KONJUGUOTOS LINOLO RŪGŠTIES IZOMERŲ TYRIMAI ATRAJOJANČIŲ GYVULIŲ PIENO IR MöSOS RIEBALUOSE

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA

Renata Andziulyt÷

KONJUGUOTOS LINOLO RŪGŠTIES IZOMERŲ

TYRIMAI ATRAJOJANČIŲ GYVULIŲ PIENO IR

MöSOS RIEBALUOSE

Magistro darbas

Darbo vadov÷: Dr.Gintar÷ Zaborskien÷

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTöS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

GYVULININKYSTöS KATEDRA

Magistro darbas atliktas 2007 – 2009 metais Lietuvos veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedroje, KTU maisto instituto laboratorijoje.

Magistro darbą paruoš÷: Renata Andziulyt÷ ___________________

(parašas)

Magistro darbo vadovas: Gintar÷ Zaborskien÷ _____________________

(parašas)

(LVA Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedra)

Recenzentas(ai): (LVA...katedra) ________________

TURINYS

SUTRUMPINIMAI 4

ĮVADAS 5

1. LITERATŪROS APŽVALGA 7

1.1 Riebalų rūgštys cheminiu aspektu 7

1.1.1 KLR rūgštis ir jos izomerai 9

1.1.2 Konjuguotos linolo rūgšties svarba žmogui 12

1.2 KLR sintez÷ atrajotojų organizme 15

1.2.1 Biohidrogenacija atrajotojų skrandyje 17

1.2.2 Endogenin÷ sintez÷ 18

1.3 Riebalų rūgščių cis ir trans izomerų tyrimai 21 1.3.1 Infraraudonųjų spindulių spektroskopija 22

1.3.2 Ag- plonasluoksn÷ chromatografija 23

1.3.3 Efektyvioji skysčių chromatografija 23

1.3.4 Dujų - skysčių chromatografija 23

1.3.5 Kapiliarin÷ elektroforez÷ 24

1.3.6 Micelin÷ elektrokinetin÷ chromatografija 24

1.4 Apibendrinimas 25

2. METODIKA 26

2.1 Tyrimų objektas ir metodika 26

2.2 Analiz÷s metodo pasirinkimas 27

2.3 M÷ginių paruošimas analizei 29

2.3.1 Riebalų ekstrakcija 29

2.3.2 Riebalų transmetilinimas 30

2.4 Chromatografin÷ įranga ir sąlygos 30

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 33

4. IŠVADOS 37

5. PADöKA 39

6. SANTRAUKA 40

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS 41

SUTRUMPINIMAI

Angl. Anglų kalba

BF₃ Boro trifloridas

c cis izomeras

C Anglies atomas

DSCh Dujų skysčių chromatografija ESCh Efektyvioji skysčių chromatografija EPR Eikozapentaeno rūgštis

FID Jonizuojančios liepsnos detektorius

H Vandenilis

H₂SO₄ Sieros sulfidin÷ rūgštis

H₂ Vandenilio dujos

IR Infraraudonųjų spindulių spektroskopija KE Kapiliarin÷ elektroforez÷

KLR Konjuguota linolo rūgštis

KTU Kauno technologijos universitetas

LA Linolo rūgštis

LNA Linoleno rūgštis

MEKC Micelin÷ elektrokinetin÷ chromatografija MNRR Mononesočiosios riebalų rūgštys

RR Riebalų rūgštis

RRME Riebalų rūgščių metilo esteriai PNRR Polinesočiosios riebalų rūgštys SRR Sočiosios riebalų rūgštys

t trans izomeras

TAG Triacilglicerolis

UV Ultravioletiniai spinduliai

ĮVADAS

Iš gyvulininkyst÷s gaunami pieno produktai ir m÷sa – vieni iš pagrindinių maisto medžiagų šaltinių mūsų kasdienin÷je mityboje. Su šiais maisto produktais gauname aukštos energetin÷s ir maistin÷s vert÷s baltymus, energiją, ir daugybę mineralinių medžiagų bei vitaminų. Paskutiniųjų metų riebalų rūgščių moksliniai tyrimai atskleid÷ ir kitą iš atrajotojų gaunamos produkcijos svarbą. Šiuo metu didelis d÷mesys ir susidom÷jimas tenka konjuguotoms linolo ir linoleno rūgštims. Konjuguota linolo rūgštis (KLR), kurios empirin÷ formul÷ C18H32O2, - tai yra nepakeičiamos polinesočios omega-6 klasei priskiriamos linolo

riebalų rūgšties geometriniai cis 9, trans 11, cis 12 ir trans 10 izomerai.

D÷l savo teigiamo fiziologinio poveikio žmogaus organizmui – KLR yra svarbi mūsų mityboje daugelio ligų profilaktikai. Konjuguotos linolo rūgšties (KLR) izomerų cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 savyb÷s ir galimyb÷ didinti žmonių sveikatingumą, sudomino mokslininkus, vartotojus ir pramoninkus. Mokslininkų pateikti tyrimų rezultatai įrodo pieno ir m÷sos produkcijos vartojimo svarbą žmonių mityboje. Pienas ir pieno produktai, kurie yra priimtini ir lengvai prieinami daugumai vartotųjų, − pagrindinis KLR šaltinis. Iš atrajojančių gyvulių gaunama produkcija gali būti panaudota kaip profilaktin÷ ir potenciali priemon÷, kovojant su v÷žiu, taip pat širdies ir kraujagyslių susirgimams gydyti, bei antsvorio ir nutukimo problemoms spręsti. Tai patvirtina ir paskutiniųjų metų KLR tyrimai, kurių tikslas buvo išaiškinti šios riebalų rūgšties galimą teigiamą fiziologinį poveikį žmonių ir gyvulių sveikatai.

Atrajojančių gyvulių skrandyje esančios bakterijos atlieka pagrindinį vaidmenį konjuguotos linolo rūgšties izomerų sintez÷je. (Muller ir kt., 2004). KLR paprastai sintetinama iš pašaruose esančių linolo ir linoleno rūgščių ir trans 11 C18:1 riebalų rūgšties. KLR sintez÷ vyksta atrajojančių gyvulių skrandyje, vykstant riebalų rūgščių biohidrogenazei, arba audiniuose, veikiant fermentams ∆9_{desutaraz÷s enzimui. Didinant linolo ir linoleno riebalų} rūgščių suvartojimą galima padidinti ir KLR kiekį atrajojančių gyvulių produkcijoje. Su viena stikline (227ml) nenugriebto pieno ir viena porcija sūrio (30g) galima gauti 90 mg KLR per parą. Optimalus KLR cis-9, trans-11 ir trans-10, cis-12 izomerų santykis yra 50:50, o 70kg sveriančiam žmogui v÷žio profilaktikai rekomenduojama suvartoti 3,5g KLR per parą.

Vis dar tikslinga vykdyti tolimesnius KLR izomerų tyrimus, ypač gyvulininkyst÷s produkcijoje, nustatant veiksnius, galinčius skatinti min÷tų izomerų sintezę.

Darbo tikslas. Įvertinti Lietuvoje auginamų atrajotojų pieno ir m÷sos kokybę, fiziologiškai reikšmingų žmogaus sveikatai riebalų rūgščių atžvilgiu.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti konjuguotos linolo (C18:2 ) rūgšties izomerų cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 kiekius Lietuvoje išaugintų atrajojančių gyvulių piene ir m÷soje.

2. Įvertinti KLR cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 izomerų kiekio kitimus per ganyklinio ir tvartinio laikotarpių atskirus m÷nesius.

3. Palyginti KLR cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 izomerų kiekius ganyklinio ir tvartinio laikotarpio pieno ir m÷sos riebaluose su kitų mokslininkų publikuotais duomenimis.

Darbo naujumas. Lietuvoje prieš tai nebuvo atlikti konjuguotos linolo rūgšties izomerų tyrimai atrajotojų produkcijoje. Dauguma Lietuvoje publikuotų mokslinių straipsnių yra apibendrinantys omega - rūgščių svarbą žmogaus mitybai. Kadangi Lietuvoje tai pirmieji konjuguotos linolo rūgšties izomerų tyrimai, publikacijų šia tema beveik n÷ra, ypač apie atrajojančių gyvulių produkciją ir apie KLR izomerų reikšmę žmogaus fiziologijai. Manau šis magistrinis darbas bus pradžia tolimesniems konjuguotos linolo rūgšties izomerų tyrimams. Šiame darbe aprašyti tik du (cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 )iš dvidešimties konjuguotos linolo rūgšties izomerų, kiekvienas iš šių izomerų pasižymi skirtingomis savyb÷mis ir bioaktyvumu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Riebalų rūgštys cheminiu aspektu

Riebalams oksiduojantis organizme iš 1 g riebalų išsiskiria 39 kJ šilumos. Tai 2 kartus daugiau, negu oksiduojantis angliavandeniams ar baltymams. Paprastai riebalai sudaro 20% žmogaus mas÷s ir yra jo energijos resursas. Kita svarbi riebalų oksidavimosi reikšm÷ organizmui yra ta, kad reakcijų metu susidaro vanduo − 1 g riebalų yra 1,4 g surišto (endogeninio) vandens. Surištas vanduo yra reikšminga bendrojo organizmo vandens balanso sudedamoji dalis.

Riebalų rūgštys (RR) tai didel÷s molekulin÷s mas÷s ir įvairių grupių organiniai junginiai, kurie yra tirpūs nepoliniuose tirpikliuose ( kaip chloroforme, acetone ir benzene ir kt.) ir dažniausiai netirpūs vandenyje. Riebalų rūgštys savo grandin÷je turinčios iki šešių anglies atomų yra priskiriamos prie trumpagrandininių riebalų rūgščių. Šios rūgštys žymiai lengviau tirpsta vandenyje, lyginant su ilgą grandinę turinčiomis riebalų rūgštimis, bei yra lengviau skaidomos ir absorbuojamos. Fiziologinis jų veikimas organizme taip pat skiriasi nuo ilgą grandinę turinčių riebalų rūgščių. Organizme jos labai greitai suskaidomos ir absorbuojamos žarnyne. Biocheminiu požiūriu, jos labiau panašios į angliavandenius negu į riebalus. Bendra riebalų rūgšties formul÷:

Riebalų rūgštys, kurių grandin÷ sudaryta iš aštuonių arba dešimties anglies atomų priskiriamos prie vidutinio ilgumo grandinę turinčių rūgščių. Tokio tipo grandinių riebalų rūgščių skaidymas organizme išeikvoja didelį kiekį energijos. Mityboje ilgą grandinę turinčios riebalų rūgštys, dažnai keičiamos vidutinio ilgumo grandinines turinčiomis rūgštimis, siekiant kontroliuoti kūno mas÷s sumaž÷jimą. (St- Onge ir kt., 2002). Riebalų rūgštys savo grandin÷je turinčios 14 ir daugiau anglies atomų priskiriamos prie ilgą grandinę turinčių riebalų rūgščių.

