LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Kęstutis Maciūnas
PLYŠINIŲ JUNGČIŲ MODELIAVIMAS IR
JO TAIKYMAS NEURONŲ BEI
KARDIOMIOCITŲ TINKLŲ TYRIMAMS
Daktaro disertacijaBiomedicinos mokslai, biofizika (02B)
Disertacija rengta 2014–2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje.
Mokslinis vadovas
prof. habil. dr. Feliksas F. Bukauskas (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B) 2014 – 2017;
prof. dr. Vytautas K. Veršelis (Alberto Einšteino medicinos koledžas (JAV), biomedicinos mokslai, biofizika – 02B) 2017 – 2019.
Konsultantas
prof. dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto biofizikos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkas
prof. dr. Algimantas Kriščiukaitis (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B).
Nariai:
prof. habil. dr. Arvaidas Galdikas (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, fiziniai mokslai, fizika – 02P);
prof. dr. Armuntas Baginskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02B);
prof. habil. dr. Arūnas Lukoševičius (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, elektros ir elektronikos inžinerija – 01T);
dr. Virginijus Valiūnas (Stony Brook universitetas, biomedicinos moks-lai, biofizika – 02B).
Disertacija ginama viešajame biofizikos mokslo krypties tarybos posėdyje 2019 m. gegužės 10 d. 14 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Simpoziumų salėje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Kestutis Maciunas
MODELLING OF GAP JUNCTION
CHANNEL GATING AND ITS ROLE IN
FUNCTION OF NETWORKS OF NEURONS
AND CARDIOMYOCYTES
Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,
Biophysics (02B)
Dissertation has been prepared at the Institute of Cardiology of Medical Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period 2014–2019.
Scientific Supervisor
Prof. Habil. Dr. Feliksas F. Bukauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B) 2014 – 2017.
Prof. Dr. Vytautas K. Verselis (Albert Einstein College of Medicine, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B) 2017 – 2019.
Scientific Consultant
Prof. Dr. Vytenis Arvydas Skeberdis (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B).
Dissertation is defended at the Biophysics Research Council of the Lith-uanian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Algimantas Kriščiukaitis (Lithuanian University of Health Sci-ences, Biomedical SciSci-ences, Biophysics – 02B).
Members:
Prof. Habil. Dr. Arvaidas Galdikas (Lithuanian University of Health Sciences, Physical Sciences, Physics – 02P);
Prof. Dr. Armuntas Baginskas (Lithuanian University of Health Sciences, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B);
Prof. Habil. Dr. Arunas Lukosevičius (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Electrical and Electronics Engineering – 01T); Dr. Virginijus Valiunas (Stony Brook University, Biomedical Sciences, Biophysics – 02B).
Dissertation is defended at the open session of the Biophysics Research Council at 2 PM on the 10th of May 2019 in the Meetings Auditorium of Institute of Cardiology of Lithuanian University of Health Sciences.
TURINYS
SANTRUMPOS IR SUTARTINIAI ŽYMĖJIMAI ... 7
ĮVADAS... 8
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
Plyšinių jungčių struktūra... 13
Plyšinių jungčių funkcijos širdyje ir neuronų tinkluose ... 14
Plyšinių jungčių laidumo reguliavimas ... 16
Reguliavimas cheminiais veiksniais ... 16
Plyšinių jungčių laidumo priklausomybė nuo įtampos ... 17
Plyšinių jungčių reguliavimo įtampa mechanizmai ... 18
Įtampai jautrių vartų modeliai ... 24
Boltcmano lygtimi aprašytas plyšinės jungties atsidarymo ir užsidarymo procesas ... 24
Homotipinių plyšinių jungčių atsidarymo ir užsidarymo savybių Vogelio-Veingarto 4 būsenų modeliai ... 26
Homotipinių ir heterotipinių plyšinių jungčių keturių būsenų vartinių savybių Moreno modelis ... 28
Stochastinis keturių būsenų plyšinės jungties kanalo vartinių savybių modelis ... 28
Stochastinis 16-os būsenų modelis ... 30
Modelių, aprašančių širdies elektrofiziologiją, apžvalga ... 32
Modeliai, aprašantys atskiro kardiomiocito elektrofiziologiją ... 32
Aritmijų modeliavimas audinyje ... 33
Plyšinės jungtys tarp neuronų ir jų modeliavimas ... 35
2. TYRIMŲ METODIKA... 38
Skaitinis modeliavimas ... 38
Tarpląstelinio ryšio per plyšines jungtis matavimai ... 38
Ląstelių kultūros ir jų paruošimas ... 40
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 41
36-ių būsenų plyšinių jungčių modelis ... 41
Plyšinės jungties stochastinis 36-ių būsenų modelis ... 41
Plyšinės jungties Markovo 36-ių būsenų modelis ... 43
Lėto gj atsistatymo modeliavimas ... 46
gj-Vj histerezė ... 50
Plyšinių jungčių reguliavimo [Mg2+]i modeliavimas ... 52
Funkcinis plyšinių jungčių kanalų efektyvumas ... 54
36-ių būsenų modelio taikymas neuronų tinklo modeliavimui ... 56
Elektrinių sinapsių plastiškumas ... 57
Plyšinių jungčių poveikis neuronų klasterio sinchronizacijai ... 61
Asimetrinis sužadinimo perdavimas elektrinėmis sinapsėmis ... 61
Sužadinimo reverberacija elektrinėmis sinapsėmis besijungiančiame neuronų klasteryje ... 63
Plyšinių jungčių įtakos sužadinimo sklidimui neuronų tinkluose rezultatų aptarimas ... 67
36-ių būsenų modelio taikymas kardiomiocitų tinklo modeliavimui ... 69
Plyšinių jungčių laidumo ir jo anizotropijos pokyčiai sklindant aukšto dažnio sužadinimo bangoms ... 70
Plyšinių jungčių laidumo ir jo anizotropijos įtaka grįžtamo sužadinimo rizikai ... 73
Grįžtamo sužadinimo metu kylantys plyšinių jungčių laidumo pokyčiai ir jų poveikis tolesnei aritmijos dinamikai ... 74
Plyšinių jungčių įtakos sužadinimo sklidimui kardiomiocitų tinkluose tyrimų rezultatų aptarimas ... 78
IŠVADOS ... 79 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 80 MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS ... 95 SUMMARY ... 151 CURRICULUM VITAE ... 160 PADĖKA ... 161
SANTRUMPOS IR SUTART
INIAI ŽYMĖJIMAI
[Mg2+]i – viduląstelinė magnio jonų koncentracija Cx – koneksinas (angl. connexin)
EA – elektrinė anizotropija
Ij – jungties srovė
MC16SM – stochastinis 16-kos būsenų modelis (angl. Markov chain 16-state model)
MC36SM – stochastinis 36-ių būsenų modelis (angl. Markov chain 36-state model)
PJ – plyšinės jungtys
S16SM – stochastinis 16-kos būsenų modelis (angl. stochastic 16-state model)
S36SM – stochastinis 36-ių būsenų modelis (angl. stochastic 36-state model)
Vj – jungties įtampa
Vm – transmembraninė įtampa
Vo – įtampos, krentančios ant kanalo vartų, reikšmė, kuriai e-sant vartų atsidarymo tikimybė Po = 0.5
gj – plyšinės jungties laidumas
γc – uždaros būsenos vienetinio kanalo laidumas γo – atviros būsenos vienetinio kanalo laidumas γres – vienetinio kanalo liekamasis laidumas
ĮVADAS
Plyšinių jungčių (PJ) kanalai susidaro tarp susiglaudusių ląstelių, jie sufor-muoti iš membraninių baltymų – koneksinų (Cx). PJ-ys užtikrina jonų mai-nus, mažų metabolitų ir signalinių molekulių pernašą. Žmogaus genomas ko-duoja 21 tipo Cx [1]. PJ-ių kanalai aptinkami daugumoje gyvūnų ir žmogaus ląstelių. Skirtingi audiniai ekspresuoja įvairių tipų Cx, iš kurių sudarytos PJ-ys pasižymi unikaliomis kanalo savybėmis ir skirtingai reaguoja į tarpląste-linę įtampą (Vj), pH, viduląstetarpląste-linę Mg2+ koncentracija ir kt. cheminius rea-gentus [2]. Didelis PJ-ių paplitimas ir gausi ligų įvairovė, kurias gali sukelti Cx mutacijos, rodo jų svarbą organizmui ir skatina tyrimus.
PJ-ių kanalai yra labai svarbūs įvairiems biologiniams procesams [3, 4], vieni reikšmingiausi jų: impulso sklidimas širdyje [5–9] ir centrinėje nervų sistemoje [10–14]. Šiuos reiškinius sudėtinga stebėti eksperimentų metu, to-dėl įvairių hipotezių validavimui pasitelkiami kompiuteriniai-matematiniai modeliai, kurie leidžia įvertinti sunkiai išmatuojamus fiziologinius procesus. Pirmieji įtampai jautrių PJ-ių kanalo vartų modeliai buvo pristatyti 1981 m. Harris ir jo kolegų darbuose [15, 16], apibūdinti PJ-ių laidumui šiame mo-delyje buvo panaudota Blocmano funkcija. Vėliau, Moreno ir jo kolegos pris-tatė kitą modelį [17], tačiau šis modelis galėjo apibūdinti tik stacionarų PJ-ies laidumą. Taip pat, modelį pristatė Vogel, Weingart ir jų kolegos [18, 19], ku-riant šį modelį buvo laikomasi prielaidos, kad kiekvienas PJ-je esantis Cx yra atitinka sub-vartus, kurie atsidaro-užsidaro nepriklausomai nuo kitų.
PJ-ių vartinių savybių modeliavimas buvo tiriamas ir prof. F. Bukausko vadovaujamos mokslinės grupės darbuose. Pvz., 2009 m. buvo pristatytas 4-ių būsenų PJ-4-ių modelis (S4SM) [20], jis apibūdino greituosius PJ-ies vartus, kurie turi atvirą ir uždarą būseną, kuri uždaro kanalą nepilnai, palikdama lie-kamąjį laidumą. Tai pat, 2012 m. buvo pristatytas 16-kos būsenų PJ-ių mo-delis (S16SM) [21]. Šiame modelyje buvo laikomasi prielaidos, kad PJ-ies kanalą sudaro dvi poros lėtų ir greitų vartų, kurie gali būti atviroje arba užda-roje būsenoje.
Disertacijoje pristatomų eksperimentų rezultatai parodė, kad lėtieji vartai gali turėti dvi arba daugiau uždaras būsenas [22]. Todėl šis modelis buvo išp-lėstas, įtraukiant giliai uždarą būseną (c2), tai buvo vienas iš disertacinio darbo tikslų. Naujame modelyje (S36SM) lėti vartai veikia pagal būsenų schemą: 𝑜𝑜 ↔ 𝑐𝑐1 ↔ 𝑐𝑐2, kur c1 yra pirminė uždara, o c2 – antrinė („giliai už-dara“) būsena, abi uždaro kanalą pilnai. Siekdami pagreitinti skaičiavimą ir pašalinti gj triukšmą, mes transformavome S36SM į Markovo grandinėmis paremtą 36 būsenų modelį (MC36SM). 36-ių būsenų modelis suteikė gali-mybę aprašyti tokias eksperimentiškai stebimas PJ-ių savybes kaip lėtas gj atsistatymas po Vj poveikio bei santykinai mažas funkcionalių kanalų
skaičius PJ-yje. Taip pat šis modelis leidžia apibūdinti PJ-ių vartų regulia-vimą cheminėmis medžiagomis (pvz. Mg2+, H+).
