšties, metionino ir riebalų rūgščių trūkumas (Clark et al., 2002; Buda et al., 2002).
1.2.2. Peroz÷ (varus – valgus)
Peroz÷ dar kitaip vadinama varus – valgus deformacija, chondrodistrofija arba kulno liga, apibūdinama kaip paukščių ilgųjų kojų kaulų iškrypimas. Valgus deformacija pasireiškia kaip nu-kreiptas išor÷n tibiometatarsus kaulų išlinkimas. Varus tai medialinis tibiometatarsus kaulų įlinki-mas į vidų (Hunter et al., 2008). Ligos etiologija ir patogenez÷ n÷ra pakankamai išaiškinta. Teigia-ma, jog tam tikrų medžiagų kaip: mangano, biotino, cinko, cholino, vitaminų (ypač D3) stoka
su-trikdo kaulinio audinio augimo plokštelių formavimąsi, o taip pat įtakos turi genetiniai faktoriai (Ju-lian, Gazdzinsky, 2000; Reimann, 2002).
Varus chondrodistrofija dažniau pasireiškia 5 ir 15 dienų amžiaus viščiukams broileriams, o valgus deformacija 2 ir 7 dienų amžiaus broileriams, ši patologija dažnai apima abi kojas, t.y. vys-tosi bilateraliai. Net 60 proc. paukščių, paveiktų stipria valgus deformacija kartu aptinkama ir gast-rocnemius sausgyslių lateralin÷ displazija. Esant stipriai išreikštai perozei, pastebimas paukščių šlu-bavimas bei sumaž÷jęs jų augimo greitis (Leterrier, Nys, 1992).
Mokslininko Julian (2005) nuomone varus – valgus deformacija dažnai prasideda reikštis de-šimtą amžiaus dieną, tačiau gali atsirasti ir anksčiau, paukščiui augant d÷l sutrikusio kaulinių plokš-telių formavimosi. Reikšmingos deformacijos gali nepasireikšti iki 21 auginimo paros.
Manoma varus – valgus pasireiškimus gali sukelti ir pastovus kaulų augimas, per intensyvi, be pertraukų naudojama šviesos programa paukštynuose. Ši patologija viena iš dažniausių raišumo priežasčių, sukelianti iki 60 proc. skeleto ligų (Julian 2005).
Lynch et al., (1992) nuomone varus – valgus labiausiai paplitusios ilgųjų kojų kaulų patolo-gijos broileriams. Abi šios deformacijos gali atsirasti be jokių išoriškai matomų pažeidimų. Peroz÷s deformacijų klinikiniai požymiai panašūs, šie susirgimai priskiriami metaboliniams sutrikimams, siejamiems su maistinių medžiagų pasisavinimo sutrikimu, greitu augimu, itin sparčiu metabolizmu. Tyrimais nustatyta, kad ilgalaikis β-hidroksi-β-metilbutirato vartojimas, kartu su vitaminu B12 pa-gerina kaulų mineralizaciją ir jų tankį, taip pat papa-gerina geometrines ir mechanines skeleto savybes. Tačiau ir esant normaliai kaulų mineralizacijai, spontaniški lūžiai gali rastis per augimo plokšteles tarp blauzdikaulio ir čiurnos kaulų (Julian, 2005).
13
1.2.3. Artritas – tendovaginitas
M÷sinių kalakutų pulke artritai gali būti nustatomi apie 5 proc. kalakutų (Shivaprasad et al., 2002). Aseptinius sąnarių uždegimus gali sukelti per didel÷ kūno mas÷ ir traumos (Julian et al., 2005). Ūmaus artrito atvejais sąnariuose padaug÷ja serozinio – serofibrininio sinovinio skysčio, sąnariai sutinsta, pasidaro skausmingi kojų judesiai ir taip paukščiai pradeda šlubuoti, stengiasi daugiau tup÷ti (Aziz et al., 2003). L÷tinis artritas išsivysto tiek d÷l ilgo nuolatinio sąnarių dirgini-mo, tiek d÷l per didel÷s kūno mas÷s. Jų priežastimi gali būti ir mažo virulentiškumo mikroorga-nizmai, tokie kaip: Chlamydia spp., Mycoplazma spp., o taip pat sąnariuose susiformavusių ataugų dirginimas. (Julian et al., 2005). Sąnarių uždegimai dažnai kartu paveikia ir laterialiai esančias gast-rocnemius sausgysles, šios savo ruožtu kaupia uždegiminį skystį – eksudatą. Infekcinio artrito prie-žastys susijusios su įvairių mikroorganizmų patekimų hematogeniniu keliu ar patekus tiesiogiai į sąnarius per sužeidimus. Artritai gali būti ir infekuoto pododermatito, slenkančio aukštyn, pasekm÷ (Aziz et al., 2003; Schmidt et al., 2003). Esant galūnių pažeidimams procesą dažnai komplikuoja koliforminiai mikroorganizmai ir stafilokokai (Julian, Gazdzinski, 2000; Shivaprasad et al., 2002). Manoma jog įtakos gali tur÷ti ir paukščių patiriamas stresas, kanibalizmas. Thorp (2000) nuomone, kalakutų artrito – tendovaginito galūnių patologijos atsižvelgiant į etiologiją, patogenezę, kliniki-nius ir patologikliniki-nius požymius gal÷tų būti priskiriamos daugiafaktoriniams susirgimams, susijusias su infekciniais ir neinfekciniais veiksniais.
1.2. Ligų ir kitų faktorių įtaka raumenų morfologijai ir m÷sos kokybei
M÷sos kokybę lemia gyvūno rūšis, veisl÷, lytis, amžius, įmitimas, š÷rimo racionas, anatomin÷ skerdenos dalis, priešskerdiminiai ir poskerdiminiai faktoriai, taip pat technologiniai perdirbimo aspektai, laikymas (Blaha, Blaha 2001; Hambrecht, 2000). Kalakutai daugiausiai veisiami ir augi-nami taikant ekstensyvaus pramoninio augimo būdą, deja toks būdas neigiamai veikia kalakutienos m÷sos kokybę (Petracci, Cavani, 2011; Windhorst, 2006;). Paskutiniais dešimtmečiais m÷siniai paukščiai intensyviai atranka ir selekcija nukreipta greito augimo, m÷sos liesumo, didelio raume-ningumo kryptimi. Gaunamas didelis m÷sos produkcijos kiekis per santykinai trumpą laiką. Moks-lininkų nuomone tokia selekcija ir intensyvus gyvūnų auginimas siejamas su pablog÷jusia m÷sos kokybe, gyvūnų jautrumu stresui (Owens et al., 2000), o taip pat pastebimas m÷sos morfologiniais pakitimais, kaip raumeninių skaidulų hipertrofija, didesnis santykiniu glikolitiniu – oksidaciniu ak-tyvumu raumenin÷se skaidulose (Werner et al., 2005).
14
Šalaševičien÷s su bendraautoriais (2003) teigimu, nustatomi m÷sos kokybinių rodiklių poky-čiai dažniausiai d÷l medžiagų apykaitos sutrikimų, nes sutrikus įvairių medžiagų metabolizmo pro-duktų pašalinimui iš organizmo, prast÷ja m÷sos juslin÷s savyb÷s. Lemme et al., (2006) nuomone tinkamas š÷rimas kokybiškais lesalais leidžia reguliuoti raumeningumą, m÷sos išeigą. Jei racionas nesubalansuotas ir jame trūksta proteinų, vitaminų bei mineralinių elementų, tuomet paukščių orga-nizme sutrinka medžiagų apykaitos procesai, sumaž÷ja produktyvumas ir jo kokyb÷, susilpn÷ja imunitetas, padid÷ja jautrumas stresui. Paukščiams augimo, transportavimo metu patyrus didelį stresą, juos skerdžiant prasčiau išteka kraujas, o gauta m÷sa blogai bręsta (Nather, 2004). Palyginus sveikų ir su virusu infekuotų gyvulių raumenų audiniais nustatyta, kad ligos atveju metaboliniai procesai gyvame organizme vyksta intensyviau, tai taip pat apsprendžia intensyvesnius autoliz÷s procesus postmortem (Šalavičien÷ ir kt., 2003).
