BENZIMIDAZOLŲ IR DIHIDROPIRIDINŲ POVEIKIO KRAUJAGYSLIŲ SEGMENTŲ IR PAPILIARINIŲ RAUMENŲ IZOMETRINEI FUNKCIJAI ĮVERTINIMAS

1

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Vygantas Barsys

BENZIMIDAZOLŲ IR DIHIDROPIRIDINŲ

POVEIKIO KRAUJAGYSLIŲ SEGMENTŲ

IR PAPILIARINIŲ RAUMENŲ

IZOMETRINEI FUNKCIJAI ĮVERTINIMAS

Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,

medicina (06B)

2

Disertacija rengta 2007–2011 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijoje.

Disertacija ginama eksternu. Mokslinis konsultantas

habil. dr. Vida Garalienė, (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medi-cinos akademija, biomediMedi-cinos mokslai, medicina – 06B)

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkas

Prof. habil. dr. Rūta Marija Babarskienė (Lietuvos sveikatos mokslų uni-versitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Nariai:

Prof. dr. Edgaras Stankevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Prof. habil. dr. Valdimaras Janulis (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, farmacija – 08B) Prof. dr. Žaneta Petrulionienė (Vilniaus universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)

Doc. dr. Reinis Vilskersts (Latvijos organinės sintezės institutas, biome-dicinos mokslai, farmacija – 08B)

Disertacija bus ginama viešame biomedicinos mokslų srities medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2013 m. lapkričio 28 d. 13.00 val. Lietu-vos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto posėdžių salėje.

3

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY

Vygantas Barsys

EVALUATION OF BENZIMIDAZOLE AND

DIHYDROPYRIDINE EFFECTS ON

VASCULAR SEGMENTS AND PAPILLARY

MUSCLE ISOMETRIC FUNCTION

Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,

Medicine (06B)

4

Dissertation has been prepared at the Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during period of 2007–2011.

Scientific Consultant

Habil. Dr. Vida Garalienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Dissertation is defended extramurally.

Dissertation is defended at the Medical Research Council of Lithuanian University of Health Sciences.

Chairperson

Prof. Dr. Habil. Rūta Marija Babarskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Members:

Prof. Dr. Edgaras Stankevičius (Lithuanian University of Health Scien-ces, Medical Academy, Biomedical ScienScien-ces, Medicine – 06B)

Prof. Dr. Habil. Valdimaras Janulis (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B) Prof. Dr. Žaneta Petrulionienė (Vilnius University, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)

Assoc. Prof. Dr. Reinis Vilskersts (Latvian Institute of Organic Synthe-sis, Biomedical Sciences, Pharmacy – 08B)

Dissertation will be defended at the open session of the Medical Reasearch Council of Lithuanian University of Health Sciences at 1:00 p.m. on 28 November 2013 at the Symposium auditorium of the Institute of Cardiology of Lithuanian University of Health Sciences.

5

TURINYS

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 9

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10

2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS ... 11

3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

3.1. Ca2+ _{apykaita kardiomiocituose ... 12}

3.2. Kraujagyslių lygiųjų raumenų susitraukimo-atsipalaidavimo mechanizmai ... 14

3.2.1. Įtampos valdomi L-tipo Ca2+ _{jonų kanalai ... 15}

3.2.2. Didelio pralaidumo Ca2+ _{jonų aktyvuojami K}+ _{jonų kanalai ... 16}

3.3. Kraujagyslių lygiųjų raumenų sarkoplazminio/endoplazminio tinklo ryanodino ir inozitoltrifosfato receptoriai ... 17

3.4. Endotelio išskiriami atpalaiduojantys faktoriai ... 20

3.4.1. Azoto oksidas (NO) ... 20

3.4.2. Endotelio išskiriamo hyperpoliarizuojančio faktorius ... 21

3.4.3. Mažo/vidutinio pralaidumo Ca2+_{aktyvuojami K+ kanalai ... 21}

3.5. Kalcio kanalų antagonistai ... 23

3.5.1. 1,4-dihidropiridino junginiai ... 23

3.5.2. Fermento fosfodiesterazės inhibitoriai (PDE) – Benzimidazolo junginiai . 24 4. DARBO OBJEKTAS IR METODIKOS ... 26

4.1. Tiriamųjų junginių inotropinio aktyvumo nustatymas ... 27

4.2. Kalio kanalų (IKIR, KATP ir IKr) blokatorių poveikis tiriamųjų junginių aktyvumui ... 28

4.3. Jūrų kiaulyčių ir žmogaus kraujagyslių preparatų susitraukimo ir atsipalaidavimo procesų dinamika veikiant tinamosioms medžiagoms ... 28

5. TYRIMŲ REZULTATAI ... 30

5.1. Jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų inotropinio poveikio ir veikimo potencialo trukmės priklausomybė nuo tiriamųjų junginių cheminės struktūros ... 30

5.1.1. 1,4-dihidropiridino junginiai ... 30

5.1.2. Benzimidazolo junginių poveikis jūrų kiaulyčių kairiojo prieširdžio susitraukimo jėgai ir transmembraninio veikimo potencialo trukmei ... 32

5.1.3. Atrinktų junginių poveikis jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veikimo potencialo trukmei ... 36

5.1.4. Glibenklamido, dl-sotalolo ir BaCl2 įtaka dihidropridino OSI-9719 jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veikimo potencialo trukmei ... 38

6

5.2. Benzimidazolų ir dihidropiridinų poveikio įvertinimas a. thoracica interna ir

v. saphena magna segmentų atsipalaidavimui ... 41

5.2.1. Ca2+ _{kanalų antagonistų poveikis žmogaus venos (v. saphena magna)} segmentų atsipalaidavimui ... 41

5.2.2. Junginių, pasižyminčių teigiamomis inotropinėmis savybėmis, poveikis žmogaus venos (v. saphena magna) segmentų atsipalaidavimui ... 50

5.2.3. Prevencinis amlodipino, diltiazemo ir benzimidazolo darinio poveikis venos segmentų lygiųjų raumenų susitraukimui ... 57

5.3. Kalcio kanalų antagonistų ir kalcio kanalų agonistų poveikis žmogaus izoliuotos krūtininės arterijos (a. thoracica interna) segmentų susitraukimo – atsipalaidavimo dinamikai ... 63

5.3.1. Išorinio kalcio įtaka tiriamųjų junginių poveikiui izoliuotų krūtininės arterijos segmentų susitraukimui ir atsipalaidavimui ... 65

5.3.2. Prevencinis kalcio kanalų agonistų ir antagonistų poveikis izoliuotų krūtininės arterijos segmentų susitraukimui ... 68

6. REZULTATŲ APTARIMAS ... 72

IŠVADOS ... 81

LITERATŪRA ... 82

MOKSLINIAI STRAIPSNIAI ... 90

PRANEŠIMAI MOKSLINĖSE KONFERENCIJOSE ... 91

SUMMARY ... 92

7

SANTRUMPOS

a. thoracica interna – vidinė krūtinės arterija

v. saphena magna – didžioji poodinė vena

AC – adenilatciklazė

ACh – acetilcholinas

β-AR – beta adrenerginis receptorius

BKCa – didelio pralaidumo nuo Ca2+ priklausomi kalio jonų

kanalas [Ca2+_]

i – Ca2+ koncentracija ląstelės citoplazmoje

Cal M – kalmodulinas M

cAMP – ciklinis adenozin-3’, 5’-monofosfatas

cGMP – ciklinis guanozin-3’, 5’-monofosfatas

DAG – diacilglicerolis

Emaks. – maksimalus poveikis

EDRF – endotelio išskiriami atpalaiduojantys faktoriai EDHF – endotelio išskiriami hiperpoliarizuojantys faktoriai GPCR – su G baltymų besijungiantis receptorius

ICa, L – Ca2+ srovė, tekanti L tipo Ca2+ kanalais

IP3 – 1,4,5-inozitoltrifosfatas

IP3R – inozitoltrifosfato receptoriai

KV – įtampos valdomi uždelsto išlyginimo K+ srovių

kanalai

IKR – K+ srovės per KV kanalus greitoji komponentė

Kir – vidinio išlyginimo K+ srovės kanalai

IKir – kalio jonų srovė per Kir kanalus

KATF – ATF reguliuojami kalio jonų kanalai

IKATF – kalio jonų srovė per KATF kanalus

L-VDCC – įtampa valdomas L tipo kalcio jonų kanalas

M – muskarininis receptorius

mV – milivoltas

NO – azoto (II) oksidas

PDE – fosfodiesterazė

PIP2 – inozitolfosfatidil-4,5-difosfatas

PKA – baltymų kinazė A

PKC – baltymų kinazė C

PKG – baltymų kinazė G

Plb – fosfolambanas

SERCA – sarkoplazminio/ endoplazminio tinklo ATFazė

8

SKCa/ IKCa – mažo / vidutinio pralaidumo Ca2+ aktyvuojami K+

kanalai

SR/ER – sarkoplazminio/endoplazminio tinklas

RyR – ryanodino receptoriai

BKCa – didelio pralaidumo Ca2+ aktyvuojami K+ kanalai

9

ĮVADAS

Sisteminis kraujo spaudimas priklauso nuo kraujagyslių lygiųjų raumenų funkcinės būsenos: ilgalaikis kraujagyslių tonuso padidėjimas yra vienas svar-biausių veiksnių, sąlygojančių lėtinės hipertenzijos išsivystymą [27]. Krau-jagyslių sienelės tonusą sąlygoja krauKrau-jagyslių lygiųjų raumenų susitraukimas-atsipalaidavimas bei endotelio funkcinė būklė. Ilgalaikė lygiųjų raumenų depoliarizacija padidina L-tipo kalcio jonų kanalų atsidarymą ir kalcio jonų patekimą į ląstelės vidų, taip padidindami viduląstelinio Ca2+ _{koncentraciją ir}

sąlygodami kraujagyslių lygiųjų raumenų susitraukimą. Pastarųjų metų tyrimų rezultatai nurodo, kad kraujagyslių sienelės vidinį sluoksnį dengiantis endotelis atlieka vieną esminių kraujagyslių tonuso reguliatoriaus vaidmenį, išskirdamas kraujagysles atpalaiduojančius faktorius kaip azoto oksidas (NO), prostaciklinai (PGI2) bei endotelį hiperpoliarizuojančius faktorius (EDHF)

[89]. Endotelio funkcijos sutrikimai yra vienas iš ankstyviausių požymių, kuomet kinta kraujagyslių lygiųjų raumenų tonuso reguliacija, sutrinka vazokonstriktorių/vazodilatatorių pusiausvyra. Fiziologinėmis sąlygomis azoto oksido gamybą skatina mechaninis kraujo tekmės poveikis endoteliui bei mediatoriai (katecholaminai, acetilcholinas, histaminas, bradikininas). Hipertoninės ligos gydymui vartojami kalcio jonų kanalų blokatoriai (didhidropiridinai, verapamilis, diltiazemas), mažina širdies raumens susitraukimo jėgą ir išmetamo kraujo poveikį kraujagyslių endoteliui, todėl sumažėja azoto oksido sintezė endotelyje. Vaistų grupės, kurių veikimo mechanizmai yra susiję su endotelio bei kraujagyslių lygiųjų raumenų funkcijos homeostazės palaikymu yra reikšmingi širdies-kraujagyslių ligų gydymui ir prevencijai [39]. Pastebėta, kad pakitus kraujagyslių endotelio funkcijai, pakinta ir kraujagyslių atsakas kalcio antagonistams ir nitratams. Todėl manome, kad tikslinga atlikti tolimesnius kraujagysles atpalaiduo-jančių ir neturinčių poveikio inotropinei funkcijai junginių tyrinėjimus.

