DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ (GINKGO BILOBA L.) LAPŲ EKSTRAKTŲ POVEIKIS MITOCHONDRIJŲ OKSIDACINIO FOSFORILINIMO SISTEMAI

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

Giedrė Baliūtytė

DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ

(GINKGO BILOBA L.) LAPŲ

EKSTRAKTŲ POVEIKIS

MITOCHONDRIJŲ OKSIDACINIO

FOSFORILINIMO SISTEMAI

Disertacija rengta 2006–2010 metais Lietuvos sveikatos mokslų universi-tete, Medicinos akademijoje, Biomedicininių tyrimų institute, Biochemijos laboratorijoje.

Mokslinis vadovas

prof. habil. dr. Adolfas Toleikis (Lietuvos sveikatos mokslų univer-sitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)

Konsultantė

doc. dr. Sonata Trumbeckaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)

TURINYS

ĮVADAS ... 6

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1.DVISKIAUTIS GINKMEDIS: ISTORIJA, PRITAIKYMAS ... 9

1.2.SVARBIAUSIOS DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ EKSTRAKTŲ VEIKLIOSIOS MEDŽIAGOS ... 10

1.3.DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ EKSTRAKTŲ VEIKLIŲJŲ MEDŽIAGŲ FARMAKOLOGINIS POVEIKIS ... 12

1. 3. 1. Biologinis flavonoidų aktyvumas ... 12

1. 3. 2. Biologinis ginkolidų ir bilobalidų poveikis ... 14

1.4.DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ EKSTRAKTO EGB761 BIOLOGINIS POVEIKIS ... 16

1.5.VIENAPIESTĖ GUDOBELĖ.PAGRINDINĖS VEIKLIOSIOS MEDŽIAGOS.PANAUDOJIMAS MEDICINOJE ... 18

1.6.ANTIOKSIDACINIS FLAVONOIDŲ AKTYVUMAS ... 19

1. 6. 1. Trumpa reaktyvių deguonies junginių charakteristika ... 19

1. 6. 2. Antioksidantinė ląstelės sistema ... 20

1. 6. 3. Antioksidacinio flavonoidų aktyvumo mechanizmai ... 20

1.7.APSAUGINIS FLAVONOIDŲ IR STANDARTIZUOTO GINKMEDŽIŲ LAPŲ EKSTRAKTO POVEIKIS IŠEMIJOS/REPERFUZIJOS METU ... 22

1. 7. 1. Miokardo pažeidimai išemijos/reperfuzijos metu ... 22

1. 7. 2. Išemijos/reperfuzijos sukeliami pažeidimai, apsauginis flavonoidų ir standartizuoto ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis nuo jų ... 23

1.8.FLAVONOIDŲ BIOPRIEINAMUMAS: ABSORBCIJA, METABOLIZMAS BEI TRANSPORTO PER MEMBRANAS MECHANIZMAS ... 25

2. TYRIMO METODAI ... 27

2.1.TYRIMŲ POBŪDIS ... 27

2.2.DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ TINKTŪROS, STANDARTIZUOTO GINKMEDŽIŲ LAPŲ EGB761 IR VIENAPIESTĖS GUDOBELĖS VAISIŲ EKSTRAKTŲ PARUOŠIMAS ... 27

2.3.MITOCHONDRIJŲ IŠSKYRIMAS ... 28

2.4.MITOCHONDRIJŲ BALTYMO KIEKIO NUSTATYMAS BIURETO METODU ... 29

2.5.PADIDINTO PRALAIDUMO SKAIDULŲ PARUOŠIMAS ... 29

2.6.ŠIRDIES PERFUZIJA BEI IŠEMIJOS SUKĖLIMAS ... 29

2.7.MITOCHONDRIJŲ KVĖPAVIMO GREIČIO REGISTRAVIMAS ... 30

2.8.MITOCHONDRIJŲ MEMBRANOS POTENCIALO MATAVIMAS ... 30

2.9.MITOCHONDRIJŲ BRINKIMO MATAVIMAS ... 31

2.10.VANDENILIO PEROKSIDO KIEKIO MATAVIMAS MITOCHONDRIJOSE ... 31

2.11.CITOCHROMŲ CC1 IR AA3 KIEKIŲ MITOCHONDRIJOSE NUSTATYMAS ... 31

2.12.NADH FLUORESCENCIJOS MATAVIMAS... 32

2.13.CITRATO SINTAZĖS AKTYVUMO MATAVIMAS ... 32

2.14.MIOKARDO ELEKTROMECHANINIO AKTYVUMO MATAVIMAS ... 33

2.15.EKSPERIMENTINIAI TYRIMAI IN VIVO ... 35

2.16.STATISTINĖ DUOMENŲ ANALIZĖ ... 35

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 38

3.1.GINKMEDŽIŲ LAPŲ EKSTRAKTŲ POVEIKIO MITOCHONDRIJŲ FUNKCINEI BŪSENAI

ĮVERTINIMAS: TYRIMAI IN VITRO ... 38

3.1.1. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikis permeabilizuotų širdies skaidulų ir izoliuotų širdies mitochondrijų kvėpavimui ... 38 3.1.2. Vienapiestės gudobelės vaisių ekstrakto poveikis permeabilizuotų širdies skaidulų kvėpavimui ... 43 3.1.4. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros ir standartizuoto ginkmedžių lapų ekstrakto EGB 761 poveikis žiurkės kepenų mitochondrijų kvėpavimui ... 48 3.1.5. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikio oksidaciniam fosforilinimui žiurkės širdies mitochondrijose mechanizmo tyrimas ... 52

3.1.6. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikio H2O2 susidarymui žiurkės

širdies ir kepenų mitochondrijose tyrimas ... 58

3.2.DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ TINKTŪROS ĮTAKA MIOKARDO IR

MITOCHONDRIJŲ FUNKCIJOMS: TYRIMAI IN SITU ... 61

3.2.1. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros įtaka žiurkės miokardo

elektromechaniniam aktyvumui... 61 3.2.2. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros įtaka žiurkės širdies NADH

fluorescencijai... 66 3.2.3. Apsauginis dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikis mitochondrijoms nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų ... 68

3.3.DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ TINKTŪROS POVEIKIS MITOCHONDRIJŲ

OKSIDACINIO FOSFORILINIMO SISTEMAI: TYRIMAI IN VIVO ... 75

3.3.1. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikis in vivo žiurkės širdies ir kepenų mitochondrijų kvėpavimui ... 75

3.3.2. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikis citochromų aa3 ir cc1 kiekiams

širdies ir kepenų mitochondrijose bei citrato sintazės aktyvumui šiuose audiniuose .. 77 3.3.3. Antioksidacinio dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikio tyrimas ... 80 APIBENDRINIMAS ... 83 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 89

SANTRUMPOS

ADP Adenozino difosfatas ANT Adenino nukleotidų nešiklis ATP Adenozino trifosfatas CAT Karboksiatraktilozidas

CCCP Karbonilcianido-m-chlorofenilhidrazonas

CE Vienapiestės gudobelės (Crataegus monogyna Jacq.) vaisių ekstraktas

COX Citochromo oksidazė DNP 2,4-dinitrofenolis

DNR Dezoksiribonukleininė rūgštis

DTNB 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoinė rūgštis) ECG Elektrokardiograma

EGB 761 Standartizuotas ginkmedžių lapų ekstraktas

EGTA Etilenglikol-bis-(β-amino-etileterio)-N,N,N',N'-tetraacto rūgštis

FADH2 Flavino adenino dinukleotidas, redukuota forma

FMN Flavino mononukleotidas

GBE Ginkmedžių lapų (Ginkgo biloba L.) tinktūra GTP Guanozino trifosfatas

HEPES 4-(2-hydroksietil)-1-piperazinoetanosulfoninė rūgštis MES 2-[N-morfolino] etanosulfonato rūgštis

NADH Nikotino amido adenino dinukleotidas, redukuota forma NO Azoto monoksidas

NOS Azoto oksido sintazė RNS Reaktyvūs azoto junginiai ROS Reaktyvūs deguonies junginiai SOD Superoksido dismutazė

TMPD N,N,N′,N′-tetrametil-p-fenilendiaminas TPP+ Tetrafenilfosfonis

ĮVADAS

Pastaruoju metu didelis dėmesys skiriamas širdies ir kraujagyslių sis-temos sutrikimų, kurių metu išsivysto hipertenzija, išemija, smegenų lai-dumo sutrikimai, galvos svaigimas, spengimas ausyse, tyrimams. Yra pa-stebėta, kad daugelis širdies ir kraujagyslių sistemos ligų yra susijusios su struktūriniais bei funkciniais mitochondrijų pakitimais. Kadangi viena pa-grindinių mitochondrijų funkcijų yra tiekti ląstelei energiją, kuri reikalinga įvairiems gyvybiniams procesams, tai bet koks šių organelių pažeidimas gali sąlygoti visos ląstelės, organo, ar net organizmo veiklos sutrikimus. Todėl svarbu ištirti mitochondrijų vaidmenį fiziologinėse ar patologinėse būse-nose.

Pastaruoju metu, intensyviai vystantis farmacijos pramonei, vis didesnis dėmesys krypsta į preparatus, pagamintus iš vaistinės augalinės žaliavos bei į juose esančių biologiškai aktyvių medžiagų sudėties ir veikimo mecha-nizmo tyrimus. Pastebimas ženklus natūralių augalinių preparatų vartojimo didėjimas. Šiuo metu fitopreparatų rinka pasaulyje sudaro apie 60 milijardų JAV dolerių ir prognozuojamas 5–15 proc. kasmetinis jos augimas [Kartal, 2007]. Žinoma, kad augalinių produktų toksiškumas yra žymiai mažesnis lyginant su sintetiniais, o poveikis – švelnesnis, todėl net po ilgo vartojimo laiko nepastebimas neigiamas šalutinis poveikis.

Vieni populiariausių vaistinių augalinių preparatų Europoje yra dviskiau-čių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų preparatai. Medicinoje, gydymo ir profilaktikos tikslais naudojamos šių augalų lapų arbatos, tabletės, tinktūros ir injekciniai tirpalai, tačiau bene populiariausi yra dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktai. Jie dažniausiai yra apibūdinami kaip smegenų kraujotaką bei atmintį gerinantys preparatai. Šalia šių savybių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktai pasižymi antioksidaciniu, kraujagysles atpalaiduojančiu, krešė-jimą mažinančiu, priešuždegiminiu poveikiais [Christen, 2004, Luo, 2001]. Platų šio augalo ekstraktų pritaikymą lemia jame randamos biologiškai aktyvios medžiagos: flavono glikozidai (kvercetinas, kemferolis, rutinas ir kt.) ir terpeno laktonai (ginkolidai ir bilobalidai). Pastebėta, kad ekstraktai yra žymiai efektyvesni už atskirus izoliuotus juose esančius komponentus.

