KADMIO, CINKO IR SELENITO JONŲ ŪMUS POVEIKIS BALTYMŲ SINTEZĖS SISTEMAI LABORATORINIŲ PELIŲ KEPENYSE

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

Rasa Bernotienė

KADMIO, CINKO IR SELENITO

JONŲ ŪMUS POVEIKIS BALTYMŲ

SINTEZĖS SISTEMAI

LABORATORINIŲ PELIŲ KEPENYSE

Daktaro disertacija

Biomedicinos mokslai, biologija (01 B)

Disertacija rengta 2004–2009 metais Kauno medicinos universitete.

Mokslinis vadovas

habil. dr. Leonid Ivanov (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01 B)

Konsultantas

TURINYS

SANTRUMPOS ...5

ĮVADAS...6

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...7

2. LITERATŪROS APŽVALGA...8

2.1. Sunkiųjų metalų bendra charakteristika ...8

2.2. Kadmio biologinis poveikis ...8

2.2.1. Kadmio toksiškumo ir detoksikavimo mechanizmai...8

2.2.2. Kadmio vaidmuo ligų patogenezėje ...9

2.2.3. Kadmis ir oksidacinis stresas ...10

2.3. Cinko funkcijos organizme ...11

2.3.1. Cinko biologinis vaidmuo ...11

2.3.2. Cinko funkcijos metalofermentuose...11

2.4. Seleno svarba ir toksiškumas ...12

2.4.1. Seleno svarba organizmui ...12

2.4.2. Seleno toksiškumas ...13

2.5. Aktyviosios deguonies formos ...13

2.5.1. Aktyviųjų deguonies formų susidarymas ir biologinis poveikis ...13

2.5.2. Aktyviųjų deguonies formų reikšmė ligų patogenezėje ...15

2.5.3. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai ...15

2.6. Metalotioneinų struktūra ir funkcijos ...17

2.6.1. Metalotioneinų struktūra ...17

2.6.2. Metalotioneinų pasiskirstymas organuose ir ląstelėse...18

2.6.3. Metalotioneinų vaidmuo metalų metabolizme ...19

2.7. Streso indukuojami baltymai...19

2.8. Sunkiųjų metalų poveikis genų raiškai...20

2.9. Transliacijos sistemos komponentų charakteristika ...21

2.9.1. Pernašos RNR ...21

2.9.2. Aminoacil-tRNR sintetazės...22

2.9.3. Aminoacil-tRNR sintetazių didelės molekulinės masės kompleksai...23

3. TYRIMŲ MEDŽIAGA IR METODAI ...25

3.1. Tyrimo objektas ir reagentai ...25

3.2. Metalų toksiškumo įvertinimas. Tyrimo modeliai ...26

3.3. Tyrimų metodai...27

3.3.1. Baltymų sintezės tyrimas pelių kepenyse in vivo ...27

3.3.2. Baltymų sintezės greičio ir lygio nustatymas neląstelinėje sistemoje iš pelių kepenų ...27

3.3.3. Suminių tRNR preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir aktyvumo nustatymas...28

3.3.4. Aminoacil-tRNR sintetazių išskyrimas iš pelių kepenų ir aktyvumo nustatymas ...28

3.3.5. Metalotioneino koncentracijos nustatymas pelių kepenyse...29

3.3.6. Redukuoto glutationo koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir eritrocituose ...29

3.3.7. Malondialdehido koncentracijos nustatymas pelių kepenyse ir eritrocituose...29

4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...31

4.1. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis baltymų sintezei pelių kepenyse in vivo...31

4.1.1. Vienkartinis kadmio ir cinko jonų poveikis baltymų sintezei ...31

4.1.2. Vienkartinis kadmio ir selenito jonų poveikis baltymų sintezei...31

4.1.3. Keturiolikos dienų trukmės kadmio ir cinko jonų poveikis baltymų sintezei ...32

4.1.4. Keturiolikos dienų trukmės kadmio ir selenito jonų poveikis baltymų sintezei ...33

4.2. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikio baltymų sintezei įvertinimas neląstelinėje sistemoje iš pelių kepenų...34

4.2.1. Vienkartinio kadmio ir cinko jonų poveikio endogeninių mRNR transliacijos procesui įvertinimas neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų...34

4.2.2. Vienkartinio kadmio ir selenito jonų poveikio endogeninių mRNR transliacijos procesui įvertinimas neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų...35

4.2.3. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikio endogeninių mRNR transliacijos procesui įvertinimas neląstelinėje sistemoje iš pelių kepenų ...36

4.3. Ūmaus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikio tRNR ir leucil-tRNR sintetazei įvertinimas iš pelių kepenų ...37

Leu 4.3.1. Vienkartinis kadmio ir cinko jonų poveikis pelių kepenų tRNR ir leucil-tRNR sintetazės aktyvumams...37

Leu 4.3.2. Vienkartinis kadmio ir selenito jonų poveikis pelių kepenų tRNR ir leucil-tRNR sintetazės aktyvumams...38

Leu 4.3.3. Keturiolikos dienų trukmės kadmio ir cinko jonų poveikis pelių kepenų tRNR ir leucil-tRNR sintetazės aktyvumams...40

Leu 4.3.4. Keturiolikos dienų trukmės kadmio ir selenito jonų poveikis pelių kepenų tRNR ir leucil-tRNR sintetazės aktyvumams...41

Leu 4.4. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse...42

4.4.1. Vienkartinis kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse...42

4.4.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis metalotioneinų sintezei pelių kepenyse...43

4.5. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo susidarymui pelių kepenyse ir eritrocituose ...44

4.5.1. Vienkartinis kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo susidarymui pelių kepenyse ir eritrocituose...44

4.5.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis redukuoto glutationo susidarymui pelių kepenyse ir eritrocituose ...46

4.6. Ūmus kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eritrocituose...47

4.6.1. Vienkartinis kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eritrocituose...47

4.6.2. Keturiolikos dienų trukmės kadmio, cinko ir selenito jonų poveikis lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eritrocituose...49

5. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS...51

IŠVADOS ...53

BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS...54

SANTRUMPOS

ADF aktyvios deguonies formos ARSazė aminoacil-tRNR sintetazė ATP adenozino 5-trifosfatas CNS centrinė nervų sistema

DTNB 5,5-ditiobisnitrobenzoinė rūgštis DTT ditiotreitolis

eF eukariotų iniciacijos veiksnys EDTA etilendiamintetraacetatas eEF eukariotų elongacijos veiksnys GRED glutationo reduktazė

GSH redukuotas glutationas GSHPX glutationo peroksidazė GSSG oksiduotas glutationas GST glutationo S-transferazė GTP guanozino 5-trifosfatas

HEPES N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfo rūgštis HO hemo oksigenazė

Hsp šiluminio šoko baltymai KAT katalazė

LD50 vidutinė mirtina dozė

MDA malondialdehidas

mRNR informacinė (matricinė) ribonukleorūgštis MT metalotioneinas

MTF metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys MTL mažo tankio lipoproteinai

PMSF fenilmetilsulfonilfluoridas SAM S-adenozilmetioninas SM sunkieji metalai SOD superoksido dismutazė TBR tiobarbituro rūgštis TChA trichloracto rūgštis

TRIS tris (hidroksimetil) aminometanas tRNR pernašos (transportinė) ribonukleorūgštis TRXR tioredoksino reduktazė

ĮVADAS

Didėjantis aplinkos užterštumas yra viena svarbiausių pasaulio ekologinių problemų. Todėl pastaraisiais metais vis didesnę svarbą įgauna įvairių teršalų poveikio biologinėms sistemoms tyri-mai. Sunkieji metalai (SM) pagal pavojingumą gyvybei, sveikatai ir genomui, užima pirmąją vietą tarp kitų aplinkos veiksnių, tokių kaip pesticidai, rūgštūs lietūs, naftos išsiliejimai, cheminės trąšos, radioaktyviosios atliekos, transporto tarša, miesto triukšmas.

Cd yra vienas iš labiausiai toksiškų SM žmogaus organizmui, kuris kaupiasi jame visą gyvenimą [229, 232]. Šis metalas iš kitų SM išsiskiria savo įvairiapusiu toksiniu poveikiu: jo ypatingai ilgas biologinis gyvavimo pusperiodis žmogaus organizme – daugiau kaip 20 metų, mažas šalinimo iš organizmo greitis – 1–2 mg per dieną [265, 279].

Šis metalas pasižymi kancerogeniniu, neurotoksiniu, genotoksiniu bei nefrotoksiniu poveikiu [75]. Cd toksinio poveikio organizmui mechanizmas susijęs tiek su jo tiesioginiu poveikiu audi-niams, sutrikdant baltymų apykaitą, tiek su Zn, Cu, Se, Ca išstūmimu iš metalofermentinių sistemų [130, 186]. Minėti elementai yra Cd antagonistai ir padeda apsisaugoti nuo jo toksinio poveikio. Didelis patekusio ir susikaupusio Cd kiekis sukelia inkstų ir kepenų intoksikaciją, vystymosi ir reprodukcijos sutrikimus, prostatitus, imunodeficitus, odos ligas, arterinio kraujospūdžio padidė-jimą, anemiją, apetito sumažėpadidė-jimą, pokyčius kauluose ir sąnariuose [75, 180]. Cd siejamas su onkologinių ligų išsivystymu (prostatos, kasos, plaučių, kepenų, inkstų), osteoporoze, mažakraujys-te, eozinofilija ir t.t. [180, 159]. Šių ligų diagnostika ir, svarbiausia, gydymas dar neturi pakanka-mos teorinės eksperimentinės bazės, todėl reikalingi nuolatiniai, kruopštūs tyrimai.

Cd daugiausia kaupiasi minkštuosiuose audiniuose, ypač kepenyse ir inkstuose dėl šių audinių sugebėjimo sintetinti metalotioneinus (MT), kurie apsaugo ląsteles nuo Cd jonų toksinio poveikio. Naujausi tyrimai parodė, kad Cd sąlygoja oksidacinio streso atsiradimą, kurio metu pažeidžiami baltymai, lipidai, DNR [143, 278]. Dabar jau žinoma, kad laisvieji radikalai ir kiti oksidantai yra labai svarbi paveldimų ligų bei senėjimo proceso organizme, priežastis. Todėl ir tyrimai, susiję su oksidaciniu ląstelės stresu bei antioksidacine sistema yra labai svarbūs.

Be žalingų organizmui metalų, mokslininkų dėmesys skiriamas ir būtiniems normaliam organizmo funkcionavimui metalams, tokiems kaip Fe, Cu, Zn, Se ir kt. Zn ir Se yra būtini visuose pagrindiniuose ląstelės procesuose, įeina į daugelio svarbių fermentų sudėtį. Šie mikroelementai turi antioksidacinių savybių, mažina onkologinių, degeneracinių, autoimuninių ligų atsiradimą bei dalyvauja SM ir kitų nuodingųjų junginių detoksikavimo procesuose [150, 222, 223, 243].