10

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

1,4-dihidropiridinų ir benzimidazolų poveikio įvertinimas jūros kiauly-čių širdies papiliarinių raumenų izometrinei funkcijai bei žmogaus krauja-gyslių segmentų susitraukimui ir atsipalaidavimui.

Darbo uždaviniai:

1. 1,4-dihidropiridinų ir benzimidazolų poveikio įvertinimas jūros kiaulyčių širdies papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veiki-mo potencialui;

2. 1,4-dihidropiridinų ir benzimidazolų poveikio įvertinimas žmogaus

v. saphena magna ir a. thoracica interna segmentų susitraukimui ir

atsipalaidavimui; 3. 3. Ekstraląstelinio Ca

2+ _{koncentracijos ir tiriamųjų junginių poveikio}

įvertinimas a. thoracica interna segmentų susitraukimui ir atsipa-laidavimui.

11

2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS

Kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelių ir kardiomiocitų kontraktilinė funkcija yra priklausoma nuo intraląstelinio kalcio jonų koncentracijos po-kyčių, kuriuos sąlygoja intraląsteliniai bei ekstraląsteliniai Ca2+ _šaltiniai.

Kalcio kanalų blokatoriai, blokuodami lėtuosius kalcio jonų L-tipo kanalus, reguliuoja [Ca2+]i. Dihidropiridino junginiai yra viena pagrindinių kalcio

blokatorių grupių, vartojamų kardiovaskulinių ligų gydymui.

Kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės susitraukimo-atsipalaidavimo procesuose aktyviai dalyvauja intraląsteliniai mediatoriai cAMP bei cGMP, atliekantys antrinių signalinių molekulių vaidmenį ir sąlygojantys intraląste-linio Ca2+ _{apykaitą bei patekimą prie ląstelės kontraktilinio aparato.}

Mes atlikome eksperimentinius tyrimus in vitro su jūros kiaulyčių širdies papiliariniais raumenimis ir aortos preparatais, įvertinant 1,4-dihidro-piridinų ir benzimidazolo junginių poveikį inotropinei funkcijai ir veikimo potencialo trukmei. Įvertinus 1,4-dihidropiridino junginių poveikį inotropi-nei funkcijai, atlikti tolimesni eksperimentiniai tyrimai su žmogaus vidinės krūtinės arterijos (a. thoracica interna) ir didžiosios poodinės venos (v.

sa-phena magna) segmentais, įvertinant neigiamomis ir teigiamomis

inotropi-nėmis savybėmis pasižyminčių 1,4-dihidropiridinų bei benzimidazolo jungi-nių poveikį žmogaus izoliuotų kraujagyslių segmentų susitraukimui ir atsi-palaidavimui. Eksperimentiniuose tyrimuose v. saphena magna ir a.

thora-cica interna segmentai buvo gauti atliekant širdies vainikinių arterijų

jung-čių suformavimo operacijas ir leido įvertinti pacientų kraujagyslių segmentų atsaką į kalcio kanalų blokatorių, benzimidazolo junginių ir cholinomime-tikų poveikį in vitro sąlygomis.

12

3. LITERATŪROS APŽVALGA

3.1. Ca2+ _{apykaita kardiomiocituose}

Miokardo elektromechaninis ryšys (angl. Cardiac

excitation-contrac-tion coupling) yra apibrėžiamas kaip procesas nuo kardiomiocitų elektrinio

sujaudinimo iki mechaninio širdies raumens susitraukimo, kurio pasekoje kraujas išmetamas į kraujotakos sistemą [10]. Kalcio jonai (Ca2+_{) atlieka}

elektrinio signalo perdavėjo ir tiesioginio miokardo ląstelių aktyvatoriaus vaidmenį širdyje. Kalcio jonai patenka į miokardo ląsteles per įtampos val-domus Ca2+ _{kanalus (angl. VDCC-Voltage-dependent Ca}2+ _{channels), taip}

suformuodami kalcio jonų srovę ICa, kuri sutampa su kardiomiocitų veikimo

potencialo (VP) plato faze. Nustatyti įtampos valdomų L-tipo ir T-tipo Ca2+ kanalai, tačiau T-tipo kanalų vaidmuo kardiomiocituose yra nereikšmingas [77]. Pagrindinis Ca2+ _{judėjimas į kardiomiocitus vyksta per L–tipo Ca}2+

kanalus (angl. Long Lasting), kurie atsidaro esant sarkolemos depoliarizaci-jai. Svarbus vaidmuo tenka ir Ca2+ _{elektrocheminiam gradientui, kuris}

sąly-goja Ca2+ _{judėjimą į kardiomiocitus. L-tipo Ca}2+ _{kanalai yra jautrūs}

1,4-di-hidropiridino dariniams ir literatūroje dažnai vadinami dihidropiridinų re-ceptoriais (DHPR). Miokardo L-tipo Ca2+ _{kanalus sudaro keturi}

polipepti-diniai subvienetai: α1; β; α2/δ, suformuojantys heterotetramerinį kompleksą.

Kalcio jonai, patekę per L-tipo Ca2+ kanalus, aktyvuoja sarkoplazminio tink-lo (ST) ryanodino receptorius (RyR), kurie inicijuoja Ca2+ _{jonų išmetimą iš}

sarkoplazminio tinklo, taip vadinamus Ca2+ _{pliūpsnius. Kalcio jonai jungiasi}

prie kontraktilinių baltymų, konkrečiai troponino C. Viduląstelinė kalcio jonų koncentracija [Ca2+]i sąlygoja kalcio jonų patekimą prie kontraktilinių

baltymų bei širdies raumens susitraukimą. Ca2+ _{pliūpsniai iš sarkoplazminio}

tinklo vadinami kaip kalcio inicijuotas Ca2+ _{jonų išsiskyrimas (angl. CICR,}

calcium-induced calcium release). Padidėjusi viduląstelinio Ca2+

koncent-racija inaktyvuoja L-tipo kanalus, sumažinandama kalcio jonų patekimą bei ICa, ir taipapsaugodama nuo viduląstelinio kalcio jonų pertekliaus [97]. Ca2+

jonų išmetimas iš ST, tuo pat metu, ~50 proc. sumažina išorinio kalcio jonų patekimą tekant ICa [88]. Tarp Ca2+ išmetimo iš ST ir ICa srovės (L-tipo

kanalai) egzistuoja neigiamas lokalus grįžtamasis ryšys. Ca2+ _{apykaita kardiomiocituose vyksta:}

• Na+_/Ca2+ _{mainų sistema, keičianti 3 Na}+ _{jonus į 1 Ca}2+ _{joną ir}

pasižyminti abipusėmis jonų grąžinimo savybėmis; Ca2+ pašalini-mui naudojama dėl Na+ _{elektrocheminio gradiento susidaranti}

ener-gija, t. y. susilyginus Na+ _{gradientams abipus membranos,}

13

Na+_/Ca2+ _{mainų sistemai būdinga abipusė I}

Na/Ca srovė: padidėjusi [Ca2+]i

sąlygoja į ląstelės vidų nukreiptą srovę (angl. inward INa/Ca) ir kalcio jonų

išmetimą iš sarkoplazmos. Padidėjus [Na+_]

i ir esant teigiamam membranos

potencialui, vyrauja į miokardo ląstelės išorę nukreipta srovė (angl. outward

INa/Ca) [29]. ENa/Ca yra kintantis procesas dėl besikeičiančio [Ca2+]i

Fiziolo-ginėmis sąlygomis Na+/Ca2+ mainų sistema veikia pagrindinai Ca2+ šalinimo kryptimi, tačiau esant teigiamam membranos potencialui EM (esant VP plato

fazei), Ca2+ _{pašalinimas sumažėja.}

• SR/ER Ca2+ _{– ATPazė (angl. SERCA) perneša Ca}2+ _{jonus į}

sarko-plazminio tinklo vidų, naudojant ATF energiją. Padidėjęs kalcio jonų kiekis sarkoplazminiame tinkle [Ca2+_]

SR, kartu padidina RyR

atsidarymo galimybę bei kalcio jonų išmetimo galimybę į citozolį [8]. SR užkrovimas kalcio jonais gali būti reguliuojamas padidė-jusiu Ca2+ jonų patekimu, sumažėjusiu išmetimu arba sustiprintu grąžinimu į SR. Svarbus vaidmuo tenka fosfolambanui (angl. Plb), endogeniniam SR Ca2+ _{– ATFazės inhibitoriui. Fosfolambano}

fos-forilinimas nuo cAMP ar kalmodulino priklausomomis protein-kinazėmis (PKA ar CaMKII), susilpnina inhibuojantį fosfolambano poveikį SERCA sistemai, tuo būdu padidindamas [Ca2+_]

i

citozo-lyje.