36-ių būsenų modelį panaudojome tirdami sužadinimo sklidimą neuronų tinkle, sujungtame elektrinėmis sinapsėmis. Modelis suteikė galimybę apibū-dinti PJ-ių laidumo pokyčių poveikį sužadinimo perdavimui elektrinėse si-napsėse esant dideliam neuronų elektriniam aktyvumui ar paveikus cheminė-mis medžiagocheminė-mis (pvz. pakeitus [Mg2+]i).
Disertaciniame darbe atliktuose tyrimuose buvo pastebėta, kad sužadinimo bangos sklidimo metu, dėl fazių skirtumo tarp veikimo potencialų (VP) kai-myninėse ląstelėse susidaro pakankamai didelės amplitudės bipoliniai Vj im-pulsai, sukeliantys mažus gj kritimus kiekvieno impulso metu, kurie atsistato iki sekančio impulso. Tačiau šie kritimai gali sumuotis didelio neuronų akty-vumo metu, todėl elektrinės sinapsės gali pasižymėti plastiškumo savybe. Taip pat buvo nustatyta, kad net maži PJ-ių rektifikacijos heterogeniškumai gali sukelti vienkryptį potencialo bangos sklidimą. Tai gali sukurti palankias sąlygas sužadinimo bangos reverberacijai susidaryti, kuri, manoma [23–28], gali būti darbinės atminties veikimo mechanizmo dalis ar gali dalyvauti jos konsolidacijoje į ilgos trukmės atmintį.
Per plyšines jungtis tarp kardiomiocitų plinta elektrinis sužadinimas šir-dies audinyje, todėl PJ-ių laidumas yra vienas svarbiausių veiksnių, nuo kurio priklauso miokardo susitraukimai bei hemodinamika. Normaliomis sąlygo-mis PJ-ių laidumas yra kelis kartus didesnis už minimalų, kurio pakanka per-duoti veikimo potencialą kitai ląstelei, tačiau PJ-ių laidumas gali sumažėti įvairių patologijų atveju, pvz. išemijos metu. Šie laidumo pokyčiai yra siejami su aritmijų bei fibriliacijos susidarymo riziką [7, 8, 29].
PJ-ių laidumas yra jautrus tarpląstelinei įtampai Vj, bet iki šiol beveik ne-buvo tirti PJ-ių laidumo pokyčiai, atsirandantys sklindant sužadinimo bangai tarp kardiomiocitų. Norėdami kiekybiškai įvertinti šiuos pokyčius, atlikome skaitinio modeliavimo ir elektrofiziologijos eksperimentus. Skaitinio mode-liavimo tyrimuose naudojome 36-ių būsenų PJ-ių modelį, kurį sujungėme su Noble lygtimis, aprašančiomis kardiomiocitų elektrinę elgseną.
Disertaciniame darbe tyrėme sužadinimo impulso sklidimo metu susida-rančių Vj impulsų poveikį gj ir elektrinei anizotropijai (EA), taip pat ar jie gali paveikti grįžtamo sužadinimo aritmijos formavimąsi ir tolesnę dinamiką. Mo-deliavimo rezultatai atskleidė, kad VP-lų fazių skirtumas tarp gretimų kardio-miocitų gali sukelti Vj impulsus, kurie nedaug sumažina gj, tačiau esant dide-liam sužadinimo bangų dažniui ar padidėjusiam PJ-ių jautrumui, gj sumažė-jimas gali sumuotis. Tyrimų rezultatai rodo, kad šis sumažėsumažė-jimas gali pakeisti grįžtamo sužadinimo bangos dinamiką. Keisdami modelio parametrus, sie-kėme nustatyti sąlygas, kuriomis esant sužadinimo bangos pradeda daugintis ir virsta į chaotišką procesą, primenantį fibriliaciją.
Dalies modeliavimo rezultatų validavimui buvo atlikti elektrofiziologiniai eksperimentai RIN, Novikoff ir HeLa ląstelių kultūrose, ekspresuojančiose Cx36, Cx43 ir Cx45. Cx43 ir Cx45 formuoja PJ-is, kurios yra aptinkamos miokarde, o Cx36 ir Cx45 – centrinėje nervų sistemoje.
DARBO TIKSLAS, MOKSLINIS NAUJUMAS
Darbo tikslasIšplėtoti PJ-ių kanalų modelį ir jį pritaikyti tiriant PJ-ių kanalų poveikį su-žadinimo bangos sklidimui neuronų ir kardiomiocitų tinkluose.
Darbo uždaviniai
1. Išplėtoti 36-ių būsenų PJ-ies kanalo modelį, įvertinant prielaidą, kad lėtieji vartai gali turėti keletą uždarų būsenų. Ištirti modelio adek-vatumą elektrofiziologinių eksperimentų metu.
2. Sukurti neuronų tinklo modelį, kuriame neuronai tarpusavyje sąvei-kauja per Vj jautrias elektrines sinapses (t. y. PJ-is). Ištirti elektrinių sinapsių reguliacijos įtaką neuronų tinklų veiklai.
3. Sukurti širdies audinio modelį, kuriame kardiomiocitai yra sujungti per Vj jautrias PJ-is. Ištirti PJ-ių įtaką sužadinimo bangų sklidimui, aritmi-jos formavimuisi.
Darbo mokslinis naujumas
Disertaciniame darbe pristatomas 36-ių būsenų modelis suteikė galimybę aprašyti tokias eksperimentiškai stebimas PJ-ių savybes kaip lėtas gj atsista-tymas po Vj poveikio bei santykinai mažas funkcionalių kanalų skaičius PJ-yje. Taip pat šis modelis suteikė galimybę apibūdinti PJ-ių vartų reguliavimą cheminėmis medžiagomis (pvz. Mg2+, H+) [22]. Šios savybės negalėjo būti adekvačiai aprašytos naudojant ankstesnį, 16-kos būsenų modelį [21].
Iki šiol neuronų tinklų tyrimuose naudotuose PJ-ių modeliuose buvo lai-komasi supaprastintos prielaidos, kad PJ-ys pasižymi pastoviu laidumu. Šiame darbe tyrėme eksperimentiškai stebimos PJ-ių laidumo reguliacijos į-taką neuronų tinklų veiklai. Mūsų tyrimų rezultatai rodo, kad esant aukštam sužadinimo bangų dažniui ar didelio jautrumo PJ-ims, gali pastebimai suma-žėti gj. T. y. elektrinės sinapsės gali pasižymėti plastiškumo savybe [30]. Toks laidumo sumažėjimas gali ženkliai paveikti tinklo sinchronizacijos savybes [31]. Modeliavimo rezultatai taip pat parodė, kad dėl PJ-ių rektifikacijos ne-homogeniškumo neuronų tinkle gali kilti sužadinimo bangos reverberacija, kuri siejama su darbines ir trumpalaikės atminties formavimu [31].
Daugumoje kardiomiocitų tinklų modeliavimo tyrimuose taip pat buvo lai-koma, kad PJ-tys nėra jautrios įtampai. Mūsų tyrimų rezultatai parodė, kad gj
gali sumažėti didelio dažnio bangų sklidimo metu, be to, šie gj pokyčiai yra nevienodi skersinėje ir išilginėje kryptyse. Modeliavimo rezultatai parodė, kad grįžtamo sužadinimo bangos metu gj sumažėjimas gali pakeisti tolesnę bangos dinamiką, ir kai kuriomis sąlygomis sukelti spiralinės bangos židinių dauginimąsi, primenantį fibriliacijos metu vykstantį procesą.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
Plyšinių jungčių struktūraVieną PJ-ies kanalą sudaro du puskanaliai (koneksonai), kurių kiekvienas yra sudarytas iš šešių transmembraninių baltymų koneksinų (Cx) molekulių (1.1.1 pav. A). PJ-ių kanalai aptinkami daugumoje gyvūnų, tarp jų ir žmo-gaus, ląstelių ir yra labai svarbūs daugeliui biologinių procesų [3, 4]. Stubu-riniuose PJ-ys sudarytos iš koneksinų, o bestuburiuose – iš koneksinams gi-miningų ineksinų [32, 33]. Žmogaus organizme taip pat yra sintetinami bal-tymai – paneksinai [33], kurie savo struktūra yra artimesni ineksinams nei Cx-ams [34]. Iki šiol žmogaus organizme yra atrasti 21 Cx-no izoforma [1]. Cx-ai dažnai žymimi naudojantis nomenklatūra CxN, kur Cx – koneksino trumpinys (angl. connexin), o N – nurodo jo molekulinę masę kilodaltonais (kDa), pvz.: Cx43 – koneksinas, kurio molekulinė masė apytiksliai lygi 43 kDa [35].
Kanalų sankaupa dviejų ląstelių kontakto vietoje vadinama plyšinės jung-ties plokštele (angl. plaque). Tarpląstelinėje sąveikoje dalyvaujančios PJ-ys gali būti heterotipinės (sudarytos iš skirtingų Cx-o tipų), homotipinės (suda-rytos iš to paties Cx-o tipo) ir heteromerinės (kai bent vienas koneksonas su-darytas iš dviejų ar daugiau skirtingų Cx-o tipų) [36].
Kol kas yra nustatyta tik Cx26 kristalografinė struktūra, tačiau visi Cx-ai turi viduląstelinius NT ir CT baltymo galus, keturis alfa spiralinius transmembraninius domenus (TM1-TM4), citoplazminę kilpą (CL) bei dvi išorines kilpas (E1, E2) (1.1.1 pav. B) [37]. Pagal Cx26 erdvinę struktūrą ka-nalo maksimalus skersmuo yra ~90 Å, ilgis – ~160 Å, o kaka-nalo poros skers-muo – ~10-15 Å. TM1, TM2 ir E1 domenai forskers-muoja kanalo porą, o TM3, TM4 ir E2 yra išsidėstę arčiau membranos bilipidinio sluoksnio [37]. Šeši cisteinai formuoja tris vidumolekulinius disulfidinius tiltelius tarp E1 ir E2 kilpų, kurie stabilizuoja kanalo ekstraląstelinės dalies struktūrą.
1.1.1 pav. Plyšinės jungties kanalo (A) ir koneksino (B) struktūra
Modifikuota pagal [38]
Plyšinių jungčių funkcijos širdyje ir neuronų tinkluose
Normaliam širdies ritmo palaikymui ir impulso sklidimui yra labai svarbus elektrinis ryšys per PJ-is [9]. Žinduolių širdyje elektrinis impulsas generuoja-mas sinusiniame mazge. Vėliau šis impulsas sklinda prieširdžiais per PJ-is esančias tarp kardiomiocitų. Pasiekęs atrioventrikulinį mazgą yra užlaikomas ir toliau sklinda Hiso pluoštu, kol pasiekia skilvelio miokardą.