Daugumos lipidų pagrindą sudaro riebalų rūgštys, kurios yra būtinos normaliam ląstelių funkcionavimui ir gyvavimui. Jos sudarytos iš eil÷s metilo grupių, savo grandin÷s gale turinčių po funkcinę karboksilinę grupę. Metilo grupių grandin÷ yra riebalų rūgščių sudedamoji dalis, o tuo tarpu karboksi grup÷ – rūgštis. Pagal prisotinimo laipsnį riebalų rūgštys gali būti:

Prisotintos: visi anglies atomai prisijungę maksimalų kiekį vandenilio atomų ir yra tiesios grandin÷s struktūros. D÷l tokios struktūros, prisotintos riebalų rūgščių

CH

-(CH

)n-CH

-CH

-COOH

1

2

3

molekul÷s tampriai susiglaudę viena prie kitos, suteikia kietą konsistenciją kambario temperatūroje.

Nesočiosios – su viena ar dviguba jungtimi, jungiančia kai kuriuos anglies atomus. Nesočiųjų riebalų rūgščių grandin÷je kai kurie anglies atomai neturi vandenilio atomų, tose vietose anglies atomai sujungti dvigubomis jungtimis. Susiformavusios dvigubos jungtys, suformuoja lenktos struktūros riebalų rūgštis. D÷l tokios struktūros, nesočiosios riebalų rūgščių molekul÷s negali tampriai susiglausti, tod÷l jos sudaro skystą konsistenciją. Dauguma aliejų vyrauja nesočiosios riebalų rūgštys. (žr.1 pav.)

Produktai, savo sud÷tyje turintys didelį kiekį mononesočiųjų rūgščių (alyvuogių aliejus), atšaldyti šaldytuve, kiet÷ja. Tuo tarpu polinesočiosios riebalų rūgštys, kurios turi dvi ar daugiau dvigubas jungtis ir daugiau lankų savo fizin÷je struktūroje, atšaldymo metu nepraranda skystos konsistencijos (Laurinavičius, 2002).

a) sočioji RR.; b) mononesočioji RR; c) polinesočioji RR. 1.pav. Geometrin÷ struktūra pagal riebalų rūgščių sotumo laipsnį. (www.google.lt/images.search.html).

Riebalų rūgščių grandinių ilgis gali įvairuoti nuo dviejų iki 80 anglies atomų, bet dažniausiai sutinkamos 12 – 24 anglies atomų savo grandin÷je turinčios riebalų rūgštys. Kekinių grandinių riebalų rūgštys sutinkamos tik mikroorganizmų sud÷tyje ir neturi jokios mitybin÷s vert÷s.

Augalų ir gyvūnų audiniuose dažniausiai sutinkamos C16 ir C18 su viena arba trimis dvigubomis jungtimis cis konfigūracijoje. Gyvulių audiniuose gali būti šešios cis konfigūracijos, kurias skiria metileno grup÷s. (žr. 2 pav.).

H – H – H – H – H – H – H – H – H | | | | | | | | |

R – C – C – C = C – C – C = C – C – C – COOH | | | | |

H H H H H

2 pav. Nekonjuguotos nesočiosios riebalų rūgšties chemin÷ struktūra.(Bagdonien÷ ir kt., 2006).

Polinesočiosios riebalų rūgtys gali būti konjuguotos. Dvigubojo ryšio pad÷tis žymima simboliu ∆, skaičiais pažymima prie kurio C atomo šis ryšys susidaro. (Bagdonien÷ ir kt., 2006). Konjuguotos rūgštys neturi metileno grup÷s prie anglies atomų, kurie sujungti dvigubomis jungtimis (3 pav.).

H – H – H – H – H – H – H – H – H | | | | | | | | | R – C – C – C = C – C = C – C – C – COOH | | | | H H H H

3 pav. Konjuguotos polinesočiosios riebalų rūgšties struktūra.(Bagdonien÷ ir kt., 2006).

Iš konjuguotų polinesočiųjų riebalų rūgščių labiausiai žinoma – konjuguota linolo rūgštis. Konjuguota linolo rūgštis (KLR) yra polinesočioji riebalų rūgštis, kuri paprastai aptinkama atrajojančių gyvulių produkcijoje (piene ir m÷soje bei jų produktuose), taip pat nedideliais kiekiais - paukštienoje, kiaulienoje, kiaušiniuose, bei aliejinių kultūrų augaluose. Didžiausi kiekiai šios rūgšties aptinkami atrajojančių gyvulių piene ir jo produktuose (Staszka, 2005) ir m÷soje.

1.1.1 KLR rūgštis ir jos izomerai

Konjuguota linolo rūgštis – tai terminas naudojamas apibūdinti įvairių pozicijų (dvigubos jungtys ties 7 ir 9 anglies atomu arba – 8 ir 10; – 9 ir 11; – 10, 12; – 11, 13; – 12, 14) ir geometrijos (cis/cis; cis/trans; trans/cis; trans/trans) oktadecadienoin÷s rūgšties grup÷s izomerus (Aydin ir kt., 2005; Rickert ir kt., 1999; Stanton ir kt., 1997 ). Dvigubos jungtys KLR atskirtos vienguba jungtimi, kuria pakeičiama metilo grup÷ (C = C – C = C) (Chin ir kt., 1991; Dhiman ir kt., 2000; Parodi, 2003), žr. 4 pav. ir 5 pav. Dvigubos jungtys grandin÷je gali būti skirtingose pozicijose, pradedant septintuoju ir baigiant dvidešimtuoju anglies atomu (Christie, 2003). Konjuguota jungtis tarp anglies atomų – tai pradin÷ riebalų rūgščių oksidacijos stadija. (Li – Min Wang ir kt., 2006).

Cis 9, trans 11

Vienguba jungtis (konjugacija) Trans 10 cis 12

Vienguba jungtis (konjugacija)

4 pav. KLR izomerų cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 struktūrin÷s formul÷s. (Christie., 2003).

5 pav. KLR izomerų cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 trimat÷s (erdvin÷s) struktūros. (Steinhart, 1996).

Šiuo metu yra identifikuota apie 20 KLR izomerų. Cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 izomerai yra svarbiausi KLR izomerai, pasižymintys dideliu bioaktyvumu. Bioaktyvumas pasireiškia tuo, kad šie izomerai gali būti įjungiami į fosfolipidų frakcijas gyvulio audiniuose. Šie izomerai savo sud÷tyje turi tik po vieną trans dvigubą jungtį (Ellen ir kt., 2004). Daugiau kaip 82% KLR tenka cis 9, trans 11 izomerui, o trans 10, cis 12 sudaro tik 3 – 5%. (Li – Min.ir kt., 2006). Cis 9, trans 11 izomeras yra vadinamas - „atrajotojų rūgštimi“, o izomero trans 10, cis 12 sinonimas - „geroji riebalų rūgštis“. Tod÷l labai dažnai kalbant apie KLR izomerus pagrinde turima omenyje cis 9, trans 11, o trans 10, cis 12 d÷l nedidelio izomero procento KLR - neįvardijamas. (žr. 1lentel÷, 1 priede). (Collomb ir kt., 2004; Dugan ir kt., 2001; Dhiman ir kt., 2005). Mokslininko Pariza (1999) teigimu, „atrajotojų rūgštis“ ir trans 10, cis 12 linolo rūgšties izomeras yra skirtingi savo biologiniu veikimu, ir kai kuriais atvejais jie turi akumuliacinį poveikį.

Pradin÷ KLR forma randama gyvulių audiniuose ir kai kuriuose maisto produktuose, bet didžiausia koncentracija - atrajojančių gyvulių m÷soje ir pieno produktuose. Bet KLR mažais

Augaliniuose riebaluose yra susikaupę mažesni KLR kiekiai. Gyvulių audiniuose cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 izomeras gali pailg÷ti, ar iš jų susidaryti polinesočiosios riebalų rūgštys. Pavyzdžiui, iš arachido rūgšties biosintez÷s metu, fermentų poveikyje, susidaro analogiški konjuguoti junginiai. (William, 2007).

KLR tai grup÷ polinesočiųjų RR izomerų, kuriuos žmogaus organizmas gauna iš atrajojančių gyvulių maisto produktų, didžiausia KLR koncentracija yra karvių piene. (Aydin ir kt., 2005; Kelsey ir kt., 2003). Linolo rūgštis (18:2, n-6) priklauso omega-6 rūgščių grupei, pagrindin÷ riebalų rūgštis saul÷grąžų ir kukurūzų aliejuje. Atrajotojai yra pripažinti kaip pagrindinis konjuguotos linolo rūgšties šaltinis, kadangi kitos rūšies gyvuliai KLR nesintetina.

Pienas – pagrindinis KLR šaltinis. KLR koncentracija piene išreiškiama mg/1g riebalų. Dauguma pieno produktų savo sud÷tyje KLR turi nuo 3 – 6mg/g riebalų, tai sudarytų 0,3 – 0,6% bendro pieno riebalų kiekio. Kiti tyr÷jai pieno riebaluose nustat÷ 1,4% šios rūgšties. (Staszka, 2005). Didžiausias kiekis rastas KLR karv÷s pieno riebaluose siek÷ 3,7%. Moters piene taip pat yra šios rūgšties (apie 0,1%). (Khanal ir kt., 2004).