EGB 761 yra standartizuotas patentuotas ginkmedžių lapų ekstraktas, kuriame yra 24 proc. flavono glikozidų, 6 proc. terpeno laktonų ir mažiau nei 5 ppm ginkolinių rūgščių. Tokią preparato sudėtį patvirtino Vokietijos bei Prancūzijos sveikatos ekspertai [Smith and Lou, 2004]. Daugelis moks-linių tyrimų atlikta tiriant šio ekstrakto poveikį demencijos, Alzheimerio, periferinių kraujagyslių įvairių ligų profilaktikai bei gydymui. Yra

duome-jos/reperfuzijos pažeidimų ir sumažina aritmijas [Clostre, 2001; Varga et

al., 1999; Varga, 2002; Shen et al., 1998], slopina reaktyvių deguonies

jun-ginių ir azoto monoksido susidarymą išeminiame miokarde [Pietri et al., 1997; Varga et al., 1999]. EGB 761 veikia mitochondrijų funkcijas (stabi-lizuoja mitochondrijų membraninį potencialą ir kvėpavimo grandinės funk-cijas) bei apoptotinius kelius (slopina kaspazių 3 ir 9 aktyvumus, cito-chromo c išėjimą po oksidacinio streso, mažina proapoptotinio baltymo Bax ir didina antiapoptotinio baltymo Bcl-2 aktyvumus). Tačiau daugelyje mokslinių darbų buvo naudojamos PC12 ląstelės, izoliuotos smegenų mito-chondrijos ar smegenų ląstelės ir labai mažai dėmesio skirta analizuojant ginkmedžių lapų ekstraktų poveikį širdies ir kepenų mitochondrijų oksida-cinio fosforilinimo sistemai. Taip pat nežinomas poveikio mechanizmas.

2005–2007 metais mūsų laboratorijoje atlikti tyrimai parodė, kad pri-klausomai nuo koncentracijos dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto veiklioji medžiaga kvercetinas ir jo glikozidai pasižymi substratų oksidaciją nuo fosforilinimo atskiriančiu poveikiu širdies mitochondrijose. Manoma, kad nedidelis oksidacijos ir fosforilinimo procesų atskyrimas gali būti nau-dingas ląstelei ir gali turėti širdį apsaugantį poveikį [Skulachev, 1998]. Tačiau nėra aišku, ar toks atskirų veikliųjų junginių poveikis galėtų pasi-reikšti ir ginkmedžių ekstrakte. Be to, neaišku, ar ekstrakto poveikis paste-bėtas in vitro galėtų būti stebimas in situ (perfuzuojamos širdies atveju), in

Tikslas:

Ištirti dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų poveikį žiurkės širdies ir kepenų mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai.

Uždaviniai:

1. Ištirti dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų poveikį žiurkės širdies permeabilizuotų skaidulų bei izoliuotų širdies ir kepenų mitochond-rijų kvėpavimui.

2. Ištirti dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikio oksidaciniam fosforilinimui širdies mitochondrijose mechanizmą.

3. Ištirti dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikį izoliuotos žiurkės širdies elektromechaniniam aktyvumui ir įvertinti galimą tinktūros komponentų patekimą į ląstelę ir mitochondrijas.

4. Ištirti ar dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūra apsaugo širdies mitochondrijas nuo žalingo išemijos/reperfuzijos poveikio.

5. Ištirti dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros poveikį mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai in vivo, įvedant ją per os.

Mokslinio darbo naujumas

Mes pirmieji parodėme (in vitro, in situ), kad etanolinė dviskiaučių gink-medžių lapų tinktūra pasižymi stipriu substratų oksidaciją nuo fosforilinimo atskiriančiu efektu širdies mitochondrijose. Buvo pastebėtas slopinantis eks-trakto poveikis mitochondrijų kvėpavimui 3-oje metabolinėje būsenoje. Nu-statėme, kad širdies mitochondrijos kur kas jautresnės ekstraktų poveikiui nei kepenų mitochondrijos. Parodėme, kad atskiriantis oksidaciją nuo fos-forilinimo ekstrakto poveikis pasireiškia dėl jo protonoforinių savybių ir yra susijęs su ANT bei atskiriančiųjų baltymų (UCP) veikla. Pagal perfuzuo-jamos širdies mitochondrijų NADH fluorescencijos mažėjimą galėtume manyti, kad kai kurie tinktūros komponentai iš perfuzato greitai patenka į širdies ląsteles ir mitochondrijas ir sukelia pastarųjų vidinės membranos protoninio laidumo padidėjimą. Parodėme, kad ekstraktas slopina H2O2

susidarymą širdies mitochondrijose ir apsaugo jas nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų ir in vivo padidina citochromo aa3 kiekį kepenų

mito-chondrijose ir sukcinato oksidacijos greitį 3-oje ir 4-oje metabolinėse būse-nose širdies mitochondrijose.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1. 1. Dviskiautis ginkmedis: istorija, pritaikymas

Dviskiautis ginkmedis (lot. Ginkgo biloba L.) – vienintelė ginkainių (lot.

Ginkgophyta) genties, ginkmedainių (lot. Ginkgoopsida) klasės,

ginkme-dinių (lot. Ginkgoaceae) šeimos rūšis. Tai seniausia žinoma medžių rūšis, egzistavusi dar prieš 180–200 milijonų metų. Tėvyne laikoma Kinija, Japonija ir Korėja. Pavadinimas kilęs iš kinų kalbos žodžių sankyo arba

yin-kuo ir išvertus į lietuvių kalbą reiškia – kalnų abrikosas arba sidabrinis

vaisius. 1712 m. Englbert Kaempfer pirmasis panaudojo pavadinimą

Gink-go, o 1771 m. Linėjus jį pavadino Ginkgo biloba (bi – du, loba –skiautės).

Daugiau nei prieš 5000 metų tradicinėje kinų medicinoje dviskiaučių ginkmedžių vaisiai bei sėklos buvo naudojami astmos, kosulio, šlapimo ne-laikymo sutrikimams gydyti [Zimmermann, 2002]. Šiek tiek vėliau šio augalo lapai buvo pritaikyti širdies ir plaučių ligoms bei odos infekcijoms gydyti [Smith and Lou, 2004]. Dviskiautį ginkmedį kaip gydomąją prie-monę 20 šimtmečio viduryje kelionės po Japoniją metu atrado vaistininkas Willmar Schwabe. Pastaraisiais metais ekstraktai paruošti iš dviskiaučių ginkmedžių lapų tapo vieni populiariausių Europoje ir vieni iš 10-ties daž-niausiai JAV vartojamų vaistinių preparatų atminčiai bei galvos smegenų ir galūnių kraujotakai gerinti [Itil and Martorano, 1995].

Vaistinėse gausu įvairių preparatų, kuriuose yra ginkmedžių lapų iš-traukos – tai sirupai, tabletės, kapsulės, tinktūros, netgi siūloma ginkmedžių lapų arbatų. Tačiau klinikiniais tyrimais patvirtintu gydomuoju poveikiu pasižymi tik tie preparatai, kuriuose yra standartizuoto dviskiaučių gink-medžių lapų ekstrakto EGb 761. Tai patentuotas ekstraktas, kuriam keliami aukšti kokybės reikalavimai. EGB 761 – vienas labiausiai pasaulyje varto-jamų ginkmedžių lapų ekstraktų, kurio sudėtyje yra: 24 proc. flavono gliko-zidų, 6 proc. terpeno laktonų (2,8–3,4 proc. ginkolidų A, B ir C ir 2,6–3,2 proc. bilobalidų), mažiau kaip 5 ppm (5 mg/kg) ginkolinės rūgšties [Jacobs and Browner, 2000]. Tokią preparato sudėtį patvirtino Vokietijos bei Prancūzijos sveikatos ekspertai [Smith and Lou, 2004].

1. 2. Svarbiausios dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų veikliosios medžiagos

Pagrindinių junginių klasės, esančios dviskiaučių ginkmedžių lapų eks-traktuose, yra dvi: flavonoidai (flavono glikozidai) ir terpenoidai (terpeno laktonai). Svarbią reikšmę turi ginkolinės rūgštys, kurios, manoma, pasi-žymi toksinėmis savybėmis. Taip pat yra ir nedideli kiekiai kitų junginių (1.2.1 lentelė).

1.2.1 lentelė. Pagrindiniai junginiai, esantys dviskiaučių ginkmedžių

ekstraktuose.

Junginių klasė Pagrindinės sudedamosios dalys

Flavonoidai Flavonai, flavonolai, flavononai, katechinai, izoflavonai,

antocianinai

Terpenoidai Diterpenoidai (ginkolidai A, B, C, J, M), triterpenoidai

(steroliai), bilobalidai

Biflavonoidai Ginkgedinas, izoginkgedinas ir kt.

Organinės rūgštys Benzoinės rūgšties dariniai (ginkolinė rūgštis) ir kt.

Kita Vaškai, steroidai, cukrūs ir kt.

Flavonoidai: struktūra, klasifikacija

Flavonoidai (lot. flavus – geltonas) – polifenoliniai, heterocikliniai, silp-nomis rūgštinėmis savybėmis pasižymintys hidrofobiniai, organiniai jungi-niai [Croft, 1998]. Remiantis literatūros šaltijungi-niais, iki 1990 metų yra nu-statyta daugiau nei 5000 skirtingų flavonoidų [Akhlaghi and Bandy, 2009]. Pagrindiniai šaltiniai, kuriuose randama šių junginių, yra: įvairios uogos, obuoliai, svogūnai, šilkmedžio vaisiai, raudoni bei citrusiniai vaisiai, pomi-dorai, riešutai, šokoladas, arbata, alus, vynas [Russo et al., 2000]. Priklau-somai nuo žmogaus valgymo įpročių, bei regiono, kuriame gyvenama, su maistu kasdien gaunama nuo 65 iki 250 mg šių medžiagų [Sampson et al., 2002, Erdman et al., 2007].

