LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Laura Rimkienė
LIETUVOS KLIMATO SĄLYGOMIS
AUGINAMŲ DVISKIAUČIŲ
GINKMEDŽIŲ (GINKGO BILOBA L.)
LAPŲ FITOCHEMINĖS SUDĖTIES,
ANTIOKSIDACINIO POVEIKIO IR
EKSTRAKTŲ FUNKCIONALIZAVIMO
TYRIMAS
Daktaro disertacija Medicinos ir sveikatos mokslai,
farmacija (M 003)
Disertacija rengta 2012–2020 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės che-mijos katedroje.
Mokslinis vadovas
prof. dr. Liudas Ivanauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, me-dicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
prof. dr. Loreta Kubilienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, uni-versitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).
Nariai:
prof. dr. Ramunė Morkūnienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003);
prof. dr. Petras Rimantas Venskutonis (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, chemijos inžinerija – T 005);
dr. Milda Pukalskienė (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, chemijos inžinerija – T 005);
prof. dr. Sergiy Ivanovich Kovalenko (Zaporožės valstybinis medicinos universitetas (Ukraina), medicinos ir sveikatos mokslai, farmacija – M 003).
Disertacija ginama viešame Farmacijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. spalio 30 d. 11 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Naujau-sių farmacijos ir sveikatos technologijų centro 204 auditorijoje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Laura Rimkienė
PHYTOCHEMICAL COMPOSITION AND
ANTIOXIDANT EFFECT OF THE LEAVES
OF GINKGO BILOBA L. GROWN IN
LITHUANIAN CLIMATIC CONDITIONS,
AND FUNCTIONALIZATION OF THEIR
EXTRACTS
Doctoral Dissertation Medical and Health Sciences,
Pharmacy (M 003)
Dissertation has been prepared at the Department of Analytical and Toxicolo-gical Chemistry in the Faculty of Pharmacy of Medical Academy of Lithua-nian University of Health Sciences during the period of 2012–2020.
Scientific Supervisor
Prof. Dr. Liudas Ivanauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).
Dissertation is defended at the Pharmacy Research Council of Lithua-nian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Loreta Kubilienė (Lithuanian University of Health Sciences, Me-dical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).
Members:
Prof. Dr. Ramunė Morkūnienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003);
Prof. Dr. Petras Rimantas Venskutonis (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – T 005);
Dr. Milda Pukalskienė (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – T 005);
Prof. Dr. Sergiy Ivanovich Kovalenko (Zaporizhzhia State Medical Uni-versity (Ukraine), Medical and Health Sciences, Pharmacy – M 003).
Dissertation will be defended at the open session of the Pharmacy Research Council of Lithuanian University of Health Sciences on the 30th of October, 2020, at 11 a. m. in the 204 auditorium of Center for the Advanced Pharmaceutical and Health Technologies of Lithuanian University of Health Sciences.
TURINYS
SANTRUMPOS ...7
ĮVADAS ...8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...13
1.1. Ginkmedžių (Ginkgo L.) taksonomija, morfologija, paplitimas, vaistinė augalinė žaliava ...13
1.2. Dviskiaučių ginkmedžių lapų fitocheminės sudėties tyrimai ...14
1.3. Dviskiaučių ginkmedžių lapų veikliųjų junginių nustatymo metodai ...17
1.4. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto biologinis poveikis ...19
1.5. Dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų vartojimas medicinos praktikoje ...20
1.6. Polimerinių plėvelių charakteristikos bei pritaikymo galimybės ...21
1.7. Antioksidantai, antioksidacinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai ...22
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ...27
2.1. Tyrimo objektas ...27
2.2. Tyrimo laikotarpio meteorologinės sąlygos ...28
2.3. Medžiagos ir reagentai ...29
2.4. Tiriamųjų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų paruošimas ...30
2.5. Polimerinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu gamyba ...31
2.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika flavonoidų nustatymui dviskiaučių ginkmedžių lapų mėginiuose ...32
2.7. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika terpeno laktonų nustatymui dviskiaučių ginkmedžių lapų mėginiuose ...33
2.8. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodika ginkolinių rūgščių nustatymui dviskiaučių ginkmedžių lapų mėginiuose ...33
2.9. Dujų chromatografijos metodika ginkolinių rūgščių nustatymui dviskiaučių ginkmedžių lapų mėginiuose ...34
2.10. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ....35
2.11. Natrio karboksimetilceliuliozinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu mechaninių savybių tyrimai ...36
2.12. Natrio karboksimetilceliuliozinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu tirpimo tyrimai in vitro ...36
2.13. Natrio karboksimetilceliuliozinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu stabilumo nustatymas ...37
2.14. Dviskiaučių ginkmedžių lapų biologiškai aktyvių junginių kiekybinės sudėties kitimo tyrimai žaliavos laikymo metu ...37
2.15. Statistiniai duomenų apdorojimo metodai ...38
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...39