• Citozolyje esančio [Ca2+]i reguliuoja Ca2+ – ATPazės sistema, kuri perneša Ca2+ _{per plazminę membraną į kardiomiocito išorę iš}

14

3.1 pav. Ca2+ _{jonų transportavimas į kardiomiocitus}

NCX-Na+_{– Ca}2+ _{mainai; I}

Ca – kalcio jonų srovė; [Ca2+]i – kalcio koncentracija;

RyR – rianodino receptoriaus valdomas kanalas; PLB – fosfolambanas; VDCC – kalcio jonų kanalas; SR – sarkoplazminis retikuliumas; ATP – ATFazė

[Modifikuota pagal Bers, 2002] 3.2. Kraujagyslių lygiųjų raumenų susitraukimo-atsipalaidavimo mechanizmai

Nuolatinis kraujagyslių tonuso padidėjimas yra vienas svarbiausių veiksnių, sąlygojančių sisteminės hipertenzijos išsivystymą [27]. Fiziolo-ginėmis sąlygomis sisteminis kraujospūdis priklauso nuo kraujagyslių rezis-tentiškumo (tonuso), kurį sąlygoja kraujagyslių lygiųjų raumenų susitrauki-mas-atsipalaidavimas bei šias savybes reguliuojantis endotelis. Lygiųjų rau-menų susitraukimas vyksta didėjant kalcio jonų koncentracijai [Ca2+_]

i

krau-jagysliųlygiuosiuose raumenyse, kur besiformuojantis Ca2+ _{– kalmodulino}

kompleksas, aktyvuoja miozino lengvųjų grandinių kinazę (MLCK), kuri katalizuoja miozino fosforilinimą, pernešdama neorganinį fosfatą nuo adenozintrifosfato molekulės (ATF) prie miozino lengvųjų grandinių. Fos-forilintas miozinas sąveikauja su aktinu, formuojasi skersinių tiltelių ciklas ir vyksta lygiųjų raumenų susitraukimas (vazokontstrikcija). Sumažėjusi [Ca2+_]

i sąlygoja miozino lengvųjų grandinių kinazės (MLCK) slopinimą,

vyksta miozino defosforilinimas dėl fosfatazių poveikio. [Ca2+_]

sarkoplaz-15

moje sumažėja dėl: 1) Ca2+ _{grąžinimo į sarkoplazminį tinklą, veikiant kalcio}

jonų siurbliui; 2) Ca2+ pernešimo į ląstelės išorę prieš koncentracijos gra-dientą; 3) Na+ _{– Ca}2+ _{priešinio pernešimo, kurio metu 3 Na}+ _{judėdami pagal}

koncentracijos gradientą, sukelia vieno Ca2+ _{pernešimą iš ląstelės [52].}

Kraujagyslių lygiųjų raumenų susitraukimo-atsipalaidavimo reguliacija vyksta glaudžioje miocitų ir endotelio tarpusavio sąveikoje, kintant [Ca2+]i:

dėl bendro [Ca2+_]

i ir kontraktilinių baltymų jautrumo padidėjimo kalcio

jonams miocituose; dėl padidėjusios endotelio [Ca2+_]

i sąlygotos lygiųjų

raumenų sarkolemos hyperpoliarizacijos [65].

Pagrindinis viduląstelinio kalcio jonų patekimas į lygiuosius raumenis vyksta per selektyvius įtampos valdomus Ca2+ _{kanalus (angl. Voltage–}

dependent Ca2+ _{channels, VDCC), taip reguliuojantis viduląstelinio [Ca}2+_]

i.

Lygiųjų raumenų membranos potencialo pokyčiai sąlygoja kanalo funkcinę būseną: kanalas yra atviras esant depoliarizuotai membranai, ir uždaras esant membranos hyperpoliarizacijai. Sarkolemos membraninio potencialo pokyčius vyksta dėl jonų apykaitos per: 1) K+ ir Cl– jonų kanalus; 2) didelio pralaidumo Ca2+ _{jonų aktyvuoti K}+ _{jonų kanalus (angl. large-conductance}

Ca2+ – activated K+ channels, BK).

3.2.1. Įtampos valdomi L-tipo Ca2+ jonų kanalai

Tarpląstelinė [Ca2+_]

i koncentracija yra 10–3 mol/l, tuo tarpu

viduląste-linė koncentracija yra palaikoma žemiau 10–7 _{mol/ L. Tarpląstelinio kalcio}

Ca2+ patekimas į miocito vidų yra valdomas per įtampos valdomus L–tipo Ca2+ _kanalus.

Kraujgyslėse nustatyti L-tipo ir T-tipo Ca2+ _{kanalai, dalyvaujantys}

sig-nalo perdavime, tačiau vyrauja L-VDCC kanalai, per kuriuos tarpląstelinis Ca2+ patenka į miocitus [101]. T-tipo Ca2+ kanalų vaidmuo kraujagyslėse dar nėra tiksliai apibrėžtas ir yra toliau tyrinėjamas. L-tipo Ca2+ _{kanalas yra}

sudarytas iš keturių subvienetų: α1; β; α2/δ, kurie suformuoja

heterotetra-merinį kompleksą; α1 formuoja selektyvų Ca2+ kanalą, užtikrinantį kalcio

jonų judėjimą į ląstelės vidų depoliarizacijos metu. α1 subvienetas turi

spe-cifines vietas, prie kurių jungiasi kanalo 1,4-dihidropiridinai ir benzotia-zepinai, blokuojantys kanalo atsidarymą [100]. L-tipo Ca2+ kanalai pasižymi dideliu jautrumu dihidropiridinams bei sąlyginai lėta inaktyvacija [109]. Kanalui būdinga sąlyginai ilgas atsidarymo laikas bei plati membranos potencialo aktyvacijos riba, nuo –44 mV iki +10–20 mV, kurią pasiekus vyksta membranos depoliarizacija ir kanalo atsidarymas [10]: pradžioje vyksta dažni bei trumpalaikiai, o vėliau sekantys yra retesni bei ilgiau trun-kantys. Kanalas užsidaro esant hyperpoliarizuotai membranai, t. y. inakty-vuojamas priklausomai nuo membranos potencialo reišmės [115]. Tuo tarpu

16

T-tipo kanalams būdingas trumpesnis atsidarymo laikas bei aktyvacijos ribos: nuo –70 mV iki –30 mV bei trumpas inaktyvacijos laikas [83].

3.2.2. Didelio pralaidumo Ca2+ _{jonų aktyvuojami K}+ _{jonų kanalai} Lygiųjų raumenų membranoje lokalizuoti didelio pralaidumo Ca2+ _jonų

aktyvuojami K+ _{jonų kanalai (angl. large-conductance Ca}2+ _{– activated K}+

channels, BKCa) yra sudaryti iš 4α ir 4β subvienetų esantys. BKCa kanalai

reguliuoja L-tipo Ca2+ _{kanalo funkcinę būseną: atviras/uždaras, kuri}

priklau-so nuo sarkolemos poliarizacijos. Kanalas yra aktyvuojamas dėl padidėjusio [Ca2+]i sarkoplazmoje, kuris inicijuoja Ca2+ pliūpsnius iš SR, paradoksaliai

aktyvuojančius BKCa kanalą, kuomet per atvirą kanalą judėdami kalio jonai

sukelia membranos hyperpoliarizaciją. Pasikeitus sarkolemos membrani-niam potencialui, L-tipo Ca2+ kanalai yra uždaromi ir Ca2+ nepatenka į mio-cito vidų [47]. BKCa gali būti aktyvuojami membranos potencialo bei [Ca2+]i

pokyčių sarkoplazmoje nepriklausomai vienas nuo kito, tačiau BKCa

akty-vaciją dažniau lemia būtent [Ca2+_]

i pokytis [75]. Nustatyta, kad kanalas

inaktyvuojamas kai potencialo reikšmė pasiekia –40 iki –50 mV. Esant žemai kalcio jonų koncentracijai, BKCa veikia kaip membranos potencialo

valdomas K+ _{kanalas, tačiau kalcio jonų koncentracijos kitimai}

sarkoplaz-moje „perjungia” BKCa parametrų reikšmes link neigiamų potencialo

reikš-mių ir leidžia kanalui funkcionuoti žemiau fiziologinio intervalo [17]. Nustatyta, kad BKCa jautrumą [Ca2+]i nulemia α subvienetai, o β1

subviene-tai, atrodo, yra atsakingi už fiziologinį Ca signalo perdavimą kraujagyslių tonuso reguliacijai [67]. BKCa kanalai gali būti veikiami sąlyginai aukšto

kalcio jonų kiekio, nes jų lokalizacija sarkolemoje yra labai arti Ca2+

„išmetimo“ vietų iš sarkoplazminio tinklo [85]. BKCa kanalo fosforilinimas

kinazėmis PKA, PKG-I, leidžia moduliuoti kanalo jautrumo priklausomybę nuo [Ca2+_]

i ir potencialo pokyčių [6]. Daugeliu atvejų PKA ir PKG-I

aktyvuoja BKCa kanalą padidindamos kanalo atsidarymo tikimybę ir

„perjungdamos“ nuo potencialo priklausomą kreivę neigiamų reikšmių link [76]. PKA ir PKG-I gali netiesiogiai aktyvuoti BKCa kanalą fosforilindamos

fosfolambaną (Plb), kuris padidina SR užkrovimą Ca2+, _{kartu padidindamas}

Ca „pliūpsnių“ dažnį ir amplitudę [115]. Proteino kinazė C (PKC) inhibuoja BKCa kanalus lygiuosiuose raumenyse, juos fosforilindama [103].

17

3.2 pav. Didelio pralaidumo Ca2+ _{jonų aktyvuojami K}+ _{jonų kanalo BK} Ca,

struktūra

KCa1.1 α subvieneto, sudaryto iš 6 transmembraninių domenų, ir sąsaja su β subvieneto,

sudaryto iš 2 transmembraninių domenų. c-terminalė, turinti hidrofobinius 7–10 segmentus, dar vadinamas „Ca2+ _{rutuliu”, atpažįstantis Ca}2+ _{jonų prisijungimą prie hidrofobinių}

7 ir 8 segmentų [Modifikuota pagal Grgic ir kt., 2009]

3.3. Kraujagyslių lygiųjų raumenų sarkoplazminio/endoplazminio tinklo ryanodino ir inozitoltrifosfato receptoriai

Trumpalaikiai Ca2+ _{jonų „pliūpsniai“ yra apibrėžiami kaip griežtai}

loka-lizuotas taškas ląstelės vidinėje erdvėje (apie 1 proc. tūrio), kur viduląs-telinio Ca2+ _{padidėja iki 10–100 µM ir šis [Ca}2+_]

i pokytis gali moduliuoti

procesus, nepriklausančius nuo viduląstelinio [Ca2+_]

i [49]. Būtent šiuos Ca2+

„pliūpsnius“ sąlygoja sarkoplazminio/endoplazminio tinklo (SR/ER) ryano-dino (RyR) ir inozitoltrifosfato (IP3R) receptoriai. Kraujagyslių lygiųjų

raumenų sarkoplazminio tinkle vyrauja (IP3R).