KLR kiekis piene yra nepastovus (Dhiman ir kt., 2000). KLR kiekis gali įvairuoti d÷l daugelio priežasčių. Pasteb÷ta, kad ganykliniu laikotarpiu, kai žol÷ yra pagrindin÷ raciono dalis, KLR kiekis piene ir m÷soje didesnis. Žiemos laikotarpiu, šeriant gyvulius koncentratais ir kitais ūkyje pagamintais pašarais, kurių sud÷tyje yra esterifikuotos linolo rūgšties, gaunama produkcija su mažesniu KLR kiekiu. Atrajotojų pašaras turi palyginti mažą kiekį lipidų. Daugumos pašarų sud÷tyje vyrauja fosfolipidai ir glikolipidai, o š÷rimui naudojamos augalų s÷klos kaip koncentruotas pašaras savo sud÷tyje turi pagrinde trigliceridus. Kai kurios s÷klos ir aliejai, kaip pavyzdžiui riešutų, rapso s÷klos, palmių aliejus ir kitos, savo sud÷tyje turi riebalų rūgščių, kurių grandin÷je 20 ir 22 anglies atomai. Pasiekus tokioms riebalų rūgštims atrajojančių gyvulių skrandį, jos intensyviai pakeičiamos, − čia esanti mikroflora kartu su fermentu lipaze riebalus hidrolizina į trigliceridus, fosfolipidus ir glikolipidus bei iki laisvų riebalų rūgščių (Khanal ir Olson, 2004).

Skirtingų mokslininkų gauti KLR kiekybin÷s analiz÷s tyrimų rezultatai panašūs, kiek nežymūs KLR izomerų kiekių skirtumai gaunami homogenizuoto pieno ir sviesto pavyzdžiuose, tačiau tai gali būti d÷l skirtingų gyvulių š÷rimo racionų ar d÷l skirtingų tyrimų metodikų taikymo (publikacijose nenurodoma kokiu š÷rimo laikotarpiu buvo paiimti m÷giniai), žr. 2 lentelę, 1 priede.

Galima išskirti šiuos pagrindinius faktorius, įtakojančius KLR kiekį pieno ir m÷sos riebaluose – sezoniškumą, š÷rimą, gyvulio veislę, bandos ar individualias gyvulių savybes ir kt.

Sezoniškumo įtaka. Ganykliniu laikotarpiu KLR kiekis žymiai didesnis, negu tvartiniu. Ganykliniu laikotarpiu KLR kiekis priklauso nuo žolynų sud÷ties, brandos, pašarų pasirinkimo š÷rimo papildymui (Lock ir kt., 2003).

Š÷rimo lygio. Šeriant gyvulius aliejin÷mis kultūromis , žuvų aliejumi padidina KLR izomerų kiekį piene iki 2 proc., tačiau riebumas ir primilžis sumaž÷ja 3,2 karto.

Veisl÷s. Didžiausias KLR kiekis pieno riebaluose – Prancūzijos pieniniai simentaliai (1,85%pieno riebalų), mažiausias Džersių veisl÷s karvių (0,47%/pieno riebalų)(Peterson ir kt., 2003), žr. 1 lentelę, 2 priede.

Bandos, individualios gyvulio savyb÷s. Bandos, individualios gyvulio savyb÷s, kurios yra genetiškai nulemtos (prieskrandžio mikrofloros populiacija), su÷sto pašaro porcija, atrajojimo laikas, laktacija turi įtakos KLR izomerų kiekiui. Didžiojo prieskrandžio mikroflora labai jautriai reaguoja į skrandžio pH, lipidų sud÷tį slenkant pašarui, keičiasi pašaro pra÷jimo per virškinamąjį traktą laikas ( Peterson ir kt., 2002; Kelly ir kt., 1998).

1.1.2 KLR svarba žmogaus mityboje

Per pastaruosius metus labai išaugo susidom÷jimas KLR tyrimais ir analize, kurių metu gauti rezultatai atskleid÷ fiziologinę KLR reikšmę profilaktin÷je žmonių mityboje. Akcentuojamos KLR tokios savyb÷s: potenciali kovotoja prieš v÷žines ląsteles, stiprina imunitetą, slopina ateroskleroz÷s procesus, tinka II tipo diabeto kontrolei ir kitos. (Bauman ir kt., 2001; Parodi, 2003).

Per pastaruosius tris dešimtmečius buvo atlikti įvairūs brangūs v÷žio gydymo tyrimai, tačiau nebuvo pasiekta didel÷s pažangos šioje srityje. Mirtingumas nuo v÷žio su invazin÷mis ir metastazin÷mis karcinomomis gaubtin÷s žarnos, krūties, plaučių, kasos, prostatos ir šlapimo pūsl÷s srityse sumaž÷jo labai nedaug. Taigi prevencin÷s priemon÷s, o ne gydymas, tur÷tų būti pagrindas kovoje su v÷žiu. Terapinis maistas, kaip KLR praturtintas pienas, gali būti viena iš kovos su v÷žiu prevencinių priemonių.

KLR buvo atrasta kaip rūgštis pasižyminti antiv÷žiniu poveikiu. (Aydin ir kt., 2005). Nacionalin÷ mokslų akademija pažym÷jo, kad KLR neabejotinai yra vienintel÷ riebalų rūgštis, galinti kovoti su kancerogeneze. Tai patvirtino tyrimai su eksperimentiniais gyvūnais (Weiss ir kt., 2004; Chin ir kt., 1991). Taip pat buvo pasteb÷tas slopinamas poveikis daugeliui žmogaus v÷žinių ląstelių augimui (Parodi, 1999). Pirminių tyrimų metu atrastas KLR antiv÷žinis poveikis, skatina tolimesnį ir išsamesnį šios riebalų rūgšties poveikio ir naudos sveikatai tyrimus.

Kai kuriais tyrimais buvo bandoma sukurti specialią dietą, nukreiptą veikimui prieš v÷žines ląsteles. Tyrimo rezultatai buvo stulbinantys, KLR vartojimas sumažino krūties auglių skaičių (Bauman ir kt., 2001).

KLR pasižymi ir kitomis savyb÷mis, kurios gali būti naudingos žmonių sveikatingumui: imunin÷s sistemos stiprinimu, kūno riebalų mas÷s mažinimu, nes stiprina raumenis, maisto alerginių reakcijų mažinimu, melanomų augimo slopinimu, leukemijos ir kitų v÷žinių susirgimų tikimyb÷s mažinimu (Selberg ir kt., 2004; Weiss ir kt., 2004; Aydin ir kt., 2005).

Parizos (1997, 1999) mokslininko atlikti tyrimai patvirtino, kad KLR - prevencin÷ priemon÷ prieš aterosklerozę. Tyrimams naudotų triušių kraujo plazmoje pasteb÷tas mažesnis kiekis didelio tankio lipoproteinų, mažo tankio lipoproteino cholesterolio koncentracijos lygis, tai pat šiek tiek pakito kūno sud÷jimas, sumaž÷jo kūno riebalų atsid÷jimas ir padid÷jo raumenų mas÷s bei vandens kiekis. (Dugan irk t., 2001).

Kelly (2001), Grigorijan (2001) ir Larsen (2003) atliko daugybę tyrimų, nor÷dami ištirti KLR poveikį žmogaus organizmui, mokslininkai padar÷ išvadą, kad tarp lipodistrofijos ir insulino lygio yra ryšys, kuris įtakojamas KLR izomerų dalyvavimo šiuose procesuose.

Kitų mokslininkų atlikti tyrimai patvirtino KLR kaip augimą skatinantį faktorių, kuris stiprina imunines reakcijas organizme.

KLR tyrimų rezultatai patvirtinantys teigiamą fiziologinį poveikį žmogaus sveikatai, leidžia daryti prielaidą, kad KLR fiziologinio poveikio pasireiškimui turi būti suvartotas pakankamas maisto produktų, turinčių savo sud÷tyje KLR, kiekis (Weiss ir kt., 2004). Pagal mokslininko Kelly (1998) rekomendacijas, antikancerogeninio poveikio sužadinimui pakaktų žmogui nedidelio terapinio maisto (šiuo atveju maisto produktų praturtintų KLR) kiekio, kuris artimas vidutiniam maisto suvartojimo lygiui.

Tokios mokslininkų padarytos išvados, ateityje padidins maisto produktų iš atrajotojų suvartojimą, arba pieno ir m÷sos produktų, praturtintų KLR, paklausą. Pastarasis požiūris yra labiau praktinis, ir gali būti pritaikytas maisto pramon÷je, d÷l galimos manipuliacijos KLR kiekiu atrajotojų piene ir m÷soje. Taip pat dirbtinis KLR kiekio didinimas piene ir m÷soje turi potencialą didinti maistines ir gydomąsias šių produktų vertes.

Pieno riebaluose pagrinde vyrauja cis 9, trans 11 izomeras (“atrajotojų rūgštis”). Piene yra pati natūraliausia KLR forma, kiekis svyruoja nuo 2,4 - 28,1 mg/g riebalų rūgščių (Parodi, 1997). Ip (1994) pasiūl÷, kad 70 kg sveriančiam žmogui v÷žio profilaktikai pakanka suvartoti 3,5g KLR per parą. Pasak Dhiman (2005) nenugriebtame piene pieno riebalai vidutiniškai sudaro 3,5%, iš kurių 0,5% yra KLR. Tod÷l, su viena stikline (227 ml) nenugriebto pieno ir viena porcija sūrio (30g) galima gauti 90 mg KLR. Tai sudaro tik 25% rekomenduojamo Ip(1994) mokslininko paros normos. Didel÷ pieno produktų įvairov÷ gali leisti pilnai patenkinti KLR rekomenduojamą suvartoti paros normą.

Knecht(1999) nustat÷, kad rizika susirgti krūties v÷žiu buvo perpus mažesn÷ moterims, suvartojusioms daugiau kaip 620 ml pieno per dieną, lyginant su tomis, kurios suvartojo mažiau nei 370 ml pieno per dieną. Noon (2002) tyrin÷jo KLR cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 izomerų poveikį širdies ligų profilaktikai. Kai KLR pagrindinių izomerų kiekis buvo santykiu 50:50, tai kraujo plazmoje sumaž÷jo triacilglicerolių (TAG) kiekis, o esant 20:80 santykiui – žymiai sumažino mažo tankio lipoproteinų cholesterolio koncentraciją. Alberts (2003) pasiūl÷ KLR kaip specifinę vakciną nuo hepatito B. Mokslininko atlikti tyrimai parod÷, kad 60% žmonių, kurie vartojo KLR izomerus santykiu 50:50 ( cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12), apsauginių antikūnių lygis prieš hepatitą B buvo 33% aukštesnis, ir 36% buvo didesnis negu tų, kurių mityboje KLR izomerai buvo santykiu 80:20 ( cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12). Tačiau daugumos mokslininkų teigimu, didesn÷s nei rekomenduojamos KLR suvartojimo paros normos netur÷tų būti viršijamos, nes n÷ra ištirta pilnai šių izomerų poveikis žmogaus sveikatai.