Flavonoidų aglikono pagrindą sudaro C6–C3–C6 struktūra, susidedanti iš

dviejų aromatinių benzeno žiedų (A ir B), sujungtų trijų anglies atomų grandine, kuri besijungdama su hidroksilo grupe, suformuoja heterociklinį (C) žiedą [Jeremy and Spencer, 2009, van Beek and Montoro, 2009] (1.2.1.pav.).

1.2.1. pav. Pagrindinė cheminė flavonoidų struktūra

1.2.2. lentelė. Flavonoidų klasės: struktūra ir priskiriami junginiai Flavonoidų klasė Struktūra Flavonoidai Flavonai apigeninas, liuteolinas, diosmetinas Flavonolai kamferolis, kvercetinas Flavononai naringeninas, hesperedinas Katechinai epikatechinas, galakatechinas Izoflavonai genisteinas, daidzeinas Antocianinai pelargonidinas, malvidinas, cianidinas

Priklausomai nuo C žiedo struktūros pokyčių (oksidacijos laipsnio) ir skirtingų pakaitų A ir B žieduose, flavonoidai gali būti skirstomi į 6 klases (1.2.2 lentelė) [Mladěnka et al., 2010]. Gamtoje flavonoidai paprastai

ran-dami C- ar O-glikozidų formos. O-glikoziduose cukrinė dalis prie aglikono jungiasi per hidroksilo grupę, tuo tarpu C-glikoziduose ši dalis jungiasi tiesiogiai (6 ar 8 padėtyse). Žinoma, kad C- glikozidai retesni nei O-glikozidai.

Terpenoidai

Terpenoidams priklauso ginkolidai, kurie yra diterpenai (C20) ir

biloba-lidai (triterpenai, C15). Ginkolidai pagal šonines grupes dar skirstomi į

ginkolidus A, B, C, J, M (1.2.2. pav.). A B R1 R2 R3 Ginkolidai A OH H H Ginkolidai B OH OH H Ginkolidai C OH OH OH Ginkolidai J OH H OH Ginkolidai M H OH OH

1.2.2 pav. Ginkolidų (A) ir bilobalidų (B) struktūra

Ginkolinės rūgštys sudaro labai mažą procentą sudėtinės ekstraktų dalies. Pagal reikalavimus, jų turi būti kuo mažiau ir nesiekti 5ppm. Jos skirstomos dar į keletą poklasių: ginkolio, bilobalolio, karnanolio, kardolio ir kt.

1.3. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų veikliųjų medžiagų farmakologinis poveikis

1.3.1. Biologinis flavonoidų aktyvumas

Mokslininkai nustatė, kad didžiausią ekstraktų farmakologinį veikimą nulemia ginkmedžių lapų sudėtyje esantys flavono glikozidai [DeFeudis and

tais mokslininkų Rysznyak ir Szent-Georgui darbe, kur šie junginiai priski-riami ir vadinami „P“ vitaminu [Ross and Kasum, 2002]. Epidemiologinės studijos parodė, kad vartojant daug vaisių ir daržovių rečiau sergama vėžiu, širdies ir kraujagyslių ligomis, o tyrimai in vitro ir in vivo sistemose pa-tvirtina neuroprotekcinį juose esančių komponentų poveikį [Doll, 1990, Hertog, 1995, Hertog et al., 1993, Maclennan et al., 2002]. Toks teigiamas poveikis yra siejamas su antioksidantinėmis savybėmis. Moksliniai tyrimai parodė, kad su maistu gaunami fenoliniai junginiai gali pasižymėti stipres-niu antioksidantistipres-niu aktyvumu nei plačiai ištyrinėti vitaminai C, E tame pa-čiame maiste [Schewe et al., 2008].

Gausūs in vitro bei in vivo moksliniai tyrimai rodo, kad flavonoidai pasi-žymi antiagregaciniu (antitrombogeniniu), antiproliferaciniu, priešvėžiniu, priešuždegiminiu, priešvirusiniu poveikiais [Havsteen, 2002, Middleton et

al., 2000, Croft, 1998]. Pastaraisiais metais didelis dėmesys skiriamas

ty-rimams, norint išsiaiškinti aterosklerozės, aukšto kraujo spaudimo, širdies infarkto, išemijos/reoksigenacijos pažeidimų mechanizmus. Nustatyta at-virkštinė koreliacija tarp flavonoidų suvartojamumo ir bendro cholesterolio kiekio [Arai et al., 2000], kuris yra vienas iš išeminės širdies ligos požymių. Keletas flavonoidų pasižymi kraujagysles atpalaiduojančiu efektu, eritrocitų agregaciją slopinančiu poveikiu [Havsteen, 2002, Middleton et al., 2000, Kim et al., 2004]. Yra duomenų, rodančių flavonoidų sugebėjimą veikti kaip laisvųjų radikalų gaudyklė, bei pasižymėti antioksidaciniu poveikiu, mažinant oksidacinį stresą kardiomiocituose. Flavonoidai, tokie kaip kver-cetinas, kemferolis geba sujungti O2., .OH, ONOO., NO., lipidų peroksidus

[Sastre et al., 1998, Hodnick et al., 1988; Silva et al., 2002].

Flavonoidai apibūdinami kaip grupė biologiškai aktyvių junginių, galin-čių turėti širdį apsaugantį poveikį nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų, oksidacinio streso. Atsižvelgiant į cheminę struktūrą, flavonoidai mažina kapiliarų trapumą, normalizuoja kraujagyslių pralaidumą, todėl vartojami gydant venų nepakankamumą, parestezijas, edemas, glaukomą. Flavonoidas kvercetinas (3,3‘,4‘,5,7-pentahidroksiflavonas) mažina laisvųjų radikalų ga-mybą, slopina ksantino oksidazę ir lipidų peroksidazę. Tiesiogiai mažina mažo tankio cholesterolio oksidaciją arba veikia per vitaminą E, apsaugo-damas jį nuo oksidacijos. Taip pat slopina uždegimą, mažinapsaugo-damas jį suke-liančių fermentų (ciklooksigenazės ir lipoksigenazės) bei mediatorių (leu-kotrienų ir prostaglandinų) aktyvumą. Tyrimai su žiurkių kepenų mitochon-drijomis parodė, kad kvercetinas (25–50 µM) slopino mitochondrijų kvė-pavimo grandinę, bet apsaugojo mitochondrijų membraną nuo lipidų perok-sidacijos, pasižymėjo superoksido ir 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalus surišančiomis savybėmis [Dorta et al., 2008, Ortega and García, 2009]. Pastebėta, kad po 7d. girdymo kvercetinu (10 mg/kg) sumažėjo

lipidų peroksidacijos produktų kiekis, bei sumažėjo lipidų (cholesterolio, trigliceridų) kaupimasis žiurkių širdyje ir jų mitochondrijose po izoprote-renolio injekcijos (100 mg/kg) bei infarkto sukėlimo, lyginant su kvercetinu negirdytomis žiurkėmis [Prince and Sathya, 2010]. Yra duomenų, kad flavo-noidai, pvz. katechinas, taksifolinas, neveikia mitochondrijų kvėpavimo, tačiau gali sukelti mitochondrijų nespecifinio pralaidumo poros atsidarymą [Dorta et al., 2005].

Kemferolis (3,4‘,5,7-tetrahidroksiflavonas) ya vienas dažniausiai randa-mų flavonolių, kurio esama ir standartizuotame dviskiaučių ginkmedžių ekstrakte EGB 761. Jis pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, padidina Mn SOD ir Cu/Zn SOD lygį H460 ląstelėse [Leung et al., 2007]. Tai yra stiprus antioksidantas, padedantis apsaugoti ląsteles, lipidus ir DNR nuo oksida-cinių pažaidų, taip pat reikšmingas aterosklerozės prevencijai, nes slopina mažo tankio lipoproteinų oksidaciją ir trombocitų agregaciją. Nustatyta, kad kemferolis slopina monocitus prijungiantį baltymą (MCP-1), kuris svarbus pradiniame aterosklerozės plokštelių formavimosi etape. Liuteolinas - flavonoidas, kuris yra svarbus hipoglikemijai, nes didina jautrumą insulinui, normalizuoja gliukozės koncentraciją kraujyje ir padeda reguliuoti kūno svorį; jis taip pat rekomenduojamas kaip prevencinė priemonė gydant kataraktos ir kraujagyslių sutrikimus. Liuteolinas neutralizuoja laisvuosius radikalus, mažina oksidacinį stresą, uždegimo procesus, reguliuoja padi-dėjusios imuninės sistemos aktyvumą ir normalizuoja angliavandenių apy-kaitą. Dar vienas flavonoidas, rutinas, taip pat pasižymi apsauginėmis funk-cijomis prieš išemijos/reperfuzijos sukeltus pažeidimus. Rutino injekcijos arba girdymas (80 mg/kg) 42 dienas šiuo flavonoidu sumažino isoprote-renolio (kardiotoksiškumą sukeliantis junginys) sukeltą širdies mitochond-rijų pažaidą, apsaugodamos nuo laisvųjų deguonies radikalų, mažindamos lipidų peroksidazių aktyvumą, lipidų ir kalcio kiekį, padidindamos glu-tationo, ATP kiekius [Punithavathi et al., 2010]. Pelių girdymas rutinu (15 ar 30 mg/ kg) prieš sukeliant smegenų išemiją/reperfuziją sumažino smegenų infarkto zoną, apsaugojo neuronus nuo pažeidimų, kurie susiję su padidėjusia ROS gamyba išemijos/reperfuzijos metu [Gupta et al., 2003].

1. 3. 2. Biologinis ginkolidų ir bilobalidų poveikis

Moksliniai duomenys rodo, kad viena iš pagrindinių veikliųjų medžiagų, esančių EGB 761 ekstrakte, yra triterpeno laktonai – bilobalidai [Nakanishi, 2005]. Standartizuotame ginkmedžio ekstrakte jų kiekis yra maždaug 2,9 proc. Bilobalidai pasižymi smegenis apsaugančiomis savybėmis, kurios

bilobalidų apsaugojo smegenų hipokampo neuronus nuo hipoksijos, 10 µM bilobalidų sumažino staurosporino sukeltą apoptozę neuronuose, 25–100 µM bilobalidų sumažino β-amiloido sukeltą ląstelių žūtį PC12 ląstelių kultūroje. O taip pat slopino lipidų peroksidaciją bei didino antioksidacinių fermentų (superoksido dismutazės, katalazės, glutationo peroksidazės) aktyvumą [Defeudis, 2002].

