Alometrijos metodų taikymas ekstrapoliuojant antimaliarinės medžiagos farmakokinetinius parametrus į žmogų

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS,

MONTPELLIER 1 UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

Nerijus LUKŠYS

Alometrijos metodų taikymas ekstrapoliuojant antimaliarinės

medžiagos farmakokinetinius parametrus į žmogų

MAGISTRO DARBAS

Darbo vadovai: Prof. Dr. Vitalis Briedis

Prof. Dr. Francoise Bressolle

KAUNAS MONTPELLIER

TURINYS Įvadas ...4 Bendroji dalis ...6 I. Maliarija ...6 1. Etiologija...6 2. Plasmodium dauginimasis ...7

2.1 Nelytinis Plasmodium dauginimosi ciklas ...7

2.2 Lytinis Plasmodium dauginimosi ciklas...9

3. Epidemiologija...11 3.1 Infekcijos šaltinis...11 3.2 Maliarijos paplitimas ...11 3.3 Rizika žmonėms ...12 3.4 Maliarija ir skurdas...12 4. Maliarijos klinika...13 5. Gydymas ...14

II. Antimaliarinį veikimą turinčios veikliosios medžiagos kūrimas, jos ypatumai ir struktūros-aktyvumo ryšys ...17

1. Farmakocheminiai faktai ...17

2. Antros kartos junginiai ...18

3. Trečios kartos junginys...19

III. Analitinio metodo pasirinkimas ir jo validacija...21

1. Analitinio metodo pasirinkimas...21

2. Metodo validacijos procedūra...22

IV. Ekstrapoliacija žmogui taikant alometrinius metodus ...24

1. Alometrijos sukūrimo pagrindai ...24

1.1 Alometrijos sąvoka ...24

1.2 Fiziologinio laiko samprata...26

2. Farmakokinetika, alometrija ir fiziologinis laikas ...27

2.1 Alometriniai ryšiai pagal Boksenbaumą ...27

2.2 Rūšies ilgaamžiškumo įtaka...27

2.3 Kreivių išvedimas ...28

Eksperimentiniai tyrimai ...30

I. Validuota antimaliarinės medžiagos analizė, darbo metodika ir analizės rezultatai ...30

2. Naudotos medžiagos...30

3. Chromatografinė įranga ir sąlygos...31

4. Tirpalų paruošimas ...32

4.1 Analitinių tirpalų paruošimas ...32

4.2 Kalibracinės eilės ir kontrolinių tirpalų paruošimas...33

4.3 Mėginių paruošimas ...33

5. Validuoto metodo rezultatai ...33

6. Stabilumo tyrimai ir jų rezultatai...36

II. Tyrimai su gyvūnais ...37

1. Žiurkės ...37

2. Beždžionės...38

3. Šunys...39

4. Kiaulės ...40

5. Rezultatai ...41

6. Farmakokinetinių parametrų skaičiavimai ...42

III. Antimaliarinės veikliosios medžiagos farmakokinetinių parametrų alometrinė analizė ...43

1. Alometrinių lygčių apskaičiavimas ...43

1.1 Pusinės eliminacijos laikas...43

1.2 Pasiskirstymo tūris ...44

1.3 Klirensas...44

2. Farmakokinetinių parametrų žmogui apskaičiavimas ...45

3. Ekstrapoliacija žmogui taikant alometrinius metodus...45

3.1 Apolysichronai ...45 3.2 Kallynochronai ...47 3.3 Dienetichronai ...48 3.4 Rezultatai...49 Išvados...50 Literatūra...51 Padėka...53

ĮVADAS

Kasmet maliarija nusineša milijonus žmonių gyvybių, todėl ieškoma būdų kaip su ja kovoti. Vaistų efektyvumas prieš maliariją mažėja, nes atsiranda vis daugiau rezistentiškų formų, ligos mastai vėl didėja, todėl ji gali paliesti Europą. Mokslininkų organizacijos siekia sukurti universalų ir veikslingą vaistą šiai ligai gydyti. Prancūzijoje, Montpellier1 universitete, farmacijos fakultete, klinikinės farmakokinentikos laboratorijoje aš dalyvavau tokio naujo vaisto ikiklinikiniuose tyrimuose vadovaujant Prof. Dr. F. Bressolle. Atliekant tokius tyrimus su gyvūnais visada tiriami farmakokinetiniai parametrai tokie kaip klirensas, pusinės eliminacijos laikas, pasiskirstymo tūris, ir tt. Iškyla klausimas: ar įmanoma, remiantis vien gyvūnų farmakokinetiniais parametrais, apskaičiuoti juos ir žmogui?

1949 metais E.F. Adolph iškėlė hipotezę, kad skirtinų rūšių žinduoliams egzistuoja ryšys tarp fiziologinių parametrų ir kūno masės. Šis ryšys pavadintas alometrija ir ekstrapoliuojant skirtingus gyvūnų fiziologinius parametrus, juos galima teoriškai apskaičiuoti žmogui. Šioje srityje dirbo H. Boxenbaum, R.L. Dedrick, G. Sacher, kurie ieškojo naujų alometrinių ryšių ir ekstrapoliacijos metodų. Todėl mano darbo tikslas yra patikrinti ar egzistuoja alometrinis

ryšys antimaliarinį veikimą turinčiai veikliajai medžiagai, jei taip, tai nustatyti farmakokinetinius parametrus žmogui. Pagal gautus preliminarius absorbcijos, pasiskirstymo,

metabolizmo ir eliminacijos rezultatus galima nustatyti ar naujas vaistas bus pakankamai efektyvus. Šiame darbe supažindinsiu su maliarijos etiologija, epidemiologija, daroma žala bei kovos prieš šią ligą priemonėmis bei vaistais. Supažindinsiu su Prancūzijoje kuriamo vaisto nuo maliarijos molekulės sukūrimo etapus, struktūros-aktyvumo ryšiu, veikimo mechanizmmu. Kol vyksta tyrimai jos tikslios struktūros atskleisti negaliu, nes tai konfidensiali informacija. Taip pat paaiškinsiu kaip reikia pasirinkti analitinį metodą, parinkti jam sąlygas bei optimizuoti. Analitinį metodą reikia valiuoti (įteisinti), tad pateiksiu validacijos procedūros etapus. Teorinėje dalyje taip pat supažindinsiu su alometrijos sąvoka ir alometriniais analizės metodais.

Antroje praktinėje mano darbo dalyje aprašiau tirtos antimaliarinės veikliosios medžiagos kiekybinio nustatymo metodą. Analitinio metodo validacija atlikta su kraujo plazma, todėl pateikiau biologinių tirpalų paruošimo esmę, antimaliarinį veikimą turinčios medžiagos tyrimų metodiką ir darbo įrangą, validacijos ir stabilumo tyrimų rezultatus. Analitinį metodą šiek tiek pakeitus tyrimus galima atlikti su krauju ar kitu biologiniu skystyčiu.

Kadangi farmakokinetikos tyrimiai ikiklinikinėje fazėje atliekami su gyvūnais, todėl reikia mokėti paimti biologinį mėginį, iš jo išskirti tiriamą junginį ir jį kiekybiškai nustatyti pagal validuotą analitinį metodą. Man atvykus į Montpellier1 universitetą tyrimai su gyvūnais buvo jau įpusėję. Teko dalyvauti tik pelių ir kiaulių farmakokinetikos tyrimuose, biloginių tirpalų, mobilios fazės, kalibracinių eilių ir kontrolinių tirpalų paruošime, ekstrakcijos, kiekybinio nustatymo procese

ir pagal gautus duomenis įvairių parametrų apskaičiavime. Žiurkių, šunų ir beždžionių tyrimai jau buvo atlikti 2003 - 2005 metais. Todėl supažindinsiu su tirtų gyvūnų protokolais ir gautais rezultatais. Visi šie duomenys naudojami farmakokinetinių parametrų alometrinėje analizėje bei ekstrapoliuojant į žmogų.

Darbo uždaviniai:

• Apskaičiuoti skiringiems gyvūnams suleistos antimaliarinės medžiagos koncentracijas ir farmakokinetinius parametrus

• Patikrinti ar egzistuoja alometrinis ryšys antimaliarinei medžiagai

BENDROJI DALIS: LITERATŪROS APŽVALGA

I. MALIARIJA

Maliarija (lot. mal aer – blogas oras) – kraujo pirmuoninė invazija, pasireiškianti reguliariai pasikartojančiais drugio priepuoliais, kepenų ir blužnies padidėjimu, hemolizine anemija. Senovėje buvo manoma, kad jos priežastis yra iš balų kylanti drėgmė, kuri užteršia orą „miazmais“. Pagal karščiavimo pobūdį maliarija buvo vadinama febris intermittens, o liaudies – drugiu. Tai gyvybei grėsminga liga, kurią sukelia keturių rūšių Plasmodium pirmuonys. Šią transmisinę kraujo infekciją perduoda nariuotakojai (uodai, blusos) (WHO, 2004).

1. ETIOLOGIJA

Plasmodium - kraujo parazitas, Hemosporidijų klasės pirmuonis. Žmogaus organizme parazituoja 4 maliarijos sukėlėjų rūšys:

Plasmodium falciparum – tropinės maliarijos sukėlėjas, jis yra pats pavojingiausias ir dažniausiai užsikrečiama.

Sukėlėjas aktyvus ištisus metus ekvatoriaus šalyse, nes dauginimuisi palankios sąlygos yra šiltuoju ir drėgnuoju metų periodu (temperatūra > 18°C) bei tropiniuose regionuose (Madagaskaro zonos Afrikoje, pietų ir pietryčių Azijoje ir pietų bei centrinėje Amerikoje).

Inkubacijos periodas trunka nuo 7 iki 12 dienų. Išvykus iš endeminės zonos tikimybė labai maža, kad liga pasireikš vėliau nei po dviejų mėnesių. Šio sukėlėjo infekcijos pasekoje sukeliamas stiprus karščiavimas kas trečią dieną.

Plasmodium vivax – tridienės maliarijos sukėlėjas, jis plačiai paplitęs, bet mažiau aktyvus nei P. falciparum.

Šis maliarijos sukėlėjas aptinkamas: a) Viduržemio jūros regione: Turkijoje, Artimuosiuose Rytuose, Šiaurės Afrikoje; b) visuose tropikuose ir Azijoje ; c) Madagaskare, Mauricijaus ir Komorų salose d) Centrinėje ir Pietų Amerikoje. Tailande ji sukelia apie 50%, Indijoje 65%, Indonezijoje 70%, Meksikoje 99% ligos atvejų.