Darbo naujumas. Šis darbas tai įnašas į integruotą biologinę intoksikavimo metalais sampratą,

pagilinantis žinias apie Cd poveikį organizmui mechanizmus bei padarinius, o tai neabejotinai svar-bu klinikiniu požiūriu. Vykdant disertacinį darbą, pirmą kartą pavyko nustatyti, kad toksinis Cd jonų poveikis kepenų baltymų sintezės sistemai yra susijęs su svarbiausių transliacijos sistemos komponentų (pernašos RNR (tRNR) ir aminoacil-tRNR sintetazių (ARSazių)) aktyvumų pokyčiais. Kadangi, Cd ląstelėje sąlygoja oksidacinio streso atsiradimą, todėl mes įvertinome ir Cd jonų poveikį ląstelės antioksidacinės sistemos komponentų (GSH ir MT) koncentracijai bei lipidų peroksidacijai. Nustatyta, kad oksidacinio streso metu padidėja lipidų peroksidacija ir sumažėja re-dukuoto glutationo (GSH) kiekis kepenyse, pažeidžiama kepenų ląstelių branduolio DNR ir su šlapimu išsiskiria metabolitai, tokie kaip malondialdehidas (MDA), formaldehidas, acetonas ir pan.

Literatūroje yra mažai duomenų apie kompleksišką Cd ir Zn bei Cd ir Se poveikį kepenų balty-mų sintezės sistemai. Todėl mes tyrėme Zn bei Se jonų galimą apsauginį poveikį prieš Cd toksišku-mą šiai sistemai bei ląstelėje sukeltam oksidaciniam stresui.

Gauti rezultatai pagilins žinias apie ūmaus Cd poveikio kepenų baltymų sintezės sistemai mechanizmus bei ląstelių antioksidacinės sistemos pajėgumus. Tyrimų duomenys suteikia papildo-mą informaciją apie Zn ir Se antioksidacinį aktyvupapildo-mą.

Gauti tyrimų rezultatai paskelbti moksliniuose straipsniuose, pristatyti Lietuvos ir tarptautinėse mokslinėse konferencijose.

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Įvertinti kadmio, cinko ir selenito jonų ūmų poveikį kepenų baltymų sintezės (transliacijos) sistemos ir jos komponentų bei ląstelių antioksidacinės sistemos aktyvumams.

Uždaviniai:

1. Įvertinti ūmų Cd2+ _{poveikį baltymų sintezei pelių kepenyse.}

2. Įvertinti ūmų Cd2+ poveikį transliacijos sistemos komponentų (tRNR ir ARSazės) aktyvu-mams pelių kepenyse.

3. Nustatyti MT koncentraciją pelių kepenyse po ūmaus Cd2+ poveikio.

4. Įvertinti ūmų Cd2+ poveikį GSH koncentracijai ir lipidų peroksidacijai pelių kepenyse ir eri-trocituose.

5. Įvertinti Zn2+ ir SeO32– įtaką pelių transliacijos ir antioksidacinėms sistemoms, esant ūmiam

2. LITERATŪROS APŽVALGA

Metalai, kurių tankis yra didesnis kaip 5 g/cm3, yra vadinami SM [115]. Tai vieni iš toksiš-kiausių elementų, todėl užima ypatingą vietą tarp gamtinės aplinkos cheminės kontrolės rodiklių. Pagal pavojingumą gyvam organizmui SM yra išsidėstę taip: Hg, Cu, Cd, Zn, Cr, Mn, Fe, Ti, Pb, o kancerogeninis bei mutageninis jų poveikis priklauso nuo koncentracijos ir gali pasireikšti ne iš karto, bet po tam tikro laiko [2, 245]. Specifišku lėtiniu poveikiu pasižymi Hg, Cd, Be, Mn, Pb, W, Zr, Ti, V, Mo, Te ir kt., esant nedidelei jų koncentracijai. Tam tikrų SM toksiškumas priklauso ne tik nuo jų koncentracijos, bet ir nuo oksidacijos laipsnio, pvz., šešiavalentis Cr yra žinomas kance-rogenas, o trivalenčio Cr reikia žmogaus organizmo veiklai (yra gliukozės tolerancijos veiksnys). SM poveikis organizmui taip pat priklauso ir nuo jų tarpusavio santykio, migracinės formos ir kiek jų lengvai įsisavinama. Metalų tarpusavio sąveika gali būti sinergistinė, antagonistinė arba neutrali. Toksiški metalai Pb ir Cd sustiprina vienas kito toksišką poveikį, o kiti būtinieji elementai, pvz., Ca, Cu, Zn ir Se, mažina toksiškų metalų, pvz., Pb, Cd, Hg neigiamą poveikį, pvz., Zn sumažina Pb ir Cd toksinį poveikį aktyvindamas MT (baltymai, kurie prijungia šiuos metalus) sintezę. Kai trūksta Ca, Zn, Se ir Fe organizme, Pb ir Cd absorbuojami geriau ir jų neigiamas toksiškas poveikis yra daug didesnis [76].

Metalų šaltiniai yra natūralūs gamtiniai – uolienų ir dirvožemių erozija, atmosferinės nuosėdos. Kitas metalų šaltinis – žmogaus ūkinė ir gamybinė veikla, pramonės įmonių atmosferos teršalai ir kietosios atliekos. Žinomi trys pagrindiniai metalų patekimo į žmogaus organizmą būdai: per kvė-pavimo takus, per virškinamąjį kanalą su užterštu maistu ar geriamuoju vandeniu, ir tiesiogiai per odą (pvz., organiniai Pb junginiai).

Beveik visi SM ir jų junginiai toksiškai veikia žmogaus organizmą. Jie įsijungia į įvairius organizmo metabolinius procesus, trikdo baltymų sintezę, jų jonai veikia kaip katalizatoriai for-muojantis įvairiems laisviesiems radikalams, sutrikdo DNR reparacijos bei replikacijos procesus ir sukelia citogenetines pažaidas [90]. SM dažnai kaupiasi organizme ir sukelia daugelį specifinių ligų: hipofosfatemiją, onkologines ir širdies ligas, urologinius sutrikimus, kepenų, centrinės nervų sistemos (CNS), reproduktyvinės funkcijos pažeidimus, augimo ir vystymosi nukrypimus, imuni-teto susilpnėjimą [246]. Lytines ląsteles veikia Cd, Zn, Cr, Ni, Pb, Hg, Mn, Be ir Ba, o kancerogeni-nių savybių turi Cd, Cr, Ni, Pb, Co ir kt. [75].

Daugelis SM kaip mikroelementai yra labai svarbūs organizmui (17 iš 30 svarbiausiųjų organizmui elementų yra metalai): užtikrina normalią fiziologinių reakcijų ir apykaitos procesų eigą, dalyvauja mineralinių ir bendrų organizmo medžiagų apykaitoje, įtakoja augimą, kraujodarą, dauginimąsi [18, 241]. SM jonai įeina į biologiškai svarbių molekulių sudėtį (pvz., fermentų – Zn, Fe, Cu, Mo, Mn ir kt.), dalyvauja katalizės procesuose (pvz., Co – vitamino B12 ar Fe –

hemoglobi-no sudėtyje), reikalingi chromatihemoglobi-no stabilizacijai (Zn, Mg, Cu) [75]. Metalai gali tiesiogiai aktyvinti tam tikrų baltymų genų raišką per metalais reguliuojamus transkripcijos veiksnius, veikti per trans-dukcijos molekules, kurių veikimui yra būtini metalų jonai (pvz., Zn) [57].

SM neigiamas poveikis dažnai nepastebimas, nes pokyčiai organizme išryškėja po kelerių ar net kelių dešimčių metų, kartais jie pasireiškia tik kitoms kartoms. Taigi daugelis metalų kaupiasi orga-nizme ir vėliau pasireiškia kancerogeniniu, mutageniniu, gonadotropiniu ir embriotoksiniu veikimu [75].

2.2. Kadmio biologinis poveikis 2.2.1. Kadmio toksiškumo ir detoksikavimo mechanizmai

Cd – antros grupės periodinės elementų lentelės elementas. Atominė masė – 112,41. Gamtoje šis metalas randamas mineraluose kartu su Zn. CdZn kiekių santykis įvairiose medžiagose svyruoja (1100–11000) [137].

Tarptautinė piktybinio naviko tyrimo agentūra priskyrė Cd I kancerogenų kategorijai [6, 279]. Cheminį Cd simbolį kai kas šifruoja kaip „susirgimą piktybiniu naviku“ (angl. cancer disease). Epidemiologiniai tyrimai parodė, kad Cd yra vienas iš labiausiai toksiškų žmogaus organizmui SM [229, 232]. Pagal Pasaulio sveikatos organizacijos rekomendacijas Cd paros dozė žmogaus orga-nizme neturėtų viršyti 70 g, tačiau manoma, kad šio metalo kai kuriose šalyse į žmogaus organizmą patenka dvigubai daugiau [66, 206]. Cd pusinio išskyrimo iš organizmo periodas 13–40 metų, o mirtina dozė žmogui – apie 150 mg/kg. Vidutinio amžiaus žmogaus organizme Cd yra apie 50 mg [265, 279].

Apie Cd poveikį įvairioms gyvųjų organizmų biologinėms sistemoms žinoma labai daug, tačiau šio metalo toksiškumo mechanizmai nėra visiškai išaiškinti. Jie gali būti susiję su tiesioginiu genotoksiniu šio metalo poveikiu arba su gebėjimu pakeisti Zn fermentinėse sistemose jas inakty-vuojant, merkapto grupių blokavimu ir konkuravimu su Zn, Co, Se jonais baltymų molekulėse. Cd prisijungia prie O ir N turinčių ligandų silpniau nei Zn, tačiau jo prisijungimas prie S yra daug stipresnis nei būtinų metalų, išskyrus Cu [130]. Didelis Cd kiekis sukelia organizmo apsinuodijimą, kurio sunkumas priklauso ne tik nuo Cd, bet ir nuo Zn kiekio – jo trūkumas maiste sustiprina Cd toksiškumą, o esant pakankamam Zn kiekiui maiste – Cd toksinis poveikis silpnėja. Eksperimentais įrodyta, kad Cd gali slopinti baltymų sintezę, kuri yra reguliuojama transliacijos veiksniais [186]. Joseph su bendraautoriais parodė, kad transliacijos iniciacijos veiksnio-3 (IF3) ir transliacijos elongacijos veiksnio-1δ (EF-1δ) genų raiška buvo intensyvi BALB/c-3T3 pelių ląstelėse, kurios buvo transformuotos dėl CdCl2 buvimo [117, 118]. Iškelta hipotezė, kad ląstelės transformacija ir

supiktybėjimas dėl Cd gali būti iš dalies susiję su transliacijos veiksnių genų padidėjusia raiška [117, 118].

Organizmo SM detoksikavimo mechanizmai yra tiesiogiai susiję su baltymų sinteze. Žinduo-liuose Cd aktyvina kai kurių genų raišką (pvz., c-fos, c-jun, c-myc, erg-1 ir t.t.). Baltymai koduo-jami šių genų gali būti suskirstyti į 3 dideles grupes: 1) detoksikuojantys baltymai tokie kaip MT, kurie dalyvauja šio metalo detoksikavime ar fermentai (γ-glutamilcisteinsintazė), gaminantys apsaugines molekules (pvz., GSH); 2) greitai reaguojantys genų produktai, tokie kaip c-Fos, c-Jun, c-Myc ar Egr-1, kurie svarbūs ląstelės proliferacijoje; 3) streso baltymai (angl. heat shock proteins,

Hsp), kurie yra svarbūs užtikrinant ląstelės funkcionavimą ekstremaliose sąlygose [73, 251] ir hemo

oksigenazė-1 (HO-1), kuri svarbi ląstelių apsaugai [4]. Šie duomenys leidžia teigti, kad baltymų sintezės procesas gali būti viena jautriausių Cd poveikiui sistemų gyvosiose ląstelėse.