Ekstensyviai auginamų m÷sinio tipo paukščių sinchroninio augimo defektas tarp kūno kom-ponentų, įskaitant širdį ir plaučius, gali prisid÷ti prie plautin÷s hipertenzijos, sukeliančios kūne pe-rteklines skysčių sankaupas – ascitus. (Noll, Kamyab, 2002; Ellerbrock, 2000). Intensyviai augantys kalakutų patinai turi nepakankamą plaučių difuzijos gebą, kas sul÷tina deguonies transportą ir taip gali sukelti audinių hipoksiją bei širdies veiklos sutrikimus. Visa tai turi įtakos plaučių hipertenzijai ir dešiniojo širdies skilvelio raumens hipertrofijai (Tafti, Karima, 2000).
Tarpusavyje susijęs atsakas į kalakutų selekciją d÷l padid÷jusios kūno mas÷s ir plačios, dide-l÷s krūtin÷dide-l÷s lemia gilios raumenų miopatijos išsivystymą, t.y. M. pectroralis inferior atrofijos, sukeltos d÷l nepakankamo audinių aprūpinimo krauju (Hafez, Hauck, 2005). Gili pektoralinio rau-mens miopatija gali būti diagnozuota tik postmortem ir neturi išreikštų klinikinių požymių, visgi ši patologija lemia paukščių, su pažeistais krūtin÷lių raumenimis, brokavimus. Dideli aiškiomis ribo-mis ištinę pažeidimai pradžioje būna blyškūs, v÷liau suprakorakoidiniai raumenys įgauna žalsvą atspalvį. Šis sutrikimas sukeliamas suprakorakoidinių raumenų išemijos, kurią lemia laktatin÷s rūgšties nepakankamas išnešiojimo greitis (Harper et al., 1975). Šis polinkis gali būti susijęs su m÷-sinio tipo paukščių neadekvačiu kraujagyslinio tinklo išsid÷stymu raumenyse (Wight, Siller, 1979).
Neigiamos įtakos m÷sos kokybei gali tur÷ti raumenų morfologiniai ir biocheminiai pokyčiai ir atsiradę raumeninių skaidulų defektai (Le Bihan – Duval et al., 2008). Intensyvus auginimo būdas siejamas su raumenų degeneracija ir kreatinkinaz÷s koncentracija plazmoje (Velleman et al., 2003).
M. pectoralis raumens struktūra yra labai kompaktiška, t.y. santykinai siauri tarpeliai tarp miofibrilių (Opalka et al., 2004). Suaugusių paukščių su hipertrofuotomis raumenin÷mis skaidulo-mis ir nedideliu kapiliarų tankumu dominuoja glikolitin÷s energijos gamyba. Po skerdimo raumeni-niame audinyje vykstanti ischemija yra palanki anaerobin÷ms reakcijoms, tokiu atveju piruvatas metabolizuojamas į laktatą, kuris turi įtakos raumeninio audinio acidoz÷s susiformavimui (Opalka et al., 2004). Kalakutų 30 proc. viso kūno svorio sudaro baltieji raumenys, įskaitant ir m. pectoralis,
15
kurie turi didžiausią įtaką vystantis bendrai skerdenos acidozei (Opalka et al., 2004). Priešskerdimi-nio streso aktyvuota medžiagų apykaita gali atpalaiduoti didelį kiekį piruvato, taip pat gali sąlygoti glikogeno irimą. Paukščiuose su ribotu geb÷jimu oksiduoti piruvatą gali būti pagaminami dideli kiekiai laktato kas lemia greitą poskerdiminį pH vert÷s sumaž÷jimą.
Mokslininko Fernandez et al., (2002) tyrimų duomenimis yra ryšys tarp paukščio mas÷s sker-dimo metu ir m÷sos pH poskerdiminiu periodu. Tų kalakutų, kurie prieš skerdimą tur÷jo mažesnę masę, M. pectoralis superficialis ir M. iliotibialis raumenų pH reikšm÷s statistiškai patikimai buvo žemesn÷s.
Nuo 1990 metų mokslininkai didelį d÷mesį skiria PSE (išblyškusi, minkšta, eksudacin÷ m÷sa) sindromui, d÷l jo neigiamo poveikio paukštienos kokybei. Kiaulienoje PSE genetin÷s kilm÷s sindromas yra gerai žinomas (Barbut et al., 2008), bet lieka neaišku kas tiksliai šį sindromą sukelia paukštienos m÷soje (Re´mignon et al., 2007). Tik÷tina, kad žinduolių kaip ir paukščių poskerdiminių raumenų žema pH vert÷ ir aukšta temperatūra yra susijusi su proteinų denatūracija, kas lemia m÷sos kokyb÷s pakitimus (Alvarado and Sams, 2004). Proteinų deformacijos turi ryšį su m÷sos spalva, vandens rišlumo geba, m÷sos sulčių praradimu, tekstūra ir taip pat siejasi su technologin÷mis ir kulinarin÷mis m÷sos savyb÷mis (McKee and Sams, 1998; Wynveen et al., 1999; Alvarado and Sams, 2004). Opalka et al., (2004) duomenimis nuo 5 iki 30 proc. kalakutų krūtin÷s raumenys gali tur÷ti PSE sindromo požymius, kuriuos įtakoja paukščių streso sindromas (Opalka et al., 2004). Mokslininkai pateikia keletą prielaidų d÷l PSE atsiradimo m÷soje, tai: rianodino recepto-riaus mutacijos sarkoplazminiame tinkle, imlumas stresui, pagreit÷jusi pomirtin÷ glikoliz÷, tačiau nei viena koncepcija negali pilnai paaiškinti PSE m÷soje vykstančių biocheminių kitimų (Opalka et al., 2004; Lesiow, Kijowski, 2003; Werner et al., 2005).
Anaerobin÷s glikoliz÷s metu susikaupia pieno rūgštis, d÷l kurios sutrump÷ja laikas per kurį sumaž÷ja pH vert÷. Pieno rūgšties susidaro mažiau, kai d÷l gyvūnų išsekimo ar patirto streso gliko-genas yra sunaudojamas jau prieš skerdimą. Greitas pH sumaž÷jimas ir temperatūros kilimas rau-menyse sukelia sarkoplazmos baltymų denatūravimą. To rezultatas – raumenys netenka vandens rišlumo savyb÷s, m÷sa tampa vandeninga ir minkštos konsistencijos, o denatūravus mioglobinui - pasidaro blyškios spalvos (McKee et al., 1998; Molette et al., 2003; Alvarado, Sams, 2004; Fernan-dez et al., 2002). Postmortem glikoliz÷s greitis kalakutų krūtin÷s raumenyse yra žymiai didesnis lyginant su kalakutų šlaunų raumenimis. Postmortem sąstingis abiejose raumenų grup÷se prasideda maždaug tuo pačiu laiku, tačiau galutin÷ pH vert÷ kalakutų krūtin÷lių raumenyse (pH 5,9) mažesn÷ negu šlaunelių raumenyse (pH 6,4) (Schon, Ristic, 1974). Paukščių patyrusių sąlyginai trumpą priešskerdiminį stresą m÷sa įgauna PSE sindromą, tuo tarpu patyrusių gana ilgą antemortem stresą m÷sa įgauna DFD požymius (Lawrie, 1998). PSE požymių turinčios paukštienos perdirbimas yra ribojamas. Tokia m÷sa negali būti vertinama kaip turinti tinkamas kokybiškas kulinarines savybes ir
16
neturi būti nukreipiama į mažmeninę prekybą (Alvarado, 2002). Taip pat ir DFD požymių turinčios m÷sos su aukšta pH reikšme (pH > 6.3), vartojimas yra ribotas d÷l didesn÷s mikrobin÷s taršos (Al-len et al., 1997).