Širdyje aptinkami Cx30.2, Cx40, Cx43 bei Cx45. Cx30.2 ir Cx45 daugiau-siai randami sinusiniame ir atrioventrikuliniame mazguose, Cx40 – skilvelių laidžiojoje sistemoje bei prieširdžiuose. Cx43 yra labiausiai paplitęs Cx-as, aptinkamas beveik visuose širdies regionuose, ypač darbiniame miokarde, su-darantis didelio laidumo homotipinius kanalus [39]. Cx30.2 ir Cx45 sudaro mažo elektrinio laidumo homotipinius kanalus (atitinkamai 9 ir 32 pS), bei heterotipinius kanalus Cx30.2/Cx45 (17 pS) [2, 38]. Impulsų sklidimo greitis atrioventrikuliniame mazge sumažėja dėl mažo homotipinių ir heterotipinių PJ-ių laidumo [38]. Sinchroninį prieširdžių ir vėliau sekantį skilvelių susit-raukimą palaiko greitas impulso sklidimas per didelio vienetinio kanalo lai-dumo Cx40 ir Cx43 kanalus (atitinkamai 180 ir 115 pS) [40]. Cx43 kanalų laidumo sumažėjimas yra siejamas su įvairiomis patologijomis. Pvz. išemijos progresavimas padidina širdies audinio elektrinį nehomogeniškumą ir suma-žina PJ-ių laidumą, kas gali padidinti aritmijų riziką [5–8]. Širdies audinys
pasižymi natūralia elektrine anizotropija1 (EA) [41]. EA-ja sukelia elipsės pa-vidalo sužadinimo bangos sklidimą dėl didesnio sklidimo greičio išilgai kar-diomiocitų skaidulų. EA-ja smarkiai varijuoja skirtingose širdies dalyse [42]. EA-jos pokyčiai yra vienas iš aritmijų rizikos veiksnių esant tiek fiziologinė-mis, tiek patologinėmis sąlygomis [43–46]. Vienas svarbiausių veiksnių le-miantis EA-ją yra skirtingas laidumas išilgai ir skersai kardiomiocitų, kurį lemia ląstelės geometrija taip pat skirtingas PJ-ių pasiskirstymas išilgai ir skersai kardiomiocitų esančiose PJ-ių sankaupose. PJ-ių laidumo pokyčiai gali pakeisti širdies audinio EA-ją, o jos pokyčiai gali padidinti aritmijų riziką [47, 48]. Taigi EA-ja ir tarpląstelinis ryšys per PJ-is yra susiję veiksniai, ga-lintys sudaryti grįžtamo sužadinimo (angl. reentry) aritmijų susiformavimui palankias sąlygas.
Elektrinės sinapsės yra ekspresuojamos daugumoje centrinės nervų siste-mos dalių žinduoliuose. Jos veikia kartu su cheminėmis sinapsėmis ir paleng-vina sinchronizaciją bei impulsų fazių suderinimą neuronų tinkle. Formuoda-mos dendro-dendritines jungtis elektrinės sinapsės gali sukelti neuronų akty-vumo sinchronizaciją [49], net kai jie nutolę per kelis šimtus mikrometrų [50, 51]. Tiesioginis ryšys per PJ-is buvo atrastas tarp neuronų hipokampe, sme-genų žievėje, migdoliniame kūne ir kituose smesme-genų dalyse. Per paskutinį dešimtmetį sukaupta daug žinių apie Cx raišką žinduolių smegenyse dėka naujų antikūnų taikymo fluorescencinėje mikroskopijoje ir geresnių vaizdi-nimo metodų [10, 52]. Elektrinės sinapsės tarp neuronų daugiausia sudarytos iš Cx36, taip pat aptinkama Cx45 [52, 53].
Šiuo metu yra atrasta daug elektrinių sinapsių funkcijų, tarp kurių yra neuronų tinklų sinchronizacija mokymosi metu bei atminties formavimas [10, 11]. Be to yra žinoma, kad elektrinės sinapsės yra svarbios pereinant tarp miego ir budrumo būsenų [12]. PJ-ys tarp hipokampo piramidinių neuronų yra svarbios gama impulsų susidarymui. Šie impulsai perduoda hipokampe esančią informaciją į smegenų žievę laikinam saugojimui [13]. Svarbus PJ-ių vaidmuo buvo aptiktas erdvinės informacijos kodavime [14].
Elektrinės sinapsės kurių laidumas >10 nS galėtų nustelbti cheminių si-napsių funkciją ir sustabdyti informacijos apdorojimą neuronų tinkluose. Ga-limai tai yra viena iš priežasčių, kodėl labiausiai paplitusios iš Cx36 sufor-muotos elektrinės sinapsės, kurių vienetinio kanalo laidumas yra mažiausias
1 elektrine anizotropija (angl. electrical anisotropy, EA) – širdies elektrofiziologijos
lite-ratūroje dažnai varojamas terminas turintis keletą prasmių. Šio darbo kontekse EA-ja reiškia nevienodą PJ-ių laidumų pasiskirstymą horizontaliai ir vertikaliai išsidėsčiusiose PJ-se tarp kardiomiocitų širdies audinyje. EA-ja yra išreiškiama kaip santykis tarp PJ-ių laidumų dve-jose skirtingose kryptyse, pvz. 𝑔𝑔𝑗𝑗𝑗𝑗/𝑔𝑔𝑗𝑗𝑗𝑗.
iš visų Cx [54]. Mažiau nei 1% Cx36 PJ-ių kanalų, esančių jungčių plokšte-lėse yra funkcionalūs esant normaliomis sąlygomis [55, 56]. Cx36 PJ-ių ka-nalo atsidarymo tikimybė (ir laidumas) padidėja vykstant intraląstelinei hipo-magnezemijai [36, 57], arachidoninės rūgšties sintezės inhibicijai, ar acidifi-kacijai [58]. Padidėjus elektrinių sinapsių laidumui, gali būti sukelta hyper-sinchronizaciją, kuri yra siejama su epilepsijos priepuolių formavimusi ir traukuliais [59, 60]. Per paskutinius penkiolika metų PJ-ių vaidmuo traukulių susidaryme buvo intensyviai tiriamas, tačiau išlieka mokslinių diskusijų ob-jektu. Per daug išplitusi neuronų tinklo sinchronizacija gali sumažinti infor-macijos apdorojimo galimybes pirminėje klausos žievėje (angl. primary
au-ditory cortex) [61]. Dėl šių priežasčių didėja susidomėjimas PJ-ių blokavimo
tyrimais, silpninant traukulių aktyvumą. Įdomu tai, kad didelis neuronų elekt-rinis aktyvumas žiurkės tarpinių smegenų gumburo tinkliniame darinyje su-kėlė PJ-ių laidumo sumažėjimą dalyvaujant vidulasteliniam Ca2+ reguliacijos mechanizmui. Manoma, kad tai gali būti dalis kompensacinio mechanizmo, mažinančio per daug išplitusią sinchronizaciją [62]. Atrasta, kad PJ-ių elekt-rinio laidumo padidinimas naudojant trimetilaminą, padidino CNS kilmės traukulių riziką [60, 63, 64]. Taip pat nemažai in vitro ir in vivo tyrimų atsk-leidė, kad PJ-ių blokavimas silpnina konvulsinius efektus [65–67], tačiau gali lemti ir traukulių susidarymą [68].
Plyšinių jungčių laidumo reguliavimas
Reguliavimas cheminiais veiksniais
PJ-ių kanalų laidumą reguliuojančias farmakologinėmis medžiagomis ga-lima skirstyti į dvi rūšis: PJ-ių kanalus uždarančios – t. y. blokatoriai (pvz. alkoholiai, lakūs anestetikai, jonai (Ca2+, Mg2+, H+), rūgštys (natrio acetatas, CO2 ir kt.) ir atidarančios – t. y. aktyvatoriai (pvz. amonio chloridas, forbolo esteteriai, trimetilaminas) [69]. Vieni iš žinomų PJ-ių blokatorių yra heptano-lis ir oktanolis. Tačiau atrasta, kad ir kiti alkoholiai blokuoja PJ-is priklauso-mai nuo audinio ir ląstelės tipo bei aplinkos sąlygų. Pastebėta, kad alkoholio blokavimo poveikis priklauso nuo grandinės ilgio, kuo ilgesnė alkoholio grandinė, tuo mažesnės koncentracijos reikia norint sukelti blokuojantį po-veikį [69].
Naudojant farmakologines medžiagas galima tirti PJ-ių fiziologinę svarbą (pvz. kaip pasikeičia sužadinimo impulsų sklidimas širdies audinyje, pavei-kus PJ-ių laidumą keičiančiomis medžiagomis). Manoma, jog Cx-ai gali būti vieni iš farmakologinių taikinių gydant epilepsiją, širdies aritmijas, insultą ir kt. ligas [70–73].
Priklausomai nuo ligos būklės ir tipo, PJ-ių kanalų blokavimas ar stimu-liavimas gali lemti tolesnę jos eigą – būklės pagerėjimą ar pablogėjimą: pvz. PJ-ių elektrinio laidumo blokavimas [69, 74, 75] ar stimuliavimas [76, 77] daro įtaką širdies funkcijai normos ir patologijos sąlygomis; epilepsijos atveju PJ-ių blokatoriai silpnina priepuolius, o aktyvatoriai – didina jų riziką in vitro ir in vivo sąlygomis [65–67]. Didžiausia problema išlieka specifinių farma-kologinių medžiagų, veikiančių tik PJ-is, trūkumas [78].
PJ-ių laidumas priklauso nuo divalenčių jonų koncentracijos ir pH. Pap-rastai padidėjus citozolinio Ca2+, Mg2+ arba H+ koncentracijai PJ-ių kanalai užsidaro [79–81]. Taip pat PJ-ių laidumą keičia postransliacinės modifikaci-jos, pvz. fosforilinimas [82]. Šie pokyčiai siejami su įvairiomis patologijoms. Pavyzdžiui didelis sužadinimo impulsų dažnis padidina Ca2+ koncentraciją [83], o viduląstelinis pH gali sumažėti išemijos metu [84]. Taip pat išemijos metu vyksta Cx43 defosforilinimas [85] ir PJ-ių reorganizacija. Manoma, kad šie procesai vaidina apsauginį vaidmenį stabdydami miokardo infarkto pli-timą [86].