13 savaičių tyrimai su 60 vyrų ir moterų, turinčių antsvorį parod÷, kad per parą suvartojant nuo 1,8 iki 3,6 mg KLR, nesugrįžo netekta riebalų mas÷, − suaktyv÷jo medžiagų apykaitos procesai organizme, po kūno mas÷s sumaž÷jimo. (Kamphuis ir kt., 2004).

Šiuo metu KLR pripažinta kaip „Geroji riebalų rūgštis“ d÷l savo unikalių savybių:

1. Potenciali kovotoja prieš v÷žinių ląstelių susidarymą. Bandymai parod÷, kad ši rūgštis blokuoja ir stabdo v÷žinių ląstelių susidarymą ir augimą. Trijose pagrindin÷s v÷žio stadijose dav÷ teigiamus rezultatus. Tuo tarpu dauguma gydymui naudojamų antiv÷žinių agentų sugeb÷jo sustabdyti tik viena iš šių stadijų. (www.eatwild.com/cla.html);

2. Žmogaus organizme mažina kūno riebalų kaupimąsi, didina raumenų masę. Blokuoja riebalų patekimą į riebalines ląsteles, skatina riebalų deginimą;

3. Padeda sureguliuoti normalų cholesterolio ir trigliceridų lygį kraujyje; 4. Reguliuoja insulino lygį kraujyje;

5. Mažina maisto sukeliamas alergijas; 6. Stiprina organizmo imuninę sistemą.

4 pav. KLR izomerų teigiamas poveikis.

1.2 KLR biosintez÷ atrajotojų organizme

Riebalai praktiškai netirpsta vandenyje, tačiau gali sudaryti emulsijas, stabilizuojamas emulgatorių (tulžies rūgščių, baltymų, muilų ir kt. medžiagų). Riebalų emulsijų susidarymas yra reikšmingas gyvybiniams organizmo procesams. Virškinami riebalai iš pradžių emulguojami, o paskui hidrolizuojami. Gamtin÷s, stabilizuotos baltymų - riebalų emulsijos pavyzdys − pienas. Pieno riebalai yra lengvai virškinami, kadangi yra emulguoti.

Iš linolo ir neprisotintų oleino rūgšties darinių, mikrobiologin÷s izomerizacijos reakcijų metu, skrandžio mikroflora suformuoja KLR. KLR sintez÷ gali vykti tiek atrajojančių gyvulių skrandyje, tiek audiniuose. Skrandyje KLR susidaro, kaip tarpinis junginys, linolo rūgšties biosintez÷je, kur pagrindinis vaidmuo tenka bakterijai Butyrivibrio fibrisolven. Biohidrinimas – tai neprisotintų riebalų rūgščių virsmas prisotintomis, per izomerizacijos ir hidrinimo procesus, veikiant atrajotojo skrandžio mikroflorai. Tai organizmo apsauginio mechanizmo procesas nuo galimų nuodingų neprisotintų riebalų rūgščių apsinuodijimo.

Audiniuose KLR susidaro iš neprisotintos ∆9_{oktadeceno trans 11 C18:1} (Destaillats ir kt., 2005; Ellen ir kt., 2004). Neprisotinta ∆9 _{oktadeceno trans 11 C}18:1 yra tarpinis junginys, susidarantis skrandyje biohidrinimo metu iš linolo ir linoleno rūgšties. (Abu – Ghazaleh ir kt., 2002).

Mažina lipoproteino lipaz÷s poveikį, stabdo trigliceridų kaupimąsi riebalų ląstel÷se. Aktyvina riebalų rūgščių skilimą raumenyse, energijos gavimui

Stimuliuoja termogenezę, skatina riebalų skilimą ir mažina kūno riebalų atsid÷jimą

Riebalų rūgščių, taip pat KLR tarpinio junginio biohidrinimo metu, riebalų rūgštys iš skrandžio yra absorbuojamos į plonąsias žarnas, ir tokiu būdu patenka į pieno riebalus. Tokios sintez÷s metu atrajotojų piene susidaro apie 70 - 80% KLR. Iš jų 3 - 5% tenka trans 10, cis 12, o didžiąją dalį ( 80 - 90%) sudaro izomeras cis 9, trans 11.

Didžiojo prieskrandžio mikroflora – pagrindinis raktas KLR izomerų susidarymui, tai vienas iš unikalių reiškinių vykstančių tik atrajotojų organizme.

Pramoniniu būdu KLR gaunama, vykstant šarminei augalinių riebalų izomerizacijai. (William, 2007).

Galvijus šeriant pašarais, kuriuose gausu linolo ir linoleno rūgščių, did÷ja KLR kiekis piene, tačiau tik tuo atveju, jei pašaruose esantys aliejai yra struktūriškai priimtini skrandžio mikroflorai − gali vykti biohidrinimo procesai arba audiniuose endogenin÷ sintez÷ (Griinari ir kt., 2000). Jei pašaruose vyrauja nesočiosios riebalų rūgštys arba biohidrinimas jau yra įvykęs, oktadeceno trans-11 C18:1 ir KLR (nebiohidrinta) iš skrandžio patenka tiesiai į plonąsias žarnas. Iš absorbuoto oktadeceno trans-11 C18:1 substrato susidaro KLR, kuri toliau tiesiogiai įsiurbiama į audinius, kuriose vyksta endogenin÷ sintez÷. (Loor ir kt., 2003).

Be Butyrivibrio fibrisolven bakterijų, skrandyje yra ir kitų mikroorganizmų padermių, kurios biohidrina riebalų rūgštis. Tačiau iš visos skrandžio mikrofloros Butyrivibrio fibrisolven veikla yra labiausiai ištirta (Barret ir kt., 2007; Kay ir kt., 2002; Piperova ir kt., 2002).

Skrandis Audiniai

Izomerizacija Dvylikapiršt÷ žarna

Cis 9, cis 12 C_18:2 Cis 9, cis 12 C_18:2

Hidrinimas

Cis 9, trans 11 C18:2 _{Cis 9, trans 12} C18:2

Hidrinimas ∆ 9 desutaraz÷ Trans 11 C18:1 _{Trans 11} C18:1

C

C

1.2.1 KLR biohidrinimas atrajojančių gyvulių skrandyje

Polinesočiosioms riebalų rūgštims (PNRR) pasiekus skrandį, biohidrinimo proceso metu bei, dalyvaujant fermentui lipazei, skrandžio mikroflora paverčia jas į trigliceridus, fosfolipidus ir glikolipidus. (Khanal ir kt., 2004).

Parodi (1999) teigimu cis 9, trans 11 C_18:2 KLR izomeras yra pagrindinis KLR izomeras pieno riebaluose. Šis izomeras buvo pavadintas „atrajotojų rūgštimi“, d÷l jo didel÷s koncentracijos atrajotojų didžiajame skrandyje, − tai tarsi apsauginis faktorius, apsaugantis skrandžio gleivinę nuo visiško išdžiuvimo. Linolo rūgties dalyvavimas biohidrinimo procesuose (biohidrinama linolo rūgštis iki KLR cis 9, trans 11 C_18:2) vyksta žymiai dažniau nei oktadeceno trans 11 C18:1 rūgšties. KLR cis 9, trans 11 C18:2 izomeras, kaip tarpinis junginys, iš atrajotojų didžiojo skrandžio patenka į plonąsias žarnas, kur vyksta tolimesn÷ absorbcija. (Khanal ir kt., 2004; Li – Min. Wang ir kt., 2007).

KLR cis 9, trans 11 C18:2 izomeras skrandyje yra stabilus, pirmasis tarpinis junginys, susidarantis biohidratacijos metu iš pašaruose esančios linolo (cis 9, cis 12 C_18:2) rūgšties, veikiant Butyrivibrio fibrisolven bakterijų linolo rūgšties izomerazei. (Barret ir kt., 2007 ; Kim ir kt., 2000; Harfoot ir kt., 1988; Stanton ir kt., 1997).

Pašarų kaita racione, įtakoja skrandžio mikrofloros kiekį ir keičia fermentacijos, bei produkcijos struktūrą. Beveik visi KLR izomerai yra nustatyti ir žinomi, tačiau pagrindinis vaidmuo tenka KLR cis 9, trans 11 C_18:2 izomerui, kuris dar kitaip apibūdinamas kaip „Atrajotojų rūgštis“ (Bauman, 2000).

Pirmoji bohidrinimo tiek linoleno, tiek linolo rūgšties reakcija prasideda nuo cis 12 dvigubos jungties formavimo į trans 11 dvigubą jungtį. (1 schema). Tokiu būdu iš linolo rūgšties susiformuoja „atrajotojų rūgštis“ (RA) (Cis 9, trans 11 C18:2). Labai dažnai yra painiojami linolo ir linoleno rūgščių terminai, ir pirminis RA šaltinis nurodoma linoleno rūgštis. Tačiau RA izomeras yra tarpinis junginys, susidarantis iš linolo rūgšties biohidrinimo, tuo tarpu linoleno rūgšties biohidrinimo metu susidaro kiti tarpiniai junginiai. Išskyrus atvejį, kai tarpinis junginys, susidarantis biohidrinimo metu iš linoleno, yra oktadeceno (trans 11, C_18:1) rūgštis, kuri Palmquist (2001) teigimu yra substratas endogeninei RA sintezei endogeniniai cis 9, trans 11 C_18:2izomero sintezei audiniuose. Linolo rūgšties biohidratacija baigiasi reakcija, kurios metu iš trans-11 dvigubos jungties susidaro stearino rūgštis. (Santora ir kt., 2000; Abu – Ghazaleh ir kt., 2001).