Lesiow ir Kijowski (2003) nuomone kalakutų m÷sos pH reikšm÷s įvertinimas po 15-20 min. po skerdimo ir m÷sos spalvos šviesumo įvertinimas gali būti naudojami kalakutų m÷sos PSE sin-dromo identifikavimui. Tačiau mokslininkas Eadmusik su bendraautoriais (2011) savo tyrimuose skelbia, jog pH matavimas 20 min. po skerdimo yra nepakankamas rodiklis aptikti kalakutų m÷sos PSE sindromą.
Dauguma m÷sos kokybę įtakojančių faktorių yra susiję su ląstelių energijos ir kalcio metabo-lizmu, taigi kartu susiję ir su mitochondrijų funkcijomis (Wicke et al., 2000; Gunter et al., 2004; Opalka et al., 2004).
1.4. Mitochondrijų struktūra ir funkcijos
Mitochondrijos yra pagrindinis ląstelių energijos šaltinis. Jos po branduolio yra antros pagal dydį gyvūnų ląstelių organel÷s. Mitochondrijų forma, dydis ir išsid÷stymas ląstel÷je priklauso nuo ląstel÷s rūšies. Jų kiekis ląstel÷je įvairus ir priklauso nuo aerobinio energijos teikimo poreikio orga-nizmui. Skeleto raumens raudonųjų skaidulų ir miokardo ląstel÷s turi daugiau mitochondrijų nei kepenų ir griaučių raumens baltųjų skaidulų ląstel÷s, t.y. jų kiekis proporcingas audinių energijos poreikiams (Mildažien÷ ir kt., 2004).
Mitochondrijos skiriasi nuo kitų ląstel÷s organelių tuo, kad turi savo DNR, kuris koduoja tam tikrus mitochondrijų membranų baltymus (Chen, Butow, 2005). Taip pat jos savyb÷mis ir išvaizda primena bakteriją, turi savo ribosomų. D÷l šių priežasčių atsirado teorija teigianti, kad mitochondri-jos, tai kadaise buvusios atskiros ląstel÷s endocitoz÷s būdu patekusios į kitas ląsteles (Abhishek et al., 2011). Kiekvieną ovalios formos mitochondriją nuo ląstel÷s citoplazmos skiria apvalkal÷lis su-sidedantis iš dviejų, turinčių skirtingas savybes ir funkcijas membranų: išorin÷s ir vidin÷s (Bowsher, Tobin, 2001). Per apvalkal÷lį vyksta ryšys tarp organoidų ir juos supančio citozolio. Tarp abiejų apvalkal÷lio membranų yra tarpmembranin÷s ertm÷s (Frey, Mannella, 2000; ). Išorin÷ memb-rana lygi, o vidin÷ vingiuota. Vidin÷s membranos riboja vidines ertmes, užpildytas standžia me-džiaga, vadinama matriksu. Matrikse išsid÷stęs mitochondrijų DNR, ribosomos, įvairūs fermentai, daugiausia tai medžiagų oksidacijos fermentai: riebalų rūgščių oksidacijos t.y. β-oksidacijos, Kreb-so ciklo fermentai, piruvato dehidrogenaz÷, dalis aminorūgščių oksidacijos fermentų ir kt. (Borutai-t÷, 2010; Mildažien÷ ir kt., 2004; ). Kadangi mitochondrijų vidin÷s membranos vingiuotos, d÷l to į jų vidų įsiterpia vingiai – kristos. Abi membranos yra fosfolipidų dvisluoksnis, tačiau jų sud÷tis ski-riasi, kas lemia jų skirtingo laidumo priežastis (Navarro, Boveris, 2006; Mildažien÷ ir kt. 2004). Išorin÷je membranoje daug integralinio baltymo porino, sudarančio poras, d÷l to ši membrana laidi
17
jonams ir nedidel÷s molekulin÷s mas÷s junginiams, taip pat sud÷tyje turinti fermentų, pvz.: acil-CoA sintetaz÷s ir kt. Nepažeista vidin÷ membrana selektyviai laidi tik tam tikriems jonams ir jungi-niams, kurių pernaša vyksta dalyvaujant savitiems nešikliams. Vidin÷se membranose yra daug fer-mentų, tai kv÷pavimo grandin÷s kompleksai, sukcinato dehidrogenaz÷, ATP-sintaz÷, pernašos bal-tymai ir kt. (Borutait÷, 2010; Navarro, Boveris, 2006; Mildažien÷ ir kt., 2004).
Pagrindin÷ energijos forma ATP, sintetinama mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo metu, įgalina reakcijų metu išsiskiriančią energiją panaudoti raumenų susitraukimo, aktyvaus transporto, jonų gradiento palaikymo ir kituose energijos reikalaujančiuose procesuose (Dobson, Himmerl-reich, 2002). Nors pagrindin÷ mitochondrijų funkcija yra oksidacinis fosforilinimas, tačiau šios or-ganel÷s atliekas ir kitas svarbias funkcijas: sintetina hemą, lipidus, aminorūgštis, nukleotidus, palai-ko ląstel÷s neorganinių jonų homeostazę (tarp jų ir Ca2+), jose vyksta dalis karbamido ciklo ir ste-roidinių hormonų sintez÷s reakcijų (Mildažien÷ ir kt., 2004; Praškevičius ir kt., 2003; Borutait÷, 2010). Mitochondrijų disfunkcija įtakoja degeneracinių ligų vystymąsi, sen÷jimo, v÷žinius procesus (Navarro, Boveris 2006). Šios organel÷s reguliuoja ir programuotą ląstelių mirtį - apoptozę. Apop-toz÷ charakterizuojama morfologiniais pakitimais, kurie apima ląstel÷s susitraukimą, chromatino kondensaciją, oligonukleosomin÷s DNR segmentaciją ir ląstel÷s mirtį. Lemiamas apoptoz÷s procesų etapas yra proteazių, vadinamų kaspaz÷mis aktyvinimas, kurį sukelia tam tikrų baltymų (pvz. ci-tochromo c, esančio kristose) per÷jimas iš mitochondrijų į citozolį. Yra žinoma, kad mitochondrijos vaidina pagrindinį vaidmenį tiek apoptotin÷je, tiek nekrotin÷je ląstel÷s mirtyje. (Borutait÷, 2010; Toleikis et al., 2005).
1.5. Mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s struktūra ir funkcijos
Mitochondrijų kv÷pavimo grandinę sudaro keturi stambūs fermentiniai kompleksai, įterpti į vidin÷s membranos fosfolipidų dvisluoksnį. Ši kv÷pavimo grandin÷ yra sud÷tinga oksidacijos-redukcijos – elektronų pernašos sistema, kuri redukuotų kofermentų elektronus perduoda molekuli-niam deguoniui. Deguonis elektronus gali prisijungti iš visų kv÷pavimo grandin÷s komponentų, o galutinis reakcijos produktas – vanduo (Dudkina et al., 2005). Pagrindin÷ kv÷pavimo grandin÷s funkcija – laipsniškai išlaisvinti energiją iš redukuotų kofermentų (NADH ir FADH2), kurie yra
kv÷pavimo grandin÷s substratai. Šie redukuoti oksidoreduktazių kofermentai NADH ir FADH2
ga-minami oksiduojantis junginiams, susidariusiems iš riebalų, angliavandenių, baltymų. Piruvato, tri-karboksirūgščių tarpinių junginių ir riebalų rūgščių oksidacijos mitochondrijų matrikse metu pasi-gamina redukuojantys ekvivalentai NADH ir FADH2, kurie panaudojami elektronų pernašai
kv÷pa-vimo grandin÷je (Praškevičius ir kt., 2003; Žūkien÷ et al., 2006). Kv÷pakv÷pa-vimo grandin÷s kompleksai: NADH dehidrogenaz÷, sukcinato dehidrogenaz÷, kofermento Q-citochromo c oksidoreduktaz÷,
ci-18
tochromo c oksidaz÷ arba I, II, III, IV kompleksai, atitinkamai yra kompleksiškai išsid÷stę vidin÷je mitochondrijų membranoje (kristose), teigiamai did÷jančio oksidacijos-redukcijos potencialo kryp-timi. Kiekvienas kompleksas turi kelias prostetines grupes prijungiančias elektronus (Žukien÷ et al., 2006). Kompleksai tarpusavyje sąveikauja dalyvaujant judriems elektronų nešikliams: lipiduose tirpiam kofermentui Q/unichinonui (Ko-Q) ir vandenyje tirpiam citochromui c (Cyt c), kurie perne-ša elektronus tarp kompleksų. Kadangi kv÷pavimo grandin÷s kompleksai turi did÷jantį standartinį potencialą, tai sudaro sąlygas savaime perduoti elektronus nuo NADH ar kitų elektronų donorų per kompleksus molekuliniam deguoniui (Grinius et al.,1971).