Plyšinių jungčių laidumo priklausomybė nuo įtampos
PJ-ims būdinga savybė yra jos laidumo (gj) jautrumas dviejų tipų įtampai: 1) tarpląstelinei jungties įtampai Vj, kuri yra apibrėžiama kaip potencialo skir-tumas tarp besijungiančių ląstelių citoplazmų [2]; 2) kai kurie koneksinai yra jautrūs transmembraninei įtampai Vm, kuri yra potencialo skirtumas tarp ci-toplazmos ir ląstelės išorės. Manoma, kad grupė krūvį turinčių aminorūgščių keičia konformaciją priklausomai nuo elektrinio lauko, todėl jos yra vadina-mos įtampos jutikliu. Tokiu būdu jutiklis transformuoja elektrinio lauko ener-giją į mechaninę, kad įvyktų įkrautos aminorūgšties poslinkiai, lemiantys ka-nalo užsidarymą ar atsidarymą [87]. Struktūros dalis kurioje vyksta šie poky-čiai vadinama kanalo vartais. Be to PJ-ims būdinga momentinė jungties sro-vės-įtampos (Ij-Vj) rektifikacija, kuri priklauso nuo Cx tipo. Homotipinėse PJ-se ši rektifikacija paprastai yra nežymi, tačiau ji gali būti ženkli heteroti-pinėse PJ-yse [36].
PJ-ių kanalų jautrumas Vm pirmiausiai buvo atrastas bestuburiuose. Toles-niais tyrimais buvo atrasta gj priklausomybė nuo Vm iš Cx57 ir Cx45 sudary-tuose PJ-ių kanaluose [87]. Jautrumas Vm priklauso nuo Cx ir ląstelių tipo, kuriuose jie ekspresuojami. Pvz. Cx43 PJ kanalų laidumas priklauso nuo Vm, kai jie ekspresuojami Xenopus oocituose, tačiau ši savybė nepastebėta HeLa ląstelėse [87].
PJ-ių kanalų gj priklausomybės nuo Vj forma yra savita kiekvienam Cx tipui. Homotipiniams kanalams yra būdinga simetrinė varpo formos gj-Vj priklausomybė (1.3.1 pav. A), o heterotipinės PJ-yse yra charakterizuojamos
asimetrinės varpo formos gj-Vj priklausomybėmis (1.3.1 pav. B). Pavyzdžiui, Cx43 formuojamo homotipinio kanalo gj-Vj priklausomybė yra simetriška, nes kiekviename puskanalyje yra identiškai Vj jautrūs vartai. PJ-ies kanalo laidumas nepasiekia nulio, didėjant Vj, bet pasiekia liekamąjį laidumą, kuris yra ~5-40 % (priklausomai nuo Cx izoformos) mažesnis nei maksimalus gj [87].
1.3.1 pav. Homotipinio Cx45 PJ kanalo ir heterotipinio Cx43EGFP/Cx45
PJ kanalo gj-Vjpriklausomybės
(A) homotipinės PJ gj kreivė yra simetriška, (B) heterotipinės PJ – asimetriška. Juodai žymima eksperimentiškai gauta kreivė, pilkai – sumodeliuota naudojant S16SM modelį. Modifikuota pagal Paulauskas ir kt [21].
Nors PJ-ių laidumo reguliavimas įtampa žinomas jau senai, jo fiziologinis vaidmuo yra mažai ištirtas. Kai kuriuose Cx įtampos reguliavimo mechaniz-mas gali persidengti su cheminio reguliavimo mechanizmu, nes citoplazmi-nės kilpos CL sutrumpinimas pašalina tiek jautrumą pH tiek įtampai [88, 89].
Plyšinių jungčių reguliavimo įtampa mechanizmai
Remiantis vienetinių PJ-ių kanalų matavimais buvo aprašyti PJ-ių kana-lams būdingi du užsidarymo/atsidarymo mechanizmai [87]. Buvo pastebėta, kad vienetinių PJ-ių kanalų laidumas sumažėja iki lygio, didesnio už nulį, kuris vadinamas liekamuoju laidumu, γres (1.3.2 pav. A raudonomis rodyklė-mis pažymėti perėjimai tarp liekamojo laidumo ir atviro kanalo būsenų). Pvz. Cx43 vienetinių kanalų γres sudaro apie 20-25 % atviros būsenos laidumo [87]. Kadangi perėjimai iš γres į pilnai atidaryto kanalo būseną buvo sąlyginai greiti (~1 ms), šis mechanizmas buvo pavadintas greitaisiais PJ-ių kanalo var-tais. Taip pat, pastebėta, kad kartais vienetiniai PJ-ių kanalai pereidavo į pil-nai uždarytą būseną γc (1.3.2 pav. A mėlynomis rodyklėmis pažymėti
perėjimai). Kadangi perėjimai tarp γc ir γo trunka apie ~10-50 ms, šis mecha-nizmas pavadintas lėtaisiais kanalo vartais. Greiti ir lėti vartai yra reguliuo-jami Vj [87, 90, 91]. Abu mechanizmus gerai iliustruoja Cx43 ir Cx43EGFP elektrinių savybių palyginimas. Žaliai fluorescuojančio baltymo (EGFP) pri-kabinimas prie Cx43 CT galo pažeidžia greitųjų vartų mechanizmą, todėl vie-netiniai Cx43EGFP kanalai pasižymi tik lėtiesiems vartams būdingais perėji-mais, tuo tarpu vienetiniams Cx43 kanalams būdingi perėjimai tarp γo ir γres [87]. Dviejų vartų egzistavimą taip pat patvirtino puskanalių tyrimai [92]. Greiti vartai priklausomai nuo Cx tipo pasižymi skirtingu poliškumu: tei-giamo poliškumo vartai užsidaro esant teitei-giamoms Vj reikšmėms, neitei-giamo poliškumo – neigiamoms Vj reikšmėms. [92, 93]. Lėti vartai pasižymi nei-giamu atsidarymo-užsidarymo proceso poliškumu. Šie vartai yra mažiau jaut-rūs Vj pokyčiams, nei greiti vartai. Manoma, kad abiejų kanalą sudarančių puskanalių greiti ir lėti vartai jungiasi nuosekliai (1.3.1 pav., B) todėl kiek-vienam iš keturių kanale išsidėsčiusių vartų tenkanti įtampa priklauso nuo kitų trijų vartų būsenos. Ištirta, kad greiti vartai turi įtakos PJ-ių kanalo laidu-mui prie mažesnių įtampų, o lėti vartai prie didesnių (>50 mV) [2].
1.3.2 pav. Lėtų ir greitų vartų mechanizmas
(A) CO2 poveikis Cx43 PJ vartų atsidarymui/užsidarymui vienetinio kanalo lygmenyje,
fibroblastų ląstelių poroje. 100 % CO2 poveikis sukėlė pilną elektrinio ryšio blokavimą. Ij
buvo registruojama esant Vj = 55 mV, dar nesant pilnam blokavimui ir atplovimo nuo CO2
metu. PJ pasižymėjo dviejų tipų būsenų perėjimais – 1) tarp atviros ir liekamosios (~ 90 pS), perėjimo laikas ~ 1-2 ms (raudonos rodyklės); 2) tarp pilnai atviros ir uždarytos, perėjimo laikas ~ 10 ms (mėlynos rodyklės). Padidinti vaizdai (intarpuose) rodo, kad paskutinis kanalas užsidaro per ~ 10 ms, o pirmas kanalas atsidaro per ~ 19 ms. Po lėto pirmo kanalo atsidarymo atplovimo metu seka greiti perėjimai tarp atviros ir liekamosios būsenų. Kai du funkcionuojantys kanalai yra liekamojoje būsenoje, gjyra lygus dviejų γres(punktyrinė linija).
(B) PJ schema, rodanti kurie vartai funkcionuoja esant greitiems ir lėtiems perėjimams. Greiti vartai (oranžinė spalva) uždaro kanalą iš dalies, tuo tarpu lėti vartai (mėlyna spalva) – uždaro pilnai. Modifikuota pagal [20].
Dviejų nepriklausomų tyrimų, kurių metu buvo tirtos iš Cx sudarytų PJ-ių puskanalių vartinės savybės, buvo prieita išvados, kad įtampai jautrūs vartai gali turėti dvi arba daugiau uždaras būsenas [94, 95] (3.1.1 pav. B). Toliau yra pateikti eksperimentų rezultatai, kurių pagrindu buvo iškelta ši idėja. 1.3.3 pav. B parodyta gj-Vj priklausomybė, išmatuota poroje HeLaCx43 ląstelių, naudojant Vj protokolą parodyta 1.3.3 pav. A; kadangi tirta PJ-is turėjo ne-daug kanalų (gj buvo sąlyginai žemas ~1,5 nS), tai leido registruoti vieneti-nius kanalų (~13) būsenų pasikeitimus, kurių kiekvieno atviros būsenos
laidumas buvo ~115 pS [96]. Tolygiai didėjančios ir mažėjančios Vj įtampos protokolo pradžioje (raudona rodyklė), visi kanalai buvo atviri (rausva ro-dyklė; gj = γ0 × N, čia N yra kanalų skaičius), ir jie tolygiai užsidarinėjo di-dėjant Vj kol visi pasiekė liekamojo laidumo būseną (rausva rodyklė; gj,ss = γres × N). gj priklausomybė nuo laiko, išmatuota darant poveikį tolygiai didė-jančios ir mažėdidė-jančios Vj įtampos protokolu (žalia rodyklė), rodo lėtą gj atsis-tatymą, grafike matomą kaip nedidelio laipsnio histerezę (dviguba mėlyna ro-dyklė).
Ląstelėse, kurios turi Cx45 jungčių, tas pats Vj protokolas sukėlė ryškesnę histerezę ir nepilną atsistatymą tolygiai didėjančios ir mažėjančios Vj įtampos protokolo pabaigoje (1.3.3 pav. C). Histerezės reiškinys gj-Vj priklausomy-bėje buvo pastebėtas visuose tirtuose koneksinuose: Cx26, Cx30.2, , Cx30.2, Cx36, Cx37, Cx40, Cx43, Cx45, ir Cx57.
1.3.3 pav. D pavaizduoti modeliavimo rezultatai: Ij grafikai, gauti naudo-jant Vj protokolą (1.1.1 pav. A), naudojant S16SM; modelio parametrai api-būdino Cx45 PJ vartų valdymą. Rezultatai parodė, kad Ij grafikas tolygiai di-dėjančios ir mažėjančios Vj įtampos protokolo metu yra simetriškas. Taigi anksčiau naudotas S16SM modelis, kuris turėjo tik vieną uždarą būseną grei-tiems ir lėgrei-tiems vartams, netinka apibūdinti histerezės reiškiniui stebimam
1.3.3 pav. gj-Vjhisterezė išmatuota eksperimento metu ir sumodeliuota su
S16SM
(A-C) gj-Vj priklausomybės išmatuotos iš Cx43 (B) ir Cx45 (C) sudarytose PJ, naudojant
protokolą parodytą (A). gj-Vj histerezė pažymėta mėlynomis rodyklėmis. (D) modeliavimo
metu gautas Ij-laiko grafikas naudojant S16SM rodo simetriškus Ij atsakus tolygiai
didėjančios (raudona) ir mažėjančios Vj įtampos protokolo metu, tai atitinka minimalią
histerezę arba jos nebuvimą gjpriklausomybėje nuo Vj. Šaltinis [22].