Inkubacijos periodas žmogui trunka 15 dienų, bet gali užsitęsti iki 9 mėnesių ar ilgiau. Dalis parazitų lieka kepenyse ir formuoja taip vadinamus snaudžiančius židinius, kurie vėliau sukelia recidyvus. Ligai vėl paūmėjus atsiranda tie patys klinikiniai ligos požymiai. Recidyvai gali trukti iki dviejų metų. P.vivax sukelia nepavojingą karščiavimą kas trečią dieną.

Plasmodium ovale – ovalinės maliarijos sukėlėjas, panašus į tridienės maliarijos sukėlėją.

Jis paplitusęs vidurinėje tropinėje Afrikoje ir sukelia nepavojingą karščiavimą kas trečią dieną, kaip ir P.vivax. Inkubacinis periodas trunka nuo 15 dienų ir gali tęstis labai ilgai (net iki 4 metų). Šios rūšies maliarijos vystymasis nėra pavojingas, bet vėlyvi recidyvai gali reikštis 5 metus.

Plasmodium malariae – keturdienės maliarijos sukėlėjas.

Geografiškai paplitęs retai (keletas židinių šiaurės Afrikoje, Karibų jūros pakrantėse, Irane). Inkubacinis periodas trunka apie tris savaites. Karščiavimas pasireiškia kas ketvirtą dieną kas kartais sukeli chroninę nefropatiją. Liga trunka ilgai: nuo trijų iki dvidešimties metų (Bannister ir kt., 2003).

2. PLASMODIUM DAUGINIMASIS

• Žmogaus organizme vyksta nelytinis Plasmodium dauginimo ciklas, kuris vadinasi

šizogonija (skilimas).

• Uodo organizme vyksta lytinis vystymosi ciklas vadinamas sporogonija Dauginimosi ciklų schema pateikta 1.1 pav.

2.1 Nelytinis Plasmodium dauginimosi ciklas

Užsikrėtime būtinai dalyvauja uodas, po įkandimo su jo seilėmis į žmogaus kraują patenka sporozoitai. Šie patenka į paodžio audinius kur vidutiniškai užsilaiko iki 5 minučių. Jau išsiskirsčius seilėms, maždaug po 15 minučių, pirma sporozoitų banga patenka į kraują, o kažkur po 45 minučių patenka ir į kepenis (Sidjanski and Vanderberg, 1997). Sporozoitai prasiskverbia į hepatocitus vakuolės forma. Prasideda ekstraeritrocitinė stadija (audininis ciklas) - hepatinė šizogonija. Jie dauginasi kepenų ar kitų organų ląstelėse. Kiekvienas sporozoitas pavirsta į endocitoplazminį

trofozoitą, kuris auga ir susiformuoja šizontas, o jo branduolys pasidalina daug kartų. Šizontuose

esantys branduoliai sąveikauja su ląstelių citoplazma ir susidaro merozoitai. Vidutiniškai po 8 – 15 dienų hepatinių ląstelių citoplazmoje būna daug milijonų branduolių.. Kai susikaupia labai daug merozoitų, jie suardo ląstelę ir per kapiliarus keliauja į sisteminę kraujotaką. Tada jie skverbiasi į eritrocitus – ši stadija yra endoeritrocitinė ir vadinasi eritrocitinė šizogonija. Dažant Gimzos būdu eritrocitų citoplazma būna žydra, o branduolys raudonas. Būdinga tai kad merozoitai „puola“ eritrocitus vienu metu ir reguliariai. Skirtingos rūšies maliarijos sukėlėjų nelytinio reprodukcinio ciklo trukmė eritrocituose yra nevienoda. Reprodukcijos procesas tuojau pat inicijuojamas visuose P. malariae ir P. falciparum užkrėstuose eritrocituose. Reprodukcija iš karto gali ir neprasidėti (turi hipnizoito pavadinimą), o kai kuriuose užkrėstuose P. vivax ir P. ovale eritrocituose ji gali pasireikšti tik po 1 ar net 18 mėnesių.

1.1 pav. Plasmodium dauginimosi ciklai (Bannister and Mitchell, 2003)

Eritrocituose vyksta ciklinė reprodukcijos stadija. Iš merozoitų eritrocituose susidaro trofozoitai. Toliau ciklas toks pat kaip ir kepenų ląstelėse.

P.faciparum P. malarie P. ovale P. vivax

1.2 pav. Šizontai

Eritrocitai sprogsta, parazitai patenka į kitus eritrocitus ir ciklas kartojasi. Ciklo trukmė ir merozoitų skaičius gautas kiekvieno eritrocitinio ciklo metu yra specifiškas kiekvienai Plasmodium rūšiai:

P. falciparum: trukmė 48 h ir vidutiniškai 16 merozoitų P. malariae: trukmė 72 h ir vidutiniškai 8 merozoitų P. vivax: trukmė 48 h ir vidutiniškai 16- 24 merozoitų P. ovale: trukmė 48 h ir vidutiniškai 4 - 16 merozoitų

(Billker et al., 1998), (Kain ir kt., 1998)

2.2 Lytinis Plasmodium dauginimosi ciklas

Vidutiniškai po savaitės daugelis merozoitų pradeda diferencijuotis, taip ruošdamiesi parazito lytiniam dauginimosi ciklui. Susidaro moteriški mikro- ir vyriški makrogametocitai (1.3

pav.), kurie nesidaugina, o laukia uodo įkandimo. Gametocitų vystymasis trunka 14 dienų, bet nauji

gametocitai kaskart gaminami eritrocitinės šizogonijos proceso pabaigoje. Užkrėstų eritrocitų morfologija ir visos jų formos yra charakteringos kiekvienai Plasmodium rūšiai. Tai padeda indentifikuoti sukėlėjus diagnostikos metu.

P. malarie P. ovale P. vivax P.faciparum

1.3 pav. Gametocitai

Uodui įkandus maliarija sergantį žmogų, jis paima užkrėsto kraujo su gametocitais. Plasmodium gyvenimo ciklas pernešėjo organize pavaizduotas 1.4 pav.

1.4 pav. Lytinis Plasmodium dauginimosi ciklas uodų patelėse (Ghosh ir kt., 2003)

Išdiferencijuotos lytinės ląstelės patenka į uodo patelių skrandį (Lobo and Kumar, 1998). Čia gametocitai virsta į gametas, kurios tuojau pat pasidalina į 8 mikrogametas. Ši transformacija yra stimuliuojama temperatūros ir aplinkos biocheminių modifikacijų. Lytinis Plasmodium dauginimosi ciklas prasideda praėjus maždaug minutei po kraujo siurbimo. Subrendusios moteriškos gametos susijungia su vyriškomis ir susidaro zigota, vėliau ookineta. Ookinetos juda ameboidiškai ir prisitvirtina prie skrandžio sienelės. Jos įlenda tarp skrandžio ląstelių ir bando įsitvirtinti išorinėje skrandžio dalyje – pilvaplėvėje (epiteliniame pagrinde), kur jos virsta į oocistas

(1.5 pav.). Laikas nuo uodo užsikrėtimo iki ookinetų susidarymo yra apie 24 valandos.

1.5 pav. Oocista

Oocistoje vyksta sporogenezė, taip susidaro apie 10000 sporozoitų. Oocistos brendimas vyksta 4 – 21 dienas esant sekančioms klimatinėms sąlygoms: optimali vystymosi temperatūra yra 30°C, minimali – 18°C, maksimali – 33°C.

Oocista labai padidėja ir sprogsta. Sporozoitai patenka į uodo hemolimfą. Vidutiniškai po 24 valandų dauguma sporozoitų susikoncentruoja seilių liaukose. Ten jie išgyvena apie 2 – 3 savaites

(maksimaliai 2 mėnesius). O toks užsikrėtęs uodas įkandęs žmogui suleidžiama daugybę sporozoitų (Lobo and Kumar, 1998), (Billker ir kt., 1998).

3. EPIDEMIOLOGIJA

3.1 Infekcijos šaltinis

Žmogus gali būti užkrėstas sekančiais būdais:

• įkandus užsikrėtusiai Anopheles genties uodo patelei;

• užkratas gali būti perduotas transfuziniu būdu ( kraujo donoras - parazitų nešiotojas, nes parazitas +4°C temperatūrai atsparus daugiau nei 3 savaites) ir per užkrėstus instrumentus; • lytiniu keliu;

• endeminėse vietovėse pasitaiko ir įgimtos maliarijos atvejų, kai parazitai užkrečia vaisių per pažeistą placentą ar gimdymo metu.

Sergamumas maliarija priklauso nuo sukėlėją pernešančių uodų populiacijos dydžio bei užsikrėtusių žmonių, kurie yra infekcijos rezervuaras.

Egzistuoja virš 300 Anopheles uodų rūšių. Apie 60 gali nešioti Plasmodium. Afrikoje yra dvi pafgrindinės rūšys: A. funestus et A. gambiae. Įkandimas dažniausiai vyksta naktį. Uodams veistis reikalingi vandens telkiniai. Ši sąlyga tenkinama ištisus metus drėgno klimato juostoje (tropikai, ekvatorius) arba lietingo sezono metu. Kita reikalinga sąlyga yra tam tikra oro temperatūra kad vyktų sporogenezė. P. vivax minimaliai reikia 3 savaičių virš 16°C, o P. falciparum - 3 savaičių virš 21°C temperatūros.

Žmogus turi būti imlus susirgimui. Jei eritrocitai savo paviršiuje neturi atitinkamų receptorių, neįvyksta merozoito patekimas - taip gali būti juodaodžiams, kurie turi neigiamą Daffi genotipą, jie neserga tečiadiene maliarija (P. vivax). Taip pat maliarija neserga sergantys S-Hemoglobinopatija, talasemija, gl-6-fostatdehidrogenazės deficitu (Whitwoth ir kt., 2000; Rowland-Jones and Lohman, 2002; van Eijk ir kt., 2003).

3.2 Maliarijos paplitimas

Maliarija yra pasaulinės sveikatos problema (WHO, 2003).Ji yra plačiai paplitusi Afrikos, Azijos, Lotynų Amerikos valstybėse. 2000 metų Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis pasaulyje yra daugiau kaip 100 šalių, kuriose galima užsikrėsti maliarija. Kasmet užregistruojama 300 – 500 mln. klinikinių maliarijos atvejų. Per metus visame pasaulyje nuo šios ligos miršta 1,5 – 2,7 mln. žmonių, iš jų 1 mln. vaikų iki 5 metų amžiaus. Kiekvienais metais ja suserga daugiau kaip 10 tūkst. turistų, iš kurių apie 1% miršta nuo tropinės maliarijos. 90 % sergančių maliarija turistų ja užsikrėtė Afrikoje tarp pietų Saharos ir 28º pietų platumos. Du

trečdaliai atvejų nustatomi šešiose valstybėse: Indijoje, Brazilijoje, Šri Lankoje, Vietname, Kolumbijoje, Saliamono salose. 80% atvejų ligos sukėlėjas būna P. falciparum (Butler D, 1997). Maliarijos paplitimo žemėlapis pavaizduotas 1.6 paveikslėlyje.