Esminis vaidmuo tenka G-baltymo (GPCR) receptorių šeimai, kuriai, pavyzdžiui priklauso adrenoreceptoriai, M-acetilcholininiai, dopamininiai receptoriai. G-baltymas yra sudarytas iš trijų subvienetų: α , β ir γ; guanidinas sąveikauja su α, katalizuoj ančiu GDP susidarymą iš GTP; β ir γ subvienetai suformuoja βγ kompleksą. Pagrindiniai GPCR taikiniai, per kuriuos reguliuojamos įvairios ląstelės funkcijos yra: 1) adenilatciklazė, fermentas atsakingas už cAMP susidarymą; 2) fosfolipazė C (PLC), fermentas atsakingas už inozitolio 1,4,5-trifosfatas (IP3) ir diacilglicerolio

(DAG) susidarymą; 3) Ca2+ _{ir K}+ _{jonų kanalai. Šiuo atveju aptarsime}

fosfolipazės C generuojamo tarpinio signalo pernešėjo IP3 susiformavimą ir

18

fermentui fosfolipazei β (PLC β). Prie Gφ/11 – baltymo subvieneto

prisijungus receptoriaus agonistui (pvz.fenilefrinui), veikiant PLC β iš PIP2

susidaro tarpinis signalo pernešėjas inositolio 1,4,5-trifosfatas (IP3), kuris

sąveikauja su sarkoplazminio tinklo IP3R ir inicijuoja intraląstelinio Ca2+

išsiskyrimą iš endoplazminio tinklo (ER – endotelyje) bei sarkoplazminio tinklo (SR – lygiuosiuose raumenyse). IP3R yra tetrametrinės struktūros

kanalai, suformuojantys Ca2+ _{joninį kanalą, pro kurį Ca}2+ _{„pliūpsniai“ yra}

išmetami iš endoplazminio (sarkoplazminio) tinklo, taip padidinantis Ca2+

koncentraciją sarkoplazmoje. [Ca2+_]

i pokyčiai lygiuosiuose raumenyse reguliuoja IP3R aktyvumą: (i)

tiesiogiai kalcio jonams prisijungiant prie IP3R aktyvavimo ar slopinimo

srities; (ii) netiesiogiai, moduliuojant IP3 prisijungimą prie IP3R [69]. Savo

ruožtu [Ca2+_]

i svyravimai citozolyje gali aktyvuoti arba inhibuoti IP3R

receptorius: žema [Ca2+_]

i <300 nM koncentracija citozolyje aktyvuoja IP3R

ir išsiskyręs kalcis inicijuoja Ca2+ _{jonų išsiskyrimą (CICR, calcium–induced}

calcium release); ir priešingai aukšta [Ca2+_]

i >300 nM koncentracija

citozolyje – inhibuoja IP3R receptorius, sumažindama Ca išmetimą iš

intra-ląstelinių Ca atsargų [41]. ATF kiekis nėra būtinas inicijuoti IP3R, tačiau

padidina receptorių jautrumą IP3 ir Ca2+ kanalo aktyvumą [42]. Proteino

kinazės PKA ir PKC tiesiogiai dalyvauja nuo IP3R priklausomoje Ca2+

išskyrimo iš SR reguliacijoje, fosforilinant IP3R kanalus, ir netiesiogiai,

reguliuodami IP3 susidarymą bei prisijungimą prie IP3R.

IP3R aktyvacija stimuliuoja lygiųjų raumenų membranos BKCa kanalus,

padidindama BKCa jautrumą [Ca2+]i bei jų atsidarymą. Sąveika tarp IP3R ir

BKCa vyksta per kaveoles: plazminės membranos sritis, suformuojanti

įdubi-mą tarp membranos ir SR. IP3R receptorių sąveika su BKCa sąlygoja [Ca2+]i

koncentracijos sumažėjimą lygiuosiuose raumenyse ir jų vazodilatciją (3.3 pav. B)

IP3R aktyvacija stimuliuoja trumpalaikių membranos joninių kanalų

TRPC 3 (angl. transient receptor potential channel) aktyvumą, kurios pase-koje indukuojama ICa, depoliarizuojasi lygiųjų raumenų membrana ir

19

3.3 pav. IP3R receptorių sąveika su kraujagyslių lygiųjų raumenų

membranos joniniais kanalais

Artima erdvėskyra (atstumas tarp dviejų membranų apytikriai ~20–25 nm) tarp SR ir plazminės membranos (PM) kaveolės; A. IP3R receptorių ir TRPC kanalo

sąveika; B. IP3R receptorių ir BKCa kanalo sąveika

20

3.4. Endotelio išskiriami atpalaiduojantys faktoriai

Endotelio išskiriami atpalaiduojantys faktoriai (angl.

Endothelium–deri-ved relaxing factors, EDRF): NO, PGI2 bei EDHF reguliuoja kraujagyslių

tonusą. [Ca2+_]

i kraujagysliųlygiuosiuose raumenyse ir endotelyje lemia

skir-tingus efektus: didėjant [Ca2+_]

i, koncentracijai, lygieji raumenys susitraukia

(vazokontstrikcija). Ir priešingai, padidėjusi [Ca2+]i endotelyje sąlygoja

ly-giųjų raumenų atsipalaidavimo faktorių: azoto oksido (NO), prostaciklino PGI2 bei endotelio išskiriamo hyperpoliarizuojančio faktoriaus EDHF (angl.

Endothelium-derived hyperpolarizing factor) išsiskyrimą bei lygiųjų

rau-menų atsipalaidavimą [65]. Endotelis inicijuoja lygiųjų raurau-menų atsipa-laidavimą, sukeldamas membranos hiperpoliarizaciją, vykstant šiems pro-cesams:

• neigiamas krūvis lygiesiems raumenims perduodamas per mio–endo-telinę jungtį, sukeldamas lygiųjų raumenų hiperpoliarizaciją[45]; • paradoksalus viduląstelinio K+ judėjimas iš išorę: dėl vidinės K+

išlyginamosios srovės per Kir kanalus, padidėja ekstraląstelinio K+

koncentracija, taip vadinamas K+ _{debesis, kuris sąlygoja paradoksalų}

intraląstelinio K+ jonųjudėjimą į ląstelės išorę [24];

• vazodilatacinėmis savybėmis pasižymintys endotelio išskiriamų atpalaiduojančių faktorių – EDRF (angl. Endothelium–derived

rela-xing factors) sistema, kuriai priklauso azoto oksidas (NO),

prostacik-linas (PGI2) ir endotelio išskiriamas hiperpoliarizuojantis faktorius –

EDHF (angl. Endothelium-derived hyperpolarizing factor). EDHF yra nepriklausomas nuo NO ir PGI2 faktorius, kuris glaudžiai

sąvei-kauja su endotelio mažo/vidutinio pralaidumo Ca aktyvuojami K+ kanalais, SK/ IK (angl. small/intermediate-conductance Ca2+

–acti-vated K+ _channels).

3.4.1. Azoto oksidas (NO)

Azoto oksidas (NO) yra endotelio išskiriamas kraujagyslių lygiuosius raumenis atpalaiduojantis faktorius. NO yra sintezuojamas endotelio ląstelė-se iš amino rūgšties L-arginino, veikiant fermentui azoto oksido sintazei (eNOS) ir dalyvaujant molekuliniam deguoniui. NO aktyvuoja fermentą guanilatciklazę (GC), kuri sąlygoja cGMP susidarymą iš ATP; cGMP akty-vuoja proteinkinazę G (PKG). Azoto oksidas pasižymi stipriu lipofiliškumu, jis greitai prasiskverbia į kraujagyslių lygiųjų raumenų ląsteles ir sukelia jų atsipalaidavimą. Fiziologinėmis sąlygomis azoto oksido gamybą skatina mechaninis poveikis kraujagyslės sienelei (išmetamo kraujo kiekis) bei vidi-niai mediatoriai (katecholaminai, acetilcholinas, histaminas, bradikininas).

21

3.4.2. Endotelio išskiriamo hyperpoliarizuojančio faktorius

Endotelio išskiriamo hyperpoliarizuojančio faktorius (angl.

Endothe-lium-derived hyperpolarizing factor, EDHF) inicijuoja kraujagyslių lygiųjų

raumenų atsipalaidavimą nuosekliai vykstant šiems procesams: i) Ca2+

patekimas į endotelio ląsteles per trumpalaikius receptorinius potencialo valdomus kanalus (TRPC1, TRPC3, TRPC4, TRPV4), ii) padidėjusi [Ca2+]i

endotelyje, aktyvuoja mažo/vidutinio pralaidumo Ca aktyvuojami K+

kana-lus, SK/IK.

EDHF inicijuota membranos lygiųjų raumenų hyperpoliarizacija paaiš-kinama remiantis „mio-endotelinė hipoteze, teigianti, kad jungtis tiesioginiu elektriniu ryšiu susieja lygiuosius raumenis ir endotelį, taip perduodant neigiamą krūvį lygiesiems raumenims. Tačiau ši hipotezė nepaaiškina lygių-jų raumenų atsipalaidavimą visose kraujagyslėse, todėl laikomasi nuomo-nės, kad EDHF gali būti „tirpus, difunduojantis faktorius“ [25].

BKCa dažniausiai inicijuoja lygiųjų raumenų hiperpoliarizaciją [96].

Taip pat tikėtina, kad KCa sukeliama lygiųjų raumenų hiperpoliarizacija ir po

to sekantis atsipalaidavimas, vyksta ir dėl K+ _{koncentracijos padidėjimo}

tarpląsteliniame tarpe, kuris savo ruožtu aktyvuoja Kir kanalus arba Na+/K+

ATFazės siurblį, dėl to keičiasi membranos poliarizacija [119].

3.4.3. Mažo/vidutinio pralaidumo Ca2+_{aktyvuojami K+ kanalai} Mažo/vidutinio pralaidumo Ca2+ _{aktyvuojami K+ kanalai (angl. small/}

intermediate-conductance Ca2+ _{– activated K+ channels, SK}

Ca/ IKCa)

apibū-dinami kaip mažo vienetinio 5–10 pS pralaidumo kanalai, kuriai priklauso KCa 2.1, KCa 2.2 ir KCa 2.3 pogrupiai, remiantis IUHAR [114] bei GRAC [4]

klasifikacija. Ketvirtasis grupės narys, KCa 3.1, [44] pasižymi 20–40 pS

22

3.4 pav. KCa3.1/ KCa2.1 kanalų topologija

Subvienetas, sudarytas iš 6 transmembraninių domenų (1–6),

ir poros kilpa tarp S5 ir S6, kur intraląstelinis Ca2+ _{jungiasi prie kalmodulino (CaM)}

[Modifikuota pagal Grgic ir kt., 2009]

Kanalas sudarytas iš 4 subvienetų, kurių kiekvienas sudarytas iš 6 trans-membraninių segmentų (S1–S6), su viduląsteliniu NH2 ir COOH

termina-lėmis, prie kurios karboksil-liekanos jungiasi Ca2+ – kalmodulinas. Kalmo-dulinas veikia kaip kanalą aktyvuojantis β-subvienetas [116].