Toliau buvo išmatuotas ir normalizuotas laidumas (gj,norm) HeLaCx43-EGFP ląstelių poroje (1.3.4 pav. A), gj,norm laipsniškai mažėjo veikiant 4% CO2, tai sutapo su žinomu faktu, kad PJ-ių komunikacija blokuojama rūgšti-nant terpę. Po išplovimo buvo stebimas gj atsistatymas iki pradinio lygio, tada ląstelės buvo trumpai paveiktos heptanoliu (3 mM), kuris sukėlė greitą ryšio susilpnėjimą (1.3.4 pav. B). Po to buvo pakartotas toks protokolas kaip 1.3.4 pav. A, tačiau trumpai paveikus heptanoliu, įsotintu 4% CO2. Kaip ir buvo tikėtasi, tai sukėlė greitą ryšio susilpnėjimą, tačiau ryšys išliko susilpnėjęs net po heptanolio išplovimo (1.3.4 pav. C), ir tai labai skyrėsi nuo pradinės hipo-tezės, parodytos rausva kreive 1.3.4 pav. A. Mes manome, kad rūgštinimas padidina perėjimų tikimybę iš pradinės uždaros būsenos į giliai uždarą būseną
(pc1→c2) arba sumažina tikimybę pereiti iš giliai uždaros būsenos į pradinę uždarą būseną (pc2→c1). Lėtų vartų perėjimas į uždarą būseną c1 sukeltas hep-tanolio, leidžia jiems vėliau pereiti į c2 būseną, kurioje jie yra užrakinami dėl sumažėjusios pc2→c1 perėjimo tikimybės dėka CO2 poveikio. Priešingai yra 1.3.4 pav. D, kuris parodo, kad Vj žingsninis protokolas taikytas CO2 povei-kio metu Cx47 PJ-is ekspresuojančiose ląstelėse (mėlyna kreivė) sumažino gj iki gj,res. Pasibaigus Vj impulsams gj palyginti greitai atsistatė į pradinį lygį. (1.3.4 pav. D, rausva kreivė). Yra žinoma, kad iš Cx40 ir Cx47 sudarytos PJ-ys, kai Vj yra iki ~80 mV, iš esmės yra veikiamos tik greitų vartų mecha-nizmo, tai patvirtina stabilus gj,min [90, 97, 98]. Vietoje Cx47 panaudojus Cx43-EGFP PJ-is turinčias ląstelės, Vj impulsai sukėlė panašų atsaką kaip naudojant heptanolį – kanalai visiškai užsidarė, žymiai prailgėjo gj atsistaty-mas po poveikio nutraukimo. Yra žinoma, kad EGFP pažymėjus Cx43 yra pažeidžiami greiti vartai [96]. Todėl tikėtina, kad c2 būsena yra tik lėtų vartų savybė (kurios greiti vartai neturi). 1.3.4 pav. D parodo, kad oktanolis (žalia linija) taip pat sukėlė pilną ryšio nutrūkimą su labai lėtu gj atsistatymu. Tai buvo tikėtina, remiantis eksperimento su heptanoliu/CO2 rezultatais.
Buvo pastebėta, kad ląstelėse turinčiose Cx36 PJ-ių, gj sumažėjo padidinus [Mg2+]i nuo kontrolės (~1 mM) iki 5 mM [99]. 8 pav. B esantis [99] parodo gj atsistatymo skirtumus, sukeltus dekanolio (0.5 mM), kuriuo buvo paveikta kai gj nusistovėjo prie skirtingų [Mg2+]i: gj atsistatė pilnai prie [Mg2+]i = 0,01 mM, ~50% prie [Mg2+]i = 1 mM, ir ~25% prie [Mg2+]i = 5 mM. Todėl buvo iškelta idėja, kad panašiai kaip rūgštinimas, [Mg2+]i padidina pc1→c2 ir/ar su-mažina pc2→c1, tai paaiškintų šiuos gj atsistatymo skirtumus. Veikdami ilgesnį laiką cheminiai ryšio blokatoriai paprastai sukelia visišką ryšio nutraukimą, vykstant lėtiems atskirų kanalų perėjimais į uždarą būseną, (parodyti kairiame intarpe 1.3.2 pav. A). Tai palaiko hipotezę, kad cheminis poveikis pasireiškia per lėtą vartų valdymo mechanizmą. Lėtų vartų perėjimai į c1 būseną, sukelti tiek įtampos, tiek cheminio poveikio, gali sąlygoti jų perėjimą ir pasilikimą c2 būsenoje.
1.3.4 pav. Eksperimento duomenys, kuriais remiantis buvo pasiūlyta kelių
uždarų būsenų koncepcija
(A-C) heptanolio ir CO2 sukeltas gjsumažėjimas ir lėtas atsistatymas. (D) greitas valdymo
Vj mechanizmas neįtakoja gj atsistatymo po CO2 sukelto sumažėjimo. Šaltinis [22]. Įtampai jautrių vartų modeliai
Boltcmano lygtimi aprašytas plyšinės jungties atsidarymo ir užsidarymo procesas
Pirmasis modelis įtampai jautrių PJ-ies kanalo vartų gj-Vj priklausomybei aprašyti buvo sukurtas 1981 m. Hariso (Harris) ir jo kolegų [15]. Jame yra daroma prielaida, kad PJ-ies kanalo vartų laidumas priklauso nuo viso kanalo įtampos Vj ir uždaros būsenos vartų laidumas lygus nuliui. Tada užsidarius vieniems iš vartų, visa įtampa krenta ant uždarų vartų, o ant atvirų vartų ji yra lygi nuliui. Perėjimai tarp būsenų yra priklausomi nuo kitų vartų, todėl šis
modelis buvo pavadintas priklausomu modeliu (angl. contingent gating). Šio modelio būsenų perėjimai pavaizduoti 1.4.1 pav. A.
1.4.1 pav. Harris ir jo kolegų sukurtų pirmo (A) ir patobulinto (B) modelių
būsenų perėjimai
Perėjimo tikimybės α1, α2, β1, β2aprašo perėjimus tarp būsenų, kurie yra priklausomi nuo
jungties įtampos Vj. o ir c atitinka atvirą ir uždarą būsenas.
Tie patys tyrėjai pasiūlė dar vieną modelį, kuriame daroma prielaida, kad kiekvienas iš PJ-ies kanalo vartų priklauso nuo visos tarpląstelinės įtampos Vj nepriklausomai nuo jų būsenų.
Šis modelis autorių buvo pavadintas nepriklausomu modeliu. Modelio būsenų perėjimus galima pavaizduoti 1.4.1 pav. B. Nusistovėjęs laidumas gj,ss yra aprašomas formule (1), kuri yra pagrįsta Boltcmano (Boltzmann) funkcija.
𝑔𝑔𝑗𝑗,𝑠𝑠𝑠𝑠 = 𝑔𝑔𝑗𝑗,𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 − 𝑔𝑔𝑗𝑗,𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚
1 + 𝑒𝑒𝐴𝐴�𝑉𝑉𝑗𝑗−𝑉𝑉0� + 𝑔𝑔𝑗𝑗,𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚 (1)
kur V0 atitinka Vj reikšmę, prie kurios pusė PJ-ies kanalų yra atviroje būse-noje (gj lygus pusei maksimalaus laidumo); gj,min yra minimalus laidumas (prie didelių Vj reikšmių); A yra konstanta, nusakanti vartų krūvį, 𝐴𝐴 = 𝑛𝑛𝑛𝑛(𝑘𝑘𝑘𝑘)−1 , kur n yra krūvių skaičius, kuriuos veikia elektrinis laukas, q yra elektrono krūvis, k yra Boltzmann konstanta, T yra temperatūra kelvinais.
Šis metodas leido aprašyti homotipinių ir heterotipinių PJ-ių kanalų elekt-rines savybes, priimant, kad kiekvienas kanalą sudarantis puskanalis užsidaro nepriklausomai nuo kito. Tai yra teisinga tik tuo atveju, jei abu puskanaliai pasižymi tuo pačiu poliarumu, panašiu vienetinių kanalų laidumu ir yra sąly-ginai mažai jautrūs Vj. Modelio privalumas yra mažas skaičiavimo resursų poreikis. A B α2 β2 β1 α1 o c c α1 o β1 c α2 o β2 c
Homotipinių plyšinių jungčių atsidarymo ir užsidarymo savybių Vogelio-Veingarto 4 būsenų modeliai
4 būsenų Vogelio-Veingarto (Vogel-Weingart) modelis buvo pristatytas
1998 m. [19]. Jis aprašo PJ-ių kanalų atsidarymo-užsidarymo procesą prik-lausomai nuo jungties įtampos Vj.
Šis modelis paremtas idėja, kad PJ-į sudaro kanalai, susidedantys iš dviejų nuosekliai sujungtų puskanalių (1.4.2 pav. A) [19]. Kiekvienas puskanalis turi du skirtingus laidumus γo ir γc. Kai puskanalis atidarytas, jo laidumas lygus γo, kai uždarytas γc. Kanalo funkcionavimas buvo apibrėžtas keturiomis būse-nomis: abu puskanaliai atidaryti – (HH), vienas puskanalis atidarytas kitas uždarytas (HL) arba (LH) ir abu puskanaliai uždaryti (LL) (1.4.2 pav. B), čia L reiškia mažo laidumo būseną, o H – didelio (angl. L – low, H - high).
1.4.2 pav. Rolfo Vogelio ir Roberto Veingarto PJ kanalo modelis: (A) vartų
elektrinis jungimas; (B) PJ kanalo modelio būsenų perėjimai
α1, α2, β1, β2aprašo perėjimus tarp būsenų, kurie yra priklausomi nuo puskanaliams tenkančių
įtampų Vj1 ir Vj2, γH1ir γH2yra kiekvieno puskanalio atviros būsenos laidumai, o γL1ir γL2
yra uždaros būsenos laidumai. Galimos kanalo būsenos: abu puskanaliai atidaryti – (HH), vienas puskanalis atidarytas kitas uždarytas (HL) arba (LH) ir abu puskanaliai uždaryti (LL), čia L reiškia mažo laidumo būseną, o H – didelio. Modifikuota pagal [81].
Šis modelis 2006 m. jo kūrėjų buvo modifikuotas darant prielaidą, kad puskanalis sudarytas ne iš vienų vartų, kuriems nustatomas bendras laidumas, o iš 6 vartų dar vadinamų subvartais (angl. subgate) [18]. Šiame modelyje buvo imituojamas realus PJ-ies kanalas, kuriame yra šešis koneksinus
A
atitinkantys subvartai. Šis PJ-ies kanalo modelis aprašė įtampai jautrių vartų būsenų perėjimus tarp atviros ir uždaros būsenos. Priklausomai nuo įtampos poliškumo, vienas iš puskanalių gali pereiti iš didelio laidumo į mažo laidumo būseną ir atvirkščiai, tuo tarpu antras puskanalis lieka aukšto laidumo būse-noje. Ši elgsena modeliavo vienų kanalo vartų būsenas (kiekviena vieno ka-nalo vartų būsena vaizduoja vieno puskanalio vartų sužadinimą arba užsida-rymą, kai kito puskanalio vartai yra nesužadinti arba atviri). Vieno kanalo pagrindinė būsena žymima sub0, o uždara būsena – sub6 (1.4.3 pav.).