2.2.2. Kadmio vaidmuo ligų patogenezėje

Nustatyta, kad Cd gali pažeisti kepenų ląstelių membranas ir sukelti lipidų peroksidaciją, pakenkti mitochondrijų konfigūraciją ir funkciją, sutrikdyti energijos metabolizmą, susilpninti DNR sintezę, transformaciją ir raišką [99, 128, 216]. Eksperimentiniams gyvūnams Cd sukelia plaučių, prostatos, sėklidžių, hematopoetinės sistemos auglių vystymąsi. Žmonėms Cd poveikyje dažniausiai išsivysto piktybinis plaučių navikas [75]. Ūmaus intoksikavimo Cd metu išsivysto pneumonija ir plaučių edema, graužikams susilpnėja humoralinis imuninis atsakas, slopinama pilvaplėvės makro-fagų fagocitozė, natūraliųjų ląstelių naikintojų aktyvumas bei atsparumas infekcijoms [75]. Lėtinės Cd inhaliacijos arba cigarečių dūmai sukelia plaučių emfizemą, kuri išsivysto dėl plaučių jungia-mojo audinio pakitimų, ir lėtinę obstrukcinę plaučių ligą [276]. Ilgalaikis buvimas aplinkoje, kurioje padidėjęs Cd kiekis, žmonėms gali sukelti plaučių jungiamojo audinio irimą, o žiurkėms – plaučių navikų atsiradimą [159].

Tyrimai su pelėmis parodė, kad Cd druskų tirpalų injekcijos turi įtakos Ca pasišalinimui iš kaulų. Dekalcinacija intensyviausia, esant 0,4–0,8 M Cd jonų koncentracijai. Taigi Cd veikia kaulus ir sukelia žmonėms bei gyvūnams tokias ligas kaip osteoporozė ir osteomaliacija. Liga, išsivystanti dėl lėtinio intoksikavimo Cd, Japonijoje pavadinta itai-itai, pasireiškia inkstų nepakankamumu, kaulų lūžiais, osteomaliacija, mažakraujyste [180].

Cd taip pat pasižymi teratogeniniu ir embriotoksiniu poveikiu. Organogenezės periode Cd suke-lia ilgai trunkančią anoreksiją, vaisiaus augimo sulėtėjimą, skeleto, nervų kanalų, galūnių

užuomaz-gų apsigimimus. Nėštumo metu rūkančių motinų placentose išsivysto morfologiniai pakitimai [75]. Reprodukcinę sistemą Cd gali veikti tiesiogiai sukeldamas pakitimus lytinėse liaukose, arba netiesiogiai veikdamas per sąveiką su endokrinine sistema. Eksperimentiniams gyvūnams Cd suke-lia sėklidžių kraujagyslinio dangalo pažeidimus, intersticinių ląstelių edemą, išsivysto hemoragija, sumažėja androgenų gamyba Ledigo ląstelėse, išsivysto nekrozė Sertolio ląstelėse, slopinama sper-matogenezė ir galiausiai išsivysto sėklidžių atrofija. Cd slopina cholinacetiltransferazės aktyvumą ir sumažina acetilcholino gamybą spermatozoiduose bei pablogina jų judrumą [75].

Cd veikia nukleorūgščių ir baltymų apykaitą. Tyrimais įrodyta, kad Cd slopina daugelio fermen-tų, tokių kaip alkoholio- ir glutamatdehidrogenazės, adenilatkinazės, glutationo reduktazės (GRED) ir kt. aktyvumą. Cd pakeičia metalofermentų: alkoholdehidrogenazės, karboksipeptidazės, -amino-levulino rūgšties dehidratazės ir superoksido dismutazės (SOD) koveiksnius – Zn, Fe ir Cu, tokiu būdu keisdamas jų aktyvumą ir sąlygodamas toksiškumą. Taip Cd sukelia šių metalų koncentracijos padidėjimą ląstelės viduje ir laisvųjų radikalų susidarymą pagal Fentono reakcijas [61, 266, 289]. Daugelį paminėtų metabolizmo sutrikimų, sukeltų Cd, galima pašalinti skiriant Se ir Zn injekcijas [16].

Cd turi įtakos ir angliavandenių apykaitos fermentams. Parodyta, kad jis stimuliuoja aldolazės, fosforilazės, piruvatkarboksilazės ir kt. fermentų aktyvumą [297].

Cd yra plačiai žinomas kaip alerginio dermatito atsiradimo priežastis. Tyrimais įrodyta, kad necitotoksinės CdCl2 dozės mažina fibroblastų prokolageno gamybą in vitro [27]. Parodyta, kad Cd

stimuliuoja žmogaus prostatos epitelio augimą in vitro, todėl Se gali būti naudingas pašalinant toksinį Cd poveikį prostatos patologijos atveju [78]. Nors Se apsaugo nuo Cd toksinio poveikio, šio mikroelemento perteklius gali žalingai veikti organizmą [111].

Grupė mokslininkų nustatė Cd toksinį poveikį chondrocitų ląstelių kultūrai [138]. Šio metalo toksiškumas pasireiškė esant 5 M Cd koncentracijai. Esant mažesnėms jo koncentracijoms (0,25 M), vyksta ląstelės DNR bei baltymų sintezės sumažėjimas. Nustatyta, kad Cd sukelia apoptozę žmogaus T ląstelėse CEM-C12 [64]. Ląstelių žūtį sąlygoja chromatino kondensacija ir DNR frag-mentacija. Be to, manoma, kad Cd sukelta apoptozė yra procesas, priklausantis nuo baltymų sintezės [64].

Nustatyta, kad Cd gali veikti nefrotoksiškai. Kepenyse jis skatina MT sintezę, susiformuoja Cd-MT kompleksas, kuris atpalaiduojamas į kraujo apytaką ir vyksta pernaša į inkstų epitelio ląsteles. Inkstuose vyksta Cd-MT komplekso skilimas lizosomų pūslelėse ir atsipalaidavęs Cd stimuliuoja viduląstelinių SM detoksikuojančių baltymų sintezę, tokių kaip MT [254]. Išankstinis Zn jonų įve-dimas gali apsaugoti nuo Cd-MT komplekso nefrotoksiškumo [252]. Nuolat pasikartojantis Cd patekimas į organizmą sukelia kepenų pažeidimus (parenchiminių ląstelių nekrozę, pakitimus šiurkščiajame endoplazminiame tinkle ir mitochondrijose, lygiojo endoplazminio tinklo prolifera-ciją) bei Cd-MT komplekso patekimą į kraujotakos sistemą. Pakitimams kepenyse išsivystyti pa-kanka 60 M Cd koncentracijos. Cd-MT kompleksas yra palyginti inertiškas, kai saugomas ląstelės viduje komplekso pavidalu, tačiau kai šis kompleksas patenka į kraują, tampa labai toksišku [75].

2.2.3. Kadmis ir oksidacinis stresas

Naujausi tyrimai parodė, kad Cd sąlygoja oksidacinio streso atsiradimą [143]. Jo metu padidėja lipidų peroksidacija ir sumažėja GSH kiekis kepenyse, pažeidžiama kepenų ląstelių branduolio DNR ir su šlapimu išsiskiria metabolitai, tokie kaip MDA, formaldehidas, acetaldehidas ir acetonas. Šie pakitimai nustatyti naudojant mažas (0,05 LD50) Cd dozes. Lipidų peroksidacija nustatyta ne tik

kepenyse, ji vyksta tiek in vivo tiek ir in vitro, o padidėjusi lipidų peroksidų koncentracija tampa aktyviųjų deguonies formų (ADF) šaltiniu [278]. Peroksidai yra deguonį turinčios molekulės, kurios pažeidžia ląstelės membraną, DNR struktūrą, sukelia mineralinių medžiagų metabolizmo pakitimus bei sutrikdo merkapto grupių homeostazę. Buvo tiriama Cd įtaka viščiukams, Zn ir Se apsauginis poveikis prieš Cd toksiškumą, bei MT vaidmuo mažinant oksidacinį stresą, kurį sukelia Cd [16]. 20-ties dienų amžiaus viščiukams 14 dienų su maistu buvo duodamas Cd (100 mg/kg), kuris pate-kęs į organizmą, sukėlė lipidų peroksidaciją. Papildomai pridėjus Zn (500 mg/kg) ir Se (1 mg/kg) į

viščiukų maistą, pastebėta, kad Cd koncentracija sumažėjo kraujo serume ir kepenyse, padidėjo glu-tationo peroksidazės (GSHPX) aktyvumas kraujyje ir MT koncentracija kepenyse. Tyrimo autorės teigia, kad būtent MT sulėtina Cd pernašą per žarnyno epitelį į kraują. Tuo tarpu, Zn ir Se antioksi-dacinis poveikis organizme yra įvairus. Ši problema yra analizuojama tolesniuose disertacinio darbo skyriuose.

2.3. Cinko funkcijos organizme 2.3.1. Cinko biologinis vaidmuo

Zn periodinėje elementų lentelėje yra ketvirtame periode, antroje B grupėje, jo atominis skaičius 30, atominė masė 65,38. Zn priskiriamas prie pereinamųjų elementų. Tai yra chemiškai aktyvus, antrasis pagal paplitimą viduląstelinis metalas po Fe [296]. Zn yra būtinas visuose pagrindiniuose ląstelės procesuose, svarbus imunitetui, virškinimo sistemos veiklai, moterų ir vyrų lytinėms funk-cijoms, sumažina onkologinių ligų riziką, turi antioksidacinių savybių, palaiko normalų augimą ir vystymąsi [14, 199, 243]. Taip pat šis mikroelementas būtinas daugiau kaip 300 fermentų funkcijai: šarminei fosfatazei, alkoholio dehidrogenazei, Cu/Zn SOD, karboksipeptidazei, δ-aminolevulino rūgšties dehidratazei, anglies anhidrazei, DNR polimerazei (DNR polimerazei α, DNR polimerazei III), atvirkštinei transkriptazei [89, 101, 147, 222, 267], dalyvauja nukleorūgščių, baltymų sintezėje ir hormonų apykaitoje (ypač lytinių hormonų), tiesiogiai veikia audinių ir skeleto kolagenus, gerina regėjimą [45, 280]. Parodyta, kad Zn gali įtakoti apoptozę ir kinazės C veiklą [158, 253, 260, 290]. Išsakyta prielaida, kad Zn gali konkuruoti su daugeliu dvivalenčių metalų jonais – Cd, Cu, Fe ir Pb, pernešant šiuos metalus į epitelį, taip pat ir į žinduolių plonąją žarną [79]. Daugelis tyrėjų teigia, kad Zn gali sumažinti Cd toksiškumą [22, 41], mažinant jo absorbciją ar aktyvuojant MT sintezę [133]. Toksinė Cd dozė gali slopinti Zn absorbciją [152]. King ir kiti bendraautoriai aprašė, kad CdCl2 sušvirkštimas pelėms sumažino Zn prijungimą sėklidėse ir smegenyse iki 56 ir 47 proc.

atitinkamai [124].