3.1. Flavonoidų sudėties tyrimai dviskiaučių ginkmedžių lapuose ...39
3.1.1. Flavonoidų kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas dviskiaučių ginkmedžių lapuose vegetacijos metu ...41 3.2. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo tyrimai 50
3.3. Terpeno laktonų sudėties dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiuose tyrimai ...56
3.3.1. ESC metodikos dviskiaučių ginkmedžių lapų terpeno laktonų kokybinei ir kiekybinei sudėčiai vertinti pritaikymas ir validavimas ...58
3.3.2 Terpeno laktonų kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas dviskiaučių ginkmedžių lapuose vegetacijos metu ...61
3.4. Ginkolinių rūgščių sudėties dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiuose tyrimai ...70
3.4.1. Ginkolinių rūgščių kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimas dviskiaučių ginkmedžių lapuose vegetacijos metu ...72
3.5. Dviskiaučių ginkmedžių lapų žaliavos laikymo trukmės įtakos biologiškai aktyvių junginių kokybinei ir kiekybinei sudėčiai tyrimai ...80
3.6. Natrio karboksimetilceliuliozinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu formavimas ...83
3.6.1. Natrio karboksimetilceliuliozinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu mechaninių savybių tyrimas ...84
3.6.2. Flavonoidų atpalaidavimo ir tirpimo in vitro proceso vertinimas ...85
3.6.3. Natrio karboksimetilceliuliozinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu stabilumo tyrimai ...87
3.7. Rezultatų apibendrinimas ...87
IŠVADOS ...89
SUMMARY ...91
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 111
DISERTACIJOS TEMA PASKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ...122
MOKSLINIŲ KONFERENCIJŲ, KURIOSE BUVO PASKELBTI DISERTACIJOS TYRIMŲ REZULTATAI, SĄRAŠAS ...122
STRAIPSNIŲ KOPIJOS, KURIOSE SKELBIAMI SVARBIAUSI TYRIMŲ REZULTATAI ...124
PRIEDAI ...139
CURRICULUM VITAE ...151
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2’-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
AR – aptikimo riba
C 17:1E – suminis ginkolinių rūgščių kiekis, išreikštas ginkolinės rūgšties
C 17:1 ekvivalentu
CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidacinė galia (angl. cupric ion
reducing antioxidant capacity)
DC – dujų chromatografija
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (angl.
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
ELSD – garinantis šviesos sklaidos detektorius (angl. evaporative light
scattering detector)
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidacinė galia (angl. ferric
reducing antioxidant power)
HTK – hidroterminis koeficientas
IAA – indėlis į antioksidacinį aktyvumą
MS – masių spektrometrija
NR – nustatymo riba
R – koreliacijos koeficientas
R2 – determinacijos koeficientas
S/T – signalo ir bazinės linijos triukšmo santykis (angl. signal to
noise ratio – S/N)
TE – trolokso ekvivalentai
UV – ultravioletiniai spinduliai
VDU – Vytauto Didžiojo universitetas
m.d. – milijoninės dalys (angl. parts per million-ppm)
DGP – dviskiaučių ginkmedžių plėvelė
ORAC – deguonies radikalų absorbcijos galia (angl. oxygen radical
absorbance capacity)
TRAP – antioksidanto sugaudytų radikalų suminis matas (angl. total
radical-trapping antioxidant parameter)
Csa – karštų vasarų viduržemio klimatas su ilga sausa vasara ir
lietinga žiema
Cfa – drėgnas subtropikų klimatas su tvankiomis drėgnomis
vasaromis ir sausesnėmis žiemomis
Csb – šiltų vasarų viduržemio klimatas su ilga sausa vasara ir lietinga
žiema
Dfb – šiltų vasarų vidutinių platumų klimatas su šaltomis žiemomis
ĮVADAS
Oksidacinis stresas ir uždegiminiai procesai dalyvauja neurodegeneraci-nių ligų (įskaitant išsėtinę sklerozę, Alzhaimerio bei Parkinsono ligas) pa-togenezės etapuose [78, 136 ]. Neurodegeneracinių ligų gydymo strategijoje svarbią vietą užima komponentai, pasižymintys priešuždegiminiu ir antioksi-daciniu poveikiais. Tokiais komponentais gali būti ir dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapuose kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai. Dau-gumoje Europos šalių dviskiaučių ginkmedžių preparatai plačiai vartojami simptominiam kognityvinių sutrikimų gydymui pacientams, sergantiems lengva ir vidutine demencija [44, 63, 159]. Įvairios mokslininkų grupės tiria šio augalo biologiškai aktyvių junginių farmakologinį aktyvumą in vivo ir in vitro [113, 186].
Augalinių preparatų kokybė, efektyvumas bei saugumas priklauso nuo naudojamų žaliavų kokybės [101]. Vaistinių augalinių žaliavų kokybės kontrolė yra būtina norint užtikrinti saugų šių produktų vartojimą. Vaistinės augalinės žaliavos kokybę lemia biologiškai aktyvių junginių kokybiniai ir kiekybiniai rodikliai, tinkamos vaistinių augalų auginimo technologijos, tinkamas žaliavos surinkimas, džiovinimas, smulkinimas bei laikymo sąly-gos [19, 67]. Augavietės dėl joms būdingo cheminio heterogeniškumo gali sąlygoti ženklų augalinių žaliavų kokybę apibūdinančių rodiklių įvairavimą [142]. Natūralioms augavietėms būdingas cheminis polimorfizmas, o plan-tacijose kultivuojamų augalų vaistinė žaliava yra aukštesnės kokybės, tokių augalų fitocheminė sudėtis yra homogeniškesnė [21, 142]. Kultivuojant auga-lus galima atlikti biologiškai aktyvių junginių kiekio bei biologinio poveikio aktyvumo tyrimus, standartizuoti auginimo sąlygas.