1.4.3 pav. PJ kanalo modelio su 6 vartais puskanalyje elektrinė atstojamoji
schema
(A) elektrinė schema kai puskanaliai veikia nepriklausomai. (B) elektrinė schema kai koneksinai veikia priklausomai. Čia Cx1..6reiškia koneksino eilės numerį kanale, γLir γL yra
uždaros būsenos laidumai, o γHir γH – atviros; ΓH, ΓL, Γsub - atitinkamai atviros, uždaros, ir
tarpinės būsenos laidumo konstantos; Vj, Vj1, Vj2 – atitinkamai įtampos tenkančios visai
Homotipinių ir heterotipinių plyšinių jungčių keturių būsenų vartinių savybių Moreno modelis
2001 m. Moreno ir jo kolegos sukūrė dar vieną modelį [17]. Jame daroma prielaida, kad kiekvienas puskanalis priklauso nuo įtampos krentančios ant viso kanalo. PJ-ies kanalo būsenų perėjimai pavaizduoti 1.4.4 pav.
1.4.4 pav. Moreno ir jo kolegų sukurto modelio būsenų perėjimai
Ki(i=1,2,3,4) yra pusiausvyros konstantos kiekvienam pereinamajam procesui aprašomos
Boltzmann lygtimis. Kanalas gali užimti vieną iš keturių galimų būsenų: 1) O(oo) – abu vartai yra atviri 2) C1(co) –3) C2(oc) - kairieji vartai yra atviri, o dešinieji yra uždari 4) C3(cc) – abu
vartai uždari.
Pusiausvyros konstantos yra aprašomos Boltzmann lygtimis: 𝐾𝐾1= 𝑒𝑒𝐴𝐴1(−𝑉𝑉−𝑉𝑉01)
𝐾𝐾2 = 𝑒𝑒𝐴𝐴2(𝑉𝑉−𝑉𝑉02) (2) 𝐾𝐾3 = 𝑒𝑒𝐴𝐴3(−𝑉𝑉−𝑉𝑉03)
𝐾𝐾4 = 𝑒𝑒𝐴𝐴4(𝑉𝑉−𝑉𝑉04)
čia Ai yra įtampos jautrumo koeficientas, V0i – įtampa, kuriai esant PJ-ies kanalo laidumas yra lygus pusei savo maksimalios reikšmės. Ženklai prie į-tampos V yra neigiami ties K1 ir K3, bet teigiami ties K2 ir K4, nes vartai yra orientuoti kaip veidrodinis atspindys vienas kitam, todėl jų poliškumas yra priešingas.
Šis modelis aprašė tik stacionarių PJ-ies laidumą, bet ne jo kinetika. Stochastinis keturių būsenų plyšinės jungties kanalo vartinių savybių modelis
2009 m. vadovaujant prof. F. Bukauskui buvo sukurtas dviejų greitų PJ-ies vartų keturių būsenų modelis – S4SM (angl. stochastic four state model), aprašantis homotipinių ir heterotipinių PJ-ių vartų elgseną [20]. Šiame
modelyje vartų laidumo reguliavimas įtampa priklauso ne nuo visos Vj, bet nuo VA ir VB, kurie priklauso nuo Vj ir puskanalių A ir B laidumų santykio, kuris savo ruoštu priklauso nuo vartų būsenos (galimos būsenos: oo, oc, co,
cc). Kiekvienas jų funkcionuoja nepriklausomai nuo kitų ir gali būti dvejose
būsenose: atviroje (o) arba uždaroje (c). 1.4.5 pav. A pavaizduotas S4SM mo-delio vartų išdėstymas, o 1.4.5 pav. B būsenų perėjimai.
1.4.5 pav. Stochastinio 4 būsenų modelio vartų išdėstymas (A) ir būsenų
perėjimai (B)
Čia K1..4 yra konstantos, pagal kurias skaičiuojamos būsenų perėjimo tikimybės. A ir B -
puskanaliai, o – atvira būsena, c – uždara, pvz. AoBc reiškia A puskanalis atviras B – uždaras.
Modifikuota pagal [73].
Tokiu principu veikiantis modelis gana tiksliai imituoja PJ-ies kanalų atsi-darymo-užsidarymo savybes. Modelis gali atkartoti eksperimentuose matomą kinetiką kai staigus įtampos pokytis gali duoti kitokią gj-Vj priklausomybę, kanalams nespėjant pasiekti pusiausvyros būsenos, nei lėto Vj įtampos poky-čio atveju (1.4.6 pav. A ir B). Modelis gali gana tiksliai atkartoti homotipinių ir heterotipinių kanalų stacionarią gj-Vj priklausomybę (1.4.6 pav. C ir D). Paveiksle pavaizduota modeliuojamų homotipinių Cx43 bei heterotipinių Cx43/45 kanalų gj-Vj priklausomybės. Homotipiniuose kanaluose vartų po-liškumas nėra matomas dėl priklausomybės simetriškumo, tačiau heterotipi-nėse jungtyse poliškumo pokytis pakeičia vartų jautrumą įtampai (1.4.6 pav. D).
1.4.6 pav. gj-Vjcharakteristika gauta naudojant stochastinį keturių būsenų
modelį
(A) įtampos protokolas naudotas eksperimentuose. (B) gj-Vj priklausomybės gautos prie
skirtingos tolygiai didėjančios ir mažėjančios Vjįtampos protokolo trukmės. (C) kreivės 1-3
parodo heterotipinių kanalų asimetrijos priklausomybę prie skirtingų vieno puskanalio laidumų. (D) įtampos reguliavimas esant skirtingiems puskanalių poliškumams, 1 ir 4 kreivės buvo gautos kai abu vartai buvo to paties poliškumo, atitinkamai neigiamo ir teigiamo, 5 ir 6 kreivės buvo gautos prie skirtingų poliškumų, Cx45 neigiamo, o Cx43 teigiamo (5) ir Cx45 teigiamo, o Cx43 neigiamo (6). Modifikuota pagal [20].
Taikant S4SM galima modeliuoti vieną ar daugiau homotipinių ar hetero-tipinių PJ kanalų. S4SM leidžia tirti jungties laidumo kinetiką, priklausančią nuo jungties įtampos.
Stochastinis 16-os būsenų modelis
S4SM modelis aprašė tik greitus vartus, nors yra žinoma, kad PJ-ies kana-las turi ir lėtus vartus. Todėl vystant 4SM modelio idėją, jis buvo praplėstas iki 16-os būsenų (S16SM, angl. – stochastic 16 State Model). Naujame mo-delyje kiekvienas puskanalis turi po du vartus: greitus ir lėtus. Greitų vartų būsena kinta tarp atviros būsenos su laidumu 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹 ir uždaros būsenos su lieka-muoju laidumu 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹, o lėtų vartų laidumas kinta tarp atviros būsenos laidumo 𝛾𝛾𝑆𝑆𝐹𝐹 ir uždaros būsenos laidumo 𝛾𝛾𝑆𝑆𝑆𝑆 = 0 pS [21], būsenų perėjimai
A
B
C
D
pavaizduoti 1.4.7 pav. S16SM modelis buvo pritaikytas imituoti homotipinių ir heterotipinių PJ-ių reguliaciją Vj, Ij dinamiką ir nusistovėjusios būsenos gj,ss-Vj priklausomybes.
1.4.7 pav. S16SM modelio būsenų perėjimai
Modelyje PJ sudaro du puskanaliai, kiekviename yra greiti ir lėti vartai. Paveiksle pateiktos keturių būsenų schemos greitiems (kairėje) ir lėtiems (dešinėje) vartams, kur 𝐾𝐾𝑆𝑆,𝐹𝐹↔𝑆𝑆 ir 𝐾𝐾𝐹𝐹,𝐹𝐹↔𝐹𝐹
yra atitinkamai atidarytos ir uždarytos (liekamosios) būsenų pusiausvyros konstantos lėtiems ir greitiems vartams. Visas kanalas gali būti vienoje iš šešiolikos būsenų. Modifikuota pagal [21].
Kadangi kiekvienas puskanalis turi po du vartus, kurių kiekvienas gali būti dvejose būsenose, todėl iš viso yra šešiolika galimų kanalo būsenų.
S16SM modelyje kiekvienas iš vartų gali pasižymėti I-V rektifikacija. Lai-dumai 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹, 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹, ir 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝑠𝑠 yra vienodi abiejuose puskanaliuose homotipinės jungties atveju ir skirtingi heterotipinės jungties atveju. Laidumų 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹, 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹, ir 𝛾𝛾𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝐹𝑠𝑠 rektifikacija yra aprašoma eksponentine funkcija: 𝛾𝛾𝐹𝐹,𝐹𝐹𝐹𝐹𝑠𝑠 = 𝛾𝛾𝐹𝐹,𝐹𝐹𝐹𝐹𝑠𝑠,0∙ 𝑒𝑒−𝑉𝑉𝐹𝐹⁄𝑅𝑅𝐹𝐹,𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟.
Modelis paremtas Markovo savybe, kuri teigia, kad perėjimų tikimybės nepriklauso nuo prieš tai buvusių perėjimų. Jungties įtampa tenkanti kanalui yra visų keturių jungties vartų įtampų suma: 𝑉𝑉𝑗𝑗 = 𝑉𝑉𝐹𝐹,𝐴𝐴+ 𝑉𝑉𝑆𝑆,𝐴𝐴+ 𝑉𝑉𝐹𝐹,𝐵𝐵+ 𝑉𝑉𝑆𝑆,𝐵𝐵, kur A ir B žymi atitinkamą puskanalį. Vienų vartų užsidarymas keičia įtampą ir kituose trijuose vartuose, kas gali paveikti būsenos perėjimo tikimybę per diskretų laiko intervalą. Modelio algoritme daroma prielaida, kad vartai ne-sąveikauja tarpusavyje kitu būdu išskyrus per įtampos pasiskirstymą kanale. S4SM ir S16SM modeliai buvo pritaikyti, vertinant homotipinių ir hetero-tipinių PJ-ių vartų reguliavimo mechanizmus normaliomis ir patologijos są-lygomis [100, 101].
Modelių, aprašančių širdies elektrofiziologiją, apžvalga
Širdies elektrinio sužadinimo procesas yra kompleksiškas ir visi jo kom-ponentai turi veikti darniai: nuo atskirų jonų kanalų ląstelėje iki viso mio-kardo. Elektrinis sužadinimas tarp kardiomiocitų perduodamas per plyšines jungtis, todėl plyšinės jungtys yra labai svarbios širdies audinio fiziologijoje. Kuriant širdies ligų gydymo metodus svarbu suprasti širdies ligų fiziolo-gijos mechanizmus. Tuo tikslu eksperimentų metu gautų žinių papildymui yra pasitelkiami ir kompiuteriniai-matematiniai modeliai, kurie leidžia įvertinti fiziologinius parametrus kurie eksperimentų metu gali būti sunkiai išmatuo-jami. Todėl kompiuteriniai modeliai naudojami mokslinių hipotezių patikri-nimui, taip pat kuriant terapijos strategiją pritaikytą konkretaus paciento fi-ziologijai. Per paskutinius penkiasdešimt metų skaitiniai kardiologijos mode-liai buvo intensyviai tobulinami, tačiau pagrindiniai principai išliko tie patys. Toliau trumpai aptarsime svarbiausius iš jų.