1 pav. Oksidacinio fosforilinimo sistema. Kv÷pavimo grandin÷s kompleksai pažym÷ti rom÷niškais skaitmenimis (I, II,II, IV – atitinkamai), fosforilinimo sistemos sandai – lotyniškais (1,2,3 - fosfato nešiklis, ATP sintaz÷, ATP/ADP nešiklis, atitinkamai).
(http://www.bchi.lt/LBD/saitas/files/mkitoch.pdf)
Kv÷pavimo grandin÷s komponentai yra hidrofobiniai integraliniai baltymai. Ko-Q hidrofobi-nis mažos molekulin÷s mas÷s junginys, o Cyt c yra hidrofilihidrofobi-nis periferihidrofobi-nis baltymas silpnais ryšiais prisitvirtinęs prie mitochondrijų vidin÷s membranos išorin÷s pus÷s (Praškevičius ir kt., 2003). Kv÷-pavimo grandin÷ naudoja mitochondrijose pagamintus substratus – NADH ir FADH2, jų elektronus
perduoda molekuliniam deguoniui, tuo pačiu per protonų siurblius vandenilio jonai iš matrikso pa-tenka į tarpmembraninę ertmę. Taip, išlaisvinant redukuotų kofermentų energiją, sukuriamas elekt-rocheminis protonų gradientas. Vidin÷s membranos nelaidumas protonams lemia elektrocheminio protonų gradiento susidarymą (Mitchell, 1961). Ląstelinę energiją – ATP, gamina ATP-sintaz÷, kuri ADP fosforilinimui naudoja kv÷pavimo grandin÷s sukurtą protonų gradientą. ATP-sintaz÷ taip pat
19
yra mitochondrijų vidin÷s membranos integralinis baltymas, tačiau didžioji jos dalis yra matrikso pus÷je (Navarro, Boveris 2006; Praškevičius ir kt., 2003). Kompleksas I – pats didžiausias komp-leksas, kuris turi dviejų tipų prostetines grupes: flavinmononukleotidas (FMN), gebantis prijungti vandenilį nuo NADH ir geležies sieros centrai (Fe3+/2+ -S), prijungiantys elektronus nuo redukuoto flavino mononukleitodo FMNH2. Fe-S centrų redukcijos metu elektronai perduodami Ko-Q, o
pro-tonai išstumiami į tarpmembraninę ertmę. Kompleksas II turi dviejų tipų prostetines grupes: flavi-nadenindinukleotidai (FAD) – prijungiantys vandenilio jonus ir Fe-S centrai prijungiantys elektro-nus nuo redukuoto FADH2. Šis kompleksas oksiduoja sukcinatą, tod÷l vadinamas
sukcinato-ubichinono reduktaze. Kompleksas II taip pat perduoda elektronus nuo FADH2 Ko-Q (ubichinonui),
tačiau neišstumia protonų į tarpmembraninę ertmę. Jud÷damas mitochondrijų vidine membrana Ko-Q jungia kompleksus I ir II su kompleksu III. Ko-Ko-Q redukcijos metu prisijungia 2 elektronus iš Fe-S centrų ir 2 protonus iš matrikso. Kompleksas III – kv÷pavimo grandies darinys, į kurio sud÷tį įeina daug citochromų. Citochromai – hidrofiliniai periferiniai hemoproteinai, silpnai prisitvirtinę prie vidin÷s membranos išorin÷s pus÷s. Prie jų molekulių prijungto hemo, geležies oksidacijos laipsnis kinta nuo 3+ (oksiduota būsena) iki 2+ (redukuota būsena). Nuo citochromo 1 elektronai pereina į citochromą c, kuris jungia kompleksą III su kompleksu IV. Komplekso III prostetin÷s grup÷s – b-c1 citochromai ir Fe-S centrai prijungia Ko-Q elektronus, o protonai išstumiami į tarpmembraninę ertmę. Kompleksą III su kompleksu IV jungia citochromas c, kuris elektronus prisijungia iš citoch-romo c1, priklausančio kompleksui III. Komplekso IV sud÷tyje yra citochromai a ir a3, taip pat ok-sidacijos laipsnį gebantys keisti geležies ir vario jonai. Būtent šie jonai prijungia ir sulaiko deguonį, kol prie jo prijungiami 4 elektronai ir 4 protonai. Kompleksas IV deguonį verčia vandeniu kartu išstumdamas 4 protonus iš matrikso į tarpmembraninę ertmę.
Oksidacinį fosforilinimą lemia ląstel÷s ir viso organizmo metabolin÷ būsena. Nuo jos priklau-so mitochondrijoms teikiami medžiagų apykaitos ir ATP sintez÷s substratai (pvz., piruvatas ar rie-balų rūgštys, ADP), tuo pačiu – redukcinių ekvivalentų šaltinis ir srautas bei ATP sintez÷s greitis (Žūkien÷ et al., 2006).
20
2.1. Tyrimo atlikimo vieta ir kalakutų atranka tyrimams
Tyrimai buvo vykdomi 2010 – 2012 m. Pasirinkta „X“ m÷sos įmon÷, kurioje buvo skerdžiami BIG – 6 ir BUT – 9 veislių m÷siniai kalakutai: 132 – 154 dienų amžiaus patinai ir 98 – 104 dienų amžiaus patel÷s. M÷giniai laboratoriniams tyrimams buvo imami iš 147 dienų amžiaus BIG – 6 veisl÷s kalakutų patinų, kurie tur÷jo galūnių pažeidimus ir buvo išauginti toje pačioje fermoje.
2.2. Tyrimo atlikimo schema
Įmon÷je „X“ priešskerdiminio tikrinimo metu paukščiai buvo suskirstyti į keturias tiriamąsias grupes pagal makroskopiškai pasireiškusius galūnių pažeidimus. Iš atrinktų kalakutų grupių buvo imti m÷giniai iš krūtin÷lių ir šlaunelių raumenų (po 5 m÷ginius iš kiekvienos grup÷s). LSMU MA
VMVT ataskaitos analiz÷
Priešskerdiminis ir poskerdiminis tikrinimas
Galūnių pažeidimų identifikavimas
M÷ginių ÷mimas
Krūtin÷l÷s raumenys Šlaunel÷s raumenys
M÷ginių pristatymas į LSMU MA Neuromokslų instituto Biochemijos laboratoriją
Permeabilizuotų raumeninių skaidulų peruošimas
Mitochondrijų kv÷pavimo greičio registravimas
21
Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijoje atliktas padidinto pralaidumo (permeabilizuotų) raumeninių skaidulų paruošimas bei mitochondrijų kv÷pavimo greičio registravimas permeabilizuo-tose skaidulose. Ištirta 40 m÷ginių nepra÷jus 24 valandoms nuo jų pa÷mimo, kiekvieno m÷ginio analiz÷ kartota po tris kartus. Gavus tyrimų rezultatus, atliktas jų statistinis įvertinimas ir interpreta-vimas.
2.3. Tyrimo metodai
Kalakutų priešskerdiminis ir poskerdiminis tikrinimas „X“ m÷sos įmon÷s paukščių skerdyklo-je, atliktas vadovaujantis ES Reglamentu (EB) Nr. 854/2004.