Zn yra svarbus visų žmogaus organizmo ląstelių funkcionavimui. Nustatyta, kad daugiau kaip 85 proc. jo yra skeleto raumenyse ir kaulų audiniuose [123], didelės Zn koncentracijos yra prostatoje, kepenyse ir inkstuose [225, 283]. Taip pat šio mikroelemento yra kraujo plazmoje, eritrocituose (kaip anglies anhidrazės (87 proc.) ir Cu/Zn SOD (5,4 proc.) komponentas), leukocituose ir plokš-telėse [155]. Panašus šio metalo pasiskirstymas nustatytas ir gyvūnų organizmuose [8, 149].

Žmogaus organizme yra tik 2–3 g Zn, šio mikroelemento trūkumas sukelia įvairius sveikatos sutrikimus, o kartais ir sunkias ligas. Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis nuo Zn trūkumo kenčia 4,5 milijardo žmonių. Jo trūkumas gali tapti epilepsijos, šizofrenijos ir kitų psichinių ligų, bendro organizmo nuovargio, alergijos, diabeto, prostatos adenomos, kataraktos, kurtumo, širdies, virškinimo sistemos, odos ir akių ligų, pakitimų burnos gleivinėje priežastimi [83]. Ilgą laiką trūks-tant šio mikroelemento, sumažėja organizmo atsparumas peršalimo bei infekcinėms ligoms, kyla nėštumo komplikacijos, lėtėja vaikų augimas, trumpėja amžius [83].

Per didelis Zn kiekis gali būti kenksmingas organizmui. Jis mažina Fe, Cu, P ir kai kurių vaistų įsisavinimą, gali sukelti pykinimą, pilvo skausmą, burnos sudirginimą, nemalonų skonį burnoje. Per didelis Zn kiekis silpnina imunitetą [155].

2.3.2. Cinko funkcijos metalofermentuose

Metalofermentuose Zn atlieka 3 pagrindines funkcijas: katalizinę, struktūrinę ir reguliacinę [45, 280].

Struktūrinis Zn vaidmuo yra palengvinti baltymų susilankstymą, suformuojant biologiškai akty-vias molekules. Tokių baltymų didžioji dauguma formuoja „Zn pirštų“ domeną. Šis domenas gali tapti SM taikiniu, jo pokyčiai gali keisti transkripcijos veiksnių aktyvumą. Buvo ištirtas kai kurių metalų poveikis transkripcijos veiksnio Sp1, turinčio „Zn pirštų“ domeną, prisijungimui prie DNR [178]. Sp1 prisijungimui prie DNR yra svarbūs gretimai išsidėstę „Zn pirštų“ motyvai, kurių akty-vumui būtini Zn jonai. Šio baltymo aktyvumą gali keisti ir kitų metalų jonai. Spektrofotometriniu

metodu buvo stebimas Cd ir kitų metalų jonų prisijungimas bei tų metalų gebėjimas pakeisti Zn baltymo molekulėje. Nustatyta, kad antros B grupės metalai (Cd ir Hg) gali stipriai rištis su baltymu ir vėliau su dvigrande DNR, taip slopindami Sp1 aktyvumą [211, 221, 284]. Kiti tyrimai parodė, kad Pb gali pakeisti Zn protaminuose – baltymuose, veikiančiuose kaip transkripciją reguliuojantys veiksniai. Pb sumažina šių baltymų susirišimą su specifiniais atpažinimo fragmentais, esančiais DNR ir taip slopina genų raišką [297]. Be to, pakeitus Zn aktyviais redukuojančiais metalais gali susidaryti žalingi laisvieji radikalai, galintys tiesiogiai pažeisti DNR molekulę [57, 96]. Baltymas P53 yra pagrindinis priešnavikinis veiksnys organizme, kuris naikina pažeistas ląsteles, užkerta ke-lią navikams vystytis, aktyvindamas ir nuslopindamas tam tikrus genus. Ląstelėje prasidėjus onko-genezei, pvz., atsiradus DNR pažeidimams ar deguonies trūkumui, P53 vykdo genetinę programą, kuri lemia ląstelės žūtį, taip užkirsdamas kelią navikinių ląstelių plitimui visame kūne. Šio baltymo erdvinę struktūrą ir gebėjimą rištis prie DNR molekulės gali paveikti Cu jonai in vivo [271]. Manoma, kad Cu gali dalyvauti kaip signalo tarpininkas, kontroliuojantis P53 funkcijas [163].

Daugelis metalų gali aktyvinti genų raišką veikdami tiesiogiai per transkripcijos veiksnius (aktyvumui būtini metalai) arba netiesiogiai – per signalo perdavimo molekules. Geriausiai ištirtas metalų indukuojamas transkripcijos veiksnys yra MTF-1, kuriame yra šeši „Zn pirštai“ DNR rišančiame domene, o kiti trys atskiri domenai atsakingi už transkripcijos aktyvinimą [31, 282]. Trys ar keturi „Zn pirštai“ jungiasi su DNR, o likę veikia kaip metalo „jutikliai“ [57, 282].

2.4. Seleno svarba ir toksiškumas 2.4.1. Seleno svarba organizmui

Se atominis skaičius 34, atominė masė 78,96. Se atrado du chemikai, Jöns Jacob Berzélius ir Johan Gottlieb Gahn 1817-aisiais metais. Šiandien moksliniais tyrimais įrodyta, kad šis mikroe-lementas – viena svarbiausių žmogaus organizmo apsaugos priemonių [230]. Se įeina į daugelio hormonų ir fermentų sudėtį, todėl yra susijęs su visais organizmo organais bei sistemomis.

Se šaltinis – įvairūs augalinės (selenometioninas – Met) ir gyvulinės (selenocisteinas – Se-Cys) kilmės produktai. Nustatyta, kad jei į organizmą patenka per daug neorganinio Se, jis gali pra-dėti kauptis audiniuose laisvojo hidroselenito anijono forma. Ši Se forma yra ypač toksiška [105]. Organinio Se formos (Se-Met, Se-Cys) organizmo pasisavinamos kitu būdu. Dėl didelio metionino ir Se-Met fizikinių bei cheminių savybių panašumo sudėtingoje baltymų sistemoje metioninas gali būti pakeičiamas Se analogu. Įrodyta, kad į gyvūno organizmą patekęs Se-Met jungiasi su daugeliu pačios įvairiausios molekulinės masės baltymais: plazmos, eritrocitų ir kitų įvairių audinių baltymais [250].

Se yra gyvybiškai svarbus ir būtinas elementas. Jis stiprina imuninę sistemą (dalyvauja susidarant antikūnams, mažina infekcinių ir depresinių susirgimų tikimybę), skatina plaukų augimą, mažina onkologinių susirgimų riziką, apsaugo nuo širdies susirgimų, radioaktyvios spinduliuotės, SM ir kitų nuodingųjų junginių poveikio, būtinas nervų sistemai, skydliaukės veiklai [112, 150, 250]. Mineralas svarbus antioksidantams bei įvairioms peroksidazių sistemoms, pvz., SOD, KAT, GSHPX ir kt., nes kai kurių jų aktyviai struktūrai palaikyti būtinas Se [24, 65]. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad šis mikroelementas prailgina žmogaus amžių [24, 173].

Se apsaugo nukleorūgštis nuo bet kokio pažeidimo, veikia kaip priešnavikinė medžiaga [224]. Ląstelės, kuriose yra pakankamai šio elemento, ne tokios jautrios egzogeniškai ar endogeniškai susidarančioms ADF, veikiančioms ląstelės DNR, sukeliančioms mutacijas. Se priešnavikinės savybės gali būti siejamos ir su jo poveikiu ląstelės imunitetui. Nustatyta, kad jis stimuliuoja limfocitų proliferaciją, citokinų receptorių genų raišką, natūraliųjų naikintojų aktyvumą [65]. Taigi, šio mikroelemento junginiai – svarbi priešnavikinių medžiagų grupė, tinkama onkologinių ligų profilaktikai [65]. Eksperimentais nustatyta, kad onkologinėmis ligomis sergančiųjų žmonių kraujy-je Se kiekis yra neįtikėtinai mažas, tačiau papildžius mitybą Se preparatais, sergamumas mažėja [40, 121]. Quidong (Kinija) nustatė, kad onkologinių kepenų ligų sumažėja, jei maistas papildytas Se (iki 200 µg per dieną) [113]. Clark tyrimas taip pat pagrindė šio mikroelemento profilaktinį

poveikį onkologinėms odos ligoms (ne melanomai) [38]. Pastarasis nustatė, kad Se negali apsaugoti ar visai išgydyti nuo odos naviko, tačiau papildomas šio mikroelemento vartojimas sustabdo esan-čių navikų vystymąsi ir išplitimą į kitas organizmo vietas. Kiti mokslininkai tai pat akcentuoja, kad papildomas Se vartojimas mažina prostatos onkologinių ligų atsiradimo riziką [39, 148].

Se, kaip antioksidantas, mažina oksidavimo procesus ląstelėse, neleidžia joms deformuotis, saugo DNR ir užtikrina normalų audinių gyvavimą [230]. Šis mikroelementas stiprina imuninę sis-temą, atitolina senatvę, palengvina menopauzę, suteikia energijos, stiprina lytinį pajėgumą, padeda išvengti degeneracinių ir autoimuninių ligų, tokių kaip artritas, išsėtinė sklerozė [98]. Se veikia kaip SM antagonistas. Jis sujungia SM, todėl labai efektyvus, kai apsinuodijama Hg ar kitų SM garais [60]. Eksperimentai su laboratoriniais gyvūnais parodė, kad Se apsaugo gyvūno organizmą nuo apsinuodijimo Pb, Cd, Hg [13, 24, 40, 286]. Buvo parodyta, kad įvedus Se į pelių organizmą, suma-žėja jų mirtingumas, kurį sukelia letalinės Cd dozių inhaliacijos [78].

Apibūdinant biocheminę Se svarbą, būtina paminėti glaudų jo ryšį su vitaminu E ir S turinčiomis aminorūgštimis: metioninu bei cisteinu. Vienas iš šių komponentų gali iš dalies pakeisti kitą, tačiau kai kuriais atvejais Se negali būti pakeistas vitaminu E dėl jo funkcijų organizme. Se yra būtinas GSHPX, kuri savo struktūroje turi L-Se-Met ir L-Se-Cys liekanas [68]. Šis fermentas apsaugo ląste-les nuo suardymo oksidantais (dažniausiai lipidų peroksidų), atsirandančiais organizme dėl nuolat vykstančių metabolinių procesų. Jam sintetinti taip pat būtinos S turinčios aminorūgštys bei vitami-nas E.

Šiandien žinoma daugiau kaip 30 baltymų, kurie atlieka įvairias gyvybiškai svarbias funkcijas organizme, o jų aktyvumas priklauso nuo Se. Jo yra ne tik GSHPX, bet ir daugelyje kitų svarbių fermentų sudėtyje (tioredoksino reduktazėje (TRXR), tiroksindejodinazėje ir kt.).