1.6 pav. 2002 metų Maliarijos paplitimo žemėlapis (RBM, 2003)

3.3 Rizika žmonėms

Pagrindinės rizikos grupės yra kūdikiai ir nėščios moterys. 90% aukų būna kūdikiai (WHO, 2003). Jie yra jautrūs maliarijos sukėlėjams, nes dar neturi įgyto imuniteto. Apskaičiuota kad nuo pastarosios ligos kas 30 sekundžių miršta vienas kūdikis. Maliarijos pasikartojimas nėščiajai yra rizikingas, nes gali sukelti persileidimą arba pavėluotą vaiko vystymąsi. Pasikartojančios maliarijos infekcijos vaikams gali sukelti tokius negalavimus kaip diarėją, pneumopatijas. Infekcijos kūdikiams be greito gydymo dažniausiai būna mirtinos, o suaugusiems - priešingai, juos saugo įgytas imunitetas (WHO, 1998).

3.4 Maliarija ir skurdas

Pasaulio šalių bendro vidaus produkto (BVP) žemėlapis rodo santykį tarp maliarijos paplitimo ir skurdo (1.7 pav.). Endeminėse maliarijos zonose esančių šalių vidutinis BVP 1995 metais vienam gyventojui buvo 1,516 JAV dolerių, kai tuo tarpu kitų šalių 8,268 JAV dolerių (Sachs and Malaney, 2002).

Labiausiai liūdina faktas, kad tarp 1965 ir 1990 metų šalių, esančių endeminėse zonose, ekonomikos augimas buvo tik +0.4% BVP, o išsivysčiusiose šalyse +2.3% (Sachs and Malaney, 2002), (Gallup and Sachs, 2001). Maliarijos ir skurdo ryšys yra dvipusis. Skurdas skatina maliarijos

atsiradimą, nes nėra priemonių padedančių kovoti prieš ligą, o maliarija taip pat sukelia ir palaiko skurdą (Chima ir kt., 2003).

1.7 pav. Maliarijos ir skurdo ryšys („Roll Babck Malaria“ duomenimis, Sachs, 1999)

(http://www.rbm.who.int/cmc_upload/0/000/015/363/RBMInfosheet_10.htm)

4. MALIARIJOS KLINIKA

Patekus maliarijos sukėlėjui, tam tikrą laiką žmogus jokių negalavimų nejaučia. Šis ligos periodas vadinamasis inkubaciniu periodu ir trunka nuo vienos iki kelių savaičių, kartais daugiau kaip metus. Tai priklauso nuo sukėlėjo rūšies. P.vivax ir P.ovale dalis parazitų lieka kepenyse ir formuoja taip vadinamus snaudžiančius židinius, kurie vėliau sukelia recidyvus.

Ligos eiga skirstoma į šias stadijas: • pirminė ūminė maliarija • latentinė ikirecidyvinė stadija • ankstyvieji recidyvai

• tarprecidyvinis periodas • vėlyvieji recidyvai • pomaliarinės ligos

Pirminė maliarija prasideda staiga drugio priepuoliu, stipriu šalčio krėtimu, dažniausiai apie vidurdienį, o ovalinės maliarijos – naktį. Ligonis dreba, kalena dantimis, pamėlynuoja jo lūpos, nosis, rankos, atšąla galūnės, oda pasišiaušusi kaip žąsies. Ligonis negali sušilti net gerai apsiklojęs. Paskui užeina karščio banga, temperatūra padidėja iki 39,5-41 °C, veidas parausta, pagreitėja kvėpavimas ir pulsas, skauda galvą, strėnas ir kairiojoje pašonėje. Ligonis blaškosi, kartais vemia ir kliedi. Po kelių valandų sergantysis sušyla, jam pasidaro lengviau, gausiai išpila prakaitas, temperatūra pasidaro mažesnė už normalią. Dažnai atsiranda lūpų pūslelinis bėrimas, būna silpnumas, nuovargis, mieguistumas. Trečiadienės maliarijos priepuolis trunka 5-8 val., paskui būna apireksinė pauzė ir, praėjus 48 val. nuo pirmojo priepuolio pradžios (trečią dieną), vėl pasikartoja panašus drugio priepuolis. Negydant priepuoliai kartojasi 10-14 kartų ir vėliau savaime išnyksta. Tačiau liga dažniausiai pereina į latentinę fazę, po kurios prasideda ankstyvieji (po 3-8 savaičių), o po 6-8 mėn. – vėlyvieji recidyvai. Liga trunka iki 1,5-2,5 metų. Pasveikusieji įgyja trumpą imunitetą, todėl galima reinfekcija.

Jau nuo pirmųjų drugio priepuolių ligonis kaskart vis labiau išblykšta, labai padidėja ir sustandėja blužnis, padidėja kepenys. Būna bronchito reiškinių, sumažėja kraujospūdis. Sumažėja hemoglobino, eritrocitų kiekis, pasireiškia hemolizinė anemija. Būba leukopenija, neutropenija. Kraujo plazmoje padaugėja netiesioginio bilirubino, šlapime atsiranda baltymų, urobilinogeno (Čibiras ir kt., 1989).

5. MALIARIJOS GYDYMAS

Sergantys maliarija pacientai guldomi į ligoninę. Antimaliarinis vaistas parenkamas pagal Plasmodium rūšį, jo dauginimosi stadiją. Gydomos išsivysčiusios komplikacijos.

Maliarijos kontrolė priklauso nuo terapijos efektyvumo ir adekvačios profilaktikos. Egzistuojantys antimaliariniai vaistai jau nėra labai efektyvūs ir daugelis naudojami dešimtmečius. Vaistų pavyzdžiai pateikti 1.1 lentelėje.

1.1 lentelė Antimaliarinių vaistų klasifikacija

Veikiantys kraujyje esančius sukėlėjus 1- Chinoleino dariniai

chlorokinas, amodiakinas, pironaridinas, chininas, meflokinas, halofantrinas

2- Nukleino rūgšties sintezės inhibitoriai

sulfalenas, sulfadoksinas, dapsonas, proguanilas, pirimetaminas,

atovakonas

3- Antibiotikai

tetraciklinas, doksiciklinas, klindamicinas

4-Artemizinas ir jo dariniai

artemizinas, dihidroartemizinas, artemeteris, arteeteris, artesunatas, artelinatas

Veikiantys kepenyse esančius sukėlėjus 8-Aminochinoleinas

primakinas

Antimaliarinių vaistų vartojimas šiuo metu yra griežtai kontroliuojamas dėl sparčiai besivystančio rezistentiškumo, ypač Plasmodium falciparum. Šiuo metu tik artemizijo dariniai nesukelia rezistentiškumo. Todėl maliarija dažniausiai gydoma ne vienu antimaliariniu vaistu, o iš karto jų kombinacijomis su artemizino dariniais, kad gauti sinergistinį efektą, taip pat siekiant išvengti rezistentiškų formų išsivystymo (PSO, 2004). Rekomenduojamos vaistų kombinacijos pateiktos 1.2 lentelėje.

1.2 lentelė Kombinacijos su artemizino dariniais

Artemeteris + Lumefantrinas (COARTEM®,

RIAMET®)

Artesunatas + Amodiakinas

Artesunatas + Sulfadoksinas ir Pirimetaminas

Kitos vaistų kombinacijos pateiktos 1.3 lentelėje.

1.3 lentelė Kombinacijos be artemizino

Chlorokinas + Proguanilas (SAVARINE®₎

Meflokinas + Sulfadoksinas ir Pirimetaminas

(FANSIMEF®)

Atovakonas + Proguanilas (MALARONE®)

Amodiakinas + Sulfadoksinas ir Pirimetaminas Chlorokinas + Sulfadoksinas ir Pirimetaminas Chininas + Tetraciklinas ar Doxyciklinas

Tik amodiakino ir sulfadoksino-pyrimetamino kombinacija yra pati efektyviausia, todėl naudojama rizikos šalyse.

Maliarinės komos gydymui nedelsiant skiriama į veną chinino infuzija, sulašinant lėtai per 4 valandas. Vietoj chinino gali skirti ir chinidino gliukonato.

Patogenezinis gydymas: detoksikacijai į veną lašinama elektrolitų, gliukozės tripalų, o alerginiams reiškiniams slopinti skiriama antihistamininių preparatų.

Simptominis gydymas: skausmas malšinamas nenarkotiniais analgetikais, skiriama B grupės vitaminų, geležies preparatų. Pasveikę pacientai du metus yra aktyviai stebimi.

Maliarijos profilaktika: profilaktinės priemonės prieš sukėlėjo pernešėjus uodus (repelentai, pvz., dietiltoksamidas, citronelė, elektriniai difuzoriai, ritės, skleidžiančios insekticidus, lipnios juostos bei apsauginis tinklas virš lovos impregnuoti insekticidais) ir chemoprofilaktika (Laškonis A. ir kt., 2004).

II. ANTIMALIARINĮ VEIKIMĄ TURINČIOS VEIKLIOSIOS

MEDŽIAGOS KŪRIMAS, JOS YPATUMAI IR BŪDINGAS

STRUKTŪROS-AKTYVUMO RYŠYS

1. FARMAKOCHEMINIAI FAKTAI

Maliarija yra pasaulinės sveikatos problema, todėl ieškoma naujų molekulių, kurios būtų veiksmingos. Šioje srityje tokie tyrimai Montpellier universitete (Prancūzija) jau vyksta apie 6 metus. Ieškota nauja molekulė turinti originalią struktūrą ir veikimą, bei įtakojanti Plasmodium fosfolipidų metabilizmą.

Aminorūgščių, Peptidų ir Proteinų laboratorijoje, (Montpellier I ir II Uuniversitetai, Montpellier, Prancūzija) buvo pastebėta kad molekulė analogiška cholinui, kuri konkurenciniu būdu susijungia su cholino transporteriu, inhibuoja prekursoriaus transportą užkrėstuose maliarija eritrocituose. Vėliau nustatyta, kad inhibuoti gali tiek keturvalentis azotas, tiek cholinas (1.8 pav.), arba junginys, turintis teigiamą bazinį radikalą (pKa > 9) fiziologiniame pH intervale.