Priešskerdiminio tikrinimo metu, remiantis Ekstrand et al. (1998) pododermatitų vizualinio (makroskopinių pakitimų) vertinimo sistema, kalakutai buvo suskirstyti keturias tiriamąsias grupes:
I grup÷ – kontroliniai kalakutai, neturintys galūnių patologijų;
II grup÷ – kalakutai su 30 laipsnio pododermatitais, t.y. individai turintys stipriausiai pasireiškusius nekrotinius plantariniuis kojų padų pažeidimus;
III grup÷ - kalakutai su pododermatitais-artritais-tendovaginitais, t.y. individai turin-tys 30 laipsnio pasireiškusius pododermatitus kartu su stipriai pasireiškusiais sąnarių ir šalia jų esančių sausgyslių uždegimais;
IV grup÷ - kalakutai su pododermatitais-varus-valgus deformacijomis, t.y. individai turintys 30 laipsnio pasireiškusius pododermatitus kartu su stipriai pasireiškusiais ti-biometatarsus kaulų chondrostofiniais išlinkimais, kai stov÷senos anomalija pasireišk÷ O ar X formos išlinkimais.
Laboratorijoje įvertinti krūtin÷lių ir šlaunelių raumenų mitochondrijų kv÷pavimo aktyvumai.
2.4. Kalakutų priešskerdiminis, poskerdiminis tikrinimas
Vadovaujantis ES Reglamentu (EB) Nr. 854/2004 skerdykloje „X“ buvo atliktas kalakutų (pa-tinų ir patelių) priešskerdiminis ir poskerdiminio tikrinimas, atlikta rastų galūnių pakitimų analiz÷.
22
Pasirinkti kalakutų patinai, sveriantys 20 kg, BUT Big – 6 linijos veisl÷s, kurie buvo auginti toje pačioje fermoje pagal tą pačią standartizuotą intensyvaus auginimo programą. Į skerdyklą at-vežti 147 dienų amžiaus. Paukščiai skersti vadovaujantis Europos Sąjungos Tarybos direktyvos Nr. 93/119/EEB bei Parlamento ir Tarybos reglamento (EB) Nr. 854/2004 nuostatomis. Priešskerdimi-nio tikrinimo metu pagal makroanatomines kojų deformacijas ir pakitimus kalakutai buvo suskirsty-ti į keturias grupes: I – kontroliniai; II – individai turintys 3° (laipsnio) pododermasuskirsty-tito požymių; III – pododermatitai (3°) kartu su artritu ir tendovaginitu; IV – pododermatitai (3°) kartu su varus – valgus deformacijomis. M÷giniai skalpeliu imti tuoj po paukščių nukraujinimo iš M. pectoralis su-perficialis ir iš M. biceps femoris po 2 g, kurie buvo laikomi 4°C temperatūros izoliavimo terp÷je A, susidedančioje iš: 20 mM imidazolo, 20 mM taurino, 0,5 mM ditiotreitolio, 7,1 mM MgCl2, 50 mM
MES buferio (2-(N-morfolino)-etansulfonin÷ rūgštis), 5 mM ATP, 15 mM fosfokreatino, 2,6 mM CaK2EGTA ir 7,4 mM K2EGTA (laisvo Ca2+ koncentracija 0,1 µM), pH sureguliuotas KOH iki 7,0
esant 2°C temperatūrai.
2.6. Padidinto laidumo (permeabilizuotų) raumeninių skaidulų paruošimas
Atrinktų kalakutų skeleto raumeninių skaidulų pluoštai buvo smulkinami adat÷l÷mis, paruošiant juos 0,2 – 0,3 mm skersmens pločio (Liobikas et al., 2001; Toleikis et al., 2005). Paruoštos skaidulos buvo perkeliamos į 1 ml tūrio m÷gintuv÷lius su tirpalu A, papildomai pridedant 50 µg/ml saponino (išskirto iš Gipsofilija augalo rūšies, turinčio apie 17 proc. sapogenų) ir 3 mg/ml IV tipo kolagenaz÷s. Toliau buvo atliekama 30 min. inkubacija su intensyviu 120 k/min. purtymu. Po to skaidulos buvo nuplautos, t.y. perd÷tos į tirpalą B, kurio sud÷tis: 20 mM imidazolo, 20 mM taurino, 0,5 mM ditiotreitolio, 1,6 mM MgCl2, 100 mM MES buferio, 3 mM KH2PO4, 3,0 mM
CaK2EGTA ir 7,1 mM K2EGTA (laisvo Ca2+ koncentracija 0,1 µM), pH vert÷ iki 7,1 sureguliuota
KOH esant 37°C temperatūrai. Paruošti m÷gintuv÷liai su skaidulomis v÷l purtomi 10 min. Galiausiai skaidulos buvo perkeliamos į pastarąjį tirpalą B ir laikomos leduose.
2.7. Mitochondrijų kv÷pavimo greičio registravimas permeabilizuotose skaidulose
Permeabilizuotų skeleto raumeninių skaidulų mitochondrijų in situ (t.y. savo buvimo vietoje, jų neizoliuojant) kv÷pavimo greičiai buvo matuoti poliarografiškai termostatuojamoje 37°C temperatūroje, naudojant uždarą Klarko tipo deguonies elektrodą (įtaisytą stiklin÷s kiuvet÷s sienel÷je), magnetinę maišyklę, poliarografą (“Linseis L250E”, Vokietija) tirpale B, į jį pridedant jaučio serumo albumino (2mg/ml). Kaip kv÷pavimo substratai buvo naudoti 5 mM glutamatas + 6
23
mM malatas, 1 mM sukcinatas (+2 mM amitalio). Mitochondrijų kv÷pavimo greitis 2-oje metabolin÷je būsenoje (V2) buvo matuotas esant substratui glutamatui + malatui. Prid÷jus 2 mM
ADP įvertinome mitochondrijų kv÷pavimo greitį 3-oje metabolin÷je būsenoje (VADP). Citochromo c
efektas išorin÷s membranos intaktiškumui ir kv÷pavimo greičiui įvertinti buvo nustatytas pridedant 32 µM citochromo c po 120 µM atraktilozido (ATR), kuris yra ATP ir ADP nešiklių slopiklis. Galiausiai buvo prid÷ta 0,2 µM karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazono (CCCP), kuris yra oksidacijos (kv÷pavimo) ir fosforilinimo procesų skyriklis. Iš oksimetrinių matavimo kreivių naudojant „BioMed“ programinę įrangą buvo apskaičiuotas deguonies sunaudojimo greitis įvairiose mitochondrijų metabolin÷se būsenose. Jis buvo išreiškiamas nanomoliais deguonies per minutę sausų skaidulų svorio-1 (nmolO/min/mg). Sausų skaidulų svoris buvo gautas dalinant dr÷gnų skai-dulų svorį (prieš matavimą) iš koeficiento 4,85. (Į stiklinę kiuvetę uždaromą kamščiu su besimai-šančia magnetine maišykle ir tirpalu B buvo dedama 5-7 mg skaidulų).
2.8. Statistinis duomenų įvertinimas
Duomenų, mažiausiai trijų nepriklausomų atvejų, vidurkiai pateikti su vidutin÷mis ± standar-tin÷s paklaidomis, statistiškai palyginti Stjudento t-testu (Student‘s t-test), skirtumai tarp vidurkių patikimi, jei p < 0,05. Statistin÷ analiz÷ atlikta naudojant programin÷s įrangos Sigma Plot 2000 pa-ketą.
24
3.1. „X“ įmon÷je atlikto kalakutų priešskerdiminio ir poskerdiminio tikrinimo rezultatai
2 pav. Kalakutų poskerdiminio tyrimo metu nustatyti galūnių pakitimai
„X” įmon÷je 2010-2011 metų laikotarpiu poskerdiminio tikrinimo metu apžiūr÷ta 12340 Big-6 linijos kalakutų, iš jų 7534 patinai ir 480Big-6 patel÷s.