Mažo/vidutinio pralaidumo K+ _{kanalai yra lokalizuoti kraujagyslių}

endo-telyje. Nepažeistų kraujagyslių lygiuosiuose raumenyse šių kanalų nėra (arba labai nedaug paplitę), tačiau besidauginančių ar sužalotų kraujagyslių ląstelėse, kanalų skaičius lygiuosiuose raumenyse ženkliai padidėja [61]. Šie endotelio kanalai padidina viduląstelinę Ca2+_{koncentraciją, sąlygodami}

endo-telio vazoaktyvių faktorių išsiskirimą. Manoma, kad SKCa kanalo atsidarymo

galimybės nepriklauso nuo membranos potencialo, tačiau yra siejamas su kalmodulino (CaM) jautrumu [Ca2+_]

i [59]. SKCa ir IKCa kanalai išsidėstę

skirtingose erdviniu požiūriu endotelio vietose. Agonistai, stimuliuojantys su GS baltymu susijusius receptorius (GPCR), padidina Ca2+ jonų koncentraciją

endotelyje, kuri savo ruožtu aktyvina SKCa ir IKCa kanalus: hyperpoliarizuotas

endotelis inicijuoja nuo endotelio priklausomą lygiųjų raumenų hyperpolia-rizaciją. Todėl KCa kanalai yra viena pagrindinių tarpinių grandžių,

perduo-dančių EDHF signalus lygiesiem raumenims, taip pat aktyvina Ca2+ _jautrų

23

3.5 pav. BKCa, SKCa ir IKCa kanalų topologija kraujagyslių sienelėje

[Modifikuota pagal Ledoux ir kt., 2006] 3.5. Kalcio kanalų antagonistai 3.5.1. 1,4-dihidropiridino junginiai

Skirtingų kalcio kanalų antagonistų grupių junginiai, priklausomai nuo cheminės molekulės struktūros, blokuoja L-VDCC kanalus (CaV 1.2)

nu-traukdami kalcio jonų (Ca2+) patekimą į ląstelės vidų, sąlygodami neigiamas inotropines ir kraujagysles atpalaiduojančias šių junginių savybes. Šiuo metu kalcio blokatoriai yra plačiai vartojami širdies-kraujagyslių ligų profilaktikai ir gydymui. Didžiausią selektyvumą kraujagyslių L-tipo kana-lams demonstruoja kalcio antagonistai – 1,4-dihidropiridino klasės junginiai (nifedipinas, amlodipinas) [109], lyginant juos su benzotiazepinais (pvz. Diltiazemu) bei fenilalkilaminais (pvz. verapamilis). Nustatyta, kad žmo-gaus v. saphena magna būdingas membranos ramybės potencialas siekia – 76,0±7 mV esant fiziologinei ekstraląstelinio K+ _{normai, ir pasiekia –64,7±7}

1,4-24

dihidropiridino junginiai, pvz., nifedipinas, kuriems yra jautrūs L-tipo kana-lai, farmakologinis blokuojantis L-tipo kanalus efektas vena saphena turėtų pasireikšti esant negatyvesnei potencialo Emaks reikšmei: nustatyta, kad

eksperimento sąlygomis nifedipinas maksimaliai atpalaiduoja v. saphena

magna esant 20 mM ekstraląstelinio K+ _{koncentracijai, kas depoliarizuoja}

Emaks. tik 4 mV nuo ramybės potencialo [28]. Todėl dihidropiridinų veikimas

gali būti siejamas su azoto oksido sintazės aktyvacija bei NO išlaisvinimu iš kraujagyslių endotelio [35].

Amlodipinas yra trečios kartos dihidropiridinų klasės kalcio anta-gonistas, pasižymintis ženkliu selektyvumu kraujagyslėms ir mažesniu nei nifedipinas neigiamu inotropiniu poveikiu [81]. Ilgas pašalinimo iš orga-nizmo pusperiodis ir žemas kintamumas iki pasiekiant koncentracijos mak-simumą plazmoje, įgalina gauti žymų terapinį efektą, vartojant jį tik kartą per dieną [123]. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad amlodipinas laipsniš-kai mažina kraujo spaudimą ir tuo pat metu nesukelia tachikardijos. Varto-jant profilaktiškai, amlodipinas apsaugo kardiomiocitus nuo išeminės kalcio perkrovos, susidarančios po reperfuzijos, o endotelį nuo išeminio paken-kimo [90]. Šis vaistas palyginti neblogai toleruojamas, ir jis neturi nepagei-daujamų efektų angliavandenių ir lipidų metabolizmui.

Tolimesni tyrimai patvirtino hipotezę, jog amlodipino teigiamas efek-tas, esant hipertenzijai ar širdies nepakankamumui, galėtų būti siejamas ne tik su kalcio jonų perkrovos sumažėjimu, bet ir su azoto oksido išlaisvinimu iš kraujagyslių endotelio [70]. Šie teiginiai buvo patvirtinti eksperimentuose su izoliuotomis smulkiomis miokardo kraujagyslėmis, stambiomis epikardo koronarinėmis arterijomis bei aorta. Tokių rezultatų nebuvo gauta tiriant ki-tų kalcio antagoniski-tų (nifedipinas ir diltiazemas) poveikį azoto oksido išlais-vinimui [106].

3.5.2. Fermento fosfodiesterazės inhibitoriai (PDE) – Benzimidazolo junginiai

Lygiųjų raumenų ląstelės atsipalaidavimo procese didelę reikšmę turi antrinių mediatorių cAMP ir cGMP kiekis ląstelėje. Daugelis aktyvių me-džiagų, sąveikoje su GS baltymu susijusiais receptoriais (GPCR), veikdami

fermento AC aktyvumą, sąlygoja cAMP kiekį ląstelėje. cAMP sintezuojasi iš ATP veikiant fermentui adenilciklazei (AC). Savo ruožtu, cGMP sintezuojasi iš ATP veikiant fermentui guanilciklazei (GC). Abu nukleotidai atlieka antrinių signalinių molekulių vaidmenį ląstelėje: cAMP aktyvina proteinkinazę A (PKA), cGMP aktyvina proteinkinazę G (PKG). PKA lygiuosiuose raumenyse fosforilina miozino lengvųjų grandinių kinazę (MLCK), ją inaktyvuodama, dėl ko lygieji raumenys atsipalaiduoja. cAMP

25

ir cGMP yra skaldomos veikiant fermentui fosfodiesterazei (PDE). Fosfo-diesterazės PDE-III formos inhibitoriai, didinantys cAMP koncentraciją miokarde bei kraujagyslių lygiuose raumenyse, sąlygoja teigiamą inotropinį veikimą bei kraujagyslių atsipalaidavimą.

Benzimidazolo darinių savybės, priklausomai nuo cheminės struktūros, pasižymi teigiamu inotropiniu aktyvumu: nuosekliai keičiant benzimidazolo žiedo struktūrą, ir keičiant radikalų padėtį žiede, junginiai prilygsta analo-giškam milrinono, PDE-III inhibitoriaus, aktyvumui. Benzimidazolo darinių teigiamas inotropinis poveikis miokarde yra susijęs su mechanizmais, pri-klausomais nuo cAMP, kurio didesnis kiekis susidaro dėl PDE-III slopinimo arba β-adrenoreceptorių receptorių stimuliavimo.

26

4. DARBO OBJEKTAS IR METODIKOS

Eksperimentiniai tyrimai atlikti su jūros kiaulyčių širdies papiliariniais raumenimis bei aortos 2–4 mm segmentais. Taip pat atlikti tyrimai su pacientų, kuriems buvo atliekamos širdies vainikinių arterijų jungčių suformavimo operacijos, a. thoracica interna ir v. saphena magna segmen-tais.

Jūros kiaulyčių izoliuotų papiliarinių raumenų paruošimas. Ši

proce-dūra buvo patvirtinta Lietuvos maisto ir veterinarijos tarnybos, kurio pagrin-du buvo išpagrin-duoti leidimai eksperimentinių gyvūnų naudojimui eksperimenti-niams tikslams (Leidimas išduotas 2005–10–29, Nr. 0139, Vilnius; asme-ninis leidimas, išduotas V. Garalienei 2007–12–07, Nr. B1–584, Vilnius). Gyvūnai buvo įsigyjami Lietuvos veterinarijos akademijos vivariume (Viva-riumo licenzijos Nr. B–76).

Jūrų kiaulytėms atlikta cerebralinė dislokacija pailgųjų smegenų srityje, atveriama krūtinės ląsta; išpreparuota širdis su aortos viršutine dalimi buvo patalpinama į deguonies prisotintą Tyrode tirpalą: NaCl – 144 mmol/l, KCl – 4 mmol/l, CaCl2 – 1,8 mmol/l, TrisCl – 10 mmol/l, MgCl2 – 1

mmol/l, gliukozės – 5 mmol/l, pH 7,3–7,4. Tirpalas prisotintas deguonimi, kurio pO2 siekė 560–580 mm Hg. Preparatai buvo patalpinami į 1 ml talpos

perfūzijos kamerą, kurio 37 °C temperatūra buvo palaikoma stabilizato-riumi VTS13 (Danija). Vienas preparato buvo stabilizuota laikiklyje, o kitas prie jėgos daviklio 6MX2B (Rusija). Preparatai buvo stimuliuojami 2 ms trukmės, 1,0 Hz dažnio impulsais, generuojamais stimuliatoriumi ES-50-1 (Rusija).

Lygiagrečiai izometriniam papiliarinių raumenų susitraukimui, stan-dartinės mikroelekrodinės technikos pagalba registravome transmembra-ninio veikimo potencialo trukmę (VPT). Mikroelektrodai buvo padaryti iš boro-silikatinio stiklo GC15F-10 (Harvardas) ir pripildyti 2,5 mol/l KCI tirpalu.

Duomenų registracija buvo atliekama po 60 min. trukusio kontrolinio periodo, kuomet papiliarinių raumenų susitraukimo jėga pasiekdavo pastovų dydį. Izometrinis širdies papiliarinių raumenų susitraukimo ir transmembra-ninio veikimo potencialo trukmės atsakas buvo apdorojami A/D keitikliu (Digidata 1200, Axon Instruments, JAV) ir registruoti kompiuteryje. Gauti rezultatai buvo analizuojami, apskaičiuojant maksimalią papiliarinių rau-menų susitraukimo jėgą bei VP trukmę esant 10 proc. (VP10), 25 proc.

27

Žmogaus kraujagyslių preparatų paruošimas. Žmogaus izoliuotų

krau-jagyslių preparatų tyrimams suteiktas Kauno regioninio bioetikos komiteto leidimas Nr. BE-2-64, išduotas 2010–11–05. Tyrimams panaudota 240 kraujagyslių segmentai, gauti iš 72 a. thoracica interna ir 168 v. saphena

magna preparatų. Kraujagyslių preparatai gauti iš 182 pacientų, kuriems

buvo atliekamos širdies vainikinių arterijų jungčių suformavimo operacijos LSMU ligoninės Kauno klinikos Kardiochirurgijos klinikoje.