1.8 pav.Cholino ir prekursoriaus ryšys (Vial and Calas, 2000)

Buvo susintetinta daugiau nei 100 jonizuotų junginių tame pH ir tirta in vitro, kad nustatyti jų aktyvumą su užkrėstais P. falciparum eritrocitais (Ancelin ir kt., 1998) (Calas ir kt., 1997) (Calas ir kt., 2000). Tarp jų 36 junginiai, kurie kaip ir cholinas turėjo vieną ar du keturvalenčius azotus ir lipofilinę alkilo grandinę, nulemiančią inhibuojantį veikimą 50% (CI50) nuo10-6 M iki 10-9 M

(Calas ir kt., 2000) (1.9 pav.). R_{2 N} R1 R3 (CH2)n N R2 R1 R3 , 2Br G19 : R1= R2= R3= C2H5 G25: R1= CH3, R2/R3= -(CH2)4-

Šie keturvalenčiai azoto atomai selektyviai inhibuoja fosfatidylcholino biosintezę (Ancelin ir kt., 1998). Molekulės labai aktyviai veikia intraeritrocitinių parazito stadijų metu (specifiška trofozoinei stadijai), kurios metaboliškai yra aktyviausios. Yra nedidelis tarpusavio santykis tarp fosfolipidų metabolizmo inhibavimo ir parazitų skaičiaus augimo (Ancelin ir kt., 2003b). Šie junginiai vienodai veikia skirtingos kilmės P. falciparum, taip sakant skirtingas, polichemiškai rezistentiškas formas (Ancelin ir kt., 2003b). Tyrimai su ląstelėmis, tolerancija ir terapinis indeksas buvo geri. Tarp šių junginių, G25 buvo pažymėtas kaip pirmos kartos lyderis dėl didelio aktyvumo in vitro (CI₅₀= 0,6 nM prieš P. falciparum) ir in vivo (0.21 mg/kg prieš P.berghei ir 0.08 mg/kg prieš P.chabaudi) bei mažos sintezės savikainos. Junginys G25 taip pat veikė multirezistentiškas Plasmodium formas, nepalikdamas toksiškumo požymių ląstelėse (Calas ir kt., 2000).

Šis junginys taip pat duoda gerus rezultatus gydant užkrėstas P. falciparum Aotus beždžiones vienkartine ir silpna doze (terapinis veikimas matomas nuo 0.01mg/kg). Naudojant radioaktyvų G25 analogą, gauti įdomūs rezultatai: jo akumuliacija yra specifinė ir atvirkščia užkrėstų eritrocitų skaičiui (Wengelnik ir kt., 2002).

Taikinys (greičiausiai cholino transporteris) sąveikauja su analogais, paprastai per elektrostatinę sąveiką, kurią sukelia amonio galvutė. Hidrofobinė katijoninė aplinka ir kiekis atlieka svarbų vaidmenį sustiprinant vidinį atsaką. Didžiausias aktyvumas nustatytas esant apie 250 Åtarp katijonų. Svarbiausią vaidmenį atlieka dipolinės molekulės savybės ir atstumas tarp katijoninių atomų. Didžiausias aktyvumas užfiksuotas esant 21 anglies atomui tarp dviejų keturvalenčių azotų (mažiausiai 14 C yra 20 Å). Visi mėginimai įvesti lipofilinę funkciją ar grandinę mažina aktyvumą (Calas ir kt., 2000).

2. ANTROS KARTOS JUNGINIAI

Nepaisant šių pasisekimų, dėl azoto krūvio, antimalairinės medžiagos adsorbcija per os labai maža. Todėl vartojant junginį su krūviu dideliais kiekiais susidaro problema, jis negali pereiti biologinių, lipofilinių membranų.

Kad sustiprinti oralinę absorbciją anomio radikalai buvo pakeisti kitais katijoniniais radikalais, kurie gali lengviau difunduoti per audinius dėl neutralios pusiausvyros. Junginiai turintys trivalentį azotą vietoj keturvalenčio nedavė tokių rezultatų, kokių buvo tikėtasi (IC50 > 0.1 µM). Tačiau, pakeitus amonio radikalus į amidinius (1.10 pav.), gauti junginiai labiau aktyvūs (IC50 ~ 1 nM) ir daug labiau toleruojami nei G25 (DL 50 > 30 mg/kg pelytėms suleidus intraperitoninėn ertmėn), ir geriau absobuojamas per os (10, 20 kartų). Teigiamas krūvis šioje naujoje serijoje (arba antros kartos junginiuose) yra stipriai delokalizuotas ir suformavo daug stipresnius ryšius (vandenilinius ar joninius) už trivalentį ar keturvalentį azotą. Priešingai nei amonio grupėje,

amidinė dalis ir erdvinė struktūra neturi tokio pačio aktyvumo, kaip cholino transporteris, todėl šie junginiai mažiau veiksmingi.

C HN HN (NH) SPACER R₁ R2 (NH) C NH NH R1 R2 SPACER

1.10 pav. Antros kartos junginių struktūra

Antros kartos junginių biopraeinamumas vartojant per burną vistiek nėra pakankamas dėl dviejų teigiamų krūvių molekulėje (Ancelin ir kt., 2003b)..

2. TREČIOS KARTOS JUNGINYS

1997 metais buvo susintetinti trečios kartos junginiai kaip provaistų pagrindas. Jie chemiškai modifikuojasi iš vaisto į provaistą, kad laikinai panaikintų fizikochemines savybes, kurios neleidžia absorbuotis virškinamajame trakte. Po absorbcijos (arba perėjimo į jautrią ląstelę) provaistai, veikiant fermentams, transformuojasi į aktyvią vaisto formą (1.11 pav.).

S N R1 H O R3 R2 C O R S R' R1 N S H O R3 R2 C O R S R' S N R1 R2 R3 S N R1 R2 R3 Transformacija Transformacija Virškinamojo trakto barjeras 1.11 pav. Provaisto transformacija

Trečios kartos molekulės yra neutralios ir gali daug lengviau skverbtis pro biologines membranas. Aktyvi forma susidaro kraujyje cheminių ar fermentinių (veikia karboksiesterazė arba glutationas) reakcijų metu. Šios reakcijos nulemia vidinio ir tiazolo (T) ciklų formavimąsi, aktyvios formos in situ susidarymą. Tiazolo žiedas sudaro polinę galvutę (1.12 pav.)

N R2 R3 S R1 S R H O N R2 R3 S R1 C H O O R N S R2 R3 R1 glutathion esterase TS TE T

1.12 pav. Provaisto-vaisto transformacijos principas

Trečios kartos junginiai yra 10-100 kartų aktyvesnis už antros kartos junginius. Norint sustiprinti cholino receptorių atsaką, pirmiausia turi būti hidrofobinė katijoninė aplinka. Didžiausias aktyvumas pastebėtas, kai molekulė yra dviguba, o atstumas tarp katijonų yra apie 500Å. Maksimalus aktyvumas gautas su grandine turinčia 12 anglies atomų. Su lipofiliniu aromatiniu junginiu gauti rezultatai nebuvo geri dėl alkilinės grandinės. Protingas radikalo pasirinkimas leidžia surasti pusiausvyrą tarp provaisto stabilumo ir tirpimo vandenyje. Grupė R turi suteikti antrinį netoksišką metabolizmą (RCOOH arba RSH). Pirmieji junginiai susintetinti su alkyl, aryl radikalais yra geri, nes labai aktyvūs, tačiau buvo mažai tirpūs vandenyje. Ištyrus junginius su tretiniu azotu nustatyta, kad fizikocheminės savybės yra geresnės, nes nesunku gauti kristalinius produktus, kurie puikiai tirpūs vandenyje, o gautos druskos yra stabilios. Dauguma junginių pasižymi stipriu antimaliariniu veikimu in vitro (Calas ir kt., 1997/2000; Ancelin ir kt., 1998/2000/2003a/2003b).

Akumuliacijos duomenys surinkti panaudojus žymėtą (radioaktyvų) junginį. Trečios kartos junginiai užkrėstuose P. falciparum eritrocituose koncentruojasi 100 kartų daugiau, palyginus su sveikais. 80% junginio suvartoja parazitas, o 50% junginio atsiranda parazito šizonte. Ten jis nutraukia Plasmodium membranų sintezę eritrocitinėje stadijoje, todėl sugeba visiškai sunaikinti maliarijos sukėlėjus. Nebūna paaštrėjusios infekcijos požymių, nes užkertamas parazito lytinio dauginimosi kelias. Ši molekulė gali būti inhibuota cholino arba jo analogo. Taip pat pastebėta, kad molekulės transportas yra jautrus anijonams ir furozemidui (Biagini ir kt., 2003).

III. ANALITINIO METODO PASIRINKIMAS IR JO VALIDACIJA

Norint nustatyti vaistus ir jų metabolitus biologiniuose mėginiuose, tam reikalinga sukurti patikimą analitinį metodą. Kad galėtume jį naudoti, visu pirma metodas turi būti validuotas (įteisintas). Metodo validacija bioanalizės srityje yra esminis etapas tyrimuose su nauja molekule iki jos patentavimo.

1. ANALITINIO METODO PASIRINKIMAS

Analitinio metodo pasirinkimas yra įtakojamas įvairių skirtingų faktorių, todėl jis atliekamas etapais:

• Pirmame etape nustatomi chromatografiniai parametrai. Dažniausiai vartojami metodai yra dujinė chromatografija su jonų liepsnos ar masių spektro detektoriais ir efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh) su ultraviletiniu, fluorescenciniu, elektrocheminiu ar masių spektro detektoriais. Naudojant dujinės chromatografijos metodą būtina išgarinti tiriamas medžiagų dozes, o tai optimaliai padaryti nėra lengva dėl nelakių daugelio junginių savybių. ESCh metodas priešingai, jis yra puikiai tinkamas nelakioms medžiagoms ir jų metabolitams tirti. Per paskutinius dešimt metų efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh) susijungė su masių spektrometrija ir tapo vienu tiksliausių analitinių metodų ESCh/MS. Šie metodai yra jautrūs ir specifiniai, bei leidžia tirti medžiagų pėdsakus net sumaišytuose kompleksuose. Tik vienintelė šių metodų problema yra jų jautrumas matricos komponentams.

• Antras etapas yra pasirinkti tinkamą detektorių (masių, ultravioletinis, fluorescencinis spektrai). Masių spektro detektorius yra labai tikslus kiekybiškai nustatant medžiagas. Nestipri jonizacija gerai tinka biomolekulių ir jų cheminių savybių nustatymui nenaudojant išgarinimo. Šio etapo metu masių spektrometro parametrai parenkami pagal konos fragmentinį slėgį ir labiausiai atsiliekančius jonus.