Linoleno rūgštis Linolo rūgštis Cis 9, cis 12, cis 15 C_18:3 Cis 9, cis 12 C_18:2

Cis 12, trans 11 izomeraz÷ Cis 12, trans 11 izomeraz÷

Cis 9, trans 11, cis 15 C_18:3 cis 9, trans 11 C_18:2 KLR

Trans 11, cis 15 C_18:2 reduktaz÷ (2H)

Reduktaz÷(2H) Reduktaz÷ (2H)

Cis 15 C_18:1 Octadeceno rūgštis Trans 11 C_18:1 Reduktaz÷ (2H)

Stearino rūgštis C_18:0

1 schema. Linolo ir linoleno rūgščių biohidratacijos eiga atrajotojų didžiajame skrandyje (Bauman, 2001; Palmquist, 2001).

Trans 10, cis 12 C_18:2 izomeras yra tarpinis junginys, susidarantis iš linolo ir linoleno rūgščių biohidrinimo metu ir iš izomero trans 10 C18:1 (2 schema). Griinari (1998) teigimu tarp trans 10, cis 12 C_18:2 ir trans 10 C_18:1 izomerų yra ryšys. Karv÷ms turinčioms pieno riebalų depresijos sindromą, piene padid÷jus trans 10, cis 12 C_18:2 KLR kiekiui – maž÷ja pieno riebumas. Šį teiginį patvirtino Baumgard (2001) ir Palquist (2001), kai atlikti tyrimai parod÷, kad trans 10, cis 12 C _18:2 įtakoja pieno riebalų depresiją, kai tuo tarpu cis 9, trans 11 C_18:2 izomeras neįtakoja pieno kiekybinių rodiklių.

Linoleno rūgštis Linolo rūgštis

Cis 9, cis 12, cis 15 C_18:3 Cis 9, cis 12 C_18:2

trans 10, cis 12, cis 15 C _18:3 trans 10, cis 12 C_18:2 KLR trans 10, cis 15 C_18:2

Trans 10 C_18:1

Stearino rūgštis C_18:0

2 schema Linoleno ir linolo rūgšties biohidrinimas didžiajame prieskrandyje, dalyvaujant trans 10, cis 12 C_18:2 izomerazei.

Biohidrinimo lygį skrandyje įtakoja skrandžio aplinkos kaita. Pavyzdžiui, sumažinus pH, dauguma tarpinių junginių išvengs biohidrinimo, ko pasekoje padid÷s KLR srautas į dvylikapirštę žarną (Qiu ir kt., 2004).

Kitas faktorius galintis tur÷ti įtakos KLR koncentracijai atrajotojų piene ir m÷soje, raciono pašaruose esantys angliavandeniai, kurie veikia mikroorganizmų fermentacijos procesus, kartu ir KLR gamybą didžiajame skrandyje. Skrandžio mikrofloros veiklos susilpn÷jimas turi įtakos KLR koncentracijai pieno riebaluose. Tai paaiškina KLR koncentracijos skirtumus karvių piene, gautus ganykliniu ir tvartiniu laikotarpiu. Tvartiniu laikotarpiu, racionuose vyrauja koncentruoti pašarai, o juose esantys cukrūs (fruktoz÷), krakmolas, pektinas ir tirpus pluoštas, labai mažina koncentruotų pašarų virškinamumą. Didelis kiekis lengvai virškinamo krakmolo, cukrų, kurie randami ankstyvojo brendimo pavasarin÷je žol÷je, sukuria atrajotojų skrandyje optimalias sąlygas mikroorganizmų veiklai, sąlygoja geresnę produkciją (Qiu ir kt., 2004).

Labai svarbus veiksnys didžiojo prieskrandžio mikroflorai – mikrobiologin÷ populiacija. Atrajojantys gyvuliai turi šiek tiek skirtingą mikrobiologinę populiaciją. Pavyzdžiui, atrajojimo lygis ir skrandžio sulčių praskiedimo lygis gali padid÷ti d÷l didelio kiekio vandens, gaunamo su atrajojama žole. Su÷dimo norma, š÷rimo dažnumas, kąsnių dydis ir atrajojimo laikas įvairuoja priklausomai nuo gyvulio rūšies ir įtakoja KLR gamybą skrandyje (Abu-Ghazaleh ir kt., 2003).

Daugyb÷ atliktų tyrimų patvirtino, kad KLR didžiausia koncentracija piene susidaro, ganykliniu laikotarpiu (Palmquist, 2001). Jaunoje žol÷je dominuojanti riebalų rūgštis yra linoleno rūgštis (C18:3, n-3), augaluose vyksta panašus biohidrinimo procesas, tik čia skirtingai nei skrandyje, KLR susidaro ne kaip tarpinis junginys. Didel÷ KLR koncentracija piene kai pagrindin÷ raciono dalis tenka žolei, leidžia daryti prielaidą, kad KLR susidaro ne tik didžiajame prieskrandyje, bet gali būti ir kitos kilm÷s ( Griinary ir kt., 2000; Hartfoot ir kt., 1988).

Taigi, KLR sintez÷ gali vykti ne tik atrajotojų skrandyje. Mokslininkas Bauman (1999) suformavo hipotezę ir pareišk÷, kad endogenin÷ sintez÷, bet ne biohidrinimas, yra pirmin÷ pakopa KLR sintez÷je. Ši hipotez÷ v÷liau buvo patvirtinta Corl (2001) ir Piperova (2002). Kay (2004) padar÷ išvadą, kad daugiau nei 91% „Atrajotojų rūgšties“ (cis 9, trans 11, C_18:2) ganykliniu laikotarpiu susidaro endogenin÷s sintez÷s metu.

1.2.2 Endogenin÷ sintez÷

Endogenin÷ sintez÷ vyksta laktuojančių karvių pieno liaukos audiniuose. Katalizuojantis endogen÷s sintez÷s fermentas audiniuose yra ∆9

desutaraz÷. Oktadeceno (trans 11 C18:1₎ rūgštis − substratas, kuris susidaro linolo rūgšties dalinio biohidrinimo didžiajame prieskrandyje metu. (Griinari ir kt., 2000, Abu-Glazaleh ir kt., 2001; Piperova ir irk t., 2002).

Bauman (2001) endogeninę sintezę apibūdina, kaip pirminę oktadeceno (trans 11, C18:1) rūgšties absorbciją. Veikiant ∆9

fermentui desutarazei, ši rūgštis paverčiama į „Atrajotojų rūgštį“. Riebalų rūgštys prisotinamos, veikiant acil-CoA. Prisotintos riebalų rūgštys turi žemesnį lydimosi tašką nei sočiosios ir turi įtakos pieno riebalų savyb÷ms, svarbios lipidų depui ir ląstelių membranoms. (žr. 3 schemą).

Pasak Griinari (2000) tarp “Atrajotojų rūgšties” ir oktadeceno rūgšties yra stiprus koreliacinis ryšys. Padid÷jus racione oktadeceno rūgšties kiekiui – padid÷ja ir KLR kiekis.

Oktadeceno rūgštis (trans 11, C_18:1)

Co – enzimas A

Kofermentas A

Octadeceniol-CoA +ATF +PPi

∆9

desaturaz÷ O₂ NADF+

Cis 9, trans 11, C_18:2 3 schema. Endogenin÷ KLR sintez÷. (Palmquist, 2001).

1.3 KLR cis ir trans izomerų tyrimų metodai

Šiuo metu cis ir trans izomerų tyrimui yra naudojami du pagrindiniai metodai – efektyvioji skysčių chromatografija ir infraraudonųjų spindulių (IR) spektroskopija. Atskiri kiti cis ir trans riebalų rūgščių metodai yra kokybiniai ir kiekybiniai tyrimo metodai maisto produktuose. Tai analitin÷s procedūros, dažniausia turinčios savo atlikimo technikos specifiškumą ir pagrinde naudojamos atskirų lipidų identifikavimui, – Ag-plonasluoksn÷ chromatografija (TLC), efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh), efektyvioji skysčių chromatografija su impregnuota sidabro nitrato kolon÷l÷ (Ag-ESCh), kapiliarin÷ elektroforez÷ (KE) ir kiti. Kiekvienas iš šių metodų turi savo privalumų ir trūkumų.

1.3.1 Infraraudonųjų spindulių(IR)spektroskopija

Infraraudonųjų spindulių spektroskopija tai metodas, kuris buvo naudojamas per paskutiniuosius metus trans ir cis rūgščių sud÷ties tyrimams maisto m÷giniuose. Trans etilenin÷s jungtys pasižymi specifine infraraudonųjų spindulių absorbcija prie 976cm−1_{. Tai} greitas ir paprastas metodas, bet IR metodas n÷ra labai patikimas − trūksta jautrumo, trans rūgščių turi būti daugiau nei 5%. IR spektroskopija taip pat neišskiria atskirų trans ir cis rūgščių izomerų arba neaptinka skirtingų pozicinių izomerų. Be to, gaunami rezultatai yra didesni, kartais net daugiau nei du kartus, lyginant su rezultatais gautais, pasirinkus dujų skysčių chromatografijos metodą. Yra keletas priežasčių d÷l tokio rezultatų skirtumo. Dauguma triglicerolių yra absorbuojami infraraudonųjų spindulių, esant panašiam bangų diapazonui, kaip ir trans izomerai. D÷l to gaunami bendri trigliceridų ir trans izomerų rezultatai. IR spektroskopija taip pat užfiksuoja konjuguotos KLR trans ir cis izomerus, kurie skiriasi nuo trans riebalų rūgščių. (Ulbrecht ir kt., 1994). IR spektroskopija tai ribotų galimybių trans ir cis riebalų rūgščių sud÷ties tyrimų metodas, ypatingai jei maži kiekiai maisto m÷giniuose, neatskiriantis skirtingus geometrinius ir pozicinius izomerus (Ulbrecht ir kt., 1996), tod÷l trans riebalų rūgščių izomerų tyrimams dažniausiai naudojami dujų chromatografijos metodai.

5 pav. Infraraudonųjų spindulių spektroskopijos įranga. (http:// mineralsciences.si.edu/facilities/ftir.htm).