Tyrimai atlikti naudojant Global Town Microtechnology (JAV) specia-lia vonelių sistema (tissue/organ bath systems), registruojančia kraujagyslių segmentų susitraukimo ir atsipalaidavimo procesus. Signalai buvo įrašomi ir analizuojami kompiuterio kietąjame diske, naudojant specializuotą programą. 3–4 mm pločio kraujagyslių segmentai buvo pakabinti ant strypelių, kurių vienas pritvirtintas stacionariai, o kitas – sujungtas su jėgos davikliu i-FOT10, registruojančiu segmento izometrinį susitraukimą/atsi-palaidavimą. Strypeliai buvo patalpinami į 5 ml talpos stiklinę vonelę, pripildytą Tyrode tirpalu (mmol/l): NaCl – 137, KCl – 5,4, CaCl2 – 1,8,

MgCl2 – 0,9, HCl –10, gliukozė 5; pH=7,4. Tirpalas eksperimento metu

buvo nuolatos perfuzuojamas 100 proc. deguonimi ir palaikoma 37°C temperatūra. Eksperimento metu Tyrode tirpalas buvo keičiamas kas 15 min. Tiriamieji kraujagyslių segmentai, po 60 min. kontrolinio periodo, buvo veikiami fenilefrino hidrochlorido 10–4 _{mol/L koncentracijos tirpalu ir}

pasiekus segmentų stabilų susitraukimą, pridedami tiriamieji junginiai, koncentracijomis nuo 10–7 _{iki 10}–4 _{M. Kraujagyslių segmentų izometrinio}

susitraukimo/atsipalaidavimo reikšmės buvo registruojamos kompiuteryje specializuota programa.

4.1. Tiriamųjų junginių inotropinio aktyvumo nustatymas

Izoliuoto papiliarinio raumens susitraukimui pasiekus pastovų dydį (po 60 min. perfuzijos deguonimi prisotintu fiziologiniu tirpalu) į perfuzuojamą kamerą buvo įpilamas atitinkamos koncentracijos (nuo 10–7 mol/l iki 10–4 mol/l) tiriamosios medžiagos tirpalas. Susitraukimo jėgos kitimas kiekybiš-kai buvo išreikštas santykiu P/Po, kur P – susitraukimo jėga, veikiant tiriamajai medžiagai nustatyta koncentracija, Po – susitraukimo jėga normos sąlygomis, išreikšta mg ir prilyginta 100 proc. Norėdami įvertinti junginių inotropinį efektyvumą, skaičiavome EC50 rodiklį, nurodantį tokią

tiriamo-sios medžiagos koncentraciją, kai pasiekiama 50 proc. stipriausio poveikio. Preparato perfuzija su nustatytos koncentracijos tiriamuoju junginiu truko ~20 min.

28

Veikimo potencialo trukmė, esant 10 proc., 25 proc., 50 proc. ir 90 proc. repoliarizacijai, buvo registruojama kartu su susitraukimo jėga ir išreikšta milisekundėmis (ms).

4.2. Kalio kanalų (IKIR, KATP ir IKr) blokatorių poveikis tiriamųjų junginių aktyvumui

Įeinamąją išlyginamąją kalio srovę (IKIR) blokavome selektyviu kanalų

blokatoriumi bario chloridu. Po 60 min. trukusio kontrolinio laikotarpio fiziologiniu Tyrode tirpalu, papiliarinius raumenis perfuzavome 3,1 µmol/l koncentracijos BaCl2 tirpalu. Susitraukimui ir VP trukmei pasiekus pastovų

dydį (~20 min.), pridedamas tiriamojo junginio tirpalas didėjančiomis nuo 10–7 _{mol/l iki 10}–4 _{mol/l koncentracijomis.}

Nuo adenozintrifosfato priklausomą kalio kanalas, (KATP), buvo

blo-kuojamas 10 µmol/l koncentracijos glibenklamidu.

Išlyginamosios kalio srovės greitąją komponentę (IKr) blokavome 1,0

µmol/l koncentracijos DL-sotalolu. Likusi procedūra buvo tokia pati kaip ir bario chlorido atveju.

4.3. Jūrų kiaulyčių ir žmogaus kraujagyslių preparatų susitraukimo ir atsipalaidavimo procesų dinamika veikiant tinamosioms medžiagoms

Po 45–60 min. trukusios perfuzijos fiziologiniu tirpalu, jūros kiaulyčių širdies papiliarinių raumenų bei aortos segmentų susitraukimas buvo suke-liamas fenilefrino 10–4 _{mol/l tirpalu. Susitraukimui pasiekus pastovų dydį,}

buvo pridedamas atitinkamos koncentracijos tiriamosios medžiagos tirpalus. Naudojome 10–6_–10–4 _{mol/l koncentracijos tiriamųjų junginių tirpalus.}

Panaudotos medžiagos

1,4-dihidropiridino junginiai susintetinti Rygos Organinės sintezės institute, Aizkraukles 21, LV-1006 Riga, Latvija. Koduotų tiriamųjų jungi-nių cheminė struktūra pateikta skyriuje Priedai.

Tiriamieji benzimidazolo junginiai susintetinti Vilniaus universiteto Chemijos katedroje.

Karbacholas, glibenklamidas, DL-sotalolas bei fenilefrinas buvo paga-minti Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Vokietija).

29 Duomenų statistinė analizė

Duomenys analizuoti naudojantis programų paketais: SPSS 17.0, „Excel 2003“.

Izoliuotų kraujagyslių segmentų susitraukimo–atsipalaidavimo dinami-kos rezultatai tiriamiesiems junginiams yra pateikti procentine išraiška, kaip X±mx, kur X – rezultatų vidurkis, proc; mx – standartinė vidurkio paklaida

(SE). Taip pat pirminiai duomenys, registruoti mV(milivoltais) buvo per-skaičiuoti į mg (miligramus), todėl naudota reikšmių tarpusavio priklau-somybės kalibracinė (standarto) kreivė (4.1 pav.). Pateikiame pavyzdį: ašių diskretiškumas 100 mV atitinkamai yra 400 mg.

4.1 pav. Grafinis priklausomybių santykis tarp mV ir mg

Mažų imčių (n<20), neparametrinių dydžių ar esant nenormaliąjam duomenų pasiskirstymui, vidurkių skirtumai buvo lyginami naudojant Mann-Whitney U testas. Proporcijų palyginimui skirtingose grupėse naudo-tas χ2 arba tikslusis Fisher‘io kriterijus. Dinaminė stebėsena ir gauti rezulta-tai lyginti vienfaktorinės ir dvifaktorinės dispersinės analizės metodais (Friedman). Koncentracijų skirtumai, esant skirtingiems koncentracijų titrams, vertinti naudojant neparametrinį Kruskall-Wallis.Visų tyrimų statis-tinių hipotezių tikrinimui naudotas reikšmingumo lygmuo – p<0,05.

30

5. TYRIMŲ REZULTATAI

5.1. Jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų inotropinio poveikio ir veikimo potencialo trukmės priklausomybė nuo tiriamųjų

junginių cheminės struktūros 5.1.1. 1,4-dihidropiridino junginiai

Eksperimentiniai tyrimai atlikti su 28 1,4-dihidropiridino junginiais, koncentracijomis nuo 10–7 _{mol/l iki 10}–4 _{mol/l, registruojant jūros kiaulyčių}

širdies papiliarinių raumenų izometrinį susitraukimą ir transmembraninio veikimo potencialo (VP) trukmę. Junginių cheminės struktūros pateiktos skyriuje Priedai.

Amlodipinas (kodas OSI-9787), didėjant koncentracijai, tolygiai mažino susitraukimo jėgą, kuri sumažėjo 60 proc., esant 10–4 _{mol/l. VP}

truk-mė trumpėjo nežymiai ir buvo išreikšta esant ankstyvai repoliarizacijai (VP10, 5,25 ms, 13,6 proc., p<0,05) (Priedai: 1 lentelė). Pakeitus amlodipino

amino grupės vandenilį benzensulfonatu, gaunamas junginys (OSI-9529, Norvasc) panašiu poveikiu kaip ir amlodipinas: susitraukimo jėga sumažėjo 64 proc. (10–4 _{mol/l), VP trukmė sutrumpėjo nereikšmingai. Analogiški}

duomenys gauti, kai vandenilis pakeistas acetilu (OSI-9527). Jam veikiant papiliarinių raumenų susitraukimas mažėja 63,4 proc., VP trukmė nekinta. Tuo tarpu kitas pakaitas, 2,5-dihidrobenzoatas (OSI-9587), sąlygoja 1,5 karto silpnesnį poveikį susitraukimo jėgai ir jokio VP trukmei. Tiriamųjų junginių efektyvumui reikšmingos įtakos turi cheminių grupių prigimtis fenilo žiede. Tai patvirtina rezultatai, gauti tiriant darinį OSI-9614, kurio struktūroje chloro atomas fenilo žiede pakeistas diflor-metoksi grupe, lyginant su OSI-9529 struktūra. OSI-9614 atveju neigiamas inotropinis poveikis yra didesnis, o VP trukmė reikšmingai mažėja esant 10 proc. ir 25 proc. repoliarizacijai (atitinkamai 35,7 ir 31,4 proc.). Pakeitus amino grupę amlodipino molekulėje etilenglikoliu (junginiai OSI-9730, OSI-9566, OSI-9586) ar daug sudėtingesne grupe – 2,2-dimetil-[1,3] dioxolan-4-ylmetoksimetil- (OSI-9600) bei papildomai prijungus chloro atomą fenilo žiede (OSI-9599), esminių inotropinio poveikio ir VP trukmės skirtumų neregistruota: susitraukimo jėga sumažėjo 49–53 proc., o VP trukmė kito nereikšmingai.

Kita junginių grupė, pagal cheminę struktūrą panaši amlodipino cheminei struktūrai, pasižymi erdvine izomerija: dešiniojo sukimo izomeras OSI-9674 mažomis koncentracijomis (10–7_–10–6 _{mol/l) silpnai didina}

papiliarinių raumenų susitraukimo jėgą, didesnėmis nežymiai (~10 proc.) mažina, o VP trukmė pailgėja atitinkamai 15,6 proc., 17,3 proc. ir 11,8

31

proc., esant 25 proc., 50 proc. ir 90 proc. repoliarizacijai. Tuo pat metu veikiant kairiojo sukimo izomerui OSI-9675 susitraukimo jėga mažėja 58 proc., o VP trukmė nekinta. Šių junginių mišinys OSI-9597 sąlygojo ženklų neigiamų inotropinių savybių pasireiškimą: susitraukimo jėga sumažėjo 70 proc., tačiau VP trukmė nekito, esant 10–4 _{mol/l koncentracijai. Analogiškus}

rezultatus gavome tirdami dešiniojo sukimo junginį OSI-9758: susitraukimo jėga didėjo (~22 proc.), esant 10–7_–10–6 _{mol/l koncentracijoms, 10}–5_–10–4

mol/l koncentracijos susitraukimo jėgą mažino vidutiniškai 37 proc.; VP trukmės pokyčiai buvo nereikšmingi. Kairiojo sukimo izomeras OSI-9757 (10–4 _{mol/l) mažina izometrinį susitraukimą iki 49 proc. VP trukmė kito}

nereikšmingai.