Tyrimai rodo, kad bilobalidai veikia ir mitochondrijų funkcijas. Manoma, kad vienas pagrindinių jų veikimo taikinių yra mitochondrijų kvėpavimo grandinė [Stromgaard and Nakanishi, 2004]. Eksperimentai in vitro su kraujagyslių endotelio ląstelėmis rodo, kad bilobalidai gali atstatyti po išemijos sumažėjusį ATP kiekį [Janssens et al., 1995]. Tyrimuose in vivo parodyta, kad bilobalidai apsaugo kepenų mitochondrijas nuo išemijos sukelto oksidacinio fosforilinimo sulėtėjimo ir sugeba pagerinti ATP sintezę bei pasižymi mitochondrijų kvėpavimą tausojančiu poveikiu [Chao and Chu, 2004]. Po girdymo bilobalidais (2–8 mg/kg) padidėja žiurkių kepenų mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientas, o taip pat mitochondrijų I, III kompleksų aktyvumai [Janssens et al., 1999]. Bilobalidai nežymiai sumažino kvėpavimą 3-oje mitochondrijų kvėpavimo būsenoje, tačiau nekeitė adenino nukleotidų nešiklio aktyvumo ir sukcinato transporto [Janssens et al., 2000]. Rezultatai rodo, kai bilobalidai gali apsaugoti ne tik nuo išemijos sukelto mitochondrijų kvėpavimo kontrolės RCI mažėjimo, bet ir nuo mitochondrijų kvėpavimo grandinės I kompekso aktyvumo sumažė-jimo [Bouaziz et al., 2002].

Eksperimentai parodė, kad bilobalidai (30,6 µM) veikia tam tikrų genų ekspresiją PC12 ląstelių kultūroje: padidina citochromo c oksidazės 3 subvieneto genų raišką ir NADH dehidrogenazės 1 subvieneto mRNR lygį [Tendi et al., 2002], bei slopina hipoksijos sukeltą fosfolipazės A aktyvumą, sumažina infarktinę zoną bei padidina gliukozės transportą [Stromgaard, 2004]. Manoma, kad jie gali veikti kaip antioksidantai, surišdami superok-sido jonus ir NO [Janssens et al., 1999]. Yra duomenų, kad bilobalidai (10 µM) padidina superoksido dismutazės ir katalazės aktyvumus [Song et al., 2000].

Kita veiklioji medžiaga, esanti EGB 761 ekstrakte, yra ginkolidai. Tyrimai parodė, kad ginkolidai apsaugo centrinę nervų sistemą nuo išemijos ir uždegiminių procesų pažeidimų. Nustatyta, kad ginkolidas B (2 µM) gali apsaugoti žiurkės širdį nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų, kadangi page-rina širdies funkcijas, sumažina infarktinę zoną bei išėjusio laktato dehidro-genazės kiekį. Žiurkių girdymas 15 dienų ginkolidu A (4 mg/kg/per dieną) apsaugojo širdį, manoma, dėl antioksidacinio šių medžiagų poveikio [Pietri

et al., 1997]. Keletame straipsnių pabrėžiamos antiapoptotinės ginkolidų

proapo-ptotinio baltymo Bax kiekio sumažinimas [Hao et al., 2009], citochromo c išėjimo slopinimas, kaspazių 9 ir 3 aktyvumo sumažinimas po oksidacinio streso [Smith and Luo, 2004]. Pelių smegenų neuronų kultūros 24 val. pripratinimas su ginkolidais B (120 µM) apsaugojo nuo išemijos sukeliamos apoptozės [Wu et al., 2009]. Taip pat pastebėta, kad ginkolidai B, J ir bilobalidai slopina staurosporino sukeltą apoptozę [Ahlemeyer and Kriegl-stein, 1999]. Ginkolidai, ypač ginkolidas B, mažina hemoreologinius sutri-kimus ir endotelio ląstelių sąveiką su leukocitais ir trombocitais išeminėse srityse, slopina trombocitų agregaciją aktyvinantį faktorių ir su juo susi-jusius poveikius bei mažina ląstelių membranų lipidų peroksidaciją [Pietri et

al., 1997].

1. 4. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto EGB 761 biologinis poveikis

Farmakologinį augalinio preparato EGB 761 poveikį sukelia ne viena, o kelios veikliųjų junginių grupės. Tokiu būdu pasireiškia sinergistinis povei-kis, nulemiantis terapinį fitopreparatų aktyvumą [Capasso, 2000]. Šis stan-dartizuotas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktas apibūdinamas kaip krau-jotaką ir atmintį gerinantis preparatas [Christen 2004, Lou 2001]. Ginkme-džių lapų preparatai pasižymi antiagregacinėmis savybėmis, neleidžia trom-bocitams sulipti, todėl mažomis dozėmis (40 mg per parą) jų skiriama su-trikus kraujotakai, o didesnėmis dozėmis (240 mg per parą) – atminties sutrikimui gydyti.Klinikiniai tyrimai ir mokslinės studijos parodė, kad EGB 761 ekstraktas pagerina širdies funkcijas, sumažina ritmo sutrikimus po išemijos – reperfuzijos pažeidimų [Shen et al., 1998, Varga et al., 1999, Clostre, 2001, Varga, 2002], slopina reaktyviųjų deguonies junginių (ROS) bei azoto monoksido gamybą išeminiame miokarde [Pietri et al., 1997]. Moksliniai tyrimai su jūros kiaulytėmis rodo šio ginkmedžių lapų preparato gebėjimą gerinti kraujotaką [Didier et al., 1996; Lamprogou et al., 1998]. Nustatyta, kad EGB 761 ekstrakte esantys flavonoidai ir terpenoidai suteikia ekstraktui antioksidacinių savybių [DeFeudis and Drieu, 2000, Akhlaghi and Bandy, 2009].

EGb 761 ekstraktu gydomi kai kurie galvos smegenų funkcijos sutri-kimai, su amžiumi susiję įvairūs atminties sutrisutri-kimai, demencijos. Manoma, kad EGb 761 pasižymi neuroprotekciniu poveikiu [Maclennan et al., 2002], gerina smegenų medžiagų apykaitą, normalizuoja impulsų perdavimą, apsaugo smegenų ląsteles nuo hipoksijos, gerina smegenų ir periferinės nervų sistemos veiklą, saugo nervines ląsteles nuo žalingų įvairių faktorių

mechanizmą, apsaugantį nuo Alzheimerio ligos [Luo, 2001]. Buvo nusta-tyta, kad EGb 761 slopina β amiloido agregaciją in vitro ir silpnina reakty-vius oksidacinius procesus in vivo [Luo et al., 2002]. Šie duomenys leidžia spėti, kad EGb 761 galėtų pasižymėti prevenciniu ar gydomuoju poveikiu, apsaugančiu nuo Alzhaimerio ligos.

Žinoma, kad širdies išemijos metu kraujagyslių endotelio ląstelės ir makrofagai gamina didelius kiekius azoto monoksido (NO). Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte esantys proantocianinai dalyvauja iš endotelio išskiriant kraujagysles atpalaiduojančias medžiagas, ypač NO [Mesbah and Khalifa, 2005]. Ginkmedžių lapų veikliosios medžiagos, aktyvindamos gliukozės panaudojimą ir ATP sintezę, gerina ląstelių energijos apykaitą, stabilizuoja ląstelių membranas deguonies stygiaus sąlygomis [Ahlemeyer and Krieglstein, 2003]. Ekstraktas EGB 761 slopina hemodinaminius su-trikimus, išeminių zonų vazomotoriką, kapiliarų pralaidumą, ląstelių ho-meostazės jonų reguliaciją, kai kuriuos intraląstelinius fermentus – fosfo-lipazes, fosfodiesterazes ir proteinkinazes – bei pasižymi gerai žinomu lais-vuosius radikalus neutralizuojančiu veikimu [Shi et al., 2009]. Manoma, jog EGB 761 ekstraktas padeda išvengti kraujotakos sutrikimų organizme, regu-liuoja kraujagyslių tonusą ir elastingumą, mažina kraujo klampumą. Gink-medžių lapų preparatas veikia ir kaip antioksidantas, todėl lėtina senėjimo procesus, suteikia energijos, stimuliuoja organizmo apsaugines jėgas, maži-na toksinį medžiagų poveikį. Jis palankiai veikia pagyvenusių ir vyresnio amžiaus žmonių pažintines funkcijas, padeda išvengti insulto, infarkto.

Standartizuoto dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto EGB 761 poveikis žiurkės kepenų mitochondrijoms bei jų funkcijoms parodė, kad šis ekstraktas stabilizuoja mitochondrijų membraninį potencialą, bei kvėpavimo grandinės funkcijas, pagerina energetinį metabolizmą [Tendi et al., 2002, Eckert et al., 2005, Janssens et al., 2000, Lahouel et al., 2006]. EGB 761 padidina oksidacinės pažaidos sumažintą membraninį potencialą, citochro-mo oksidazės aktyvumą bei ATP sintezę [Chun Shi, 2009, Abdel-Kader et

al., 2007]. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad EGB 761 (50-200 µg/ml)

neturėjo jokio poveikio žiurkės kepenų mitochondrijų kvėpavimo paramet-rams prieš anoksiją, bet sumažino padidėjusį mitochondrijų kvėpavimo greitį 4-oje būsenoje po anoksijos/reoksigenacijos [Du et al., 1999].

Eksperimentai in vitro su PC12 ląstelėmis parodė, kad inkubacija su 100 µg/ml EGB 761 ekstrakto padidino mitochondrijų kvėpavimo kontrolės koeficientą, mitochondrijų kvėpavimo greitį 4-oje metabolinėje būsenoje, bei NADH dehidrogenazės mRNR ekspresijos lygį [Tendi et al., 2002], o taip pat stabilizavo mitochondrijų membraninį potencialą bei ATP lygį šiose ląstelėse [Abdel-Kader et al., 2007; Eckert et al., 2005]. Nustatytas ir antiapoptotinis EGB 761 ekstrakto poveikis, kuris siejamas su apsauginiais

efektais mitochondrijoms [Eckert et al., 2003]. EGB 761 apsaugojo nuo staurosporino sukeltų mitochondrinių pažeidimų: sumažino išėjusį citochro-mo c kiekį, slopino kaspazės 3, 9 aktyvumus, aktyvino antiapoptotinį bal-tymą Bcl, slopino proapoptotinį balbal-tymą Bax, apsaugojo nuo DNR frag-mentacijos [Smith and Luo, 2004; Eckert et al., 2005]. Tyrimai parodė, kad EGB 761 ekstraktas padidina fermentų superoksido dismutazės ir glutationo peroksidazės aktyvumus, sumažina lipidų peroksidacijos laipsnį [Naidu et

al., 2002].

Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų toksiškumas

Pagrindinės medžiagos, esančios ekstrakte ir galinčios sukelti neigiamą poveikį, yra: ginkolinės rūgštys, ginkolidas B ir ginkotoksinas – 4 metilpi-ridoksinas (B6 antivitaminas). Ginkolinės rūgštys gali sukelti alergines reak-cijas, virškinamojo trakto sutrikimus, tačiau standartizuotuose ekstraktuose šio junginio kiekiai yra griežtai reguliuojami. Yra duomenų, rodančiu, kad ginkolidas B gali sukelti kraujavimą, o ginkotoksinas gali slopinti glutamato dekarboksilazę ir 4-aminobutirato (GABA) sintezę iš glutamato smegenyse, kas gali sukeli epilepsiją, traukulius.

1. 5. Vienapiestė gudobelė. Pagrindinės veikliosios medžiagos. Panaudojimas medicinoje

Vienapiestė gudobelė (lot. Crataegus monogyna Jacq.) augalas, priklau-santis erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimai. Gudobelių vaistinė ir augalinė medžiaga yra gudobelių žiedai, lapai ir vaisiai. Gudobelių pumpurai kaip vaistinė žaliava nėra naudojami ir duomenų apie jų naudojimą gydymo ar ligų profilaktikos tikslais nėra. Įvairiuose literatūros šaltiniuose nurodomas flavonoidų suminis kiekis Crataegus monogyna lapuose, vaisiuose ir žie-duose įvairuoja nuo 1,0 iki 3,0 proc. Vienapiestės gudobelės vaistinėje ža-liavoje nustatyti panašūs flavonoidai ir jų glikozidai kaip ir Ginkgo biloba L.: hiperozidas, kvercetinas, kvercitrinas, rutinas, viteksinas, orientinas, kemferolis ir kt. Taip pat yra procianidinų, katechinų, kavos rūgšties, chlorogeno rūgšties, cholinų, kumarinų, eterinių aliejų, riebalų rūgščių, rau-ginių medžiagų, sacharidų, pektinų, karotinoidų, triterpeninių saponinų [Bruneton, 1995; Jakštas et al., 2002]. Lyginant gudobelės ekstraktų sudėtį su dviskiaučių ginkmedžių lapų pastebėta, kad gudobelės preparatuose yra daug daugiau flavonų ir jų glikozidų, nei flavonolių ir jų glikozidų, kurių daugiau ginkmedžių lapų ekstaktuose.

1995]. Preparatai rekomenduojami ankstyvoje hipertonijos stadijoje ar kaip pagalbinė priemonė sergant aritmija ir tachikardija. Preparatai stiprina širdies raumens susitraukimus, didina širdies atsparumą deguonies stygiui, mažina periferinių kraujagyslių įtampą, gerina širdies laidumą, miokardo veiklą, širdies vainikinę ir galvos smegenų kraujotaką [Al Makdessi, 1996]. Gudobelės vaisių ekstraktai pasižymi antiradikaliniu aktyvumu, kuris la-biausiai priklauso nuo epikatechinų ir katechinų, esančių preparate [Berna-tonienė et al., 2008]. Nustatyta, kad pavienės veikliosios medžiagos lais-vuosius radikalus suriša silpniau nei šių medžiagų mišinys [Bernatoniene et

al., 2008], taigi taip pat kaip ir dviskiaučių ginkmedžių ekstrakte, pasireiškia

sinergistinis veikliųjų medžiagų poveikis.

Mokslinių duomenų apie Crataegus monogyna ekstraktų poveikį širdies mitochondrijoms praktiškai nėra. Kadangi cheminė sudėtis, pagrindinės veikliosios medžiagos, esančios preparate panašios į Ginkgo biloba L. ekstraktų, galime manyti, kad abu ekstraktai galėtų pasižymėti panašiu bio-loginiu poveikiu.

1. 6. Antioksidacinis flavonoidų aktyvumas 1.6.1. Trumpa reaktyvių deguonies junginių charakteristika

Laisvųjų radikalų reakcijos yra svarbus biologinių sistemų homeostazės veiksnys. Padidėję laisvųjų radikalų kiekiai dalyvauja įvairių ligų (vėžio, aterosklerozės, miokardo infarkto, uždegiminių ligų) patogenezėje [Valko et

al., 2007]. Aktyvūs deguonies junginiai yra nestabilūs, lengvai reaguoja su

organiniais ir neorganiniais junginiais, sudarydami įvairius peroksidacijos produktus. Reaktyvių deguonies junginių sąveika su lipidais, baltymais, DNR molekulėmis sukelia jų peroksidaciją. Laisvųjų radikalų reakcijos prasideda dėl įvairių reaktyvių deguonies junginių: superoksido radikalo (O2•-), hidroksilo radikalo (•OH), azoto monoksido (NO•), peroksilo

radi-kalo (ROO•), vandenilio peroksido (H2O2), hipochlorinės rūgšties (HOCl),

singuletinio deguonies (1O2) ir kitų. Deguonies molekulei tiesiogiai

prisi-jungus laisvą ar atitrūkusį iš mitochondrijų kvėpavimo grandinės elektroną, susidaro superoksido radikalas, randamas audiniuose. Hidroksilo radikalas stimuliuoja grandinines lipidų peroksidacijos laisvųjų radikalų susidarymo reakcijas, o jam atakuojant membraninius fosfolipidus, pasigamina perok-silo radikalas. Hidrokperok-silo radikalas yra ypač stiprus oksidantas, kuris rea-guoja praktiškai su visomis žinomomis biomolekulėmis. Kitas ROS šaltinis, sukeliantis oksidacinį stresą, yra vandenilio peroksidas (H2O2), kuris atlieka

ląstelių membranas. Kadangi H2O2 visi elektronai suporuoti, jis nėra

lais-vasis radikalas ir laikomas santykinai mažai reaktyviu oksidaciniu agentu. Tačiau H2O2 pasižymi stipriomis lipofilinėmis savybėmis, greitai

prasi-skverbia per ląstelių membranas ir reaguodamas su metalų jonais sukuria labai reaktyvų hidroksilo radikalą (•OH) audiniuose, kuriuose yra padidėjusi Fe ir Cu metalų koncentracija. Singuletinis deguonis neturi nesuporuotų elektronų, tačiau aktyviai veikia membraninius lipidus ir, oksiduodamas juos, suformuoja lipoperoksidus. Taigi, ląstelės membranose esantys lipidai yra laisvųjų radikalų pažeidžiama sritis, o lipidų peroksidacija – tai grandininės reakcijos tarp deguonies reaktyvių junginių ir lipidų. Lipidų peroksidacijos intensyvumas vertinamas nustatant lipidų peroksidacijos galutinius produktus (pvz.: maloninį dialdehidą).

1.6.2. Antioksidantinė ląstelės sistema

Organizme egzistuoja daugiakomponentė gynybos prieš žalingą laisvųjų radikalų poveikį sistema, kurią sudaro tiek endogeniniai, tiek egzogeniniai gynybos mechanizmai. Pirmoji grandis, sauganti nuo laisvųjų radikalų susidarymo, yra antioksidantiniai fermentai: superoksido dismutazė (SOD), gliutationo peroksidazė. Antrąją grandį sudarantys junginiai, kurie ardo ar stabdo laisvųjų radikalų įsijungimą į peroksidacijos reakcijas, yra vitaminai E, C, β-karotinas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, albuminas. Trečiąją grandį sudaro DNR reparuojantys fermentai, metioninsulfoksido reduktazė, kurie atstato pažeistas ląstelių struktūras. Antioksidantai veikia pašalindami laisvųjų radikalų reakcijas katalizuojančius metalų jonus, reaktyvius deguonies junginius (pvz.: superoksido radikalą), lipidų peroksidaciją inicijuojančius laisvuosius radikalus (hidroksilo, peroksilo), nutraukia pradinio etapo grandininę reakciją, pašalina singuletinį deguonį.

1.6.3. Antioksidacinio flavonoidų aktyvumo mechanizmai

Flavonoidai priskiriami prie riebaluose tirpių, egzogeninių antioksidantų [Kandaswami and Middleton, 1994; Cotelle, 2001; Halliwell et al., 2005; Pietta, 2000]. Yra nustatyta, kad šių medžiagų antioksidacinis veikimas gali pasireikšti keliais mechanizmais: 1) tiesiogiai prijungiant laisvuosius radi-kalus; 2) surišant pereinamųjų metalų jonus; 3) sąveikaujant su lipidų bi-sluoksniu biomembranose; 4) veikiant antioksidacinę ląstelės sistemą.

Moksliniai tyrimai parodė, kad tiesioginis antioksidacinis flavonoidų aktyvumas, neutralizuojant susidariusius aktyvius radikalus, yra

svarbiau-atomą. Flavonoidų dariniai, turintys savo struktūros žieduose daug •OH grupių, turi stiprų afinitetą peroksilo radikalams ir geba surišti superoksido anijoną (O2.-), hidroksilo (OH·), alkoksilo (RO·) radikalus [Hodnick et al.,

1988; Silva et al., 2002].

Be tiesioginio antioksidacinio poveikio, flavonoidai pasižymi gebėjimu surišti pereinamųjų metalų (Ca2+, Fe2+, Cu2+) jonus, kurie gali inicijuoti lipidų peroksidinimą. Flavonoidai, gebėdami chelatuoti geležies jonus, slo-pina Fentono bei Haber-Veiso reakcijų metu susiformuojančių aktyviųjų deguonies formų susidarymą. Surišdami vario jonus, užkerta jiems kelią da-lyvauti ciklinėse redokso reakcijose.