1.3.2 Ag – plonasluoksn÷ chromatografija(Ag-TLC)

Geometrinių izomerų atskyrimas Ag- TLC metodu pagrįstas trans izomerų nepatvarių junginių susidarymu reakcijose su sidabro druskomis. Šie junginiai skiriasi nuo tų, kurie susiformuoja su cis izomeru. (Ledoux ir kt., 2000). Dažniausia Ag- TLC sluoksniai užpildomi 5-20% sidabro nitrato tirpalu, po to išdžiovinami ir suaktyvinami. Riebalų rūgščių metilesterių m÷giniai sumaišomi su heksanu, dietil- arba petrolio eteriu, arba dietileteriu. Tokiu būdu lengviau atsiskiria cis ir trans mononesočiųjų riebalų rūgščių frakcijos. Toliau seka šių rūgščių metilesterių lašinimas ant silikagelio plokštelių ir atliekama dujų skysčių chromatografin÷ (DSCh angl.GLC) analiz÷ (Precht ir kt., 1997). DSCh analiz÷, lyginant su Ag-TLC, duoda žymiai tikslesnius rezultatus, negu naudojant tik DSCh. Molkentin (1995), taikydamas pastarąją metodiką, sugeb÷jo atskirti 10 pikų trans C_18:1 ir 9 pikus cis C_18:1 riebalų rūgščių izomerų, naudojant 100 m kapiliarinę Sil-88 kolon÷lę. O Ledoux (2000) aptiko 18 skirtingų pikų, taikydamas panašias metodo technines sąlygas. Ag – TLC metodo trūkumas – didel÷s laiko sąnaudos ir reikalingas atidumas bei tikslumas, be galimyb÷s automatizuoti šį procesą arba jo dalį.

1.3.3 Efektyvioji skysčių chromatografija

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESCh) yra pagrindinis metodas, naudojamas atskirų cis ir trans riebalų rūgščių izomerų grupių identifikavimui ir kiekybinei analizei. Tai labai paplitusi chromatografijos rūšis. Klasikin÷ efektyviosios skysčių chromatografijos kolon÷l÷ buvo nedidelio eliuento greičio, l÷to atskyrimo, ir tolimesnei analizei buvo reikalingi papildomi metodai. Juaneda (2002) publikacijoje apie ESCh pažym÷jo, kad cis ir trans izomerų atskyrimui su dviem atvirkštinių fazių kolon÷l÷mis būtina naudoti ir dujinį skysčių chromatografą, surinkti frakcijas ESCh analizei, t.y. naudoti DSCh metodą. Atsiradusi sidabro jonų kolon÷l÷ prapl÷t÷ šio brangaus metodo technines galimybes. Pastaruoju metu daugumoje publikuojamų mokslinių straipsnių ESCh yra naudojamas kaip pagrindinis metodas cis ir trans riebalų rūgščių izomerų grupių identifikavimui (Ratnayake, 2004).

1.3.4 Dujų - skysčių chromatografija

Riebalų rūgštys, tai lipidų grup÷, kuri dažniausiai analizuojama dujine skysčių chromatografija (DSCh angl. GLC). Tai neabejotinai geriausias metodas riebalų rūgščių analizei, trans ir cis izomerų grupių identifikavimui. Didžiausias šio analiz÷s metodo privalumas, d÷l atskirų cis ir trans riebalų rūgščių identifikavimo ir kiekio nustatymo, tai galimyb÷ naudoti labai ilgas kapiliarines kolon÷les, užpildytas aukšto polingumo nejudriomis faz÷mis. Kolon÷l÷s efektyvumas yra proporcingas (matematiškai) kvadratinei kolon÷l÷s ilgio šakniai, skiriamoji geba priklauso nuo nejudrios faz÷s pasirinkimo. Padid÷jus kolon÷l÷s ilgiui, bus didesn÷ skiriamoji geba, o nejudrios faz÷s modifikacija tur÷s įtakos riebalų rūgščių izomerų atskyrimui (Wolff ir kt., 1995).

Didžiausia pasiekta skiriamoji galia su nauja labai ilga ir aukšto polingumo kolon÷le. Uždarų sienelių atvira vamzdin÷ kapiliarin÷ kolon÷l÷ DSCh metodą padar÷ tinkamą cis ir trans riebalų rūgščių izomerų identifikavimui ir jų kiekių maisto produktuose nustatymui, ypač hidrintų aliejų tyrimui.

1.3.5 Kapiliarin÷ elektroforez÷

Kapiliarin÷ elektroforez÷ (KE) tai analiz÷s metodas, pasižymintis dideliu efektyvumu, greita analize, ir paprasta analitine technika. Šis metodas gali būti pritaikomas daugelyje sričių, tapo rimtu konkurentu dujinei skysčių chromatografijai. Kapiliarin÷ elektroforez÷s analiz÷ nereikalauja didelio reagentų kiekio ir m÷ginių skaičiaus. Tačiau tai neigiamai veikia rezultatų tikslumą ir metodo jautrumą. Pagrindin÷ problema − analizei naudojant mažą m÷ginio kiekį, analit÷ būna nevisada teisinga. Kaip pavyzdys gal÷tų būti aliejai, turintys mažą kiekį trans riebalų rūgščių (Castaneda ir kt., 2005). Tačiau sumažinus tokias problemas, kurios gali tur÷ti įtakos rezultatų kokybei, atidus m÷ginių paruošimas sąlygoja didelį efektyvumą, greitą analizę ir tikslius rezultatus. Tod÷l, nors ir riebalų rūgščių analizei dažniausiai naudojama dujin÷ skysčių chromatografija, tačiau analiz÷s pagreitinimui dažnai pasirenkamas KE metodas.

Kaip alternatyvi riebalų rūgščių atskyrimo technika galinti pakeisti KE yra micelin÷ elektrokinetin÷ chromatografija (MEKC).

7 pav. Kapiliarin÷s elektroforez÷s įranga. (http://

www.hood.edu/images/content/academics/instruments/Agilent_Capillary_Electrophoresis_Sys tem. JPG).

1.3.6 Micelin÷ elektrokinetin÷ chromatografija (MEKC)

MEKC privalumas yra tas, kad vandeniniuose tirpaluose galima ištirpinti netirpius junginius (kaip riebalų rūgštis). Trūkstant riebalų rūgtims chromoforin÷s arba floroforin÷s grup÷s, jos praeina per UV detektorių neužfiksuotos – neabsorbuoja UV bangų. Jų identifikavimui turi būti naudojamas papildomas detektorius (Erim ir kt., 1995). Dauguma

grandinę turinčių riebalų rūgščių analizei gali būti naudojama kapiliarin÷ elektroforez÷. Kai kuriuose moksliniuose straipsniuose trans ir cis riebalų rūgščių analiz÷ atliekama, naudojant kapiliarinę elektroforezę, tačiau tik bendram jų kiekiui nustatyti, bet ne atskirų izomerų grupių identifikavimui.

1.4 Apibendrinimas

Literatūros apžvalgoje buvo analizuojama kitų tyr÷jų atlikti KLR tyrimai, siekiant išaiškinti šios riebalų rūgšties fiziologines savybes, kurias būtų galima panaudoti žmogaus profilaktinei mitybai. Taip pat šios rūgšties sintez÷s mechanizmą, atskirų analiz÷s metodų efektyvumą.

D÷l potencialių antiv÷žinių ir kitų teigiamų fiziologinių savybių KLR turtingas maistas turi didelę paklausą. Pagrindinis KLR tyrimų tikslas yra išaiškinti tinkamus būdus KLR koncentracijai pieno riebaluose ir m÷soje nustatyti, pl÷sti maisto produktų su KLR asortimentą. Pagrindin÷ KLR cis 9, tran 11 ir trans 10, cis 12 biosintez÷ vyksta atrajojančių gyvulių skrandyje, biohidrinimo procesų metu iš linolo ir linoleno rūgščių, bei iš trans 11 C_18:1riebalų rūgšties. Sintez÷ gali vykti ir audiniuose, tik čia KLR cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12 susidaro iš pilnai nehidrintų linolo ir linoleno riebalų rūgščių junginių.

KLR manipuliacija galima per gyvulių pašarą. Racionų papildymas riebalų rūgštimis, vienas iš efektyviausių būdų ir mitybos strategijų, siekiant padidinti KLR kiekį atrajojančių gyvulių produkcijoje. Gyvulių š÷rimo organizavimas, įtraukiant į racionus lipidų šaltinius yra puikus būdas į rinką pateikti konkurencingą produkciją su didesne KLR koncentracija.

D÷l didelio v÷žinių susirgimų skaičiaus ir antsvorio bei nutukimo pasaulin÷s problemos, vis dar tikslinga tęsti tyrimus galimybių insulino lygio sumažinimui, KLR, kaip prevencin÷s priemon÷s, panaudojimo.

Viena iš biochemijos užduočių yra atskirti sudedamąsias dalis iš įvairių gamtinių mišinių. Literatūros apžvalgoje aptarta keletas KLR izomerų tyrimų metodų, naudojamų medžiagų atskyrimui ir analizei, tačiau dauguma iš jų d÷l įvairiausių priežasčių negali efektyviai atskirti individualias medžiagas (izomerus ir jų grupes). Chromatografija kaip metodas paplito d÷l paprastumo, analiz÷s ir atlikimo spartos. Dujų ir efektyvioji skysčių chromatografija – viena iš svarbiausių kontrol÷s metodų chemijos ir biochemijos pramon÷je.

2. METODIKA

2.1 Tyrimų objektas ir metodika

Tyrimas atliktas KTU maisto institute, darbui vadovavo magistrinio darbo vadov÷ dr.Gintare Zaborskiene. M÷giniai tyrimui rinkti atsižvelgiant į atskirus ganyklinio (birželis, liepa, rugpjūtis) ir tvartinio (gruodis, sausis, vasaris) laikotarpių m÷nesius.

Tyrimų objektas. Lietuvoje išaugintų atrajojančių gyvulių pienas ir grietin÷l÷, m÷sa: 1. Žalias karvių pienas (3,5% riebumo).

2. Nepasterizuota grietin÷l÷ (normalizuota iki 40%). 3. Atšaldytas jautienos kumpis.

4. Atšaldytas avienos kumpis.

5. Atšaldyta kiaulienos nugarin÷ ir kumpis. 6. Atšaldytas avienos kumpis.

7. Standartas “Supelco 37 Component FAME mix”, pieno ir m÷sos riebalų rūgščių sud÷čiai nustatyti.

Pieno m÷giniai surinkti iš LVA praktinio mokymo ir bandymo centro Girait÷s ir Muniškių fermų. Grietin÷l÷s m÷giniai surinkti iš AB“Pieno žvaigžd÷“. Jautienos ir avienos, kiaulienos m÷giniai atrinkti iš MPĮ „Sasnel÷“ ir prekybos centro „Maxima“. Per ganyklinį ir tvartinį periodus ištirta 144 m÷giniai.