Modeliai, aprašantys atskiro kardiomiocito elektrofiziologiją
Kardiomiocitų elektrinis sužadinimas turi panašumų su neuronų elektriniu sužadinimu, dėl analogiškų jonų kanalų dalyvavimo šiame procese. Dėl šios priežasties kardiomiocitų elektrinio sužadinimo modeliuose dažnai yra nau-dojama metodika, kuri buvo panaudota išvedant Hodgkin-Huxley (HH) mo-delio lygtis, aprašančias neuronų elektrinį sužadinimą [102, 103]. Jonų srovės taip pat gali būti modeliuojamos naudojant Markovo metodika [104].
Pirmasis HH tipo kardiomiocitų sužadinimo modelis buvo sukurtas Noble ir rėmėsi elektrofiziologiniais eksperimentais Purkinjė skaidulose [105, 106]. Šis modelis apibūdino Na+, K+ir foninę (angl. background) Cl-sroves. Vėliau patobulintame DiFrancesco-Noble modelyje [107] buvo įtraukta ir Ca2+ sro-vės dinamika [104]. McAllister ir jo kolegos aprašė lėtąsias įtekančias sroves [108].
Supaprastinant HH lygtis buvo sukurtas FitzHugh ir Nagumo modelis [109, 110], kuris neaprašo atskirų jonų srovių, bet jame yra mažiau kintamųjų, tai pagreitina kompiuterinius skaičiavimus, todėl yra naudojamas modeliuo-jant 2D ar 3D širdies audinį, kai modeliuojamas didelis ląstelių kiekis [111– 113].
Pirmasis skilvelių ląstelės modelį sukūrė Beeler ir Reuter [114]. Šis mo-delis apibūdino tarpląstelinės Na+ bei tarpląstelinės ir viduląstelinės K+ kon-centracijų variacijas, taip pat natrio-kalio (Na-K) pompos ir natrio-kalcio per-našos kanalo (NCX) veiklą.
Luo ir Rudy sukūrė modelį paremta eksperimentų su jūrų kiaulyte
naujai aprašytos pagrindinės depoliarizacijos ir repoliarizacijos srovės. Vė-liau jie papildė savo modelį, įtraukdami Na+, K+ bei Ca2+koncentracijų dina-miką [116–118].
Ankstesni modeliai rėmėsi eksperimentų duomenimis surinktais ne žmo-gaus širdyje. Pirmasis žmožmo-gaus širdies skilvelio miocito elektrofiziologijos modelis buvo publikuotas Priebe ir Beuckelmann [119] ir apibūdino sveikų ir širdies nepakankamumu sergančių žmonių kardiomiocitų elgseną.
Pastaruoju metu elektrofiziologijos modeliavimui daugiausiai buvo nau-dojami du modeliai: Ten Tussher, Noble, Noble ir Panfilov modelis ir Iyer,
Mazhari, ir Winslow modelis [120–122]. Abu modeliai naudojo Markovo
grandines joninėms srovėms aprašyti, tačiau kai kurių srovių aprašymui nau-dojo naujų eksperimentų duomenis (daugiausiai atliktus su jūrų kiaulytėmis).
Ten Tussher, Noble, Noble ir Panfilov modelis buvo patobulintas įtraukiant
patikslintą Ca2+ dinamiką, bei IKs ir ICa,L srovių parametrus [123].
Iš naujausių ir detaliausių žmogaus skilvelio ląstelių modelių galima pa-minėti šiuos: Grandi, Pasqualini, Bers; O'Hara, Virag, Varro, Rudy; ir Carro,
Rodriguez, Laguna, Pueyo [123–125]. Grandi, Pasqualini, Bers žmogaus
skilvelio ląstelių veikimo potencialo modelis apibūdina kelis subląstelinius regionus, bei detaliai aprašo Ca2+ jonų pernašą, paremtą ankstesniu triušio skilvelio modeliu [125, 126]. Dėl šios priežasties modelis negali tiksliai at-kartoti žmogaus veikimo potencialo atsistatymo ir širdies susitraukimo daž-nio adaptacijos. Siekdami ištaisyti minėtus modelio trūkumus Carro,
Rodri-guez, Laguna, ir Pueyo įvedė greitus ir lėtus ICa,L inaktyvacijos vartus bei
per-formulavo NCX srautą ir K+ sroves aprašančias lygtis [123]. Svarbu tai, kad jų modelyje buvo panaudoti tik eksperimentų su žmogaus ląstelėmis duome-nys. O'Hara, Virag, Varro, Rudy modelyje, O‘Hara ir jo kolegos taip pat nau-dojo tik duomenis, gautus iš žmonių ląstelių. Jame yra parametrizuojamos ICa,L, Ito, INCX, IK1, IKr, IKs, INa, and INa-K srovės [124]. Autoriai taip pat pateikia modelių apribojimus, kurie yra susiję su eksperimentinių duomenų trūku-mais.
Aritmijų modeliavimas audinyje
Norint sukurti efektyvius aritmijų gydymo metodus yra svarbu gerai sup-rasti šių procesų fiziologijos mechanizmus. Sistemų fiziologijos tikslas yra suprasti kompleksinę sistemos elgseną integruojant įvairių lygmenų fiziolo-ginius ir anatominius duomenis [127]. Tuo tikslu į pagalbą yra pasitelkiamas ir kompiuterinis modeliavimas. Tiriant širdies aritmijas vienos ląstelės mode-lis yra apjungiamas į audinį, siekiant suprasti kaip mikroskopiniai fiziologijos pokyčiai pakeičia fiziologiją makroskopiniame lygmenyje. Tuo būdu galima įvertinti atskirus parametrus ir jų poveikį aritmijų susidarymui (pvz. PJ
laidumo pokyčius), kuriuos labai sudėtinga arba praktiškai neįmanoma tiesio-giai įvertinti eksperimentų metu.
Modeliuojant miokardo elektrinę veiklą dažnai laikomasi funkcinio sinci-tiumo (angl. syncytium) koncepcijos ir naudojant vieno domeno (angl.
mono-domain) arba dviejų domenų (angl. bidomain) tipo lygtis [128–130]. Dviejų
domenų modeliai yra adekvatesni, nes juose yra įvertinama miokardo intra-ląstelinė ir ekstraintra-ląstelinė anizotropija [131], tačiau jie reikalauja daugiau skaičiavimo resursų nei vieno domeno modeliai. Vieno domeno modelyje yra laikomasi prielaidos, kad minėtos anizotropijos yra vienodos [132]. Modelių detalumo parinkimas lemia skaičiavimo operacijų kiekį ir tuo pačiu laiko sąnaudas.
Taikydami dviejų domenų modelį Tusscher ir Panfilov integravo žmogaus kardiomiocito modelį į 2D audinio modelį [133] ir tyrė atsistatymo kreivės (angl. restitution slope) poveikį alternančių atsiradimui bei elektrinio nesta-bilumo formavimuisi. Tyrėjai supaprastino anksčiau jų sukurtą ląstelės mo-delį siekdami pagreitinti skaičiavimus, tačiau įvertino atskirų jonų srovių pa-rametrus [122]. Tokiu būdu jie galėjo pakankamai tiksliai modeliuoti jonų srovių anomalijas, kurios kyla patologijų, pvz. ilgo QT sindromo, metu.
Modeliuojant žmogaus širdies elektrofiziologiją audinio lygyje galima į-vertinti miokardo nehomogeniškumo poveikį. Šie nehomogeniškumai apima skaidulų orientaciją, regioninius jonų srovių skirtumus, taip pat laidumo sa-vybes, pvz. anizotropiją. Pvz., Tusscher ir Panfilov modelis buvo modifikuo-tas [134] ir pritaikymodifikuo-tas vertinant miokardo fibrozės proaritminį [135] poveikį 2D bei 3D audiniuose.
Elshrif ir Cherry atliko pagal O'Hara, Virag, Varro, Rudy; ir Carro,
Rodri-guez, Laguna, Pueyo ir Grandi, Pasqualini, Bers žmogaus skilvelių ląstelių
modelius sukurtų audinio modelių tyrimus [136]. Abu modeliai gana gerai atitiko eksperimentuose išmatuotą veikimo potencialo trukmę, tačiau kitos audinio lygmens elektrinės savybės buvo prasčiau atkartojamos. Tokie tiesio-giniai ląstelių modelių palyginimai su audiniu gali padėti pasirinkti tinkamą modelį tiriamam fiziologiniam procesui aprašyti, nes atskirų ląstelių modelius integruojant į audinio modelius rezultatai gali skirtis.
Be ląstelių modelių skirtumų iškyla ir kitų iššūkių juos integruojant į šir-dies audinio modelius. Esami ląstelių modeliai, kurie yra laisvai prieinami modelių duomenų bazėse internete, (pvz. cell markup language (CellML),
systems biology markup language (SBML) bei FieldML) nėra matematiškai
suformuluoti taip, kad juos būtų galima tiesiogiai panaudoti kaip audinio mo-delio komponentus [137–140], todėl iš jų atskirai turi būti išrinktos reikalin-gos lygtys ir parametrai bei įtraukti į audinio modelį. Šiai situacijai paleng-vinti buvo sukurta Chaste programinė biblioteka, naudojanti Python progra-mavimo kalbos PyCml biblioteką, kuri suteikia galimybę tinkamai aprašytą
ląstelės modelį panaudoti audinio modeliavimui [141–143]. Modelius reali-zavus naudojant C programavimo jie veikia žymiai greičiau, tačiau yra sudė-tingiau parašyti ar modifikuoti programą. Visgi, tiesiogiai panaudojus ląstelės modelį ar jo parametrus audinio lygmens modeliui nėra garantijų, kad mode-liavimo rezultatai atitiks realaus audinio elgseną [144].
Integruojant detalius atskiros ląstelės modelius audinio modeliavimui, rei-kia atsižvelgti ar visi parametrai bus reikalingi tiriamos elgsenos aprašymui ir mažiau svarbias lygtis praleisti, kitu atveju gali smarkiai išaugti skaičia-vimo trukmė. Svarbu įvertinti parametrus kurie daro poveikį grįžtančio suža-dinimo sukėlimui, dinamikai ir stabilumui [145]. Modelyje ir eksperimen-tuose turi atitikti potencialo bangos sklidimo greitis, repoliarizacijos greičio priklausomybė nuo dažnio, laidumas, anizotropija bei priekinio fronto statu-mas.
Aritmijoms susidaryti svarbios ląstelių elektrofiziologinės savybės yra stipriai įtakojamos tarpląstelinio ryšio per plyšines jungtis. Šiuo metu jau yra plačiai žinoma, kad PJ laidumas keičiasi priklausomai nuo tarpląstelinės į-tampos, kuri kinta veikimo potencialo metu elektriškai sužadinamose ląste-lėse tokiose kaip kardiomiocitai. Taip pat manoma, kad grįžtamo sužadinimo ir fibriliacijos rizika yra susijusi su anizotropijos padidėjimu, kuris tiesiogiai priklauso nuo PJ-ių laidumo. Tačiau iki šiol visuose širdies audinio aritmijų modeliuose buvo laikoma, kad PJ-ių laidumas yra pastovus ir jo dinamikos poveikis aritmogenezėje nebuvo tirtas.