Poskerdiminio tikrinimo metu nustatyta, kad 77,66 proc. apžiūr÷tų kalakutų rasti pododermatito požymiai, 3,35 proc. diagnozuotas artritas, 3,02 proc. diagnozuotas tendovaginitas, o varus-valgus deformacija aptikta 0,85 proc. tirtų kalakutų.
Analizuojant įvairių galūnių pažeidimų pobūdžio priklausomybę nuo lyties, kalakutų patinams pododermatitai nustatyti 6,61 proc. daugiau nei patel÷ms. Artritai ir tendovaginitai diagnozuoti gana retai, tačiau šių patologijų pasiskirstymas tarp atskirų lyčių atstovų skyr÷si (patinams artritai nustatyti 4,58 proc., tendovaginitai 3,81 proc. daugiau nei patel÷ms). Galūnių iškrypimas (varus-valgus deformacija) nustatytas nedideliam skaičiui skerdžiamų paukščių – 0,85 proc., tačiau patinams jis buvo 10,7 karto dažnesnis nei patel÷ms (žr. priede 1 lentelę).
3.2. Mitochondrijų kv÷pavimo greičio registravimo schema permeabilizuotose kalakutų raumenin÷se skaidulose
25
Nor÷dami ištirti ir palyginti kontrolinių (sveikų) I gr. kalakutų ir kalakutų su: II gr. pododermatitu, III gr. pododermatitu-artritu-tendovaginitu, IV gr. su pododermatitu-varus-valgus deformacijų galimą poveikį mitochondrijų oksidaciniam fosforilinimui permeabilizuotose skaidulose, buvo matuotas mitochondrijų kv÷pavimo greitis įvairiose metabolin÷se būsenose, naudojant poliarografinę standartinę kv÷pavimo matavimų kreivę (žr. 3 pav.). Pradžioje įvertintas mitochondrijų kv÷pavimo greitis 2-oje metabolin÷je būsenoje (V2), panaudojus nuo kv÷pavimo
grandin÷s I komplekso priklausomų substratų glutamato + malato (Glu + mal) veikimo efektyvumą. Mitochondrijų kv÷pavimo 3-oji būsena (VADP) pasiekta įdedant adenozindifosfato (ADP). Po
mitochondrijų kv÷pavimo grandin÷s I komplekso substratų inhibicijos su amitaliu (šis inhibitorius slopina elektronų pernašą nuo Fe-S centrų ubichinonui ir stabdo oksidacinį fosforilinimą), prid÷ta sukcinato tam, kad įvertinti II kv÷pavimo grandin÷s komplekso substrato sukcinato oksidaz÷s aktyvumą 3-oje metabolin÷je būsenoje. Kv÷pavimo greitis 4-oje metabolin÷je būsenoje matuotas pridedant nukleotidų slopiklio atraktilozido (ATR), kuris inhibuoja ATP/ADP transportą per vidinę mitochondrijų membraną, šiuo inhibitoriumi buvo stebima ar n÷ra pažeistos mitochondrijų vidinių membranų pralaidumo poros. Egzogeninis citochromas c (elektronų nešiklis), panaudotas tam, kad patikrinti mitochondrijų išorin÷s membranos intaktiškumą. Galiausiai buvo prid÷ta karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazono (CCCP), kuris yra klasikinis jonoforas, oksidacinio fosforilinimo skyriklis, atskiriantis oksidaciją nuo fosforilinimo, t. y. jis stimuliuoja mitochondrijų kv÷pavimą 2-oje metabolin÷je būsenoje ir stabdo ATP sintezę, kuomet pernešami elektronai kv÷pavimo grandine deguoniui, bet ATP sintez÷ nevyksta.
26
3 pav. Standartin÷ poliarografin÷ mitochondrijų kv÷pavimo matavimų kreiv÷, atliekant matavimus permeabilizuotose kalakutų skeleto raumenų skaidulose. Kaip kv÷pavimo substratai naudoti: 5 mM glutamatas ir 6 mM malatas. Priedai: 0 – skaidulos; A1 – 2 mM ADP; A2 – 2 mM amitalis; A3 – 1 mM sukcinatas; A4 – 0,1 mM atraktilozidas; A5 – 32 µM citochromas c; A6 – 0,2 µM CCCP.
3.3. Mitochondrijų kv÷pavimo greičių palyginimas kalakutų šlaunelių ir krūtin÷lių permeabilizuotose raumenin÷se skaidulose
1 lentel÷. Mitochondrijų kv÷pavimo greičiai esant I kv÷pavimo grandin÷s komplekso substratams (glutamatui + malatui) kalakutų krūtin÷l÷s (M. pectoralis superficialis) ir šlaunel÷s (M. biceps femoris) raumenin÷se permeabilizuotose skaidulose.
Kv÷pavimo greičiai 3-ioje metabolin÷je būsenoje (VADP) su Glu+mal (nmol
O/min/mg/sausų skaidulų svorio) Tiriamosios
grup÷s
Krūtin÷l÷s raumenys Šlaunel÷s raumenys
27 II – pododermatitas 13,8 ± 1,7 18,7 ± 1,9 III – pododermatitas-artritas-tendovaginitas 11,0 ± 3,2 13,8 ± 1,3 IV – pododermatitas-varus-valgus 12,0 ± 0,4 17,7 ± 3,6
Kaip matyti iš 1 lentel÷s duomenų, palyginus šlaunel÷s (M. biceps femoris) ir krūtin÷l÷s (M. pectoralis superficialis) m÷ginių mitochondrijų kv÷pavimo greičius 3-oje metabolin÷je būsenoje, t.y. esant ADP (VADP) visais atvejais nustatyta, kad I kontrolin÷s ir II pododermatito grupių
kv÷pavimo greičiai buvo 1,4 karto didesni šlaunel÷s raumenyse. Nežymus skirtumas gautas III grup÷je – pododermatito-artrito-tendovaginito atveju – 1,3 karto ir IV grup÷je su pododermatitu-varus-valgus – 1,5 karto didesni kv÷pavimo greičiai taip pat buvo įvertinti permeabilizuotose raumenin÷se skaidulose iš M. biceps femoris.
3.4. Mitochondrijų kv÷pavimo įvertinimas sveikų ir kojų patologijas tur÷jusių kalakutų krūtin÷l÷s raumenų permeabilizuotose skaidulose
Tyrimai parod÷, kad kalakutai II gr. su pododermatitu, III gr. su pododermatitu-artritu-tendovaginitu, IV gr. su pododermatitu-varus-valgus deformacijomis netur÷jo statistiškai reikšmingo poveikio mitochondrijų kv÷pavimo greičiui 2-oje (V2) ir 3-oje (VADP) metabolin÷se
būsenose esant substratui gliutamatui + malatui, permeabilizuotose krūtin÷lių (M. pectoralis superficialis) skaidulose (4 pav.).
15 20 25 Kontrol÷ Pododermatitas Pododermatitas-artritas-tendovaginitas Pododermatitas-varus-valgus deformacijos K v ÷ p a v im o g re it is , n m o l O /m in /m g s a u s ų s k a id u lų s v o ri o
*
28
4 pav. Mitochondrijų kv÷pavimas permeabilizuotose kalakutų M. pectoralis superficialis skai-dulose esant skirtingoms metabolin÷ms būsenoms, tiriant patologijų (II gr. pododermatitų, III gr. pododermatitų-artritų-tendovaginitų, IV gr. pododermatitų-varus-valgus) pasireiškimo poveikį. Naudota standartin÷ inkubacin÷ terp÷. Priedai eil÷s tvarka: 5 mM glutamatas + 6 mM malatas (V2); 2 mM ADP (VADP); 1 mM sukcinatas (+ 2mM amitalis), 120 µM atraktilozidas
(VATR); 32 µM citochromas c (VCyt c); 1 µM karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas (VCCCP). *
Statistiškai patikimas skirtumas, lyginant su kontrole, p < 0,05; n=5.