• Trečio etapo metu vyksta eliuento (nešančiosios (-čių) medžiagos (-ų)) ir ekstrakcijos būdo pasirinkimas. Biologinės medžiagos ekstrahuojamos skysčiais arba kietomis medžiagomis, taip pat tiriama medžiaga gali būti atskirta ją nusodinant. Ekstrakcijos skysčiais privalumas yra galimybė gauti labai grynas medžiagas. Šio metodo trūkumas yra tai, kad vartojami dideli organinio tirpiklio kiekiai, ilgai trunka analizės laikas ir dėl to sunku automatizuoti procesą. Ekstrakcija kietomis medžiagomis arba per ekstrakcines kolonėlės yra vis dažniau naudojama. Jos privalumai yra stacionarių fazių skirtingumas, leidžiantis atskirti visų tipų junginius, automatizavimo galimybės, taip pat sutaupoma laiko ir suvartojamas mažesnis

biologinių tirpalų ir organinių tirpiklių kiekis palyginus su ekstrakcija skysčiais. Bet gryninimas ir selektyvumas turi ribas, be to automatizavimo įranga yra brangi.

• Ketvirto etapo metu pasirenkamas vidinis etalonas. Jis turi duoti gerus pikus chromatogramoje, išsiskirti tinkamu laiku ir prie tų pačių sąlygų, kaip ir tiriama medžiaga, lengvai ekstrahuotis (Buhrman ir kt., 1996). Paprastai naudojant stabilų izotopą kaip vidinį etaloną, kuris ištirpsta kartu su tiriama medžiaga, jis pagerina metodo tikslumą ir atkartojamumą, nes tiriama medžiaga su vidiniu etalonu išsaugo santykį, kuris nesikeičia. Bet neseni tyrimai (Vander Heyden ir kt., 1998) parodė, kad tiriant mevalono rūgštį su plazma ir šlapimu, esant skirtingoms sąlygoms bei naudojant deuterinius analogus kaip vidinius etalonus, santykis išsaugomas nepakankamai vienodas.

Kiekybinės junginio analizės rezultatai gali būti klaidingi dėl endogeninių medžiagų esančių biologiniame tirpale, kurios koaguliuoja su tiriama medžiaga. Todėl biologinių tirpalų paruošimo esmė yra pašalinti tas medžigas. Tai leidžia: 1) prailginti analitinės kolonos veikimo laiką, kai suleidžiami ekstraktai turintys minimalų endogeninių medžiagų kiekį pagrinde, 2) pagerinti analizės atkuriamumą, 3) nustatyti mažesnius ribinius medžiagų kiekius pašalinant fonines medžiagas iš pagrindo 4) pagerinti analizės tikslumą ir teisingumą ir 5) padidinti selektyvumą.

Tiriant medžiagų biologiniuose tirpaluose farmakokinetinius parametrus ir metabolizmą gali iškilti problemomų dėl susidariusių biologinių kompleksų, pavyzdžiui su krauju, plazma, serumu, šlapimu, tulžimi, išmatomis, organais. Biologinių tirpalų paruošimo problemos įtakojamos: a) silpnos junginio koncentracijos matricoje b) dažnai endogeninė medžiagos koncentracija biologiniuose mėginiuose yra maža, palyginus tyrimuose su ląstelėmis c) dėl mažų analizuojamo tirpalo kiekių ir d) dozavimo metodo pasirinkimo naudojamo tiksliai medžiagos koncentracijai nustatyti (Buhrman ir kt., 1996), (King ir kt., 2000).

.

2. METODO VALIDACIJOS PROCEDŪRA

Metodo validacija suprantama kaip visuma procedūrų, kuriomis parodoma, kaip kiekybiškai ir tiksliai nustatyti tiriamos medžiagos kiekį matricoje. Skirtingi parametrai tokie kaip tikslumas, teisingumas, selektyvumas, specifiškumas, atkartojamumas, atkuriamumas, patvarumas ir galiausiai tiriamos medžiagos stabilumas per visus paruošimo etapus leidžia tiksliai pasirinkti tinkamą analitinį metodą. Validacija yra dinamiška ir pritaikoma keičiant reikalingus parametrus. Taip pat analizės selektyvumas keičiasi dėl maricoje esančių endogeninių medžiagų, atsitiktinių metabolitų,

kartu vartojamų kitų vaistų ar antikoagulianto pasirinkimo, todėl visą laiką metodo analizė turi būti tobulinama.

Visi metodo validacijos etapai pavaizduoti sekančioje schemoje (1.13 pav.). Analizuojamos medžiagos stabilumas tirpale Ekstrakcijos parametų optimizavimas (ECHc) ir paruošimas medžiagos įvedimui

Vidinio etalono pasirinkimas

Koncentracijų parinkimas kalibracinių kreivių sudarymui

Matematinio modelio pasirinkimas koncentracijų apskaičiavimui

Atkartojamumas, minimaliai 5

kalibracinės kreivės tą pačią dieną kalibracinės kreivės skirtingų dienų Atkuriamumas, minimaliai 6

Statistinis atitikimo testas tarp kreivių ir įdėtos medžiagos koncentracijos

-Ryšys trap

Cteorinė / Cpraktinė

- Suvartojimas - Tyrimų skaičiavimai Nuokrypio (Biais) tyrimas

Teisingumas / Tikslumass Kontroliniai tirpalai, 3 koncentracijų (mažos, vidutinės ir didelės Tiriamos medžiagos ir vidinio etalono ekstrakcijos koeficientas Teorinis Praktinis Procedūros redagavimas

Kiekybės analizės riba Nustatymo riba +Tirpiklio pasirinkimas +Mobiliosios fazės ir pirminio tirpalo stabilumas Nuokrypis (Biais) Stabilumas matricoje

IV. EKSTRAPOLIACIJA ŽMOGUI TAIKANT ALOMETRINIUS METODUS

Tos pačios vaistinės medžiagos farmakokinetiniai parametrai (absoliutus, metabolizmo ar renalinis klirensas, pasiskirstymo tūris, pusinės eliminacijos laikas) įvairių rūšių gyvūnams yra skirtingi. Tačiau ieškota ar nėra ryšio tarp šių parametrų. Buvo iškeltas klausimas, ar farmakokinetiniai vaisto tyrimai su gyvūnais leidžia apskaičiuoti tų pačių parametrų reikšmes ir žmogui.

1. ALOMETRIJOS SUKŪRIMO PAGRINDAI

1.1 Alometrijos sąvoka

Egzistuoja gausūs panašumai tarp skirtingų rūšių žinduolių anatomijos ir fiziologijos. Fiziologinių parametrų duomenys, tokie kaip pratekančio kraujo tūris (debitas), kreatinino klirensas, deguonies suvartojimas tarp skirtinų rūšių gyvūnų varijuoja plačiose ribose. EF. Adolph 1949 metais įrodė, kad egzistuoja ryšys tarp fiziologinių parametrų ir kūno masės arba gyvūno dydžio. Vėlesni tyrimai parodė, kad rezultatai buvo linijiški atvaizdavus logaritmiškai daugelį šių parametrų su svorio funkcija.

Šis ryšys pavadintas alometriniu ryšiu ir fenomenas aprašytas lygtimi:

_{Y = a W}b

Kur

Y = fiziologinio parametro skaičius; W = kūno masė;

a = alometrijos koeficientas; b = alometrinis laipsnis.

Ankstesnę lygybę galima aprašyti ir:

Log Y = log a + b log W a = Y , jei W = 1 ;

Jei W išreikšta kilogramais, a yra parametro skaičius 1 kilogramui kūno svorio; b yra tiesės nuolydis (nuožulnumas), kuris parodo ryšį tarp farmakokinetinių parametrų ir gyvūno svorio; b išreiškia proporcingumą tarp Y ir W. Tad kad egzistuoja ryšys tarp skirtingų fiziologinių parametrų yra nenuginčijama (Adolph EF., 1949).

Dėl šio ryšio ir atsirado naujas tyrimų metodas – alometrija, kuriuo galima apskaičiuoti skirtingus žmogaus farmakokinetinius parametrus pagal kūno masę panaudojant kitų gyvūnų parametrus. Pavyzdžiui nustatytas ryšys tarp kepenų masės, kraujo debito per kepenis ir kūno masės. Jis pavaizduotas 1.14 pav. Tai išreiškia lygtys:

- Kepenų masė (kg) - Kepenų masė (kg) P = 0.0370 W0.849 Q = 0.554 W0.894

- Per kepenis pratekančio kraujo debitas (l/min) - Per kepenis pratekančio kraujo debitas (l/min)

W (gyvūno svoris) išreikštas kilogramais.

W (gyvūno svoris) išreikštas kilogramais.

Kraujo debitas per kepenis (l/min) Kepenų masė (kg) Jautis Kiaulė Jautis Žmogus Ožka Beždžionė Triušis Kiaulė Avinas Ožka Žmogus Šuo Jūros kiaulytė Žiurkė Triušis Beždžionė Pelė Jūros kiaulytė Žiurkė Pelė

1.14 pav. Skirtingų žinduolių alometrinis ryšys tarp kepenų svorio (x-x) ir per kepenis pratekančio kraujo debito (•-•). Pagal H. Boxenbaum, J. Pharmacokin. Biopharm., 8, Nr2, 1980.

Kūno masė (kg)

1.4 lentelėje pateikiamos skaitinės reikšmės, kurių pagalba apskaičiuojamos alometrinės lygys.

1.4 lentelė Skirtingų rūšių gyvūnų kepenų svorio ir kepenų kraujo debito vidurkiai. Pagal H.Boxenbaum, J. Pharmacokin. Biopharm., 8,2, 1980.

RŪŠIS KŪNO MASĖ _(kg) KEPENŲ KRAUJO _{DEBITAS (l/min) (% nuo kūno masės)} KEPENŲ SVORIS Pelė Žiurkė Šuo Kiaulė Beždžionė Žmogus 0.0304 0.2492 16.5 76.8 4.84 70.0 0.00262 0.0172 0.676 3.360 0.250 1.780 5.06 4.04 2.91 1.97 3.25 2.42

1.2 Fiziologinio laiko samprata

Fiziologinis laikas apibūdinamas kaip chronologinio laiko dalis reikalinga fiziologiniam procesui įvykti. Jis yra skirtingas kiekvienai gyvūno rūšiai.

Pavyzdžiui palyginkime dviejų gyvūnų rūšių gyvenimo trukmę: - 14 metų šunims;

- 98 metai žmogui.

Šuo „sunaudoja“ 7,14% savo gyvenimo per metus, kai žmogus 7,14% „sunaudoja“ tik per 7 metus. Vieneri metai šuniui ir septyneri metai žmogui, fiziologinio laiko atžvilgiu, yra ekvivalentiški ir nepriklausomai nuo rūšies sudaro 7,14% gyvenimo laiko.