Sekanti tirtų 1,4–dihidropiridino junginių grupė skiriasi cheminių grupių tipu dihidropiridino bei fenilo žieduose. Junginys OSI-1212, dar žinomas cerebrokrasto vardu (CAS [118790–71–9]), antroje fenilo žiedo padėtyje turi diflormetoksi grupę, o dihidropiridino žiedo 3-je ir 5-je padėtyse – (propoksi) etoksikarbonilą. Toks struktūros pakeitimas sustiprina neigiamas inotropines savybes palyginus su amlodipinu, tuo tarpu abiejų junginių poveikis VP trukmei mažai tarpusavyje skiriasi. Tuo tarpu junginys OSI-3802, kurio cheminė struktūra skiriasi nuo OSI-1212 tuo, kad propoksi– radikalas pakeistas izopropoksi– radikalu, ženkliai siaurina VP potencialo trukmę (29,5, 25 bei 19,3 proc. atitinkamai VP25, VP50 ir VP90),

lygiagrečiai mažindamas susitraukimo jėgą iki 67,2 proc.

Kiti cheminės struktūros pakitimai, kuriuos atspindi junginiai OSI-9789, OSI-9879, OSI-9761 bei OSI-9843 sąlygojo silpnesnį neigiamą inotropinį poveikį ir VP trukmės didėjimą. Pvz., OSI-9761 plačiose kon-centracijų ribose papiliarinių raumenų susitraukimo jėgos nemažino, tačiau statistiškai reikšmingai (p<0,05) ilgino veikimo potencialo trukmę (23,6, 34,4, 35 ms atitinkamai esant 25, 50 ir 90 proc. repoliarizacijai).

Junginiai, turintys savo struktūroje – NO2 pakaitą 5-je

1,4-dihidropiri-dino žiedo padėtyje bei fenilo žiedo 2-je ir 4-je padėtyse triflormetilo (–CF3)

arba diflormetoksi (–OCF2) grupes, pasižymi tiek teigiamomis, tiek

neigiamomis intropinėmis savybėmis bei reikšmingu poveikiu VP trukmei. Papiliarinių raumenų izometrinis susitraukimas OSI-9961 poveikyje padidėja vidutiniškai 11,5 proc. nepriklausomai nuo koncentracijos. Tačiau junginys, kurio struktūroje nėra 6-metilo radikalo (OSI-4161) rodo neigiamą inotropinį poveikį ir didina VP trukmę, esant 90 proc. repoliarizacijai (22,0 ms ir 7,9 ms atitinkamai OSI-4161 ir OSI-9961 grupėse). Panašų poveikį registravome OSI-9963 grupėje: metilo radikalo nebuvimas 1,4– dihidropiridino žiede sąlygoja neigiamų inotropinių savybių atsiradimą ir statistiškai reikšmingą VP trukmės ilgėjimą, labiau išreikštą esant ankstyvai depoliarizacijai (VP10 ir VP25). Pakeitimas fenilo žiede 2-flormetoksi-

32

grupės triflormetilu– grupe OSI-9962 ir OSI-9961 junginiuose padidina teigiamą inotropinį efektą. Kiti tirti panašios struktūros junginiai OSI-9968 ir OSI-9719, kurie skiriasi cheminių grupių tipu ir jų padėtimi fenilo žiede (atitinkamai 4-triflormetil- ir 2-triflormetoksi-), pasižymėjo panašiu povei-kiu VP trukmei. Analizuojant OSI-4146 ir OSI-9719 efektyvumą, 2-propok-sietil- grupė sąlygoja VP trukmės ilgėjimą ir sustiprina teigiamą inotropinį poveikį. Pvz., VP trukmė OSI-9719 grupėje, esant 10–4 _{mol/l koncentracijai,}

VP10 padidėja 18,5; VP25 – 39,5, VP50 – 46 ir VP90 – 50 ms ir sutampa su

papiliarinių raumenų susitraukimo jėgos padidėjimu. Junginiai OSI-9962 (Bay K 8644) ir OSI-2456 (CGP 28392) pasižymėjo teigiamomis intropinė-mis savybėintropinė-mis ir reikšmingu poveikiu VP trukmei.

Atlikus eksperimentinius tyrimus su 1,4-dihidropiridino junginiais galima teigti:

1) dauguma 1,4-dihidropiridino junginių pasižymi neigiamomis ino-tropinėmis savybėmis ir nereikšmingu poveikiu VP trukmei. Jun-ginys OSI-9719 (2-propoksietil 4-(2-diflormetoksipenil)-2-metil-5-nitro-1,4-dihidropiridino-3-karboksilatas) statistiškai reikšmingai (p<0,05) platina VP trukmę, o pagal teigiamą inotropinį poveikį prilygsta kalcio kanalų agonistui OSI-9962 (Bay K 8644);

2) junginių efektyvumas priklauso nuo cheminių grupių prigimties fenilo ir 1,4-dihidropiridino žieduose, erdvinės izomerijos ir yra tie-siogiai proporcingas koncentracijoms;

3) papiliarinių raumenų susitraukimo jėga yra informatyvesnis rodik-lis nei veikimo potencialo trukmė, vertinant junginių poveikį papiliarinių raumenų inotropinei funkcijai.

5.1.2. Benzimidazolo junginių poveikis jūrų kiaulyčių kairiojo prieširdžio susitraukimo jėgai ir transmembraninio veikimo potencialo trukmei

5,6-dimetoksi/dietoksi-2-metiltiobenzimidazolai (5.1 pav.) pasižymi tei-giamu inotropiniu efektu jūros kiaulyčių papiliariniams raumenims (Gara-lienė, 2001). Benzimidazolo junginių teigiamas inotropinis poveikis priklau-so dėl padidėjusios antrinio signalizatoriaus cAMP koncentracijos ląstelės viduje, kurią sąlygoja dėl fermento fosfodiesterazės (PDE) slopinimas.

33

5.1 pav. 1-Acil-2-alkiltio-5,6-dialkoksi-benzimidazolai

Naujai sintetintų junginių struktūroje buvo keičiami radikalai 1-je ir 2-je benzimidazolo žiedo padėtyse. Tyrimams pasirinkti 1-acil-5,6-dietoksi-2-metiltiobenzimidazolo junginiai (5.2 pav.): 3-piridil- (1); 2-piridil- (2); 4-tiazolil- (3); 4-piridil- (4); metil- (5); 2-tienil- (6) ir 1-acetil-5,6-dimetoksi-2-metiltiobenzimidazolą (7). Pagal ankščiau atliktus tyrimus visi išvardyti junginiai, pasižymi ženkliai išreikštu teigiamu inotropiniu poveikiu, tai yra panašūs į milrinono veikimo mechanizmą.

Šiuo atveju tyrėme aukščiau išvardintų junginių poveikį jūros kiaulyčių kairiojo prieširdžio papiliarinių raumenų izometriniam susitraukimui, veiki-mo potencialo trukmei (VP90) ir aortos preparatų susitraukimui.

5.2 pav. 1-acil-5,6-dietoksi-2-metiltiobenzimidazolai

Papiliarinių raumenų susitraukimo jėga, cholinomimetiko karbacholo (1 µmol/l) poveikyje sumažėjo 63,2 proc., veikimo potencialo (VP90)

truk-mė – 49,6 proc. 1-acil-5,6-dietoksi-2-metiltiobenzimidazolo junginiai (Nr. 1– 6), koncentracijomis nuo 10 iki 500 µmol/l, reikšmingai silpnino karbacholo (1 µmol/l) poveikį papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai bei VP90 trukmei

(5.1 lentelė).

34

5.1 lentelė. 5,6-dimetoksi/dietoksi-2-metiltiobenzimidazolų poveikis jūros kiau-lyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veikimo potencialo trukmei

Junginys Koncentracija, mol/l Susitraukimo jėga, mg VPT90, ms

Karbacholas Kontrolė (n=4) Junginys Nr. 1 1×10 –6 1×10–5 1×10–4 5×10–4 390,4±76 125,0±18,8* 165,4±33,5* 192,8±50,0 245,4±31,4 129,7±10,0 48,0±7,0*** 58,0±8,0** 77,0±6,7**# 96,6±1,9* Karbacholas Kontrolė (n=5) Junginys Nr. 2 1×10 –6 1×10–5 1×10–4 5×10–4 413,0±52,8 154,8±45,9** 163,0±28,4** 195,0±25,6,** 379,7±66,8 117,0±8,3 66,9±6,7*** 75,0±3,3** 85,0±6,5* 118,0±4,5 Karbacholas Kontrolė (n=4) Junginys Nr. 3 1×10 –6 1×10–5 1×10–4 5×10–4 463,3±19,0 217,0±32,6*** 228,0±25,6*** 246,0±32,2** 274,3±34,4** 137,7±13,0 78,6±9,6** 72,0±10,0** 85,0±6,5** 118,0±4,5 Karbacholas Kontrolė (n=5) Junginys Nr. 4 1×10 –6 1×10–5 1×10–4 5×10–4 503,4±43,5 178,6,±37,5** 256,4±47,7** 281,0±40,2** 449,0±51,7 155,5±5,9 89,0±7,4*** 86,9±7,6*** 107,0±9,0** 137,4±5,0 Karbacholas Kontrolė (n=4) Junginys Nr.5 1×10 –6 1×10–5 1×10–4 5×10–4 453,8±66,3 131,2±18,0** 144,0±8,5** 185,0±17,0** 284,6±56,7 126,0±2,8 59,4±3,5*** 63,0±5,8*** 75,8±2,8*** 112,9±3,8* Karbacholas Kontrolė (n=4) Junginys Nr.6 1×10 –6 1×10–5 1×10–4 5×10–4 384,0±26,7 152,9±21,2*** 149,0±22,3*** 132,8±17,6*** 260,9±15,8** 128,0±3,8 68,0±2,7*** 67,0±3,1*** 70,0±3,3*** 96,5±2,8*** Duomenys pateikti kaip X±mx, kur X – aritmetinis vidurkis, mx – standartinė vidurkio paklaida.

Simuliacijos dažnis 1 Hz; n, eksperimentų kiekis; * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 bazinio lygio atžvilgiu; # p<0,05 karbacholo atžvilgiu.