Flavonoidai gali netiesiogiai dalyvauti oksidacinių pažaidų mažinime. Yra duomenų, kad šie junginiai slopina fermentus, dalyvaujančius ROS ir RNS susidaryme. Flavonoidai sugeba sąveikauti su kitais antioksidacinės sistemos komponentais: veikia fermentų SOD, katalazės ekspresiją, didina redukuoto glutationo sintezę, bei II fazės fermento glutationo S-Trans-ferazės ekspresiją [Gohil and Packer, 2002]. Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad flavonoidai slopina kitas fermentines sistemas, gaminančias laisvuosius radikalus: lipoksigenazes, ciklooksigenazes, citochromo oksida-zę, mieloperoksidaoksida-zę, NADPH oksidaoksida-zę, ksantino oksidaoksida-zę, fosfolipazę [Kandaswami and Middleton, 1994].

Fenolinių junginių antioksidacinės savybės priklauso nuo jiems būdingo gebėjimo prasiskverbti pro membranas. Yra darbų, rodančių flavonoidų gebėjimą didinti liposomų membraninį takumą, ir taip keisti membranų imlumą oksidacinei pažaidai [Saija et al., 1995]. Tačiau kiti moksliniai darbai rodo, kad flavonoidai, pasiskirstydami membranoje, stabilizuoja ją. Eksperimentai su kvercetinu atskleidžia, kad šis flavonoidas padidina membraninį laidumą, pakeičia lipidų bisluoksnio varžą [Movileanu et al., 2000]. Antioksidacinės flavonoidų savybės pasireiškia dėl aglikonų ir glikozidų struktūrų, kurios dalyvauja, nutraukiant grandinines laisvųjų radikalų reakcijas [Shen et al., 1998]. Tyrimais nustatyta, kad ekstrakto EGB-761 flavonoidų frakcija pasižymi žymiai stipresniu antioksidaciniu poveikiu prieš hidroksilo radikalus nei terpenoidų frakcija [Zimmermann et

al., 2002]. Antioksidacinis flavonoidų poveikis priklauso nuo struktūros,

o-di-OH grupės bei 2,3-dvigubos jungties B–žiede, o taip pat 3 ir 5-OH grupių A, C – žieduose [Dorta et al., 2008].

Tyrimai parodė, kad po 3 mėnesių kasdieninio žiurkių girdymo EGB 761 (100 mg/kg kūno svorio) malondialdehido kiekis sumažėjo 37 proc., o superoksido dismutazės aktyvumas beveik nepakito, lyginant su kontrole [Mozet et al., 2008]. Superoksido radikalų bei mitochondrijų ROS kiekis buvo matuojamas disocijuotose smegenų ląstelėse, išskirtose iš pelių, girdytų 14 dienų EGB 761 (100 mg/kg kūno svorio). Rezultatai parodė, kad

po girdymo ekstraktu ROS kiekis statistiškai patikimai sumažėjo, lyginant su kontrole. Toks poveikis aiškinamas ne tik tiesioginiu ekstrakto aktyvumu surišant radikalus, bet ir ekstrakto sugebėjimu teigiamai veikti rijų funkcijas: padidinti mitochondrijų membraninį potencialą ir mitochond-rijų kvėpavimo grandinės kompleksų aktyvumą [Abdel–Kader et al., 2007].

1. 7. Apsauginis flavonoidų ir standartizuoto ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis išemijos/reperfuzijos metu

1.7.1. Miokardo pažeidimai išemijos/reperfuzijos metu

Išemija – tai kraujo sumažėjimas organe arba jo dalyje dėl nepakankamo pritekėjimo arterijomis, dėl ko ima trūkti deguonies, substratų bei nepaša-linami ląstelės metabolizmo produktai [Jennings et al.,1969]. Išemijos metu ląstelėje atsiranda funkciniai ir struktūriniai pakitimai, kurie, ilgėjant išemijos laikui, didėja, ir ląstelė žūna. Širdies ląstelės yra ypač jautrios deguonies trūkumui – po 40–60 min. išemijos prasideda negrįžtamų pažaidų fazė – miokardo infarktas [Jennings et al., 1981]. Manoma, kad vienas iš svarbiausių faktorių, lemiančių pažeidimų lygį, yra ATP kiekis ląstelėje [Pollard, 2002]. Apie 80–90 proc. viso ląstelėje gaminamo ATP kiekio susi-daro mitochondrijose oksidacinio fosforilinimo metu. Šio proceso intensy-vumas priklauso nuo arteriniame kraujyje esančio deguonies kiekio, todėl jam žymiai sumažėjus, progresyviai mažėja ir ATP koncentracija [Di Lisa, 1998]. Po 15 min. išemijos ATP sumažėja 35 proc., o po 60 min. – 94 proc. [Jennings, 1981]. Pirmieji darbai apie išemijos poveikį širdies mitochondrijų funkcijoms pasirodė apie 1960 metus. Buvo nustatyta, kad išemijos metu vystosi funkciniai bei struktūriniai mitochondrijų pokyčiai, dėl ko mažėja oksidacinio fosforilinimo aktyvumas. Oksidacinio fosforilinimo nuslopini-mą gali sąlygoti mitochondrijų kvėpavimo grandinės bei Krebso ciklo fer-mentų aktyvumo ir kiekio sumažėjimas, ATP-sintazės, adenino nukleotidų nešiklio (ANT) ar išorinės bei vidinės mitochondrijų membranų pažeidimai. Išemijos metu padidėja vidinės membranos pralaidumas, dėl ko krinta membraninis potencialas, lėtėja substratų oksidacijos greitis, mažėja ATPazės aktyvumas [Toleikis et al.,1984, 1985, Rouslin, 1983, Di Lisa and Bernardi, 2006]. Mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo greitis išemijos metu sulėtėja dėl kvėpavimo grandinės kompleksų pažeidimo. Ankstyvoje išemijos stadijoje pastebėtas kvėpavimo grandinės komplekso I aktyvumo sumažėjimas [Jennings et al., 1969; 1976], kuris, manoma, įvyksta dėl nekovalentiškai prijungto FMN disociacijos arba dėl matrikse sumažėjusios

kompleksus: 24 proc. sumažėja komplekso II aktyvumas, 9–14 proc. kom-plekso III, ir 9–13 proc. komkom-plekso IV aktyvumai [Piper et al., 1985; Rouslin 1983; Toleikis et al., 1989]. Išemijos/reperfuzijos metu sutrinka Ca2+ homeostazė ir citozolyje padidėja laisvo Ca2+ koncentracija, kuri ląstelei yra žalinga, nes sukelia laisvųjų deguonies radikalų gamybą, aktyvina fosfolipazes, pažeidžia mitochondrijas [Prasad et al., 1991].

1.7.2. Išemijos/reperfuzijos sukeliami pažeidimai, apsauginis flavonoidų ir standartizuoto ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis nuo jų

Yra atlikta daug mokslinių tyrimų, rodančių galimą flavonoidų apsauginį poveikį nuo išemijos/reperfuzijos sukeliamų pažeidimų. Poveikis pasireiškia per antioksidacines, kraujagysles atpalaiduojančias savybes, priešuždegi-minius ir antiagregacinius efektus [Akhlaghi and Bandy, 2009; Fitzl et al., 2001; Sener et al., 2005]. Taip pat daugėja duomenų, kad, flavonoidams patekus į organizmą per os, gali pasireikšti širdį apsaugantis poveikis nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų [Modun et al., 2003; Ikizler et al., 2007; Sastre et al., 1998]. Geriausiai žinomas ir labiausiai tyrinėjamas apsauginis flavonoidų poveikis nuo išemijos/reperfuzijos sukeltų pažeidimų yra šių junginių tiesioginis antioksidacinis aktyvumas.

Daugelis mokslinių eksperimentų, tiriant galimą apsauginį dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų poveikį nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų, atlikta su smegenimis. Teigiama, kad šie preparatai apsaugo smegenis nuo išemijos/reperfuzijos pažaidų, veikdami kaip antioksidantai – laisvųjų ra-dikalų gaudyklė – bei įtakojant apoptotinius procesus [Zhou et al., 2010]. Pagirdžius žiurkes EGB 761 (150 mg/kg) ir sukėlus smegenyse 60 min. išemiją ar 60 min. išemiją/60 min. reperfuziją, pastebėta, kad padidėja SOD aktyvumas, sulėtėja lipidų peroksidacijos procesai, lyginant su kontrolinė-mis žiurkėkontrolinė-mis [Seif-el-Nasr et al., 1995].

Yra duomenų, rodančių ekstrakto EGb 761 apsauginį poveikį širdžiai nuo išemijos/reperfuzijos pažeidimų. Širdį apsaugantis ekstrakto poveikis pasi-reiškia širdies ritmo sutrikimų sumažėjimu, miokardo funkcijų atstatymu po išemijos. Apsauginis mechanizmas grindžiamas ekstrakte esančių aktyviųjų komponentų sugebėjimu mažinti superoksido, hidroksilo radikalų kiekį [Shen et al., 1998]. Eksperimentai parodė, kad žiurkės širdies perfuzija su EGb 761 ekstraktu apsaugo širdį nuo 40 min. globalios išemijos bei po to sekančios 20 min. reperfuzijos pažeidimų [Haramaki et al., 1994]. EGb 761 ekstraktas pagerino žiurkės širdies susitraukimą/darbą po globalios 30 min. išemijos bei 30 min. reperfuzijos. Teigiama, kad toks apsauginis ekstrakto poveikis susijęs su laisvųjų deguonies radikalų sumažėjimu [Tosaki et al.,

1994]. Širdies pažeidimai po išemijos/reperfuzijos tiesiogiai koreliuoja su pažeidimais mitochondrijose bei MnSOD aktyvumo kitimu [Brooks et al., 2002].

Tyrimai parodė, kad ginkmedžio ekstrakte esantys ginkolidas B gali pagerinti žiurkės širdies skilvelio funkcijas po išemijos/reperfuzijos pažeidi-mų, taip pat gali sumažinti infarkto zoną bei laktato dehidrogenazės išėjimą, reguliuoti apoptotinio baltymo Bcl-2 ekspresiją [Hao et al., 2009]. Yra duomenų, kad EGb 761 ekstrakte esantys terpenoidai – ginkolidai A, B ir bilobalidai taip pat turi antioksidacinį poveikį. Žiurkės 15 dienų buvo girdomos ginkolidu A (4 mg/kg/per dieną), po to atlikta širdies perfuzija esant 0,05 µg/ml ginkolidų A, B arba 0,15 µg/ml bilobalidų. Gauti rezultatai parodė, kad abi EGb 761 ekstrakto frakcijos turėjo antioksidacinį ir širdies apsauginį poveikį [Pietri et al., 1997]. Taip pat, nustatyta, kad po 1 savaitės žiurkių girdymo flavonoidu kvercetinu sumažėjo malondialdehido kiekis širdies audinyje po išemijos/reperfuzijos [Ikizler et al., 2007].