Sukcinato (kv÷pavimo grandin÷s II komplekso substrato) oksidacija 3-oje metabolin÷je būsenoje skyr÷si tik IV gr. m÷giniuose su kalakutų pododermatitų-varus-valgus deformacijomis ir sumaž÷jo 27 proc. palyginant su kontroline (I) grupe kaip parodyta (4 pav.). Kv÷pavimo greitis nevykstant fosforilinimo procesui buvo pamatuotas po atraktilozido įd÷jimo, kuris nekito esant n÷ vienai iš šių kojų patologijų. Kv÷pavimo 4-oji metabolin÷ būsena buvo įvertinta pridedant egzogeninio citochromo c. Kv÷pavimo greitis sumaž÷jo 46 proc. IV grup÷je su pododermatitu-varus-valgus deformacijomis. Tuo tarpu palyginus kv÷pavimo greičius kalakutų II gr. su pododermatitu, III gr. - pododermatitu-artritu-tendovaginitu ir su kontrole nebuvo pasteb÷ta statistiškai reikšmingo poveikio ketvirtoje metabolin÷je būsenoje. Po CCCP įd÷jimo kv÷pavimo greitis statistiškai reikšmingai sumaž÷jo 28 proc. tik kalakutų m÷giniuose su pododermatitu-varus-valgus deformacijomis palyginus su kontrole.
3.5. Mitochondrijų kv÷pavimo įvertinimas sveikų ir kojų patologijas tur÷jusių kalakutų šlaunel÷s raumenų permeabilizuotose skaidulose
29
Kaip matyti iš 5 pav., visos pasirinktos tyrimui kalakutų galūnių patologijos (II gr. su pododermatitais, III gr. pododermatitais-atritais-tendovaginitais, IV gr. pododermatitais-varus-valgus) netur÷jo statistiškai reikšmingo poveikio kv÷pavimo greičiui 2-oje (V2) ir 3-oje (VADP)
metabolin÷se būsenose su glutamatu + malatu ar sukcinatu permeabilizuotuose skeleto raumenin÷se skaidulose iš šlaunelių (M. biceps femoris). Kv÷pavimo greitis prid÷jus atraktilozido (ATR) ar citochromo c (Cyt c) nepakito nei vienoje grup÷je lyginant su kontrole.
Galiausiai prid÷jus į matavimo terpę klasikinio skyriklio CCCP, kuris atskiria fosforilinimą nuo oksidacijos (panaikina kv÷pavimo kontrolę), statistiškai reikšmingų pakitimų tarp tiriamųjų grupių palyginus su kontrole taip pat nerasta.
30 K v ÷ p a v im o g re it is , n m o l O /m in /m g s a u s ų s k a id u lų s v o ri o 0 10 20 30 Glu+mal
V2 VADP VADP VATR Vcytc VCCCP
Sukcinatas
Pododermatitas
Pododermatitas-artritas-tendovaginitas Pododermatitas-varus-valgus deformacijos Kontrol÷
5 pav. Mitochondrijų kv÷pavimas permeabilizuotose kalakutų M. biceps femoris skaidulose esant skirtingoms metabolin÷ms būsenoms, tiriant patologijų (II gr. pododermatitų, III gr. pododermatitų-artritų-tendovaginitų, IV gr. pododermatitų-varus-valgus) pasireiškimo poveikį. Naudota standartin÷ inkubacin÷ terp÷. Priedai eil÷s tvarka: 5 mM glutamatas + 6 mM malatas (V2); 2 mM ADP (VADP); 1 mM sukcinatas (+ 2mM amitalis), 120 µM atraktilozidas
(VATR); 32 µM citochromas c (VCyt c); 1 µM karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas (VCCCP). *
31
4. TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS
M÷sinių kalakutų jud÷jimo aparato pažeidimai yra viena aktualiausių problemų daugelyje fermų, kur šie paukščiai auginami ir veisiami pramoniniu būdu taikant ekstensyvias auginimo technologijas (Hafez, Hauck, 2005; Oviedo-Rondón, 2009). Mokslininkų nuomone, gyvūnų sveikatingumui didel÷s įtakos turi genetin÷ selekcija. Genetin÷mis modifikacijomis dirbtinai padidinamas gyvūnų teikiamos produkcijos kiekis, tačiau neigiamai įtakojama jų sveikata (Hafez, Hauck, 2005; Le Bihan-Duval et al., 2008). Intensyvios selekcijos būdu veisiant m÷sinius kalakutus pastebima itin daug problemų susijusių su jų sveikata ir gerov÷s sąlygomis. Manoma, kad fermose pagal ekstensyvią auginimo programą auginamų sunkiasvorių kalakutų tarpe beveik n÷ra visiškai sveikų paukščių (Martrenchar, 1999). Laukiniai kalakutų patinai arba kalakutai auginami ekologiškai nuo išsiritimo iš kiaušinio būdami apie 51 g svorio vidutiniškai per 4 m÷nesius priauga 3,5 kg svorio, tuo tarpu per tą patį laikotarpį selekciškai atrinkti ir veisiami kalakutai priauga daugiau nei 11,3 kg, t.y. tris kartus daugiau nei neselekcinti paukščiai (Hulet et al., 2004). M÷siniai viščiukai broileriai ir kalakutai buvo selekcionuojami su tikslu greitai auginti raumenų masę, bet skeleto ir vidaus organų augimas dažnai atsilieka (Norci, Montella, 2003; Havenstein et al., 2004). D÷l santykinai atsilikusio silpno skeleto išsivystymo, kuriam tenka išlaikyti didelę kūno masę dažnai pažeidžiamos ar net deformuojamos sunkiasvorių m÷sinių paukščių galūn÷s (Hafez, Hauck, 2005; Bradshaw et al., 2001).
Sunkiasvorių m÷sinių paukščių skeleto – raumenų sistemos ligoms dažnai būdingas šlubavimas ir kojų silpnumas. Tokie sutrikimai kaip šlubavimas, kuris pasireiškia d÷l biomechanikos ir nervų sistemos disfunkcijos, taip pat gyvūnų patiriamas skausmas siejamas ne tik su gyvūnų gerov÷s problemomis, bet ir ekonominiais nuostoliais. Daugeliu atveju pramoniniu būdu auginami, itin stipriai šlubuojantys paukščiai, turi būti brokuojami nedelsiant. Jud÷jimo aparato sistemos sutrikimai dažnai įvardijami kaip multifaktoriniai ir siejami su netinkamu lesinimu, priežiūra, auginimu, infekcijomis, o ypač genetiniais selektyvaus veisimo faktoriais (Pattison et al., 2007). Paukščiai turintys skeleto – raumenų pažeidimus, ypač šlubuojantys laikomi mažiau produktyviais, nes suvartoja mažiau lesalų, o tai daro įtaką mažesniems jų priesvoriams (Rao et al., 2003). Mokslininkų nuomone modernių m÷sinių veislių paukščių gaištamumas yra stipriai susijęs su jud÷jimo aparato pažeidimais (Havenstein et al., 2003b).
Pastaraisiais dešimtmečiais pasaulyje paplitę sunkieji m÷siniai baltieji anglų BIG-6 ir BUT-9 linijų kalakutai. Šie paukščiai greitai užauga, turi didelius priesvorius, tačiau jiems dažnai pasireiškia įvairios sveikatingumo problemos, ypač susiję su jud÷jimo aparato sistema, taip pat šie paukščiai jautresni streso faktoriams, o tai įtakoja m÷sos kokybę (Kowalski et al., 2002; Sogut et al., 2010; Opalka et al., 2004).
32
„X“ m÷sos įmon÷je pasirinkome tirti BIG-6 linijos veisl÷s baltuosius sunkiasvorius m÷sinius kalakutų patinus, nes tyr÷jų duomenimis šie paukščiai turi dažnai pasitaikančius raumenų – skeleto sistemos pažeidimus ir deformacijas. Anot mokslininkų, BIG-6 kalakutų veislei neretai priskiriamos problemos d÷l sveikatos ir m÷sos kokyb÷s (Opalka et al., 2004).