2.4.2. Seleno toksiškumas

Esant Se pertekliui ar trūkumui, organizme gali išsivystyti įvairios ligos [230]. Se trūkumas orga-nizme padidina riziką susirgti onkologinėmis ligomis, didėja aterosklerozės bei miokardo infarktų rizika, gali pasireikšti miopatija, išsivystyti mažakraujystė, raumenų distrofija bei širdies raumens susilpnėjimas [112, 150]. Se trūkumas yra viena iš pirmalaikės senatvės priežasčių, susilpnėja lytinis pajėgumas, gali sukelti nevaisingumą [148]. Tyrimų, atliktų Japonijoje, Suomijoje ir kitose šalyse, duomenys rodo, kad mažas Se kiekis serume ar plazmoje gali būti susijęs su kai kurių organų (burnos ertmės, storosios žarnos, plaučių, skrandžio, prostatos ir kt.) onkologinėmis ligomis [39, 148].

Taip pat žalingas Se perteklius (daugiau nei 400 μg per parą) – sukelia selenozę, kuriai būdingas dermatitas, nagų distrofija, neurologiniai reiškiniai (parastezija, paralyžius, hemiplegija) [77]. Gali pradėti slinkti plaukai, pasireikšti nuovargis, silpnumo jausmas, nagai auga keliais sluoksniais, vystosi kepenų cirozė [105]. Kolumbijoje, kurios teritorijoje yra daug Se, žmonės plinka, praranda nagus. Gyvuliai taip pat jaučia panašius simptomus: sutrinka virškinimo organų darbas, genda ir krenta dantys, dantenas ir odą apninka uždegimai, padažnėja galūnių traumos [121].

2.5. Aktyviosios deguonies formos 2.5.1. Aktyviųjų deguonies formų susidarymas ir biologinis poveikis

Deguoniui prisijungus po vieną elektroną susidaro ADF (angl. k. ROS – reactive oxygen

species). ADF sudaro radikalai ir chemiškai aktyvūs deguonies ar azoto junginiai, kurie ląstelėje

gamina H2O2, HOCl ir laisvus radikalus, tokius kaip •OH ir O2−• [264]. •OH radikalas yra ypač

nestabilus ir reaguoja su dauguma biologinių molekulių, turinčių SH grupes ar FeS. Tai pats stipriausias ir aktyviausias oksidantas, kuris efektyviai oksiduoja baltymus, nukleorūgštis ir lipidus. Jo sukeltos grandininės reakcijos pažeidžia ląstelę. •OH radikalas susidaro iš H2O2

oksidacijos-redukcijos reakcijoje, tokioje kaip Fentono reakcija [247]. Minėti oksidantai gali sunaikinti ląsteles, pradėdami chemines grandinines reakcijas tokias kaip lipidų peroksidacija, DNR ar baltymų oksidacija [235]. DNR pažaidos gali sukelti mutacijas ir galbūt piktybinių navikų susidarymą [176,

214, 263], tuo metu, kai baltymų pažaidos sukelia fermentų slopinimą ir baltymų denatūraciją [244]. O2− gali būti antrinė signalinė molekulė, tačiau nėra stiprus oksidantas [103, 226].

Laisvųjų radikalų koncentracijos padidėjimas ląstelėje ir nesugebėjimas jų detoksikuoti, gali sukelti ląstelėje oksidacinį stresą [109]. Cd stimuliuoja laisvųjų radikalų susidarymą, ko pasėkoje nukenčia lipidai, baltymai ir DNR, ir taip inicijuojami įvairūs patologiniai procesai žmonėse ir gyvūnuose [184].

ADF gali būti ir naudingos, ir žalingos organizmui. Jos dalyvauja pernešant elektronus pernašos grandine (pvz., semichinono radikalas), reguliuojant kraujospūdį (pvz., azoto monoksidas (NO)), apsaugo organizmą nuo mikroorganizmų (pvz., superoksidas). ADF gali būti signalo nešikliai (pvz., NO, H2O2), H2O2 skydliaukėje vartojamas hormono tiroksino sintezei. ADF sukelia programuotą

ląstelės žūtį [144, 153].

Sveiko žmogaus organizme ADF yra greitai sunaikinamos. Jei dėl kažkokių priežasčių ADF nesunaikinamos, tai jos pažeidžia beveik visas svarbiausiais ląstelių struktūras – membranas, bran-duolį, makromolekules (baltymus, nukleorūgštis, angliavandenius, lipidus) (2.5.1.1 pav.) [25, 164, 205, 265, 272].

Lipidų peroksidacijos procesas prasideda, kada laisvieji radikalai sąveikauja su nesočiaisiais

lipidais, ir susidaranti to pasėkoje grandininė reakcija užsibaigia lipidų skilimo produktų gamyba. Šie produktai tai lipidų alkoholiai, aldehidai (pvz., MDA) ir mažesni fragmentai. Taigi, susidaro peroksidacijos reakcijų kaskada, kuri galutinai suardo lipidus ir sukelia membranų pažaidas [26, 100]. Svarbiausia yra tai, kad ši kaskada gali išplisti ląstelėje (pvz., širdies išemijos pažeidimų atvejais), jei lipidų peroksidaciniai pažeidimai nebus nutraukti, veikiant tokoferoliams ir redu-kuotam kofermentui Q.Grandininė peroksidacija nutraukiama, jei du laisvieji radikalai susijungia ir susidaro jau ne radikalinis produktas [256].

2.5.1.1 pav. Aktyvių deguonies formų sukeltos oksidacinės pažaidos [116]

Baltymų oksidacinė modifikacija (cheminės struktūros pokyčiai) vyksta dėl laisvųjų radikalų

įtakos. Baltymų oksidacijos procese dalyvauja ne tik deguonies, bet ir kiti radikalai, pvz., lipidų peroksidacijos radikalai (L•, LOO•). Paskutinėse oksidacinio streso stadijose stebima ryški baltymų destrukcija. Baltymų oksidacijos procesas yra sudėtingas dėl cheminės sudėties ir struktūros įvairovės. Susidaro daug skirtingos cheminės struktūros oksiduotų produktų [192].

Įvairių aminorūgščių jautrumas oksidantams yra nevienodas, todėl baltymų molekulių pokyčiai priklauso nuo baltymų aminorūgščių sudėties ir struktūrinės organizacijos bei ADF prigimties. Baltymų oksidacinė modifikacija pasireiškia arba jų agregacija ir molekulinės masės padidėjimu, arba fragmentacija ir skilimu į mažesnius polipeptidus. Tokie pakitę baltymai greičiau suyra, pakin-ta jų elektrinis krūvis. Deguonies radikalų įpakin-takoje įvykspakin-ta baltymų pirminės, antrinės ir tretinės struktūrų pokyčiai [192]. Baltymų fragmentaciją gali įtakoti ir lipidų radikalai (L•, LOO•). Daugeliu atvejų oksidacinė baltymų molekulės modifikacija, veikiant ADF junginiams, susieta su jų fermen-tinio aktyvumo kitimais (struktūriniais pokyčiais aktyviajame centre) [248].

Nukleorūgščių pažaidos. Branduolio ir mitochondrijų DNR pažaidos sukelia mutacijas. Veikiant

laisviesiems radikalams, ypač hidroksiradikalui, DNR yra modifikuojama įvairiais būdais. Tai gali būti polinukleotidinės grandinės trūkiai, bazių ir angliavandenių modifikacija, pentozės žiedo skai-dymas. Susidaro baltymo ir DNR skersiniai kovalentiniai ryšiai. Hidroksiradikalas gali prisijungti prie heterociklinės bazės dvigubųjų ryšių, gali paimti vandenilį iš timino metilo grupės arba deoksiribozės anglies atomų [265]. Viena iš pažeidžiamiausių bazių yra guaninas. Iš deoksigua-nozino susidaro 8-hidroksideoksiguanozinas ir 8-oksodeoksiguanozinas. Nukleorūgščių pažaidos aktyvina onkogenezę [265].

2.5.2. Aktyviųjų deguonies formų reikšmė ligų patogenezėje

Sutrikus pusiausvyrai tarp laisvųjų radikalų formavimosi ir antioksidacinės sistemos gebėjimo neutralizuoti tuos radikalus, organizme vystosi oksidacinis stresas. Tai yra procesas, kurio metu susidarę laisvieji radikalai veikia ląsteles ir sukelia dažnai negrįžtamus pakitimus. Kai antioksi-dacinė sistema nusilpsta ir nepajėgia kovoti su ADF, laisvųjų deguonies radikalų sukeltos grandininės reakcijos sutrikdo organizmo veiklą, dėl ko atsiranda įvairūs susirgimai, intensyvėja lipidų peroksidacijos procesai, didėja genetinio ląstelės pažeidimo tikimybė [215].

Buvo parodyta, kad ADF tokios kaip NO, O2–, H2O2, OH sukelia įvairias ligas, tokias kaip

aterosklerozė, onkologinės ligos, išemija, uždegiminiai procesai, organizmo senėjimas, cukrinis diabetas, neurodegeneracinės ligos, katarakta ir t.t. [11, 44, 48, 95, 238, 268]. Laisvieji radikalai arba ADF yra atsakingi už cheminių junginių, tokių, kaip anglies tetrachlorido ir baltojo fosforo hepatotoksiškumą, plaučių pažaidas [256]. Oksidacinis stresas sąlygoja ligų, kaip Alzheimerio, Par-kinsono, insulto, Dauno sindromo, neurotraumų atsiradimą [164, 288]. Alzheimerio ligos etiologi-joje yra daugybė veiksnių, tarp kurių, jau neabejojama, yra tiesioginis ir netiesioginis laisvųjų radikalų poveikis. Palyginus sergančiųjų ir sveikų žmonių smegenų žievės GSH kiekį ir lipidų peroksidacijos laipsnį, pastebėta, jog Alzheimerio liga sergančių pacientų GSH kiekis stipriai sumažėjęs, o lipidų peroksidacija padidėjusi lyginant su kontroline grupe [1]. Eksperimentais įrodyta, kad ADF pažeidžia lęšiuko epitelio ir skaidulų ląstelių membranas, sukeldamos baltymų ir lipidų oksidaciją dėl ko formuojasi lęšiuko drumstis [135].

Vienas iš pagrindinių veiksnių ląstelių supiktybėjime yra DNR pažaidos veikiant ADF. Piktybinių navikų atsiradimą sąlygoja ADF kiekio padidėjimas, kurį sukelia rūkymas, oro užterš-tumas, alkoholio nesaikingas vartojimas. Ląstelėse ADF susidaro veikiant jonizuojantiems spindu-liams, metabolizuojant kai kuriuos vaistus, toksinus [55].