Standartizuotas ekstraktas EGb 761 tiesiogiai gali veikti kaip NO gau-dyklė ir slopinti iNOS mRNR ekspresiją, o tai gali pagerinti miokardo funkcijas po išemijos. Eksperimento metu, žiurkės buvo girdomos skirtin-gomis dozėmis EGb 761 ekstraktu (25, 50, 75 ir 100 mg/kg/per dieną, 10 dienų) [Varga, 2002]. Manoma, kad ginkmedžių lapų ekstraktas, slopin-damas uždegiminius citokinus žiurkės miokarde, gali reguliuoti uždegimi-nius procesus po išemijos/reperfuzijos [Bao et al., 2010].

Yra nemažai duomenų apie kvercetino poveikį, esant padidėjusiam kraujo spaudimui. Tyrimų rezultatai rodo, kad, naudojant skirtingus hiper-tenzijos modelius (spontanines hipertenzines žiurkes), kvercetinas, priklau-somai nuo dozės (2–300 mg/kg per dieną), sumažino kraujo spaudimą, apsaugojo nuo morfologinių ir funkcinių širdies, kraujagyslių bei inkstų pažeidimų [Perez-Vizcaino, 2009]. Manoma, kad toks poveikis pasireiškia dėlto, kad kvercetinas veikia kaip ROS gaudyklė, sugeba reguliuotiNADPH oksidazę, pasižymi kraujagysles atpalaiduojančiu efektu [Perez-Vizcaino et

al., 2009].

Kvercetino antioksidacinės savybės po išemijos/reperfuzijos pažeidimų, pasireiškia surišant ·O2 ir ·OH radikalus arba slopinant ksantino oksidazės

aktyvumą ir lipidų peroksidacijos procesus [Frankel et al., 1993]. Tyrimai parodė, kad malondialdehido kiekis po girdymo kvercetinu (50 mg/kg/7 dienas) sumažėjo, o glutationo reduktazės aktyvumas – padidėjo [Ikizler et

al., 2006].

Eksperimentiniai tyrimai parodė, kad ginkmedžio ekstraktas EGB 761 bei tirtos atskiros veikliosios medžiagos – bilobalidai, ginkolidai A, B, C,

µM bilobalidų, ar ginkolidų, 100 µmol/l flavonoidų). Efektas siejamas su Ca2+ srovės slopinimu L-tipo Ca kanalams, bei NO išsiskyrimu iš endotelinių ląstelių [Nishida and Satoh, 2003]. Manoma, kad standartizuotas ginkmedžių lapų ekstraktas aktyvina Ca 2+ aktyvuojamą K+ kanalą ir įtakoja membranos laidumą [Li et al., 2001]. Rezultatai parodė, kad suminis terpenoidų bei flavonoidų poveikis skyrėsi nuo EGB 761 poveikio, ir tai galima paaiškinti sudedamųjų veikliųjų komponentų tarpusavio sąveika ekstrakte – sinergistiniu poveikiu [Nishida and Satoh, 2004].

1. 8. Flavonoidų bioprieinamumas: absorbcija, metabolizmas bei transporto per membranas mechanizmas

Nors yra atlikta daug mokslinių tyrimų, aiškinantis biologinius flavo-noidų efektus, tačiau labai mažai žinoma apie šių junginių transportą į ląsteles, bioprieinamumą bei metabolizmą [Faria et al., 2009, Carbonaro M

et al., 2005].

Pirmasis barjeras, patekus flavonoidams per, os yra virškinamojo trakto membranos įveikimas. Moksliniai tyrimai parodė, kad flavonoidai sugeba pereiti šį barjerą: jie buvo randami ląstelės plazmoje [Manach et al., 2005, Ude et al., 2010; Makino et al., 2009]. Daugelio flavonoidų metabolizmas virškinamajame trakte ir kepenyse yra labai greitas ir intensyvus, tačiau bioprieinamumas pakankamai mažas [Guerrero et al., 2009; Ross and Ka-sum, 2000]. Flavonoidas kvercetinas, kvercetino glikozidas, ar šio junginio metabolitai – isoramnetinas ir tamariksetinas – žiurkių ar žmogaus organiz-mo plazorganiz-moje randami konjuguotose fororganiz-mose – kaip gliukuronidai ar sulfatai [Bieger et al., 2008; Murota and Terao, 2009; Spencer et al., 2004 ]. Kvercetino bioprieinamumas ir absorbcijos kinetiniai duomenys labai skiria-si priklausomai nuo struktūros bei formos, o taip pat dozės. Kvercetinas, kuris buvo tirtas svogūnuose ir buvo tik glikozido formos, buvo greitai absorbuojamas, tuo tarpu kvercetino-3-rutinozidas, rastas arbatoje, pasižy-mėjo mažesne absorbcija [Hollman et al., 1997]. Taigi, manoma, kad cukrūs, esantys flavonoiduose, yra svarbūs ir lemia flavonoidų bioprieina-mumą bei absorbciją žmogaus organizme [Hollman et al., 1997]. Tikslus flavonoidų absorbcijos mechanizmas žarnyne nėra galutinai aiškus. Mano-ma, kad su cukrumis sujungti flavonoidai yra hidrolizuojami žarnyno mikro-floros ar hidrolazių, o po to susidarę aglikonai gali pereiti membraną ir patekti į ląstelę [Walle et al., 2005; Sesink et al., 2001; Passamonti et al., 2009]. Kitas mechanizmas, kuriuo flavonoidai patenka į ląstelę kaip glikozidai, yra nuo Na jonų priklausomas gliukozės nešiklis [Walle, 2004]. Po to vyksta šių junginių susijungimas su gliukuronine rūgštimi,

metili-nimas ar sulfitimetili-nimas. Tyrimais parodyta, kad laisvos kvercetino – glikozido formos plazmoje žmogaus oganizme nėra randamos [Sesink et al., 2001].

Tyrimais parodyta, kad didžiausia flavonolių koncentracija plazmoje yra praėjus 2–2,5 valandoms po patekimo į organizmą [Hollman et al., 1997]. Kvercetino pusamžis plazmoje žmogaus organizme – 17–28 valandos, tuo tarpu žiurkės organizme daug trumpesnis – 4–8 valandos, o kiaulės – apie 4 valandas [Manach and Donovan, 2004; Ader et al., 2000, Manach et al., 1997]. Ilgesnės trukmės (11 savaičių) girdymo tyrimai su žiurkėmis parodė, kad patekęs į organizmą kvercetinas pasiskirsto daugelyje audinių, bet didžiausia jo ir jo metabolitų koncentracija buvo rasta plaučiuose (3,98 ir 15,3 nmol/g audinio atitinkamai po 0,1 proc. ir 1 proc. kvercetino dozės), o smegenyse, baltuosiuose riebaluose bei blužnyje rasti labai maži kiekiai. Analogiški tyrimai su kiaulėmis parodė, kad kepenys (95,87 nmol/g audinio), inkstai (2,51 nmol/g audinio) yra tie organai, kur rastos didžiausios kvercetino koncentracijos, o smegenyse, širdyje, blužnyje – mažiausi kiekiai [de Boer et al., 2005]. Yra duomenų, kad ilgesnio laiko flavonoidų dieta nepadidino šio junginio bei jo metabolitų kaupimosi audiniuose, lyginant su trumpalaike ar vienkartine doze [Bieger et al., 2008]. Galutiniai patekusių į organizmą flavonoidų metabolizmo procesai vyksta kepenyse. Nustatyta, kad po vienkartinės per os dozės radioaktyviai žymėto kvercetino, šio junginio aglikonas labai mažais kiekiais gali būti randamas tik kepenyse, bet ne plazmoje ar inkstuose [Mullen et al., 2002].

2. TYRIMO METODAI

2. 1. Tyrimų pobūdis

Eksperimentais buvo tiriamas dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros (GBE), standartizuoto ginkmedžio ekstrakto EGB-761 bei vienapiestės gud-obelės vaisių ekstrakto (CE) poveikis žiurkės širdies bei kepenų mitochond-rijų oksidacinio fosforilinimo sistemai.Buvo naudojami Wistar veislės žiur-kių suaugę patinėliai. Eksperimentinis gyvūnėlis buvo užmigdomas anglies dioksido dujomis ir nutraukiamas stuburo kanalas kaklo srityje (leidimo, at-likti laboratorinius bandymus su gyvūnais, Nr.0006).

GBE tinktūros, EGB 761 ir CE ekstraktų poveikių tyrimui buvo pasi-rinkti trys eksperimentiniai modeliai:

1) Tyrimai in vitro. Diferencinio centrifugavimo būdu izoliavome žiur-kės širdies ir kepenų mitochondrijas, paruošėme permeabilizuotas (soponinu ir kolagenaze apdorotas) širdies raumens skaidulas ir registravome GBE tinktūros, EGB 761 ir CE ekstraktų poveikį mitochondrijų kvėpavimui nau-dodami poliarografinį metodą. Tyrėme šių ekstraktų poveikio oksidaciniam fosforilinimui širdies mitochondrijose mechanizmą naudodami potenciomet-rinį (įvertinant mitochondrijų membranos potencialą), fluorescencinį (ma-tuojant H2O2 susidarymą širdies ir kepenų mitochondrijose),

spektrofoto-metrinį (įvertinant mitochondrijų brinkimą) metodus.

2) Tyrimai in situ. Atlikome žiurkės širdies perfuziją Langendorfo tipo perfuzijos sistemoje, sujungtoje su širdies elektromechaninio aktyvumo re-gistravimo sistema, ir vertinome GBE tinktūros poveikį miokardo funkcijai. Įvertinome GBE poveikį žiurkės širdies NADH fluorescencijai bei atlikome GBE poveikio širdies mitochondrijoms išemijos/reperfuzijos metu tyrimą.

3) Tyrimai in vivo. Žiurkės savaitę kasdien buvo girdomos GBE tinktūra (54 ar 108 µl/parai). Po to izoliavome širdies ir kepenų mitochondrijas ir vertinome GBE poveikį mitochondrijų kvėpavimui. Spektrofotometriškai nustatėme citochromų aa3, cc1 kiekius širdies ir kepenų mitochondrijose bei

matavome citrato sintazės aktyvumą šiuose audiniuose.