Panaudojant fiziologinį laiką taip pat galima nustatyti alometrinius ryšius. Žinduolių gyvenimo laikas, išskyrus primatus, duoda geriausius alometrinius santykius, kai alometrinė eksponentė yra lygi 0,28. Taigi buvo rastas ryšys (turintis tą pačią alometrinę eksponentę) tarp kvėpavimo ciklo ir širdies ritmo laiko:

• _{Kvėpavimo ciklo trukmė (sekundė) = 0,169 * W}0.28

• Širdies ritmo laikas (sekundė) = 0.0428 * W0.28

Tos pačios medžiagos klirensas yra žymiai didesnis mažiems gyvūnams (pelė, žiurkė) palyginus su dideliais gyvūnais (šuo, kiaulė, beždžionė) ar žmogumi. Galime daryti išvadą, kad farmakokinetiniai parametrai yra skirtingi kiekvienai gyvūnų rūšiai. Per fiziologinį laiko ekvivalentą maži gyvūnai vaistus pašalina daug greičiau nei dideli (Labaune et Wepierre, 1988).

2 FARMAKOKINETIKA, ALOMETRIJA IR FIZIOLOGINIS LAIKAS

2.1. Alometriniai ekstrapoliacijos metodai pagal Boxenbaum‘ą

Boxenbaum‘as žmogui farmakokinetiuns parametrus siūlė apskaičiuoti pagal egzistuojantį alometrinį ryšį tarp nustatytų gyvūnų farmakokinetinių parametrų ir kūno masės.

• Klirensas (CL)

Galima nustatyti vaisto klirenso išreikšto logaritmiškai ir gyvūno kūno masės santykio tiesinę lygtį pagal formulę:

CL (ml/min) = a x Wb CL = klirensas (ml/min); W = kūno masė (kg).

• Pasiskirstymo tūris (Vd)

Žinduolių raumeninių audinių fizikochemines savybės yra panašios, todėl patekę vaistai turės panašias savybes skirtingiems audiniams, nepriklausomai nuo gyvūno rūšies kuriam atlikta administracija. Bet yra aišku, kad kaskart vienodo alometrinio ryšio gali ir nebūti, todėl kad vaistų sąveika su plazmos ir/ar audinių proteinais nėra vienoda skirtingų rūšių gyvūnams. Alometrinis ryšys išreikštas lygtimi:

Vd (l) = a x Wb Vd = pasiskirstymo tūris (l); W = kūno masė (kg).

• Pusinės eliminacijos laikas (t1/2)

Žinant pasiskirstymo tūrį ir klirensą galima apskaičiuoti pusinės eliminacijos laiką kiekvienai gyvūnų rūšiai:

t1/2 = 0.693 x Vd / CL

Alometrinis ryšys yra išreikštas lygtimi:

t1/2 = a x Wb

(Boxenbaum H., 1980).

2.2 Rūšies ilgaamžiškumo įtaka ir potencialiai maksimalios gyvenimo trukmės

(MLP) samprata

Daugelio vaistų metabolizmo greitis žmonėms yra lėtesnis nei kitiems gyvūnams. Tai priklauso nuo daugelio faktorių, bei nuo gyvūno ilgaamžiškumo.

Galima apibrėžti potencialiai maksimalią gyvenimo trukmę « maximum life span potential » (MLP) kiekvienai rūšiai, kurias aprašo sekančios formulės:

MLP (metai) = 10.839 (BW) 0.363 * (W)-0.225 (Boxenbaum‘o ryšys)

Kur: BW = smegenų masė (g), W = kūno masė (g) (Boxenbaum H., 1980).

Šie stebėjimai rodo, kad farmakokinetiniai parametrai gali keistis ne tik dėl gyvūno svorio, bet ir nuo rūšies ilgaamžiškumo. 1.5 lentelėje pateikti skirtingų rūšių gyvūnų duomenys.

1.5 lentelė Potencialiai maksimalus skirtingų gyvūnų gyvenimo ilgis. Pagal H. Boxenbaum, J. Pharmacokin. Biopharm., 10, 2, 1982.

RŪŠIS KŪNO MASĖ (g) SMEGENŲ MASĖ

(g) MASĖ / KŪNO % SMEGENŲ MASĖ MAKSIMALI GYVENIMO TRUKMĖ (metai) Pelė Žiurkė Jūros kiaulytė Triušis Šuo Kiaulė Avinas Beždžionė Žmogus 23 250 270 2550 14200 77200 57600 4700 70000 0.334 1.880 3.420 9.970 75.400 58.200 110.000 62.000 1530.000 1.45 0.75 1.27 0.39 0.53 0.08 0.19 1.32 2.19 2.7 4.7 6.7 8.0 19.7 11.4 18.3 22.3 93.4

2.3 Kreivių išvedimas

Gyvūno dydis yra esminis faktorius, kuris įtakoja farmakokinetinių parametrų reikšmę. Alometrijos tikslas yra viena kreive parodyti tiriamos medžiagos kinetiką visiems žinduoliams. Todėl pirmiausia reikia atlikti du perskaičiavimus:

• plazmines koncentracijas išreikšti mg/kg • chronologinį laiką išreikšti fiziologiniu.

Fiziologinis laikas (pagal R.L. Dedrick’ą) yra vidutinis kraujo trukmės laikas vaskuliarinėje sistemoje ir išreikštas:

Kraujo kiekis / Širdies debitas

Šis laikas žmogui (kaip mato vienetas) yra 1 minutė, jis kinta su skirtigų rūšių kūno mase, todėl galime užrašyti sekantį alometrinį ryšį:

T (min) = a W0.2

1.6 lentelė Vidutinis kraujo viešnagės laikas vaskuliarinėje sistemoje. Pagal R. L. Dedrick, Cancer

Chemotherapy Reports, 54, 2, 1970.

RŪŠIS VIDUTINĖ KŪNO MASĖ

(kg) LAIKAS (min) Pelė 0,022 0.13 Žiurkė 0,16 0.22 Beždžionė 4 0.49 Šuo 5 0.52 Žmogus 70 1.00 Viena minutė chronologinio laiko žmogui yra ekvivalentiška 0,13 minutės pelei arba 0,52 minutės šuniui. Farmakokinetikos atžvilgiu, kad išvalyti tą patį plazmos kiekį vienam kilogramui kūno masės, pelei reikia 0,13, šuniui 0,52 o žmogui 1 minutės (Sacher, 1959).

Dažnai ekstrapoliacijos rezultatai dažnai būna netikslūs. Siekiant juos gauti kuo patikimesnius, kuriami nauji skačiavimo metodai. Norint apskaičiuotį vieną kreivę, kuri parodytų tiriamos medžiagos kinetiką visiems žinduoliams, reikia keisti laiko (x ašis) ir medžiagos koncentracijos kraujo plazmoje (y ašis) išraišką. Tokiu būdu gaunamos įvairios kreivės, pagal kurias (žinant gyvūno svorį ir panaudojus alometrinę lygtį) skirtingiems gyvūnams, o tuo pačiu ir žmogui galima apskaičiuoti farmakokinetinius parametrus. Išraiškos turi tam tikrus pavadinimus ir yra sekančios:

• Kallynochronai (Elementarus Dedrick’o metodas)

Y ašis = koncentracija / (Dozė/W)

X ašis = laikas / W 1 – b

b = alometrinės lygties eksponentė siejanti klirensą ir kūno masę (W)

• Apolysichronai (Kompleksinis Dedrick’o metodas)

Y ašis = koncentracija / (Dozė/W c)

X ašis = laikas / W c - b

c = alometrinės lygties eksponentė siejanti pasiskirstymo tūrį ir kūno masę

• Dienitochronai

MLP taip pat naudojama lygtyje. Pavyzdžiui Dedrick‘o kompleksinė lygtis bus sekanti:

Y ašis = koncentracija / (Dozė/W c)

X ašis = (laikas / MPL) (1 / W c – b)

EKSPERIMENTINIAI TYRIMAI

I. VALIDUOTAS ANTIMALIARINĖS MEDŽIAGOS ANALIZĖS METODAS,

DARBO METODIKA IR ANALIZĖS REZULTATAI

1. ANALIZĖS METODO PARINKIMAS

Mūsų tirta molekulė nėra laki. Trūkstant chromoforinių grupių ir esant jonizuotam keturvalenčiui azotui buvo pasinktas ESCh metodas su masių spektrometru. Atsižvelgus į kitas tiriamos molekulės charakteristikas parinktos chromatografinio atskirimo sąlygos: mobili ir stacionari fazės, kiti techniniai efektyviosios chromatografijos parametrai. Sukurtos ekstrakcijos salygos medžiagų išskyrimui iš kraujo plazmos.

Galiausiai nuspresta, kokį junginį galima būtų vertinti kaip tinkamiausią vidinį standartą kiekybiniam nustatymui. Mūsų metodui juo pasirinktas Verapamilis dėl stiprių pikų biologiniame pagrinde ir tinkamo išsiskyrimo laiko. Verapamilis išsiskiria prie tų pačių chromatografinių sąlygų kaip ir tiriama medžiaga, taip pat lengvai ekstrahuojasi.

2. NAUDOTOS MEDŽIAGOS

Antimaliarinis junginys susintetintas Aminorūgščių, Peptidų ir Proteinų laboratorijoje, CNRS UMR 5810 (Montpellier I ir II Uuniversitetai, Montpellier, Prancūzija). Verapamilis gautas iš Sigma (St. Louis, MO, JAV) ir laikytas tinkamoje temperatūroje bei tamsoje. Acetonitrilas, metanolis, dichlormetanas ir trifluoracto rūgštis atitinka kokybės reikalavimus ir gali būti naudojamos ESCh. Medžiagų tiekėjas Merck (Darmstadt, Vokietija).

Kalibracinės eilės ir kontrolinių tirpalų paruošimui panaudota žmogaus (Kraujo perpylimo centras, Languedoc Roussillon, Montpellier, Prancūzija) ir žiurkių plazma (Sprague-Dawley žiurkės, IFFA CREDO, L’Arbresle Cedex, Prancūzija). Plazma laikoma užšaldyta –30°C temperatūroje visą galiojimo laiką.

Tiriamosios medžiagos pirminis tirpalas (64 mg/l, joninėje būsenoje) ir verapamilis (250 mg/l, vidinis etalonas) buvo pagaminti ištirpinant distiliuotame vandenyje ir sumaišyti su metanolio ir distiliuotu vandens tirpalu (1:100), kad geriau ištirptų.

3. CHROMATOGRAFINĖ ĮRANGA IR SĄLYGOS

Pagal pasirinktą mobiliąją fazę bei medžiagos masės ir krūvio santykį (MZ) parinktos optimalios metodo sąlygas, kad gauti geriausią jautrumą ir selektyvumą. Taip pat chromatografinio atskyrimo kokybei įtakos turi ESCh konos įtampa.