„X“ m÷sos įmon÷s skerdykloje 2010 – 2012 metų laikotarpiu priešskerdiminio ir poskerdimi-nio tikrinimo metu ištyr÷me 12340 BIG-6 linijos kalakutus, iš jų – 7534 patinus ir 4806 pateles. Priešskerdiminio ir poskerdiminio tyrimo metu nustat÷me, jog daugiau nei pusę, t.y. 77,66 proc. apžiūr÷tų kalakutų aptikti įvairaus laipsnio pododermatito požymiai. Mūsų tyrimus patvirtina moks-lininko Liesner (2007) atlikti tyrimai, kurio duomenimis tik apie 3 proc. įvairių linijų veislių sun-kiasvorių m÷sinių kalakutų neturi pododermatito požymių. Be to, Hafez et al. (2004) teigimu kojų padų (minkštimų) pažeidimų paplitimas gali svyruoti nuo 91 iki 100 proc. Pododermatitas pradeda vystytis nuo labai ankstyvo kalakutų amžiaus, kuomet padų pagalv÷lių odos spalvos pakitimai atsi-randa jau pirmos šių paukščių gyvenimo savait÷s eigoje, o pilnai susiformavę pažeidimai (apiman-tys epidermio vientisumo suardymą) pasireiškia trečiąją amžiaus savaitę ir nuo šeštos savait÷s pa-žeidimai toliau plečiasi, paveikdami vis didesnius audinių plotus (Mayne et al., 2006b; 2007b). Be to, kalakutai nuo 6-os iki 21-os amžiaus savait÷s, turintys padų pagalv÷lių defektus labiau linkę į gausesnių nekroz÷s plotų pasireiškimą. Buvo pasteb÷ta, kad išoriniai pododermatito požymiai tam-pa makroskopiškai akivaizdūs po 48 val. po nepertraukiamo beaugančių kalakutų sąlyčio su šlapiu kraiku (Mayne et al., 2007c), tai patvirtina mokslininko Breuer (2005) tyrimo rezultatus, jog jauni kalakutų pulkai gali būti jautresni pododermatitų išsivystymui nei vyresni paukščiai. Tyr÷jų Mayne et al., (2006) teigimu, padų dermatitų paplitimas paukštynuose yra viena opiausių problemų.
Kalakutams pododermatitų atvejais gali vystytis komplikacijos, kuomet uždegiminis procesas dažnai pereina į kojų sąnarius, pirštus bei sausgyslių makštis ir tokiu būdu sąlygoja artritų, tendova-ginitų pasireiškimą (Schmidt et al., 2003). Skerdykloje priešskerdiminio ir poskerdiminio tikrinimo metu 3,35 proc. kalakutų galūn÷se nustat÷me artritus ir panašų procentą, t.y. 3,02 proc. tendovagini-tus. Mūsų gautus duomenis patvirtina mokslininkų Shivaprasad et al., (2002) tyrimų rezultatai, ku-riose teigiama, jog kalakutų pulke artritų-tendovaginitų patologijos siekia apie 5 proc. Manoma kad neinfekcinius, aseptinius sąnarių uždegimus gali sukelti didel÷ kalakutų mas÷ ir traumos (Hakkarai-nen et al., 1992), o ūmaus artrito atvejais sąnariuose padaug÷ja serozinio, serofibrininio sinovinio skysčio. Mokslininko Aziz (2003) teigimu, uždegiminiai pokyčiai sąnariuose sukelia morfologinius pokyčius sinovijoje, sąnarių uždegimai sukelia gyvūnams šlubavimą ir skausmą, jie gali būti infek-cin÷s ir neinfekinfek-cin÷s kilm÷s. Manoma yra galimi šlaunelių raumens pakitimai, kurie poskerdiminiu laikotarpiu neigiamai veikia biocheminius procesus raumenyse.
Skerdykloje kalakutų galūnių iškrypimas (į vidų arba į išorę) arba varus – valgus deformacija aptikta tik 0,85 proc. tirtų paukščių. Mūsų gautus rezultatus patvirtina mokslininkų Hester ir Ferket
33
(1998) duomenys, kuriuose teigiama, jog galūnių iškrypimų atvejų skaičius kalakutų pulkuose sie-kia nuo 0,5 proc. iki 3,3 proc. O mokslininko Hunter su bendraautoriais (2008) nuomone varus – valgus deformacija yra viena dažniausiai pasitaikančių skeleto kaulų deformacijų broilerių viščiukų pulkuose. Šios galūnių patologijos etiologija ir patogenez÷ n÷ra gerai išaiškintos, bet manoma varus – valgus itin stipriai veikia paukščių mirtingumą ar būtinybę juos priverstinai skersti (Saif et al., 2008).
Analizuojant įvairių galūnių pažeidimų pobūdžio priklausomybę nuo lyties, nustatyta, jog ka-lakutų patinams pododermatitai nustatyti 6,61 proc. daugiau nei patel÷ms. Daugelio mokslininkų duomenimis pododermatitų pasireiškimas dažnesnis kalakutų patinų pulkams, nes šie priauga dau-giau kūno mas÷s nei patel÷s, o jų skeletas nesp÷ja tinkamai subręsti, taip pat gali lemti ilgesnis nei patelių, patinų auginimo laikas iki skerdimo (Buda, 2002; Breuer, 2005; Bilgili et al., 2006). Tačiau priešingai tvirtina Nagaraj su bendraautoriais (2007b; 2007c), jų tyrimo rezultatuose nurodoma, jog kalakutų patelių pulkuose buvęs dažnesnis pododermatitų pasireiškimas nei patinų (Nagaraj et al., 2007b; Nagaraj et al., 2007c).
Tiriant artritų – tendovaginitų pasireiškimą pagal kalakutų lytį nustatyta, jog patinams artritai buvo nustatyti 4,58 proc., o tendovaginitai 3,81 proc. daugiau nei patel÷ms. Tuo tarpu varus – val-gus kojų deformacijos nustatytos net 10,7 karto dažnesni patinams nei patel÷ms. Mūsų duomenis patvirtina mokslininko Julian (1984) rezultatai, kuriuose teigiama, kad m÷sinių paukščių kojų iš-krypimai kelis kartus dažnesni patinams nei patel÷ms.
Did÷jant kalakutų masei, kinta audinių morfologin÷ sud÷tis, did÷ja krūtin÷s ir šlaunų raumenų išeiga, atsiranda raumeninių skaidulų hipertrofija, formuojasi gigantin÷s skaidulos, tod÷l tuo pačiu metu esantis vidutinis jungiamojo audinio ir kraujagyslių augimas gali sukelti hipoksiją, acidozę arba miopatiją (Julian, Gazdzinsky, 2000; Hahn et al., 2001). Mažas kraujagyslių tinklo išsid÷stymas raumenyse apsunkina deguonies ir maistingų medžiagų tiekimą, sutrikdo medžiagų apykaitos produktų pašalinimą, ypač CO2 ir laktato, tod÷l turi įtakos raumenų degeneracijai (Wenda
et al., 2003; Branscheid et al., 2004 a,b). Be to Esant tam tikroms sunkiasvorių kalakutų patologi-joms kaip pododermatitui, artritui- tendovaginitui, varus-valgus – paukščiai mažai juda, raumenys pamažu gali atrofuotis (Januškevičien÷ et al., 2011).
Literatūroje trūksta duomenų apie produkcijos gyvūnų patologijų įtaką raumenų morfologijai ir m÷sos kokybei. O esant m÷sinių paukščių kojų pakitimams, galimas poveikis raumenyse vykstan-tiems biocheminiams procesams n÷ra nagrin÷tas anksčiau. Siekdami patikrinti išsikeltą hipotezę, jog kalakutų (patinų) min÷tos kojų patologijos galimai pažeidžia jų krūtin÷lių ir šlaunelių raumenis ir juose vykstančius oksidacinio fosforilinimo procesus, tyr÷me atrinktų tiriamųjų paukščių m÷gi-nius biocheminiu lygmeniu LSMU MA Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorijoje.