2. 2. Dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros, standartizuoto ginkmedžių lapų EGB 761 ir vienapiestės gudobelės vaisių ekstraktų paruošimas

„Ginkomed“ firmos ginkmedžių lapų tinktūra (GBE) yra pagaminta fir-moje „Valentis“. Spiritinė ištrauka (1000 ml) gaminama iš 200 g ginkme-džių lapų (Ginkgo folium) ir 70 proc. etanolio (Ethanolum, 70 per centum), reikalingo tokiam tinktūros kiekiui pagaminti. 1 ml tirpalo yra 1 ml

gink-medžių lapų tinktūros 1:5 (ekstrahentas 70 proc. (V/V) etanolis). Preparato sudėtyje yra ne mažiau kaip 62 proc (V/V) etanolio. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (HPLC) buvo nustatyti veikliųjų medžiagų kiekiai [Trumbeckaitė et al., 2007]. Tyrimams mes naudojome neskiestą arba 200 kartų praskiestą etanoliu tinktūrą.

Ekstraktas EGB 761 – tai standartizuotas dviskiaučių ginkmedžių lapų sausas ekstraktas, pagamintas firmoje „Gonmisol S.A“. Žinomi flavonoidų (24 proc.) ir terpenoidų (6 proc.) kiekiai. 167 mg sauso ekstrakto tirpinome 1 ml etanolio (70 proc.) ir naudojome tyrimams.

Vienapiestės gudobelės vaisių ekstrakto (CE) paruošimas. Sausi gudobe-lės vaisiai buvo ekstrahuojami (1:10) 70 proc. etanoliu, perkoliacijos gamybos metodu. Žaliavos dalelių dydis 2–3 mm, tinktūros tekėjimo greitis 0,5 ml/min [Bernatonienė et al., 2003].

2. 3. Mitochondrijų išskyrimas

Širdies mitochondrijų išskyrimas. Širdis buvo praplaunama 0,9 proc. 0–4°C temperatūros KCl tirpalu, susmulkinama žirklutėmis ant ledų pa-dėtoje Petri lėkštelėje ir homogenizuojama mechaniniu homogenizatoriumi (stiklas/teflonas), užpilant 10 ml/g audinio homogenizavimo terpės (180 mM KCl, 10 mM Tris/HCl, 5 mM EGTA, pH 7,7 2ºC). Centrifuguojama 750 × g, 5 min., po to supernatantas buvo perpilamas per dvigubą marlinį filtrą, nenupilant nuosėdų ir paskutinių supernatanto lašų, ir vėl centrifuguojamas 6800 × g, 10 min. Mitochondrijos buvo suspenduojamos suspendavimo terpėje (180 mM KCl, 20 mM Tris/HCl, 7,3 2ºC). Mito-chondrijų suspensija (~50 mg/ml baltymo) buvo laikoma leduose.

Kepenų mitochondrijų išskyrimas. Kepenys buvo praplaunamos 0,9 proc. 0°C temperatūros KCl tirpalu. Audinys buvo smulkinamas ir homo-genizuojamas mechaniniu homogenizatoriumi (stiklas/teflonas), užpylus 10 ml/g audinio homogenizavimo terpės (70 mM sacharozės, 210 mM mani-tolio, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA ir 5 mg/ml jaučio serumo albumino, pH 7,4 2ºC). Homogenatas buvo centrifuguojamas 750 x g 5 min., supernatantas buvo perpilamas per dvigubą marlinį filtrą ir vėl centrifuguojamas 10000 × g, 10 min. Mitochondrijų nuosėdos suspenduojamos terpėje (70 mM sacharozės, 210 mM manitolio, 10 mM HEPES, pH 7,4 2ºC) ir dar kartą centrifuguojamos 10000 × g, 10 min. Mitochondrijų nuosėdos vėl buvo suspenduojamos ir gauta mitochondrijų suspensija (~50 mg/ml baltymo) buvo laikoma leduose.

2. 4. Mitochondrijų baltymo kiekio nustatymas biureto metodu

Baltymo kiekis mitochondrijų suspensijoje nustatomas modifikuotu biureto metodu [Gornal et al., 1949]. Į 0,05 ml mitochondrijų suspensijos įpilama 0,95 ml 0,33 proc. dezoksicholato tirpalo, gerai sumaišoma ir 5 min. inkubuojama vandens termostate 37°C temperatūroje. Po to įpilama 4 ml biureto reagento, sumaišoma ir inkubuojama vandens termostate 37°C, 15 min. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas spektrofotometru Helios α (Thermo Electron, Anglija) 536 nm ilgio bangoje. Baltymo kiekis nusta-tomas pagal kalibracinę kreivę, kuriai sudaryti naudojamas standartinis baltymo tirpalas, pagamintas iš jaučio serumo albumino.

2. 5. Padidinto pralaidumo skaidulų paruošimas

Širdis buvo atšaldoma ir praplaunama šaltu 0,9 proc. KCl tirpalu, per-kerpama ir išpreparuojami 0,2–0,3 mm raumenų gabalėliai, kurie sudedami į izoliavimo terpę, kurios sudėtis: 20 mM imidazolo, 20 mM taurino, 0,5 mM ditiotreitolio, 7,1 mM magnio chlorido MgCl2, 50 mM 2-[N–morfolino]

etanosulfonato rūgšties (MES), 5 mM ATP, 15 mM kreatino fosfato, 2,6 mM CaK2EGTA ir 7,4 mM K2EGTA (laisvo Ca2+ koncentracija 0,1 µM)

(pH 7,0 2°C), papildomai pridedant 50 µg/ml saponino bei 3 mg/ml kola-genazės. Toliau buvo atliekama 30 min. inkubacija (0°–4°C), pastoviai pur-tant 120 kartų/min. 2 cm žingsneliu. Skaidulos buvo perkeliamos į terpę praplovimui, kurios sudėtis: 20 mM imidazolo, 20 mM taurino, 0,5 mM ditiotreitolio, 1,6 mM MgCl2, 100 mM MES, 3 mM KH2PO4, 3,0 mM

CaK2EGTA ir 7,1 mM K2EGTA (laisvo Ca2+ koncentracija 0,1 µM) (pH 7,1

37oC) ir vėl buvo purtoma. Galiausiai skaidulos buvo vėl perkeliamos į pastarąją terpę ir laikomos leduose.

2. 6. Širdies perfuzija bei išemijos sukėlimas

Atvėrus žiurkės krūtinės ląstą, kraujo krešėjimui sustabdyti, į kairįjį širdies skilvelį buvo suleidžiamas 1 ml (aktyvumo vienetai 5000TV/ml, 37°C) injekcijoms skirto heparino tirpalo. Tuomet buvo nukerpamos širdies kraujagyslės bei pasaitai ir širdis perkeliama į termostatuojamą (37°C), pusiau uždarą kamerą. Į aortą buvo įstatoma plastikinė kaniulė, prijungta prie Langendorfo tipo širdies perfuzijos sistemos. Perfuzijai buvo naudo-jamas Krebs-Henseleit tirpalas, kurio sudėtis: 11 mM gliukozės, 118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 4,8 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM CaCl2, 1,6

papildomai pridedant tyrimui naudojamų medžiagų (GBE, EGB-761, CE). Srauto tekėjimo greitis – 20–25 ml/min. Tais atvejais, kai po širdies perfu-zijos buvo sukeliama išemija, tirpalo tekėjimas buvo sustabdomas ir širdis laikoma uždaroje drėgnoje termostatuojamoje kameroje 45 min. Reperfu-zijos modeliui po išemijos buvo atnaujinamas terpės tekėjimas 15 min. Prieš izoliuojant mitochondrijas, širdis kelias minutes buvo palaikoma 0,9 proc. 0–4°C KCl tirpale, kad nustotų susitraukinėti, sulėtėtų metabolizmas bei nevyktų autolizės procesai.

2.7. Mitochondrijų kvėpavimo greičio registravimas

Mitochondrijų kvėpavimo greitis buvo registruojamas poliarografiškai, naudojant uždarą Klarko tipo deguonies elektrodą ir poliarografą “Rank Brothers LTD“ (Anglija). Izoliuotų mitochondrijų ir permeabilizuotų širdies raumens skaidulų kvėpavimo matavimus atlikome 37°C temperatūroje. Nu-statyta, kad 1 ml inkubacinės terpės yra 422 nanoatomų deguonies, kurį naudojome apskaičiuojant mitochondrijų kvėpavimo greičius. Kvėpavimo greitis išreiškiamas nmolO/min/mg mitochondrijų baltymo. Padidinto pra-laidumo skaidulų kvėpavimo greitis buvo išreiškiamas nmolO/min/mg sausų skaidulų svorio (skaidulos sausas svoris = drėgnas svoris prieš kvėpavimą / 4,85) [Liobikas et al., 2001]. Izoliuotų mitohondrijų ir permeabilizuotų skaidulų kvėpavimo matavimai buvo atliekami inkubacinėje terpėje, kurios sudėtis: 20 mM imidazolo, 20 mM taurino, 0,5 mM ditiotreitolio, 1,6 mM MgCl2, 100 mM MES, 3 mM KH2PO4, 3 mM CaK2EGTA ir 7,1 mM

K2EGTA (laisvo Ca2+ koncentracija 0,1 µM) (pH 7,1 37oC). Kaip substratai

naudoti 1) 6 mM piruvatas + 6 mM malatas; 2) 1 mM sukcinatas; 3) 10 mM askorbatas + 0,5 mM TMPD.

2.8. Mitochondrijų membranos potencialo matavimas

Mitochondrijų membraninis potencialas buvo matuojamas uždaroje termostatuojamoje (37°C) 1,5 ml tūrio kiuvetėje, naudojant TPP+ (tetrafe-nilfosfonio) jonams atrankų elektrodą. Mitochondrijų membraninio poten-cialo matavimai buvo atliekami inkubacinėje terpėje, kurios sudėtis: 20 mM imidazolo, 20 mM taurino, 0,5 mM ditiotreitolio, 1,6 mM MgCl2, 100 mM

MES, 3 mM KH2PO4, 3 mM CaK2EGTA ir 7,1 mM K2EGTA (laisvo Ca2+

koncentracija 0,1 µM) (pH 7,1 37oC), naudojant substratus 6 mM piruvatą + 6 mM malatą.