Skysčių chromatografas Alliance 2690 (Waters, Milford, MA, JAV) automatizuotai atlieka darbą su medžiagų mėginiais. Chromatografinis atskyrimas atliekamas su Xterra kolona (30 mm ilgio, 2,1 mm vidinio diametro, Waters, Milford, MA, JAV) esant linijiniam gradientui, kurį sudaro nuo 100% vandens su 0,1% trifloracto rūgšties (TFA) iki 100% acetonitrilo su 0,1% TFA. Ciklas trunka 8 minutes: a) kolonos plovimas iki galutinio gradiento, b) laikas iki pradinių gradientų ir c) laikas reikalingas pusiausvyrai kolonoje atkurti. Absoliutus analizės laikas yra 14 minučių. Mobiliosios fazės tekėjimo greitis chromatografinėje sistemoje yra 400 µl/min ir keičiamas į 35 µl/min prieš įeinant į detektorių.

Masių spektro parodymai užrašomi vienetinių jonų nustatytomo (SIR) būdu.

Verapamilio masės ir krūvio santykis yra (M+H)+ m/z 455.3 (2.1-A pav.). Antimaliarinė medžiaga turi du masės ir krūvio santykius: keturvalentė amonio druska turi (M2+/2) m/z 227.3 ir papildomai su TFA nustatyta (M+TFA)+ m/z 567.3, (2.1-B pav.).

200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 m/z 0 100 % 455.7 457.1

A

200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 m/z 0 100 % 455.7 457.1

A

B

568 227.7

B

568

B

B

568 227.7

2.1 pav. Verapamilio (A) ir antimaliarinio junginio (B) masių spektrai

4. TIRPALŲ PARUOŠIMAS

4.1 Analitinių tirpalų paruošimas

Analitinis tirpalas paruošiamas veikliąją medžiagą tirpinant su distiliuotu vandeniu. Pagaminama 11 tirpalų, kuriuose tiriamos medžiagos koncentracija kinta nuo 0,16 iki 32 mg/l. Verapamilis praskiestas 1/20 su distiliuotu vandeniu.

Kad patikrinti ESCh sistemos efektyvumą prieš kiekvieną tirpalų seriją suleidžiamas analitinis tirpalas paruoštas su 0,1% TFA (veikliosios medžiagos koncentracija 3mg/l, Verapamilio – 2,5 mg/l).

5.2 Kalibracinės eilės ir kontrolinių tirpalų paruošimas

Kalibracinės kreivės (eilės) paruošimui naudojama 20 µl analitinio tirpalo ir pridedama 0,5 ml kraujo plazmos. Veikliosios medžiagos koncentracijos yra: 6.4, 12.8, 32.1, 64.2, 128.2, 320.6, 641.2 ir 1282 ng/ml. Trys kontroliniai tirpalai ruošiami tokiu pat būdu, kuriuose medžiagos koncentracija yra: 16, 160,3 ir 961,9 ng/ml.

5.3 Mėginių paruošimas

Į paruošimą įeina ekstrakcija kieta faze su Oasis HLB Waters 1cc ( Waters, Milfird, MA, JAV) ekstrakcijos kolonėlėmis turinčiomis pagrinde hidrofilinį kopolimerą N-vinylpyrrolidono ir lipofilinį divinylbenzeną (2.2 pav. ). Šios ekstrakcijos kolonėlės geriau atskiria hidrofilines nei lipofilinės medžiagas. Atskyrimo galia yra didesnė su tradiciniais siliciais.

O N

_{N-Vinylpirrolidonas Divinylbenzenas}

2.2 pav. Baziniai HLB eksrakcijos kolonėlės monomerai

Prieš naudojant šios ekstrakcinės kolonėlės paruošiamos praleidžiant 1 ml metanolio, po to 1 ml distiliuoto vandens. Į polietileninius 5 ml mėgintuvėlius įpilama 0,5 ml vandens turinčio 1% TFA ir 20 µl vidinio etalono (12.5 µg/ml). Mišinys sumaišomas sūkurio pagalba, centrifuguojamas 15 min 3000 aps/min greičiu (4 °C temperatūroje), paskui skystis įvedamas į ekstrakcinę kolonėlę. Tada ji iškart plaunama 1 ml distiliuoto vandens. Veikiąją medžiagą išplauname du kartus su 1 ml acetonitrilo turinčio 0,1 % TFA. Išplautas skystis džiovinamas su skystu azotu 40°C temperatūroje. Sausas likutis ištirpinamas 100 µl acetonitrilo turinčio 0,1% TFA. 3 µl tirpalo suleidžiami į ESCh sistemą.

6. VALIDUOTO METODO REZULTATAI

Antimaliarinė medžiaga išsiskiria 4,4 min (CV= 1.6 %, n = 20), o vidinis etalonas 5.9 min (CV = 1.7 %, n = 20). Chromatogramos pavaizduotos 2.3 pav.

2.3 pav. Verapamilio (vidinio etalono) 5 µg/ml (A) ir veikliosios medžiagos 1 µg/ml (B) chromatogramos plazmoje.

Buvo nustatyta tiesinė ploto po chromatografijos smailėmis priklausomybė. Rezultatai paskaičiuoti (analizuojamos medžiagos piko plotas / vidinio etalono piko plotas) pagal formulę: y = ax2 + bx + c.

Vidutiniai lygties parametrai yra sekantys: a = - 1.05 x 10-8 ± 0.64 x 10-7, b = 0.895 x 10-3 ± 0.124 x 10-3 (C.V. = 14 %), c = -0.0092 ± 0.017 (n = 10)

Perskaičiuotos koncentracijos pateiktos 2.1 lentelėje. Teisingumas ir tikslumas pateikti 2.2

lentelėje. 2 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 T im e -0 1 0 0 % E 0 9 1 1 0 4 -3 8 S IR o f 5 C h a n n e ls E S + 2 2 7 .3 + 5 6 7 .3 2 .4 7 e 7 4 .4 0 A 2 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 T im e -0 1 0 0 % E 0 9 1 1 0 4 -3 8 S IR o f 5 C h a n n e ls E S + 2 2 7 .3 + 5 6 7 .3 2 .4 7 e 7 4 .4 0 2 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 T im e -0 1 0 0 % E 0 9 1 1 0 4 -3 8 S IR o f 5 C h a n n e ls E S + 2 2 7 .3 + 5 6 7 .3 2 .4 7 e 7 4 .4 0 A

2.1 lentelė Vidutinės perskaičiuotos koncentracijos (± paklaida )

Teorinė koncentracija (ng/ml) Persaičiuota koncentracija (ng/ml) Variacijos koeficientas CV (%) Kiekis procentais (%) 6.4 6.4 20.0 100.0 12.8 14.3 16.6 111.7 32.1 34.2 6.9 106.5 64.2 61.2 11.6 95.3 128.2 127.2 6.0 99.2 320.6 323.3 7.7 100.8 641.2 649.6 5.8 101.3 1282 1278.6 0.9 99.7 2.2 lentelė Metodo teisingumas ir tikslumas

Teorinė koncentracija ng/ml Perskaičiuota koncentracija ng/ml Teisingumas % Tikslumas % Žmogaus plazma Tą pačią dieną (n=6) 16.0 _{17.2 7.8 107.5} 160.3 _{151.7 5.4 94.6} 961.9 _{890.7 7.4 92.6} Skirtingų dienų (n=7) 16.0 18.1 14.6 113.1 160.3 167.1 11.9 104.2 961.9 1004 9.2 104.4 Žiurkių plazma Skirtingų dienų (n=6) 16.0 15.8 14.0 98.8 160.3 164.9 5.6 102.8 961.9 962.1 6.8 100.0

• Metodas tikslus, nes nuokrypis nuo tikrosios koncentracijos neviršijo 15% ( 94-100%). • Metodas teisingas, nes medžiaga nustatoma 85-115% ribose.

Vidutiniai ekstrakcijos koeficientai yra:

• Veikliąjai medžiagai (n = 9): 87 ± 5.3% • Verapamiliui (n = 3): 83 ± 6%

Šis metodas buvo validuotas dėl aiškumo, tikslumo, specifiškumo, atkuriamumo ir atkartojamumo. Taip pat lengvai pritaikomas kitiems tos pačios cheminės serijos junginiams. Analizės metodo validacija buvo atlikta pagal FDA ir Geros Laboratorines Praktikos reikalavimus (Fr –BPL, Eu-GMP) (Bressolle ir kt., 1996). Papildomai buvo atliktas junginių stabilumo tyrimas su žmogaus ir žiurkės plazma.

6. STABILUMO TYRIMAI IR JŲ REZULTATAI

Buvo atlikti pirminio tirpalo su plazma vieno mėnesio stabilumo tyrimai. Stabilumas tirtas laikant pastovioje 4°C temperatūroje. Rezultatai pateikiami 2.3 lentelėje. Tiriama veiklioji medžiaga (skirtingų koncentracijų) išlieka stabili 6 valandas 20°C ir 4°C temperatūrose. Užšaldžius -30°C temperatūroje ši medžiaga plazmoje yra stabili 2 mėnesius. Išekstahuotuose tirpaluose (su acetonitrilu turinčiu 0.1 % TFA) nustatyta, kad skirtingų koncentracijų tiriamoji medžiaga pastovioje +4°C laipsnių temperatūroje yra stabili 24 valandas. Šios ištraukos negalima užšaldyti, nes pastebėti reikšmingi precipituotos veikliosios medžiagos koncentracijos pokyčiai. Veikliąjai medžiagai esant joninėje būsenoje tris kartus ją užšaldžius ir atšildžius užfiksuotas jos nustatomo kiekio sumažėjimas (netektis <10%).

2.3 lentelė Vidutinės koncentracijos (± paklaida) po 6 valandų 20°C ir 4°C temperatūrose dviejuose tirtuose pagrinduose

Atrasta procentais (± paklaida) Teorinė koncentracija

(ng/ml) _{20°C 4°C}

16,0 90,8 ± 8,0 106 ± 10,0 160,3 99,8 ± 14,5 107 ± 9,7 961,9 104 ± 9,3 95 ± 4,3

II. TYRIMAI SU GYVŪNAIS

Visi tyrimai su gyvūnais atlikti pagal Etikos Komiteto patvirtintą protokolą ir Geros Laboratorinės Praktikos su gyvūnais taisykles. Tyrimų tikslas: įvesti veikliąją medžiagą gyvūnams ir po tam tikro laiko paimti kraujo mėginius. Vėliau, pagal nustatytas koncentracijas, apskaičiuoti tirtos medžiagos farmakokinetinius parametrus bei palyginti antimaliarinės medžiagos aktyvumą skirtingų rūšių gyvūnams.