2.5.3. Ląstelių antioksidacinės sistemos komponentai

Ląstelėse yra efektyvi apsauga nuo laisvųjų radikalų poveikio (2.5.3.1 pav.). Antioksidantai žmogaus organizme sudaro sudėtingą daugiakomponentinę antioksidacinę sistemą, kuri užtikrina laisvųjų radikalų sujungimą, modifikavimą, slopinimą arba ardymą. Antioksidacinę ląstelės apsaugą sudaro: antioksidaciniai fermentai (glutationo S-transferazė (GST), SOD, KAT, GSHPX, GRED) [171], mažos molekulinės masės junginiai, prijungiantys laisvuosius radikalus. Į jos sudėtį įeina hidrofilinės (glutationas, askorbo rūgštis) ir hidrofobinės (vitaminai A ir E, flavonoidai, ubichino-nas) organinės medžiagos, pasižyminčios redukcijos savybėmis bei pereinamuosius metalų jonus surišantys baltymai(2.5.3.1 pav.) [166, 257, 272].

dažnai vadinama pirmąja antioksidacine apsauga. Ji katalizuoja superoksido pavertimą vandenilio peroksidu [139, 293]. SOD1 ir SOD3 turi po vieną Cu ir Zn joną aktyviajame centre (Cu/Zn SOD). Mitochondrijų matrikse esantis fermentas (SOD2) savo struktūroje turi Mn jonų (Mn-SOD). Jei SOD yra perkrauta didelio superoksido kiekio ir nesugeba jo greitai detoksikuoti, tai perteklinis superoksido anijonas-radikalas pažeidžia lipidus, sukeldamas jų peroksidaciją [97, 162, 183].

KAT – tai hemoproteinas, kuris katalizuoja H2O2 skaidymo reakciją [29, 292]. Daugiausiai KAT

yra sutelkta peroksisomose, šiek tiek mažiau – citoplazmoje [56]. SM jonai veikia kaip nekonkuren-tiniai KAT slopikliai, o cianidas, prisijungdamas prie KAT hemo, konkurentiškai sustabdo šio fermento veikimą [94].

2.5.3.1 pav. Pagrindiniai ląstelės antioksidacinės sistemos

komponentai [302]

SOD – superoksido dismutazė, GSHPX – glutationo peroksidazė, KAT – katalazė, GSH – redukuotas glutationas, GSSG – oksiduotas glutationas

GSHPX – tai pagrindinė peroksidazė, skaldanti įvairių rūšių peroksidus. Yra kiekvienoje

žmogaus organizmo ląstelėje [46]. GSHPX yra fermentas, turintis keturis Se koveiksnius, todėl šio fermento aktyvumas labai priklauso nuo Se kiekio maiste [21, 207]. Hepatocituose GSHPX yra citozolyje ir mitochondrijų matrikse [173]. Visi antioksidaciniai fermentai yra vienodai svarbūs ir kartu saugo ląstelę nuo oksidacinio streso.

Tokoferoliai (vitaminas E ir jo dariniai). Tai riebaluose tirpūs vitaminai, turintys antioksidanto

savybes [92, 187]. Jie saugo membranas nuo oksidacijos, reaguojant su lipidų radikalais, susidariusiais lipidų peroksidacijos grandininės reakcijos metu [92, 243]

Redukuoti ląstelės tioliniai junginiai ir kiti kofermentai. GSH yra bene vertingiausias ir

stipriausias viso organizmo antioksidantas, taip pat detoksifikuotojas, imuninės sistemos stiprinto-jas. Tai – tripeptidas: γGlu-Cys-Gly (γ-glutamilcisteinglicinas) (2.5.3.2 pav.), kuris dalyvauja reak-cijose su aktyviais tarpiniais produktais ir ADF tiesiogiai, arba katalizuojant reakciją GST [198]. Jei vyksta daug tokių reakcijų, tai ląstelės GSH kiekis bus išeikvotas. GSH kiekio išsekimas ląstelėje reiškia jos baltymų ir kitų makromolekulių galimas oksidacines pažaidas ir jautrumo joms padidėjimą. GSH funkcijos biologinėse sistemose nėra visiškai išaiškintos. Manoma, kad jis yra svarbiausias endogeninis, t.y. paties organizmo sukurtas, antioksidantas, kuris apsaugo baltymus ir peptidus, turinčius laisvąsias merkapto grupes nuo oksidacijos, padeda sudaryti disulfidinius ryšius daugelyje baltymų ir peptidinių hormonų molekulių, dalyvauja oksiduojant kenksmingą vandenilio peroksidą ksenobiotikų metabolitų konjugacijos reakcijose, kai kuriose izomerizacijos reakcijose [161, 172].

Pagrindinė GSH sintezės vieta yra kepenys, vyksta ląstelės citozolyje [30]. Žinduolių organizme viduląstelinė GSH koncentracija yra 0,5–10 mM [193]. Glutationas gali būti dviejų formų – oksi-duotas (GSSG) ir redukuotas (GSH), todėl jis žmogaus organizme sudaro labai svarbią oksidacijos-redukcijos sistemą, kuri saugo jį nuo toksinio peroksidų poveikio. Ekotoksikologijoje naudojami du parametrai: pats GSH kiekis, arba [GSH]/[GSSG] koncentracijų santykis [58, 256]. Vidinis ląstelės GSH kiekis yra tikslus rodiklis, vertinant bendrą ląstelės būklę, ir jos gebėjimą priešintis toksiniam poveikiui. GSH nukenksmina laisvuosius radikalus, paversdamas juos vandeniu. GSSG vėl virsta GSH veikiant GRED, kuri yra aktyvi, tik esant pakankamam redukuoto nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADPH) kiekiui. GSH kiekio sumažėjimas gali sukelti ląstelės žūtį [36, 132, 160, 193]. Parodyta, kad plazmos ir kepenų GSH galima padidinti vartojant S-adenozilmetioniną (SAM) [146, 151]. Be to, plazmos tioliai (GSH, ar jo pirmtakai (cisteinas)) slopina mažo tankio lipoproteinų (MTL) su juose surištu cholesteroliu oksidavimą, o oksiduoti MTL ir yra vienas iš aterosklerozės rizikos veiksnių [192].

L-askorbo rūgštis (vitaminas C). Tai monosacharidas, vandenyje tirpus vitaminas-antioksidantas

[242]. Jis gali būti vandenilio donoras ar akceptorius. Ši rūgštis pašalina singuletinio deguonies, hipochlorito, hidroperoksidų, superoksido bei hidroksiradikalo kenksmingumą, redukuoja tokofe-rolio radikalą [188]. Terpėje esant Fe ar Cu jonų, askorbo rūgštis veikia kaip oksidantas.

Pereinamųjų metalų jonus prijungiantys baltymai. Metalų jonų turintys baltymai (feritinas,

transferinas, laktoferinas, ceruloplazminas) sukelia antioksidacinį poveikį, nes suriša metalų jonus ir todėl nevyksta Fentono reakcija. Žarnyno gleivinės epitelio ląstelėse Fe2+ virsta Fe3+ ir jungiasi su baltymu apoferitinu, sudarydama stabilų kompleksą feritiną. Fe jonus perneša transferinas ir laktoferinas. Ceruloplazminas sujungia Cu2+. Se ir Zn yra laikomi antioksidantais, nors šių chemi-nių elementų patys neveikia kaip antioksidantai, o yra svarbūs kai kurių antioksidacichemi-nių fermentų aktyvumui [103].

2.6. Metalotioneinų struktūra ir funkcijos 2.6.1. Metalotioneinų struktūra

Patekę į ląstelę SM jonai skatina baltymo MT sintezę. MT pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, suriša laisvuosius metalų jonus ir atlieka SM detoksikacijos funkciją [130, 270, 294]. MT labai giminingi Cd, Hg, Ag, Zn, Cu ir kitiems SM, bet labiausiai suriša Cu, Zn ir Cd [85].

MT – citoplazminiai, mažos molekulinės masės (6000–7000 Da) monomeriniai baltymai, sudaryti iš globulinių domenų, kurių kiekvienas sudaro metalo merkapto domeną. Žinduolių MT turi daugiau kaip 60 aminorūgščių, iš kurių nuo 23 iki 33 proc. sudaro MT funkcijoms būtinas cisteinas, turintis merkapto grupes, taip pat turi daug serino ir glicino, neturi aromatinių amino-rūgščių ir histidino [72, 157, 270]. MT suriša santykinai didelį metalų kiekį (4–18 atomų), pvz., iki septynių Cd, Hg ir Zn atomų, dvylika Cu ir aštuoniolika Ag atomų (2.6.1.1 pav.) [81, 270].

2.6.1.1 pav. Metalotioneino struktūra. Trys ir keturi Cd atomai įjungti atitinkamai į  ir  domenus [305]

Domenas  yra MT polipeptidinės grandinės C gale, o  – grandinės N gale. Keturi metalo atomai surišami  domene dažniausiai šešiomis galinėmis aminorūgšties cisteino merkapto gru-pėmis ir penkiais disulfidiniais tilteliais. Trys metalo atomai surišami  domene dažniausiai šešio-mis galinėšešio-mis aminorūgšties cisteino merkapto grupėšešio-mis ir trišešio-mis disulfidiniais tilteliais. Šių dome-nų giminingumas įvairiems metalų jonams yra selektyvus ir skirtingas:  ir  domenai suriša metalus nepriklausomai vienas nuo kito, pvz., metalų surišimas  domene silpnėja tokia tvarka Cu>Zn>Cd, o  domene – Cd>Zn>Cu.Manoma, kad įprastomis sąlygomis MT dalyvauja reguliuo-jant Cu ir Zn kiekį ląstelių viduje, kadangi šie metalai yra daugelio fermentų sudedamosios dalys (koveiksniai) [53].

MT yra įvairiuose stuburinių gyvūnų organuose, bet didžiausia jų koncentracija yra kepenyse ir inkstuose, kuriuose MT kaupiasi organizmui senstant [17]. Yra atrastos keturios svarbesnės MT izoformos, iš kurių MT-I ir MT-II yra pagrindinės ir pasiskirsčiusios visuose audiniuose, tam tikras jų perteklius yra kepenyse, kasoje, žarnyne ir inkstuose [270, 114].

MT-III izoforma yra tik smegenyse [114]. Ji turi 68 aminorūgštis ir skiriasi ir nuo kitų izoformų, nes turi papildomus aminorūgščių intarpus, tokius kaip vieną treoniną N galinėje sekoje ir šešias aminorūgščių liekanas C galinėje sekoje [196].

MT-IV yra epitelio ląstelėse [93, 114]. Ji skiriasi nuo kitų izoformų apytikriai 24–27 aminorūgš-čių liekanomis, kurios yra neesminės metalų surišimo funkcijai [125].

MT-I ir MT-II izoformų sintezė skatinama įvairiomis streso sąlygomis ir junginiais, tokiais kaip gliukokortikoidai, citokinai, metalų jonai, ADF. Tuo tarpu MT-III ir MT-IV izoformos nejautrios šiems veiksniams. Labiausiai MT-I ir MT-II sintezę skatina metalų jonai, tokie kaip Zn ir Cd (tai pagrindiniai šio baltymo sintezės aktyvikliai kepenyse) bei kiti – Hg, Bi, Cu ir tam tikri organiniai metalų junginiai. Zn jonai veikia per metalo reguliuojamo transkripcijos veiksnio 1 „Zn pirštus“ [281], o Cd – per kitus veiksnius [125].

Inkstuose MT sintezę labiausiai sukelia Hg ir Cd bei didelės Zn koncentracijos. Šių MT izoformų sintezės aktyvumo priklausomybė nuo SM parodo jų vaidmenį šių metalų detoksikacijos procese [75].