Pieno m÷giniai surinkti iš LVA praktinio mokymo ir bandymo centro Girait÷s ir Muniškių fermų. Grietin÷l÷s m÷giniai surinkti iš AB“Pieno žvaigžd÷“ pieno pri÷mimo punkto. Jautienos ir avienos m÷giniai surinkti iš MPĮ „Sasnel÷“ ir prekybos centro „Maxima“. Per ganyklinį ir tvartinį periodus ištirta 144 m÷giniai.

Tiriamų m÷ginių paruošimą ir analizę nusakantys valstybiniai ir tarptautiniai standartai:

• Pieno m÷giniai imti pagal LST EN ISO 707:2008 “Pienas ir pieno produktai. M÷ginių ÷mimo vadovas” standatą.

• Pieno riebumas nustatytas pagal LST EN ISO 1211:2002 “Pienas. Riebalų kiekio nustatymas. Gravimetrinis metodas (pamatinis metodas) (ISO 1211:1999)” standartą.

• Pieno, grietin÷l÷s ir m÷sos tiriamieji m÷giniai paruošti pagal LST EN ISO 661:1989 „Gyvuliniai ir augaliniai riebalai ir aliejus. Tiriamojo m÷ginio ruošimas“ standartą.

• Pieno ir m÷sos m÷giniuose riebalų rūgščių metilo esteriai paruošti pagal ISO 5509:2000 „Animal and vegetable fats and oils – preparation of methyl ÷sters of fatty acids“ standartą.

• Dujų chromatografin÷ analiz÷ atlikta pagal LST EN ISO 5508:1990 „Gyvuliniai ir augaliniai riebalai ir aliejus. Riebalų rūgščių metilesterių analiz÷ dujų chromatografijos metodu“ standartą. Naudotas standartinis riebalų rūgščių mišinys “Supelco 37 Component FAME mix”, pieno ir m÷sos riebalų rūgščių sud÷čiai nustatyti.

Tyrimo rezultatai ir statistin÷ duomenų analiz÷ apdorota naudojant kompiuterines programas „Microsoft Exel 2007“ ir ANOVA. Šiomis programomis apskaičiuoti statistinių duomenų aritmetiniai vidurkiai (

x

2.2 Analiz÷s metodo pasirinkimas

Konjuguotos linolo rūgšties cis 9, trans 11 C18:2 ir trans 10, cis 12 C18:2 izomerų kiekybinei analizei ir identifikavimui mes pasirinkome dujinę chromatografiją. Atsižvelgiant į tiriamos riebalų rūgšties izomerų chemines ir fizikines savybes pasirinkome BXP-70, 120m kapiliarinę kolon÷lę, kurios nuostovioji faz÷ - polin÷ (bicianopropilsiloksano polisilfenilenas).

Darbo vykdymo schema

3 schema. Darbo vykdymo schema.

Pienas Grietin÷l÷ Jautiena Aviena

LVA PMBC Girait÷s ir Muniškių fermos AB“Pieno žvaigžd÷“ pieno supirkimo punktas MPĮ „Sasnel÷“ ir prekybos centras „Maxima“ MPĮ „Sasnel÷“ ir prekybos centras „Maxima“ n=36 n=36 n=36 n=36 18 m÷g.(6-8m÷n.); 18 m÷g.(12-2m÷n.) 18 m÷g.(6-8m÷n.); 18 m÷g.(12-2m÷n.) 18 m÷g.(6-8m÷n.); 18 m÷g.(12-2m÷n.) 18 m÷g.(6-8m÷n.); 18 m÷g.(12-2m÷n.) LIPIDŲ EKSTRAKCIJA

METILO ESTERIŲ PARUOŠIMAS

(Pieno, grietin÷l÷s ir m÷sos metilinimas su KOH metanoliniu tirpalu.)

ANALIZö DUJŲ CHROMATOGRAFU

2.3 M÷ginių paruošimas analizei

2.3.1.1 Riebalų ekstrakcija

Pieno riebalai atskirti separacijos būdu, pieną pašildžius iki 50°C temperatūros.

M÷sos m÷giniai (jautienos ir avienos kumpis) surinkti iš MPĮ “Sasnel÷“ ir prekybos

centro „Maxima“ buvo susmulkinti.

Riebalai iš pieno, grietin÷l÷s ir m÷sos m÷ginių ekstrahuoti su dietileteriu ir petroleteriu mišiniu (1:1), tirpikliams iš m÷ginių pašalinti, kolbos su m÷giniais buvo patalpintos į vandens vonelę prie 50˚C ir m÷giniuose esantiems tirpiklių likučiams išgarinti termostate prie 50˚C, 1 val.

Reagentai: dietilo eteris, petrolio eterio mišinys,bevandenis natrio sulfatas. Įranga: džiovinimo spinta,pašildymo priemon÷ (elektrin÷ plytel÷),

verdančio vandens vonel÷(100°C), kolba (200ml).

Kolbos su m÷giniais, kurie užpilti tirpikliu, uždaromos kamščiu. M÷giniai smarkiai purtomi 5 min. Pakartotinai purtomi kas valandą, laukiame kol pilnai išsiekstrahuoja 3 val. Taip paruošti m÷giniai atkimštose kolbose dedami į vandens vonelę garinami prie 50°C (laikas nuo laiko m÷ginį pamaišant), kol m÷ginys tampa skaidrus. Skaidrūs m÷giniai perfiltruojami, tokiu būdu atskiriami analizei reikalingi riebalai. Perfiltruoti m÷giniai užpilami bevandeniu natrio sulfatu.

2.3.2 Riebalų transmetilinimas

Prieš lipidų riebalų rūgščių sud÷ties analizę dujų chromatografu, yra būtina juos paversti į mažos molekulin÷s mas÷s nepolinius darinius, kaip metilo etsterius. Laisvosios riebalų rūgštys paprastai randamos kaip esteriai junginyje su gliceroliu. Dauguma svarbių riebalų ir aliejų yra žinomi kaip paprastų lipidų klas÷ – trigliceridai. (Christie, 1989). Metilesterių vertimas iš trigiliceridų dažniausiai pasitaikantis cheminis būdas analizuojant lipidus. Riebalų rūgščių metilinimas pagrįstas jungčių tarp riebalų rūgščių suardymu ir glicerolio pakeitimas riebalų rūgščių metilo esteriais. Norint gauti laisvąsias riebalų rūgštis nebūtina trigliceridų hidroliz÷ arba muilinimas prieš paruošiant metilo esterius. Jie gali būti tiesiogiai transesterifikuoti arba transmetilinti į riebalų rūgščių metilo esterius (RRME) dujų chromatografijos analizei (Christie, 1990).

Dažniausia riebalų rūgščių transmetilinimui naudojamas boro trifluorido (BF₃) metanolinis tirpalas. Šis reagentas gali būti naudojamas daugumai lipidų klasių transmetilinimui. Tačiau boro trifluorido (BF₃) metanolinis tirpalas yra labai nepatvarus ir greitai suskyla prie kambario temperatūros.

Mūsų tyrimams m÷ginių riebalų rūgščių transmetilinimui naudojome kalio hidroksido (KOH) (2mol/l) metanolinį tirpalą. Kalio hidroksidui neutralizuoti į tirpalą įd÷jome apie 1g natrio hidrosulfato monohidrato. Trigliceroliai yra netirpūs metileniniuose KOH tirpaluose, tod÷l būtina įterpti tirpiklį. Mūsų m÷giniai buvo praturtinti heksano tirpikliu ir vandeniu.

Paruošti riebalų metilesteriai, izooktano tirpale įšvirkščiami į dujų chromatografo inžektorių.

Reagentai: kalio hidroksidas (2ml/l), izooktanas, natrio hidrosulfato monohidratas, heksano rūgštis. Įranga: m÷gintuv÷liai (5ml), graduota pipet÷,

automatin÷ pipet÷, matavimo kolbos (50ml ir 100ml).

2.4 Chromatografin÷ įranga ir sąlygos

Chromatografijos veikimo principas pagrįstas sorbciniais veiksmais susidarius dinamin÷ms sąlygoms, t.y. per kolon÷lę, pripildytą smulkaus nejudančio sorbento, leidžiamos dujų srautas. D÷l skirtingų mišinio sudedamųjų dalių savybių mišinys suskaidomas į atskiras sudedamąsias dalis, kurių analiz÷ toliau atliekama individualiai. Atskiros sudedamosios dalys turi skirtingą sulaikymo trukmę, pirmiausia pasirodo silpniausiai adsorbuojami komponentai. (McMurry, 2000) o po to stipriau absorbuojantys. Iš praleisto per kolon÷lę srauto tūrio arba trukm÷s gaunamas eliuavimo grafikas, kitaip dar vadinama chromatograma. (žr. 1 pav. 3 priede).

Magistrinio darbo m÷ginių analiz÷ buvo atliekama naudojant japonų gamybos dujų chromatografą „Shimandzu 17A“. Dujų chromatografą sudaro penkios pagrindin÷s dalys: dujos neš÷jos (įkrova), įšvirkštimo sistema (inžektorius), termostatas, detektorius, duomenų registravimo sistema(savirašis) (8 pav.).

8 pav. Dujų chromatografo pagrindin÷s dalys. (http://www.shu.ac.uk/ schools/sci/chem/tutorials/chrom/gaschrm.htm).