Farmakokinetinės analizės metu siekiama nustatyti: • Cl - klirensą,

• Vd - pasiskirstymo tūrį,

• t1/2 - pusinės eliminacijos laiką.

1. ŽIURKĖS

2.4 lentelė Gyvūnai

Rūšis Sprague-Dawley žiurkės

Lytis patinai Amžius 6 - 7 savaitės Svoris tarp 200 ir 300 g Aplinkos parametrai Temperatūra 20 - 24°C Oro drėgnumas 40 - 70 % Oro cirkuliacija (vėdinimias)

10 - 12 pasikeitimai per valandą Šviesos periodas 12/24 valandų

Apgyvendinimas Po 3 gyvūnus viename makrolono narve

Gėrimas Laisvas priėjimas prie vandens. Vanduo analizuojamas 2 kartus per metus dėl galimos fizikinės ir cheminės kontaminacijos (Bertrand Gėrimų Institutas, 34000

Montpellier, Prancūzija), ir 4 kartus per metus dėl biologonio užterštumo

Maitinimas Granulės graužikams (SAFE®) su gamintojų analizės sertifikatu patvirtinančiu apsaugą nuo kontaminacijos (bakterijų, mikotoksinų, organinių chloro ir fosforo pesticidų, sunkiųjų metalų ir nitro junginių).

Pasiruošimas tyrimo procedūroms

Gyvūnų skaičius 48 Identifikacija Etiketės ant narvo

Administracija

Įvedimo būdas Tirpiklis Dozė * (mg/kg)

Administracijos tūris (ml/kg)

Intraveninis NaCl 0.9 % 3 2

* junginys joninėje būsenoje Mėginių paėmimas

Paimti kraujo mėginiai (3 gyvūnai vienam laiko mėginiui) iš abdominalinės aortos ir supilti į mėgintuvėlius su antikoaguliantu (ličio heparinu).

Mėginiai paimti: 0.083. 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 ir 24 valandos po intraveninės injekcijos.

Kiekvienas kraujo mėginys išcentrifuguotas (2000 aps/min, trukmė 20 min, 4°C) ir plazma užšaldyta -20°C temperatūroje.

Mėginių analizė

Mėginių analizė atlikta pagal anksčiau aprašytą metodą.

2. BEŽDŽIONĖS

2.5 lentelė Gyvūnai

Rūšis Macaque fascicularis

Tiekėjas Tube Le Vallon (Mauricijaus salos)

Lytis Patinai Amžius 4 – 8 metų Svoris 3 ir 4 kg Aplinkos parametrai Temperatūra 22 ± 2°C Oro drėgmė 40 - 70 %

Oro cirkuliacija 10 - 12 cirkuliacijos ciklų per valandą

Šviesos periodas 12/24 valandos

Maitinimas Granulės primatams (SAFE®) su gamintojų analizės sertifikatu patvirtinančiu apsaugą nuo kontaminacijos (bakterijų, mikotoksinų, organinių chloro ir fosforo pesticidų, sunkiųjų metalų ir nitro junginių).

Gėrimas Laisvas priėjimas prie vandens. Vanduo analizuojamas 2 kartus per metus dėl galimos fizikinės ir cheminės kontaminacijos (Bertrand Gėrimų Institutas, 34000 Montpellier, Prancūzija), ir 4 kartus per metus dėl biologonio užterštumo

Pasiruošimas tyrimo procedūroms

Gyvūnų skaičius 4 Identifikacija Etiketės ant narvo

Administracija Gyvūnų

skaičius Įvedimo kelias Tirpiklis

Dozė * (mg/kg)

Administracijos tūris (ml/kg)

4 Intraveninis NaCl 0.9 % 3 1

* : junginys joninėje būsenoje Mėginių paėmimas

Paimti kraujo mėginiai (5 ml) iš šlaunies venos ir supilta į polipropileninius mėgintuvėlius su antikoaguliantu (ličio heparinu).

Mėginiai paimti:T0 (prieš administraciją), 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 ir 24 valandos po junginio intraveninės injekcijos.

Po to centrifuguota 3000 aps/min 15 minučių, plazma perpilta į naujus polipropileninius mėgintuvėlius (mėgintuvėlių tūris 1 ir 0,5 ml) ir užšaldyta -20°C temperatūroje.

Mėginių analizė

Mėginių analizė atlikta pagal anksčiau aprašytą metodą.

3. ŠUNYS

2.6 lentelė Gyvūnai

Rūšis Babesia canis

Lytis Patinai

Svoris 12.2-17.5 kg

Aplinkos parametrai

Temperatūra 20 - 24°C

Oro drėgmė 40 - 70 %

Vėdinimas 10 - 12 ciklų per valandą

Šviesos periodas 12/24 valandų

Maitinimas Standartinis režimas

Gėrimas Laisvas priėjimas prie geriamo vandens

Pasiruošimas tyrimo procedūroms

Stabilizacija Prieš 6 dienas

Gyvūnų skaičius 8 Identifikacija Etiketė ant narvo Tyrimų eiga

Kiekvienas šuo prieš veikliosios medžiagos įvedimą buvo pasvertas. Užregistruojami neišvengiami įvykiai: elgesys ir tolerancija gydymui buvo tiriami viena valanda po administracijos ir 4 kartus per dieną taip iki tyrimų pabaigos.

Buvo sušvirkštos 3 mg/kg antimaliarinės medžiagos dozės. Kraujo mėginiai (vidutiniškai po 3 ml) buvo supilti į plastikinius mėgintuvėlius su EDTA.

Mėginiai paimti: 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360 minutės po intraveninės injekcijos. Po to centrifuguota 3000 aps/min 15 minučių, plazma perpilta į naujus polipropileninius mėgintuvėlius su antikoaguliantu (ličio heparinas) ir užšaldyta -20°C temperatūroje.

Mėginių analizė

Mėginių analizė atlikta pagal anksčiau aprašytą metodą.

4. KIAULĖS

2.7 lentelė Gyvūnai

Rūšis Porcine Large White (kastruoti)

Lytis patinai

Svoris apie 40 kg

Aplinkos parametrai

Temperatūra 20 - 24°C

Oro drėgmė 40 - 70 %

Vėdinimas 10 - 12 ciklų per vandą

Šviesos periodas 12/24 valandų

Maitinimas standartinis režimas

Pasiruošimas tyrimo procedūroms

Stabilizacija prieš 6 dienas

Gyvūnų skaičius 3 Gyvūno pasirinkimas

Mokslininkų nustatyta, kad kiaulės modelis yra labai artimas žmogui dėl fiziologinių panašumų. Gyvūnai laikomi ir tiriami UCPE (Karinis tropinių ligų tyrimų centras), laikantis visų GLP sąlygų.

Tyrimų eiga

kiaulėms suleistas anestetikas;

2tra diena: 7 ml kraujo mėginių paėmimas prieš intraveninę administraciją; 2tra diena: tiriamos medžiagos inraveninė administracija (3 gyvūnai);

2tra diena: mėginiai paimti: 5, 10, 30 min, 1, 2, 4, 8, 12 ir 24 valandos po intraveninės injekcijos; Mėginiai supilti į mėgintuvėlius su ličio heparinu (7 ml). Plasma atskirta nuo eritrocitų centrifuguojant (5 min., 4000 aps/min) ir padalinta į 2 mėginius, vidutiniškai po 2 ml ir užkonservuota -80 °C temperatūroje iki analizės.

Mėginių analizė

Mėginių analizė atlikta pagal anksčiau aprašytą metodą.

5. REZULTATAI

Visų tirtų gyvūnų rūšių koncentracijos plazmoje buvo perskaičiuotos į 3 mg/kg dozę ir pateiktos 2.13 lentelėje.

2.8 lentelė Vidutinė koncentracija (mg/l) plazmoje po 3mg/kg junginio įvedimo

laikas (val.) 0.083 0.25 0.5 1 2 4 6 8 12 24 konc. 4.77 2.28 0.82 0.113 0.039 0.022 0.0000 0.0106 0.00499 žiurkė SD* 0.71 0.19 0.46 0.037 0.005 0.009 0.0000 0.0149 0.00433 konc. 10.3 6.63 3.24 0.760 0.328 0.119 0.0364 0.0225 beždžionė SD* 1.6 1.78 0.32 0.111 0.074 0.040 0.0133 0.0086 šuo konc. 2.91 1.69 1.37 1.62 0.106 0.0295 0.0140 0.00179 konc. 4.54 2.53 0.580 0.142 0.0467 0.00866 kiaulė SD* 1.32 0.84 0.197 0.032 0.0061 0.00284 *SD – paklaida 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 10 100 0 5 10 15 20 25 30 t cen tr at io n o f T 3 ime (hours) p lasma co n Veikliosios medžiagos koncen-tracija plazmoje (mg/l) rat monkey dog pig žirkė beždžionė šuo kiaulė Laikas (val)

2.4 pav. Veikliosios medžiagos koncentracijos ir laiko grafikas

Iš 2.4 pav. matome, kad tirtos medžiagos koncentracija skirtingų rūšių gyvūnų plazmoje laikui einant proporcingai mazėja.

6. FARMAKOKINETINIŲ PARAMETRŲ SKAIČIAVIMAS

Farmakokinetiniai parametrai apskaičiuojami pagal formules: Pasiskirstymo tūris

Vd = bendras vaisto kiekis organizme / vaisto koncentracija plazmoje Pusinės eliminacijos laikas

t 1/2 = 0,693 x Vd / C = -ln (C1 – C2) / (t1 – t2); Klirensas

Cl = F * dozė / AUC

AUC - plotas po medžiagos koncentracijos plazmoje kreive (apskaičiuojamas pagal ESCh chromatogramas);

F - biopraeinamumas (nustatytas medžiagos kiekis / įvestas medžiagos kiekis);

Šiuos skaičiavimus automatizuotai atlieka prancūzų programa PK-FIT (2001). Pagal nustatytas koncentracijas apskaičiuoti: pusinės eliminacijos laikas, pasiskirstymo tūris ir klirensas. Rezultatai pateikti 2.9 lentelė.

2.9 lentelė Perskaičiuotų farmakokinetinių parametrų vidurkiai

Pusinės eliminacijos laikas (val) Pasiskirstymo tūris (l/) Klirensas (l/val) vidurkis 11.8 3.61 0.300 žiurkė sd 0.83 0.44 0.074 vidurkis 3.62 12.7 2.46 beždžionė sd 0.52 2.27 0.44 vidurkis 3.0 54.1 12.7 šuo sd 1.4 23.9 0.7 vidurkis 0.850 110 94.7 kiaulė sd 0.10 24.4 29.8 sd - paklaida