MT sintezę veikia daugybė nemetalinių junginių, tokių kaip hormonai, vitaminai, citokinai, anti-biotikai, medikamentai, bakterinė infekcija, uždegiminiai procesai ir daugelis kitų cheminių ir fizikinių veiksnių. Šis poveikis reguliuojamas transkripcijos lygyje dėka įvairių cis-veikiančių DNR sekų, esančių MT genų promotoriaus srityje [140, 167, 221].

2.6.2. Metalotioneinų pasiskirstymas organuose ir ląstelėse

MT yra daugelyje audinių, daugiausia parenchiminiuose audiniuose, tokiuose kaip kepenys, inkstai, kasa ir žarnynas [42, 43, 91, 258, 276]. Reprodukciniuose audiniuose esant normaliom sąlygom taip pat yra MT. MT geno raiška dažnai koreliuoja su Zn pasiskirstymu audiniuose [4]. MT pasiskirstymas skirtingų tipų ląstelėse gali būti ganėtinai heterogeninis, pvz., kepenyse MT randami hepatocituose, bet ne fibroblastuose ar Kupferio ląstelėse [177]. Nustatyta, kad suaugusiųjų kepenyse MT yra ląstelių citoplazmoje, tuo tarpu embriono/naujagimio – ląstelių branduolyje [33, 52]. MT branduolyje taip pat aptikti navikinių ląstelių ciklo S fazėje ir proliferacijos metu. MT taip pat lokalizuoti pirminės kultūros hepatocitų branduolyje po ląstelės dalijimosi stimuliavimo [261]. Tai rodo, kad MT suaugusiųjų hepatocituose yra perkeliami į branduolį ląstelės ciklo S-G2M fazės

metu po proliferacijos hepatocitų augimo veiksnių stimuliavimo. MT išsidėstymas branduolyje, nurodantis proliferacinį aktyvumą gali dalyvauti augimo stimuliacijos signalo transdukcijoje [9, 32].

MT koncentracija įvairių organizmų organuose yra skirtinga, pvz., MT koncentracija buvo nustatyta skirtingų organizmų kepenyse: šuns, katės ir ožkos – 500–700 g MT/g kepenų; kiaulės ir žmogaus – 350–500 g MT/g kepenų, žiurkėno, žiurkės, triušio, jūros kiaulytės ir pelės– 5–116 g MT/g kepenų esant normaliomis sąlygomis [94, 295].

2.6.3. Metalotioneinų vaidmuo metalų metabolizme

Manoma, kad MT gali būti susiję su metalų metabolizmu ir homeostaze. Šie baltymai yra metalų jonų chelatoriai ir turi svarbų antioksidacinį ir priešuždegiminį veikimą. MT gali apsaugoti smegenis nuo degeneracijos ir ląstelės žūties [154, 185].

MT veikia patofiziologinius procesus, tokius kaip ADF susidarymą, ląstelės degeneraciją ir apoptozę. Taip pat jie reguliuoja Zn absorbciją, svarbūs kaip Zn donorai įvairiems fermentams, transkripcijos ir antioksidaciniams veiksniams, „Zn pirštus“ turintiems baltymams bei kitų baltymų sintezei. Zn prijungiančios sritys yra turtingos cisteinu, ir dažniausiai suriša tris ar keturis Zn jonus. Kai kuriuose baltymuose, histidinas taip pat dalyvauja Zn prijungime [35].

MT esantis Zn naudingas sąveikaujant su įvairiais branduolio komponentais, įskaitant histonus, transkripcijos veiksnius ir tokios sąveikos gali modifikuoti daugelį ląstelės procesų, įskaitant genų raišką, taip pat kepenyse gali aktyvuoti aminolevulino rūgšties dehidratazę (fermentą, kuris dalyvauja hemo sintezėje ir jo veikimui būtinas Zn) [9, 19, 32, 233]. Yra tikimybė, kad MT gali sąveikauti su „Zn pirštus“ turinčiais baltymais, dalyvauti kontroliuojant Cu ar Zn absorbciją žarnyne. Keletas tyrimų parodė, kad molekuliniame lygyje MT gali veikti kaip Cu ar Zn donorai kitiems baltymams ląstelės viduje, pvz., keletas apofermentų, kurių koveiksniai yra Cu ar Zn (anglies anhidrazė, šarminė fosfatazė ir SOD) buvo suaktyvinti MT esančių Cu ar Zn [154, 185]. MT sujungdami ir atpalaiduodami Zn, tampa pagrindiniu šio mikroelemento signaliniu komponentu ląstelėje. Ši sistema ypač svarbi smegenyse, taip pat reguliuojant baltymo P53 aktyvumą [185]. Eksperimentuose su gyvūnais, nustatyta, kad MT gali veiksmingai slopinti oksidacinį stresą smegenyse in vivo, kur MT užkerta kelią ADF toksiškumui, pvz., lipidų peroksidacijai, NO formavimuisi, kuris sukelia neuronų degeneracijas ir ląstelių apoptozę. MT turi ir antiapoptotinį veikimą, kuris svarbus esant CNS patologijoms, navikų vystymosi atvejais, įskaitant pasipriešinimą antinavikinei terapijai [69, 220].

Kompensacinių organų hipertrofija, kaip padidėjęs ląstelių dauginimasis, gali skatinti MT aktyvinimą. Tiriant žiurkes buvo pastebėta, kad esant kompensacinių organų hipertrofijai, padidėjo mt-I ir mt-II genų raiška, ypač inkstų žievėje ir išorinėje šerdyje [291]. Normaliomis sąlygomis, didelės MT koncentracijos audiniuose yra esant Zn poreikiui, pvz., greito augimo ar audinių regeneracijos metu, ląstelių dalijimosi metu, įskaitant DNR, RNR ir baltymų sintezę, ir tai parodo neabejotiną šio mikroelemento poreikį greitos proliferacijos metu [7, 52]. Buvo atlikti tyrimai su laboratorinėmis pelėmis, kuriose genas taikinys buvo pašalintas arba padaugintas. Rezultatai parodė, kad mt-I geno raiškos padidėjimas pelių fenotipo neveikė, bet užtikrino ypatingą apsaugą nuo išeminio širdies ir smegenų pažeidimo, kurį sukėlė laisvi Zn jonai. Pelių, kurioms buvo slopintas mt genas, fenotipas taip pat nesiskyrė nuo normalaus. Paveikus šias peles Cd ir Zn, paaiškėjo, kad tos pelės tapo daug jautresnės Cd toksiniam ir oksidaciniam poveikiui, lyginant su kontrolinėmis grupėmis [269].

MT yra labai svarbūs Cd detoksikavime. Patekęs į kepenis Cd gali būti sujungiamas su GSH ir išskiriamas į tulžį, arba gali prisijungti prie MT ir taip kauptis. Tam tikras Cd-MT kiekis patenka į plazmą ir taip nunešamas į inkstus [125].

Metalų atpalaidavimo mechanizmas iš komplekso su MT dar nėra išaiškintas. Manoma, kad metalai gali būti atlaisvinami nuo MT oksiduojant šiuos baltymus. Ląstelėse disulfidai, tokie kaip GSSG, gali oksiduoti MT ir taip tiesiogiai atpalaiduoti Zn, Cu. Kitas veiksnys, dėl kurio gali būti atpalaiduojami metalai nuo MT yra ADF, kurie yra MT antioksidacinio mechanizmo veikimo dalis. Manoma, kad ADF sąveikauja su metalų merkaptų domenais, juos oksiduoja ir taip MT atpalaiduoja metalus [154].

2.7. Streso indukuojami baltymai

Vienas ląstelės apsaugos mechanizmų, kurį gali aktyvinti įvairūs stresai, tame tarpe ir SM, yra Hsp sintezė. Šie baltymai dar vadinami molekuliniais šaperonais. Jie nuolat egzistuoja ląstelėje ir atlieka svarbų vaidmenį susidarant taisyklingai baltymų erdvinei struktūrai ir pernešant baltymus

per membraną [54]. Šaperonai nekovalentiniais ryšiais sujungia specifines polipeptidų grandinės dalis, palaikydami aktyvią baltymo struktūrą. Streso sąlygomis šaperonai stabilizuoja ląstelių baltymus, palaiko normalią mikrofilamentų ir centrosomų struktūrą, stabilizuoja ląstelėje vykstan-čius procesus. Kai kurie autoriai Hsp vadina toksiškumo žymenimis [54].

Žinoma, kad smegenų astroglijos ląstelės apsaugo smegenis nuo galimo Pb jonų poveikio jautresniems neuronams. Ji gali toleruoti santykinai dideles šio metalo viduląstelines koncentracijas. Buvo įrodyta, kad šiame mechanizme dalyvauja endoplazminio tinklo molekulinis šaperonas – GRP78 [201]. Atliekant tyrimus su žiurkių C6 linijos astroglijos ląstelių kultūra, pastebėta, kad šio baltymo sintezė padidėjo jau pirmą dieną, kai ląstelės buvo veikiamos Pb junginiais ir didėjo toliau per visą poveikio laiką. Buvo įrodyta, kad GRP78 tvirtai rišasi su Pb jonais ir šis ryšys stipresnis nei su Zn ar Ni jonais [201]. Taip pat yra duomenų, kad Cd aktyvina hsp10, hsp27, hsp32, hsp40, hsp60, hsp70, hsp89, hsp90, hsp110 genus ląstelių kultūrose, o hsp32, hsp70, hsp90 ir hsp110 genus pelių ar žiurkių kepenyse ir inkstuose. Žinoma, kad Cd jonai konkuruoja su Zn, Co, Se jonais baltymų molekulėse, gali pakeisti juos ir sąveikauti su baltymų merkapto grupėmis, dėl ko baltymai gali būti denatūruojami. Jei metalo sukelti baltymo molekulės pokyčiai nėra dideli, jos struktūrą padeda atkurti molekulinis šaperonas Hsp70 [73, 279].

Taigi, gyvojoje ląstelėje egzistuoja mechanizmai, apsaugantys ją nuo žalingo įvairių metalų jonų poveikio. Šie mechanizmai dar nėra visiškai aiškūs, todėl šiuo metu atliekami tyrimai, kurių rezultatai galėtų būti naudingi kovojant su įvairiomis ligomis, atsiradusiomis dėl SM poveikio.

2.8. Sunkiųjų metalų poveikis genų raiškai

Genų raiška, kurios dalis yra baltymų sintezė – tai sudėtingų biocheminių procesų visuma. Baltymų sintezėje dalyvauja apie 300 makromolekulių, kurių aktyvumų pokyčiai gali vienaip ar kitaip pakeisti genetinės informacijos, užkoduotos ląstelės DNR, perdavimo tikslumą ir greitį. Todėl baltymų sintezėje dalyvaujančių makromolekulių pokyčiai gali atsispindėti ir atskirų organų funkcijoje, o tuo pačiu paveikti viso organizmo gyvybinius procesus.