Plyšinės jungtys tarp neuronų ir jų modeliavimas
Plyšinės jungtys tarp neuronų dar vadinamos elektrinėmis sinapsėmis. Jos dalyvauja svarbiuose fiziologiniuose procesuose nervų sistemoje, tarp jų di-dina sinchronizuotą neuronų veikimą galvos smegenyse. PJ-ių laidumo padi-dėjimas yra siejamas su aukšto dažnio ir gama bangų atsiradimu [146]. Ma-noma, kad PJ-ys svarbios perėjimo iš miego į budrumo būseną metu, atmin-ties formavimuisi ir atkūrimui [146], motoneuronų valdymo grandinėse [147] bei erdvinės informacijos apdorojimui [148]. Per didelė neuronų tinklo sinch-ronizacija yra siejama su patologinėmis būklėmis, pvz. epilepsija [149, 150] ir yra nustatytas tiesioginis ryšys tarp epilepsijos priepuolio susidarymo ir PJ-ių laidumo padidėjimo [151]. ŠPJ-ių procesų tyrimams į pagalba pasitelkiami kompiuteriniai-matematiniai modeliai, kadangi jie suteikia galimybę detaliau įvertinti nervų sistemoje vykstančius procesus, bei papildyti eksperimentų metu gautas žinias.
Kaip minėta anksčiau, nors PJ-ys pasižymi jautrumu įtampai, tačiau dau-gumoje neuronų tinklų modelių, kuriais tiriama sinchronizacija, PJ-ys yra
aprašomos kaip pastovaus laidumo (žr. modelių duomenų bazę https://sense-lab.med.yale.edu/ModelDB/).
Biologiškai realistiški neuronų tinklų modeliai paprastai yra paremti
Hod-gkin-Huxley tipo lygtimis [152]. Neuronų modeliai gali turėti vieną (angl.
single compartment) arba daugiau (angl. multi compartment) kompartmentų.
Vieno kompartmento modeliuose membranos potencialas apibūdinamas tik vienu kintamuoju, o kelių kompartmentų modeliuose membranos potencialas gali būti apibūdinamas skirtingoms neurono dalims atskirai. Nors kelių kom-partmentų modelis yra adekvatesnis realiems neuronams, tačiau modeliuojant sudėtingą sistemą skaičiavimai gali ilgai užtrukti.
Daugumoje neuronų tinklų modelių yra laikomasi prielaidos jog elektrinio signalo perdavimas per PJ-is yra simetriškas abiem kryptimis, tačiau eksperi-mentų duomenys rodo, kad šios prielaidos ne visada teisingos. Pavyzdžiui, kai kurios elektrinės sinapsės pasižymi momentine laidumo-įtampos rektifi-kacija, kuri sukelia sinaptinio perdavimo asimetriją krypties atžvilgiu [153– 156]. PJ-ys pasižymi laidumo jautrumu jungties įtampai [87], kuris gali būti reguliuojamas cheminėmis medžiagomis, pvz. H+, Ca2+ ar Mg2+ [58, 79, 99]. Taigi elektrinės sinapsės nėra tik pasyvios poros, bet pasižymi dinaminiais laidumo pokyčiais. Dėl šių priežasčių galima manyti, kad tokie pokyčiai gali daryti įtaką neuronų tinklų veiklai.
Sinaptinį ryšį galima apibūdinti ryšio stiprumo koeficientu. Ryšio stip-rumo koeficientai abiejomis kryptimis (K1-2 ir K2-1) yra apibrėžiami kaip membranos potencialų santykiai: 𝐾𝐾1−2 = 𝑉𝑉2⁄ ir 𝐾𝐾2−1𝑉𝑉1 = 𝑉𝑉1⁄ ; čia V žymi 𝑉𝑉2 atitinkamos ląstelės membranos įtampą [157]. Jei 𝐾𝐾1−2 ir 𝐾𝐾2−1 skiriasi, tai rodo jog plyšinės jungties kanalai signalą perduoda asimetriškai. Toks perda-vimas gali kilti dėl PJ-ies kanalo rektifikacijos arba kaimyninių ląstelių įėjimo varžų (Rin) skirtumo. Rin priklauso nuo plazminės membranos laidumo, ląste-lės paviršiaus ploto bei ir kaimyninių neuronų skaičiaus, kurie jungiasi per PJ [157]. Asimetrinis sinaptinis perdavimas buvo aptiktas daugelyje tyrimų [158–161].
Rektifikacijos PJ-ies kanale susidaro dėl asimetrinio nejudančio elektrinio krūvio (šiuo atveju - krūvį turinčių amino rūgščių) pasiskirstymo PJ-ies ka-nalo ertmėje [162]. Rektifikacija paprastai pasireiškia heterotipinėse PJ-yse esant normalioms fiziologinėmis sąlygomis [94, 156, 163], bet gali atsirasti ir homotipinėse jungtyse esant intraląstelinės aplinkos (pvz. [Mg2+]i [57]) po-kyčiams.
Minėti jungties asimetrijos veiksniai yra tarpusavyje nesusiję, pvz. Rin neurone priklauso nuo plazminės membranos paviršiaus ploto, o sinaptinė rektifikacija kyla dėl PJ-ių savybių [164]. Taigi perdavimo vienkryptiškumas, kuris yra gerai žinoma cheminių sinapsių savybė, gali susidaryti ir elektrinėse sinapsėse. Kadangi elektrinis sinaptinis perdavimas yra greitesnis nei
cheminis, vienkryptis veikimo potencialo perdavimas per PJ-is gali pasitar-nauti greitos reakcijos reikalaujančiuose procesuose kaip pavojaus refleksas [14, 165].
Asimetrinis signalo perdavimas vaidina svarbų vaidmenį neuronų veikimo dažnio reguliacijoje, kas buvo stebėta gumburo tinklinio branduolio neuro-nuose [161]. Asimetrijos sukeliamus efektus yra sudėtinga stebėti eksperi-mentuose, todėl modeliavimas gali padėti įvertinti rektifikacijos įtaką neuronų tinklo dinamikai [166].
Esant dideliam neuronų elektriniam aktyvumui buvo aptikta signalo amp-litudės asimetrija skirtingose sklidimo kryptyse gumburo tinkliniame bran-duolyje (angl. thalamic reticular nucleus) audinio pjūviuose [167]. Taigi buvo pastebėta, kad elektrinės sinapsės pasižymi plastiškumu ir tai vis daž-niau minima eksperimentiniuose tyrimuose [168].
Elektrinių sinapsių ryšio (laidumo) didumas tiesiogiai veikia sinchroniza-cijos lygį neuronų tinkle, kurio pokyčiai siejami su daugeliu fiziologinių ir patologinių procesų smegenyse. PJ-ių laidumo padidėjimas gali sukelti per daug išplitusią sinchronizaciją, kuri yra siejama su epilepsijos priepuoliais, taip pat koreliuoja su susilpnėjusia informacijos apdorojimo funkcija pirmi-nėje klausos žievėje (angl. primary auditory cortex) [61]. Buvo aptiktas dide-lio elektrinio aktyvumo sukeltas elektrinių sinapsių laidumo sumažėjimas da-lyvaujant Ca2+ reguliacijos mechanizmui gumburo tinkliniame branduolyje epileptinėse žiurkėse [62]. Manoma, kad šis sumažėjimas gali veikti kaip kompensacinis mechanizmas, kuris mažina per didelį neuronų aktyvumą.
Be sinchronizacijos, PJ gali sukelti reverberacijos procesą neuronų tinkle, panašų į vykstantį širdyje grįžtančio sužadinimo (angl. re-entry) aritmijos metu [169]. Nustatyta, kad PJ-is blokuojanti medžiaga karbenoksalonas (angl. carbenoxolone, CBX) sukelia 160 Hz bangų blokavimą smegenėlėse
in vivo [170], šios bangos siejamos su daugeliu patologijų, todėl jų valdymo
2.
TYRIMŲ METODIKA
Skaitinis modeliavimasŠio darbo metu sukūrėme 36-ių būsenų PJ-ies kanalo modelį, kuris yra pa-remtas Markovo grandinių teorija. Modelio aprašymas yra pateiktas publika-cijoje [22] ir šiame darbe rezultatų dalyje. Naudoti parametrai detaliai apra-šyti mūsų publikacijose [22, 30, 31].
Neuronų modeliavimui naudojome Hodgkin-Huxley diferencialines lygtis [152]. Modeliuodami neuronų tinklą prie šių lygčių sistemos pridėjome ies srovę (Ij), kurios apskaičiavimui panaudojome 36-ių ir 16-kos būsenų PJ-ių modelius. Mūsų tyrimuose naudotus modelius detaliai aprašėme [31].
Modeliuodami kardiomiocitų tinklą, kardiomiocitų elektrinę elgseną apra-šėme Noble diferencialinėmis lygtimis [105]. Prie minėtų lygčių sistemos pri-dėjome srovę 𝐼𝐼𝑗𝑗 = 𝑉𝑉𝑚𝑚2− 𝑉𝑉𝑚𝑚1 (Vm1 ir Vm2 yra PJ-imi besijungiančių ląstelių membranų potencialai), kuri apibūdino per PJ-į tekančią srovę:
Ij apskaičiavimui naudojome 36-ių būsenų PJ-ių modelį. Sutrumpinome refrakterinį periodą, pakeisdami αn parametrą (0,0001 į 0,0003), apibūdinantį kalio kanalo laidumo dinamiką, remdamiesi šaltiniais [171, 172], kad išemi-jos metu gali sutrumpėti refrakterinis periodas kardiomiocituose.
Diferencialinių lygčių sprendiniui gauti naudojome Oilerio metodą su 0,1 ms integravimo žingsniu. Modeliai buvo realizuoti C++ programavimo kal-boje, o rezultatų vizualizacija buvo atlikta panaudojant MATLAB programi-nes priemoprogrami-nes. Skaičiavimų pagreitinimui buvo panaudoti lygiagretieji algo-ritmai, skaičiavimus realizuojant ant keleto centrinio procesoriaus (CPU) branduolių, taip pat ant vaizdo plokštės procesoriaus (GPU). Šie metodai leido pagreitinti skaičiavimus iki 40 kartų.
Tarpląstelinio ryšio per plyšines jungtis matavimai
Tarpląstelinio ryšio per PJ-ių kanalus savybės buvo tiriamos standartiniu dvigubu visos ląstelės fiksuotos įtampos metodu (2.2.1 pav.) (angl. dual
whole-cell patch clamp), kuriuo buvo matuojama srovė, tekanti per PJ-į (2.2.2
pav.), o pagal ją, kompiuteris apskaičiuodavo PJ-ies kanalo laidumą. (3)