Dujų neš÷jų pasirinkimas yra labai svarbus. Dujų chromatografijoje gali būti naudojamos vandenilio, azoto arba helio dujos. Daugumos mokslininkų rekomenduojama pasirinkti vandenilio dujas, d÷l mažos molekulin÷s mas÷s. Kolon÷l÷s veiksmingumas ir pralaidumas kinta kartu su dujų nešimo greičiu kolon÷l÷je, tod÷l pasirinkus vandenilio dujas kaip neš÷jas, srauto greičio sutrikimai yra mažesni (Christie, 1989). Esant per žemam dujų neš÷jų srautui yra tendencija, kad diapazonas pasiskirstys per išilginę difuziją, o esant per aukštam dujų neš÷jų srautui, diapazono pasiskirstymas susilpn÷ja, ir gali būti nepakankamai laiko kai kuriems tiriamo m÷ginio komponentams įeiti į judriąją arba nejudriąją fazę, tokiu atveju riebalų rūgštys ir jų izomerai yra pilnai nesuskaidomi.

Mūsų tiriamuose m÷giniuose riebalų rūgščių ir KLR cis 9, trans 11C_18:2 ir trans 10, cis 12 C_18:2 izomerų tyrimui, kaip dujas neš÷jas pasirinkome azoto dujas, nes darbas su jomis yra saugesnis. Vandenilio dujos yra pavojingos d÷l greito sprogimo suk÷limo.

Inžektoriuje yra m÷ginių įšvirkštimo į kolon÷lę sistema, temperatūros r÷žimo steb÷jimo ir reguliavimo kontrol÷. Nenutraukus judančios faz÷s srauto, į viršutinę kolon÷l÷s dalį per inžektorių įleidžiamas nedidelis kiekis analizuojamo mišinio, kuris išplaunamas nenutrūkstamu judančios faz÷s srautu. Įšvirkštimui naudojamas graduotas švirkštas, kurio didžiausias tūris 20µm, padalos vert÷ 0,1 µm.

Termostatas reguliuojantis kapiliarin÷s kolon÷l÷s temperatūrą yra pati svarbiausia chromatografo sistemos dalis. Optimaliai parinkta kolon÷l÷s temperatūra duoda tikslius

Spaudimo reguliatorius

Dujų srautas

Dujos neš÷jos

Inžektorius Termostatas Kolon÷l÷ Detektorius

Duomenų registravimas

rezultatus. Tiriamųjų komponentų sulaikymo trukm÷ priklauso ne tik nuo nuostovios faz÷s ar nuo dujų neš÷jų srauto, bet ir nuo kolon÷l÷s temperatūros. Aukšta kolon÷l÷s temperatūra sąlygoja greitesnį mišinio pra÷jimą pro kolon÷lę, ko pasakoje sutrump÷ja komponento sulaikymo trukm÷ ir sumaž÷ja kolon÷l÷s panaudojimo galimyb÷s. Esant per žemai kolon÷l÷s temperatūrai, sulaikymo trukm÷ prailg÷ja ir mažiau tirpūs junginiai labai sunkiai praeina pro kolon÷lę. Ratnayake (2002) pasteb÷jo, kad jei kolon÷l÷s temperatūra yra 180°C arba žemesn÷, gaunama keletas vienas ant kito užeinančių cis ir trans izomerų pikų.

KLR cis 9, trans 11C_18:2 ir trans 10, cis 12 C_18:2 izomerų atskyrimui dauguma mokslininkų rekomenduoja ilgą kapiliarinę kolon÷lę. Mūsų tiriamuosiuose m÷giniuose esančiom riebalų rūgščių izomerams atskirti pasirinkome kapiliarinę kolon÷lę BXP - 70, 120m ilgio, 0,25mm vidinis skersmuo. Kolon÷l÷s vidinis paviršius padengtas didelio polingumo nuostabiąja faze iki 70% 0,25µm storio cianopropil – polisilfenileno – siloksanu. Kalon÷l÷ tvirtinama į termostatą, vienu galu prie inžektoriaus – kitu galu – prie detektoriaus. (LST ISO EN 5508:1990).

Detektorius tai prietaisas, kuris fiksuoja ištekančio srauto sud÷ties kitimus. Detektorius kaip ir kolon÷l÷ yra atskirame šilumą palaikančiame bloke, su atskira temperatūros reguliavimo sistema. Detektoriaus temperatūra turi būti aukštesn÷ už kolon÷l÷s temperatūrą. (LST EN ISO 5508:1990). Modernesnio modelio chromatografe dažniausia įmontuotas liepsnos jonizacinis detektorius (FID)(Willet, 1989). Liepsnos jonizuojantis detektorius yra labai jautrus, pasižymi trumpu analiz÷s laiku ir tiksliais rezultatais. Vienas pagrindinių liepsnos jonizacijos detektoriaus trūkumų – m÷giniai sunaikinami d÷l dujų neš÷jų difuzijos liepsnos jonizacijos veikimo junginių analizei. Kai tuo tarpu, riebalų rūgščių analizę atliekant su efektyviąją skysčių chromatografija, m÷ginių sud÷tis lieka nepakitusi ir jie gali būti analizuojami v÷l. Komponentų mišinio eliuatas iš kolon÷l÷s susimaišo su dujomis neš÷jomis (azoto dujomis, mūsų atveju) ir praeina pro detektoriaus liepsną, kur yra suardoma molekul÷ ir gaunami atskiri jonai. Kiekvienas iš šių jonų turi savo srovę, kurią detektorius užfiksuoja ir perduoda duomenų registravimo sistemai. Komponento ištek÷jimą iš kolon÷l÷s rodo smail÷, o smailių skaičius atitinka komponentų skaičių mišinyje, o jų aukštis ir plotas – komponentų kiekį. (žr. 1 pav., 3 priede).

Pirmiausia išeina trans C_18:1 ir cis C_18:1izomerai, o po to KLR cis 9, trans 11C_18:2 izomeras išeina Pirmiausia išeina trans C_18:1 ir cis C_18:1izomerai, o po to KLR cis 9, trans 11C_18:2 izomeras išeina po cis 8, trans 10 C_18:2, o KLR trans 10, cis 12 C_18:2izomeras išeina sekantis po cis 11, trans 13 C_18:2izomero.

Riebalų rūgščių smail÷s identifikuojamos lyginant tirtų m÷ginių gautas chromatogramas su sulaikymo trukme metilintų riebalų rūgščių (RRME angl. FAME,) standartu. Mūsų gauti tyrimo rezultatai buvo lyginami su „Supelco 37 Component FAME mix”, pieno ir m÷sos riebalų rūgščių sud÷čiai nustatyti standartu.

Dujų chromatografijos metodo sąlygos taikytos mūsų tiriamų m÷ginių riebalų rūgščių analizei:

Dujų chromatografas : Shimandzu 17A

Kolon÷l÷s specifikacija:

Kolon÷l÷: BXP-70

Ilgis: 120m

Vidinis skersmuo: 0,25mm

Filtras: 0,25 µm

Dujų chromatografijos sąlygos:

Pradin÷ kolon÷l÷s temperatūra: 60°C

Temperatūros k÷limo greitis: 20°C/min

Galutin÷ kolon÷l÷s temperatūra: 220°C

Detektoriaus(FID) temperatūra: 260°C

Inžektoriaus temperatūra: 220°C

Analiz÷s trukm÷: 45min

Dujos neš÷jos: Azotas

Dujų neš÷jų greitis: 17ml/min

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Ankstesn÷s kitų tyr÷jų studijų parod÷, kad KLR koncentracija pieno ir m÷sos riebaluose priklauso nuo gyvulių raciono pašaruose esančių polinesočiųjų riebalų rūgščių(PNRR). (Dhiman ir kt., 2000). Gyvulius šeriant pašarais, kuriuose yra didel÷ koncentracija PNRR, didina KLR koncentraciją pieno ir m÷sos produkcijoje. Tačiau ši koncentracija gali labai svyruoti d÷l sekančių priežasčių: bandos, veisl÷s, individualių gyvulio savybių, metų laiko.

Mūsų atliktuose tyrimuose didžiausia KLR (cis 9, trans 11 ir trans 10, cis 12) koncentracija tirtuose m÷giniuose buvo nustatyta ganykliniu laikotarpiu - avienoje, o tvartinio laikotarpio m÷giniuose – jautienoje ir avienoje. (žr. 9 ir 10 grafikus, 4 priede).

1lentel÷

. KLR

Ganyklinis laikotarpis Tvartinis laikotarpis M÷ginių

pavadinimas Cis 9, trans 11 Trans 10, cis 12 Cis 9, trans 11 Trans 10, cis 12

Viso KLR proc/nuo bendr.RR Pienas 0,82±0,01 0,48±0,01 0,53±0,03 0,44±0,03 2,27 Grietin÷l÷ 0,86±0,03 0,49±0,01 0,59±0,03 0,42±0,03 2,48 Jautiena 1,24±0,05 1,00±0,01 1,00±0,01 0,47±0,01 3,20 Aviena 1,31±0,03 0,61±0,01 1,00±0,01 0,47±0,01 3,37 p p<0,05* p<0,01** p<0,05* p<0,01** _- *p<0,05 statistiškai patikima **p<0,01statistiškai patikima

Didžiausias KLR izomero cis 9, trans 11C_18:2kiekis, tirtuose m÷giniuose, nustatytas ganyklinio laikotarpio avienoje. Avienoje „atrajotojų rūgšties“, lyginant su ganyklinio periodo KLR kiekiu piene, – 37,4% daugiau; su grietin÷le – 34,4% daugiau; su jautiena – 5,3% daugiau.

Lyginant atskirų m÷ginių KLR izomero cis 9, trans 11 C_18:2 kiekių skirtumus, ganykliniu ir tvartiniu laikotarpiu, tai:

ganyklinio laikotarpio piene min÷to izomero kiekis buvo 38,4% didesnis (p<0,05);

ganyklinio laikotarpio grietin÷l÷je KLR cis 9, trans 11 C_18:2 izomero kiekis buvo 44,2% didesnis (p<0,05);

ganyklinio periodo jautienoje KLR cis 9, trans 11 C_18:2 izomero kiekis buvo 19,4% didesnis (p<0,05);

tvartinio laikotarpio avienoje KLR cis 9, trans 11 _18:2izomero kiekis buvo 23,7% mažesnis (p<0,05).

Didžiausias KLR izomero trans 10, cis 12 C_18:2 kiekis, tirtuose m÷giniuose, nustatytas ganyklinio laikotarpio jautienoje. Lyginant su ganyklinio periodo KLR koncentracija piene, tai jautienoje „Gerosios riebalų rūgšties“ 52% daugiau; grietin÷l÷je – 51% daugiau; avienoje – 39% daugiau.