Žinoma, kad DNR molekulę pažeidžia įvairios cheminės medžiagos, tame tarpe ir metalų jonai. Metalų mutageninės savybės gali pasireikšti jiems tiesiogiai sąveikaujant su DNR molekule [57]. Atliekant tyrimus su pelėmis in vivo pastebėta, kad veikiant Pb(NO3)2 įvyksta DNR pažeidimai,

nepriklausantys nuo dozės [50]. Nedidelės kai kurių metalų (pvz., Ni, Pb, Co, Cu, Hg, Cd) koncent-racijos gali slopinti DNR repakoncent-racijos mechanizmą, nes šie metalai sąveikauja su repakoncent-racijos fermen-tais. Atlikus tyrimus su bakterine formamidopirimidino DNR glikozilaze (Fpg baltymu) ir žinduolių XP (lot. Xeroderma pigmentosum) baltymu parodyta, kad šių DNR reparacijos fermentų „Zn pirštų“ struktūrą veikia toksinės SM koncentracijos. Abiejų šių fermentų aktyvumą slopino Cd ir Cu, XP fermento aktyvumą slopino Ni ir Co, o Fpg baltymų – Hg [88].

Žinoma nemažai genų (pvz., mt-IIA, hsp70, c-fos ir kt.), kuriuos aktyvina metalai (pvz., Zn, Cd,

Ag, Hg, Cu, Co, Ni), tačiau atskirų metalų poveikio mechanizmai nėra tiksliai žinomi [119, 174]. Transliacija, vykstanti eukariotinių ląstelių citoplazmoje, yra antrasis genų raiškos etapas. Transliaciją sudaro trys stadijos: iniciacija, elongacija ir terminacija. Kiekvienoje stadijoje dalyvau-ja įvairūs transliacijos veiksniai, pvz., kai kurie eIF betarpiškai dalyvaudalyvau-ja iniciacijos komplekso susidaryme [189], tuo tarpu kiti stimuliuoja tik atskiras šio proceso stadijas. Nustatyta, kad eIF gali būti modifikuojami juos fosforilinant arba glikozilinant ir tai turi didelę reikšmę transliacijos reguliavime, pvz., Cd2+ stimuliuoja eIF2 fosforilinimą, o tai sulėtina transliacijos iniciacijos stadiją, pažeidžia poliribosomų struktūrą ir gali būti visos baltymo sintezės slopinimo priežastimi [86]. Joseph su bendraautoriais parodė, kad IF3 ir EF-1δ genų raiška buvo padidėjusi BALB/c-3T3 pelių ląstelėse, kurios buvo transformuotos dėl CdCl2 buvimo. Iškelta hipotezė, kad ląstelės

transformaci-ja ir supiktybėjimas dėl Cd gali būti iš dalies susiję su transliacijos veiksnių genų padidėjusia raiška [117, 118].

Baltymų sintezė yra sudėtingas procesas ir jame dalyvaujančių molekulių pažeidimas gali sutrikdyti ląstelės homeostazę. Tačiau ši sistema turi mechanizmus, apsaugančius gyvąjį organizmą nuo įvairių stresų, tame tarpe ir Cd2+ toksinio poveikio. Cd2+ gali aktyvinti kai kurių genų,

koduo-jančių specifinius apsauginius baltymus, raišką (žiūrėti 2.2.1 skyrių). Dėl tokio poveikio organizmas gali grįžti į normalią būseną.

2.9. Transliacijos sistemos komponentų charakteristika 2.9.1. Pernašos RNR

tRNR – pakankamai maža molekulė, kurios grandinę sudaro 73–95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kDa, sedimentacijos koeficientas 4S. tRNR molekulėje susidaro vandeniliniai ryšiai tarp komplementarių bazių porų toje pačioje grandinėje, ji atlieka tarpininko funkciją mRNR transliacijos metu [71, 285]. tRNR perneša aminorūgštis ant ribosomos ir padeda aminorūgščiai užimti taisyklingą padėtį (atitinkančią mRNR kodoną). Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių tRNR. Kiekviena aminorūgštis turi jai specifiškas kelias tRNR, vadinamas izoak-ceptinėmis [249].

tRNR molekulėms būdinga antrinė ir tretinė struktūra (2.9.1.1(a) ir (b) pav.). tRNR molekulėje gali būti 4 arba 5 spiraliniai fragmentai. Dėl to tRNR įgyja specifinę erdvinę struktūrą, dvimatėje erdvėje atrodančią kaip „dobilo lapas“, kurią sudaro: akceptinis stiebas, TC kilpa, kintamoji kilpa, D kilpa, antikodono kilpa (2.9.1.1 (a) pav.) [275].

(a) (b)

2.9.1.1 pav. Antrinė (a) [304] ir tretinė (b) [304] tRNR struktūra

Modifikuoti nukleozidai: I – inozinas, D – dihidrouridinas, T – ribotimidinas,  – pseudouridinas, mA – metiladenozinas, mG – metilguanozinas, mC – metilcitidinas

Beveik pusė tRNR nukleotidų yra suporuoti ir sudaro dvigubos spiralės sritis, tačiau tRNR funkcijai ypač svarbios dvi nesuporuotų nukleotidų vietos: vienoje iš jų yra nukleotidų tripletas, vadinamas antikodonu, o kitoje – CCA seka [275]. tRNR molekulės akceptinis stiebas sudarytas iš nukleotidų porų ir užsibaigia seka CCA. Per adenozilo 3-OH grupę prie jo jungiasi aminorūgšties karboksigrupė [275].

Antikodoną sudaro 34, 35 ir 36 nukleotidas. Antikodono kilpa atpažįsta nukleozidinį tripletą, t.y. kodoną, esantį mRNR. Ant ribosomų tRNR antikodonas sąveikauja su mRNR kodonu [275]. TC kilpa vadinama taip dėl joje esančios sekos T-pseudouridinas-C. Manoma, kad ši kilpa svarbi sąveikai su ribosoma [179]. D kilpoje yra minorinis nukleozidas dihidrouridinas. Papildoma kilpa vadinama kintamoji, nes ji kintamiausia struktūra ir jos ilgis įvairiose tRNR molekulėse nevienodas. Ji išsikiša apie 45 laipsnių kampu į tRNR „L“ formos plokštumą [275]. Tarp antrinės struktūros kilpų susidaro vandeniliniai ryšiai, dėl kurių tRNR įgauna dar kompaktiškesnę tretinę L formos konformaciją (2.9.1.1 (b) pav.). Antrinės struktūros kilpos D ir TC svarbios universalios tRNR

75].

tretinės struktūros susidarymui: TC kilpa sąveikauja su D kilpa ir akceptinio bei TC stiebų dvi-spiraliai fragmentai sudaro L raidės briauną, o D ir antikodono stiebas – kitą. tRNR biologinę funkciją ir lemia ši tretinė struktūra. Joje aktyviai veikia dvi nesuporuotos nukleotidų vietos, t.y. antikodonas ir 3 gale esanti CCA seka [275].

Apie metalų poveikį konkrečiai tRNR molekulei žinoma nedaug, tačiau yra atlikta nemažai tyrimų įrodančių, kad dėl SM jonų gali vykti RNR molekulės depolimerizacija, o dėl šios molekulės struktūros pakitimų galimas toksinio poveikio atsiradimas [3].

2.9.2. Aminoacil-tRNR sintetazės

Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos pagrindinės biocheminės reakcijos metu. Ši reakcija – tai tRNR molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja specifiniai fermentai – ARSazės.

ARSazės – tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasižyminti skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydžio subvienetų. Šios sintetazės gali būti ir monomerai, ir dimerai, ir tetramerai, o jų subdalelių molekulinė masė skiriasi nuo 37 kDa iki 108 kDa [110]. Pagal aminorūgšties prijungimo vietą ARSazės skirstomos į dvi klases (2.9.2.1 lentelė).

Pirmosios klasės ARSazių aktyviajam centrui būdingi 2 fragmentai: tetrapeptidas His-Ile-Gly-His ir pentapeptidas Lys-Met-Ser-Lys-Ser, kurie yra nukleotidus surišančio domeno – Rosmano klostės – komponentai. Šis domenas savo sudėtyje turi 6  klostes, perdengtas α spiralėmis. Histidi-no imidazolo žiedas prijungia ATP, dalyvaujant Mg2+. Antra seka identifikuota kaip tRNR CCA-galo surišimo sritis [168]. Pirmajai klasei priklauso fermentai, kurie katalizuoja specifinės amino-rūgšties prijungimą prie 2-OH adenozino, esančio 76-oje padėtyje tRNR molekulės 3 gale. Daž-niausiai šios ARSazės yra monomeriniai baltymai.

Antrosios klasės ARSazėms būdinga visiškai kita aktyvaus centro struktūra: 7 antiparalelinės  klostės, apsuptos trijų  spiralių, kurios formuoja katalitinių domenų šerdį [10, 47]. Aktyvaus centro struktūrai būdingi šie „motyvai“: 1) Gly-Phe-X-X-Val-X-X-Pro-Phe-Phe; 2) Y-Y-X-Y-X-X-X-Phe-Arg-Asn-Gly; 3) Y-Gly-Y-Gly-Y-Gly-Leu-Gly-Arg (X – bet kurios aminorūgšties liekana, Y – aminorūgšties su hidrofobiniu radikalu liekana). 2-ojo motyvo sudėtyje esanti Arg liekana dalyvauja ATP surišime. Antrosios klasės ARSazės yra homodimerai, sudaryti iš 2 arba 4 subvie-netų: AlaRSazė (, 4), AsnRSazė (2), AspRSazė (2), GlyRSazė (22), HisRSazė (2),

LysRSazė (2), ProRSazė (2), PheRSazė (22, ), SerRS (2), ThrRSazė (2) [23]. Antrosios

klasės fermentai jungia aminorūgštį prie atitinkamos tRNR 3-OH, išskyrus PheRSazę, kuri jungia aminorūgštį prie 2-OH. Šios klasės ARSazės visada yra oligomeriniai baltymai [70, 2

2.9.2.1 lentelė. Aminoacil-tRNR sintetazių klasės [156]

I klasė Glu Gln Arg Cys Met Val Ile Leu Tyr Trp

II klasė Gly Ala Pro Ser Thr His Asp Asn Lys Phe

Dažniausiai tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ties ARSazių, kiekviena iš kurių specifinė tik vienai aminorūgščiai. Tačiau yra išimčių. Buvo išskirtos ir aprašytos visos 20 ARSazių iš E. coli ir didelė dalis žemesniųjų bei aukštesniųjų eukariotų ARSazių. Genų klonavimo ir sekvenavimo metodais buvo nustatyta prokariotinių ARSazių pirminė struktūra. Visas jas koduoja skirtingi ir unikalūs genai, išskyrus LysRSazę, kurią koduoja du genai – lysS ir lysU [145].

Aminoacilinimo reakcija yra dvipakopė (2.9.2.1 pav.). Pirmosios pakopos metu aminorūgštis sužadinama (aktyvinama) dalyvaujant ATP molekulei – susidaro tarpinis junginys – aminoacilade-nilatas ir pirofosfatas [102, 231]. Antrosios pakopos metu prie 3-tRNR galo prijungiama amino-rūgštis ir susidaro aminoacil-tRNR bei AMP. Aminoacil-tRNR – tai esteris, kuriame aminorūgšties karboksigrupė sujungta su tRNR 3 galo 2-OH ar 3-OH grupe. Taigi, aminoacil-tRNR susidarymui