Junginys Nr. 2 (1-acil-5,6-dimetoksi-2-metiltiobenzimidazolas), esant 10–4 mol/l koncentracijai, 24 proc. sumažino jūros kiaulyčių aortos seg-mentų susitraukimą fenilefrino (10–4 _{mol/l) poveikyje; o esant 5×10}–4 _mol/l

koncentracijai – 76,2 proc.;

Junginys Nr. 7 (1-acetil-5,6-dietoksi-2-metiltiobenzimidazolas), esant 10–4 _{mol/l koncentracijai, 17 proc. sumažino segmentų susitraukimą}

fenilefri-35

no (10–4 _{mol/l) poveikyje; o esant 5×10}–4 _{mol/l koncentracijai – 72,5 proc.}

(5.3 pav.).

5.3 pav. Benzimidazolo junginių Nr.2 ir Nr. 7 poveikis jūros kiaulyčių aortos preparatų atsipalaidavimui

Rezultatai pateikti kaip X±mx, kur X – rezultatų vidurkis, mx – standartinė vidurkio

paklaida; junginių nr.2 atvejų skaičius (n=7); junginių Nr.7 atvejų skaičius (n=5); junginių koncentracijos nuo 10–4 _{iki 5×10}–4_;

1-acil-2-alkiltiobenzimidazolo junginių teigiamo inotropinio aktyvumo priklausomybė nuo jų struktūros:

• 5,6-dialkoksi- junginiai yra aktyvesni už šių grupių neturinčius ana-logiškus junginius.

• 5,6-dimetoksi- (ir dietoksi-) junginiai pasižymi ryškesnėmis teigia-momis inotropinėmis savybėmis nei jų cikliniai analogai – 5,6-me-tilen (arba e5,6-me-tilen) dioksi-junginiai. Ciklinių analogų teigiamas ino-tropinis aktyvumas mažėja, didėjant ciklui: metilendioksi-, etilen-dioksi-, trimetilendioksi- junginiai, kurie yra neaktyvūs.

• 1-Acil-5,6-dimetoksi-2-metiltiobenzimidazolų teigiamas inotropi-nis aktyvumas yra didžiausias, kai 1-padėtyje yra acetilas, metoksi-karbonilas ir 2-furoilas.

• Keičiant 2-metiltiogrupę 2-etiltiogrupe, aiškios aktyvumo priklau-somybės nepastebėta.

• 1-Acetil-5,6-dietoksi-2-metiltiobenzimidazolas yra žymiai aktyves-nis už 5- ar 6-etoksi analogus.Šis junginys pasižymėjo teigiamu inotropiniu poveikiu jūros kiaulyčių papiliariniams raumenims bei kraujagyslių segmentus atpalaiduojančiu poveikiu. Todėl buvo

36

nuspręsta nustatyti jo poveikų žmogaus izoliuotiems kraujagyslių preparatams.

5.1.3. Atrinktų junginių poveikis jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veikimo potencialo trukmei

Atlikus tiriamųjų dihidropiridino junginių poveikio jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veikimo potencialo trukmei rezultatų analizę, tolimesni tyrimai atlikti su 1,4-dihidropiridino junginiais: amlodipinu (OSI-9787), norvasku (OSI-9529), cerebrokrastu (OSI-1212), OSI-9719, BayK-8644 (OSI-9962), CGP-2456; diltiazemu; fosfodiesterazės (PDE III) inhibitoriumi 1-acetil-5,6-dietoksi-2-metiltiobenzimidazolu.

5.2 lentelė. Jūrų kiaulyčių papilairinių raumenų susitraukimo jėgos ir veikimo potencialo trukmės pokyčiai, tiriamųjų junginių poveikyje

Junginys Koncen- tracija, mol/l Susitrau-kimo jėga, P/Po±mx, proc.

Veikimo potencialo trukmė, ms

VPT10 VPT25 VPT50 VPT90 Amlodipi-nas Kontrolė (OSI-9787, n = 6) 1×10–7 1×10–6 1×10–5 1×10–4 100,0 91,9±6,5 75,4±11,7 60,0±12,7 40,0±5,7 38,5±1,5 41,5±1,0 37,5±1,8 33,0±2,0 33,25±1,3* 84,7±5,7 88,0±5,2 85,7±9,6 81,0±12,5 80,0±7,0 125,0±9,3 122,7±10,7 120,7±13,0 117,0±15,0 114,0±10,8 154,3±12,9 153,0±15,4 153,0±15,3 150,3±13,2 150,7±12,6 Norvaskas Kontrolė (OSI-9529, n=6) 1×10–7 1×10–6 1×10–5 1×10–4 100,0 85,9±6,0 70,7±7,6 55,6±6,3 35,8±3,5 20,3±3,3 17,9±2,3 18,8±1,8 19,0±2,4 17,7±3,2 61,8±5,0 55,7±9,2 54,4±5,0 56,7±3,4 56,6±2,8 102,6±4,2 98,4±5,0 94,3±6,0 102,6±4,6 95,5±2,8 136,7±6,0 135,3±5,2 133,6±4,2 136,5±7,8 129,4±4,4 Cerebro-krastas Kontrolė (OSI-1212, n=5) 1×10–7 1×10–6 1×10–5 1×10–4 100,0 76,0±9,6 58,4±8,3 43,47±5,8 26,4±2,8 32,0±2,4 32,0±2,2 31,0±3,0 28,4±2,6 29,0±2,6 66,75±5,9 64,0±5,3 63,4±6,2 59,0±4,4 55,6±2,9 97,0±8,2 92,6±6,7 89,6±7,3 88,0±4,9 83,6±3,6 124,0±5,9 121,0±5,8 118,2±4,8 118,7±4,6 112,7±6,4 CGP 28392 Kontrolė (n=4) 1×10 –7 1×10–6 1×10–5 1×10–4 100,0 148,6±21 142,5±18,0 149,8±19,0 142,6±19,7 40,0±6,5 44,5±7,0 42,0±7,0 41,0±7,5 42,7±7,2 88,0±8,0 92,7±6,9 91,0±6,9 85,1±10,3 89,0±10,4 133,4±7,7 135,6±8,5 133,8±8,9 129,0±10,0 133,8±10,2 218,5±5,5 220,0±9,0 218,2±6,5 217,0±9,0 223,5±10,0

37 5.2 lentelės tęsinys Junginys Koncen-tracija, mol/l Susitrau-kimo jėga, P/Po±mx, proc.

Veikimo potencialo trukmė, ms

VPT10 VPT25 VPT50 VPT90 Diltiazemas Kontrolė (n=6) 1×10 –7 1×10–6 1×10–5 1×10–4 100,0 110,0±11,5 101,6±7,4 77,0±4,6 25,7±3,0 45,0±5,2 44,0±3,6 45,0±3,4 46,0±2,7 43,4±2,0 98,0±6,4 98,0±3,6 100,0±3,2 102,0±2,7 85,0±2,8* 145,0±3,2 1465,5±2,8 149,5±2,5 149,0±2,8 128,9± 1,6*** 176,0±2,4 182,6±3,8 185,8±3,0 185,8±3,0 172,8±0,96 Benzimi-dazolas Kontrolė (n=8) 1×10–7 1×10–6 1×10–5 1×10–4 100,0 114,3±3,8 140,0±15,3 172,0±25,0 269,0±38,0 93,3±5,0 110,4±9,2 108,6±11,0 110,0±7,0 105,2±9,4 149,4±8,5 160,0±6,0 160,9±5,0 159,4±7,5 160,0±6,6 182,4±7,8 193,6±8,4 196,4±8,0 195,6±9,3 193,7±7,3 Duomenys pateikti kaip X±mx, kur X – aritmetinis vidurkis, mx – standartinė vidurkio

pa-klaida. P – susitraukimo jėga, vartojant nurodytą koncentraciją; Po, kontrolė, priimta kaip

100 proc.; VPT10, VPT25, VPT50 ir VPT90, veikimo potencialo trukmė atitinkamai esant 10

proc., 25 proc., 50 proc. ir 90 proc. repoliarizacijai; stimuliacijos dažnis 1 Hz; * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 kontrolės atžvilgiu.

Amlodipino (OSI-9787), cerebrokrasto (OSI-1212) ir diltiazemo (kalcio kanalų antagonistai) grupėse papiliarinių raumenų susitraukimo jėga ma-žėjo, didėjant koncentracijoms nuo 10–7 _{mol/l iki 10}–4 _{mol/l; cerebrokrastas}

ir diltiazemas, esant 10–4 _{mol/l koncentracijai, lyginant su amlodipinu,}

pasižymėjo stipriau išreikštomis neigiamomis inotropinėmis savybėmis: susitraukimo jėga sumažėjo 73,6 proc., 74,3 proc. bei 60 proc. (p<0,05), atitinkamai cerebrokrasto, diltiazemo ir amlodipino atvejais.

OSI-9719 (2-propoksietil 4-(2-diflormetoksipenil)-2-metil-5-nitro-1,4-di-hidropiridino-3-karboksilatas) pasižymėjo teigiamu inotropiniu poveikiu ir prailgino veikimo potencialo trukmę, priklausomai nuo koncentracijos.

Kalcio kanalų agonistas BayK 8644 (OSI-9962) pasižymi teigiamu ino-tropiniu poveikiu: papiliarinių raumenų susitraukimo jėga didėjo 176,0±31 proc., esant 10–4 mol/l.

1-acetil-5,6-dimetoksi-2-metiltiobenzimidazolo poveikyje izometrinis širdies papiliarinių raumenų susitraukimas didėjo ~14 proc., esant 10–6 _mol/l

koncentracijai; 70 proc., esant 10–4 mol/l ir ~170 proc., esant 5×10–4 mol/l koncentracijai.

5.4 paveiksle pavaizduotos „dozės-efekto“ kreivės aukčiau nurodytų junginių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgos kitimo atžvilgiu.

38

5.4 pav. Jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgos pokyčiai amlodipino, cerebrokrasto, diltiazemo, benzimidazolo,

Bay K ir OSI-9719 poveikyje

Duomenys pateikti kaip X±mx; 100 proc. – kontrolė; stimuliacijos dažnis 1,0 Hz.

5.1.4. Glibenklamido, dl-sotalolo ir BaCl2 įtaka dihidropridino

OSI-9719 jūros kiaulyčių papiliarinių raumenų susitraukimo jėgai ir veikimo potencialo trukmei

1,4-dihidropiridino junginys OSI-9719 pasižymi teigiamu inotropiniu ir VP trukmę prailginančiu poveikiu. Norėdami įvertinti ar jo efektas nėra sąlygotas vidinio išlyginimo ATF reguliuojamų K+ _{srovių kanalams (K}

ATF),

naudojome selektyvų KATF blokatorių glibenklamidą.

Veikiant tik glibenklamidui (koncentracija 20 µM) registravome nežy-mų veikimo potencialo trukmės pailgėjimą, daugiau išreikštą esant 90 proc. repolarizacijai (8 ms, 3,5 proc., p>0,05). Susitraukimo jėgos ženklesni pokyčiai nebuvo stebėti (5.3 lentelė, 5.5 pav.).