Svarbu vykdyti Lietuvoje introdukuotų augalų cheminės įvairovės tyri-mus, nes apie šių augalų prisitaikymą prie Lietuvos gamtinių sąlygų, bendrą paplitimą šalyje bei biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus to-kių augalų vaistinėse augalinėse žaliavose duomenų nėra arba jų pateikiama labai mažai. Atlikti tyrimai papildytų ir patikslintų turimas žinias apie Lietu-vos klimato sąlygomis introdukuotų dviskiaučių ginkmedžių lapų biologiš-kai aktyvių junginių kiekius, jų variacijas priklausomai nuo rinkimo laiko ir vietos.
Įvertinus dviskiaučių ginkmedžių vaistinės augalinės žaliavos kokybę api-būdinančius parametrus tikslinga plėsti farmacijos rinkoje esantį dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų asortimentą. Didžiausią dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų dalį sudaro kapsulės arba tabletės, tačiau toks preparatų var-tojimo būdas turi nemažai trūkumų: mažesnis biologinis prieinamumas, virš-kinamojo trakto dirginimas, problematiškas vartojimas esant rijimo
sutriki-mams [152]. Polimerinės plėvelės patogiai ir lengvai vartojama vaisto forma, kurią sudaro labai plona ant liežuvio arba po juo padėta juostelė, ištirpstanti greičiau nei per minutę [27]. Toks veikliųjų junginių vartojimo būdas turi daug pranašumų, lyginant su kapsulių / tablečių vartojimu: didesnis biologi-nis prieinamumas, tikslesbiologi-nis dozavimas, mažiau burnos diskomforto atvejų, mažesnė vaistų sąveikos galimybė, kai tuo pačiu metu vartojami keli vaistai [5, 70]. Polimerinės plėvelės dėl savo lankstumo, mažo dydžio, storio bei pui-kaus prisitaikymo prie gleivinės yra tinkamos vartoti pediatrinių ir geriatrinių pacientų grupėse [137, 151].
Augalinių žaliavų tyrimų tikslas yra validuotų, jautrių ir atrankių analitinių metodikų eksperimentinė plėtra ir diegimas. Vaistinių augalinių žaliavų bei iš jų gaminamų fitopreparatų kokybė privalo būti įvertinta pagal naujausius tarptautinius standartus ir Europos Sąjungos norminių dokumentų reikalavi-mus atitinkančias metodikas. Svarbiausias jų uždavinys yra nustatyti auga-linėje žaliavoje besikaupiančių veikliųjų junginių kokybinius ir kiekybinius rodiklius, būtinus standartizuojant žaliavą. Metodikų kūrimas komplikuotų mėginių tyrimams bei biologiškai aktyvių junginių išskyrimui ir jų identifi-kavimui yra vienas svarbiausių šiuolaikinio mokslo uždavinių [74]. Vystant ir plėtojant naujas analizės metodikas sąlygų parinkimas yra reikšmingas me-todikų vystymo ir optimizavimo žingsnis, padedantis atrankiai ir tiksliai įver-tinti biologiškai aktyvių junginių sudėties kokybinius ir kiekybinius rodiklius [172].
Darbo tikslas. Ištirti Lietuvos klimato sąlygomis auginamų dviskiaučių
ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų biologiškai aktyvių junginių sudėtį, jų įvairavimą vegetacijos metu, nustatyti lapų ekstraktų antioksidacinį poveikį in vitro bei suformuoti polimerinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu prototipą.
Uždaviniai:
1. Išvystyti ir pritaikyti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) bei mėginių paruošimo metodikas terpeno laktonų kokybinei ir kiekybinei sudėčiai nustatyti dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiuose.
2. Ištirti Lietuvos botanikos soduose ir privačiose kolekcijose auginamų dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių flavonoidų, terpeno laktonų, gin-kolinių rūgščių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei nustatyti kaupimosi dėsningumus vegetacijos metu.
3. Atlikti dviskiaučių ginkmedžių lapuose besikaupiančių flavonoidų an-tioksidacinio aktyvumo tyrimus taikant ESC-CUPRAC ir ESC-ABTS pokolonėlinės reakcijos metodus.
4. Nustatyti dviskiaučių ginkmedžių lapuose esančių flavonoidų, terpeno laktonų bei ginkolinių rūgščių kiekybinės sudėties kitimus žaliavos lai-kymo metu.
5. Suformuoti peroraliniam vartojimui skirtas polimerines plėveles su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu bei atlikti pagamintų plėvelių kokybės kontrolės tyrimus.
Mokslinio darbo naujumas
Terpeno laktonams identifikuoti dviskiaučių ginkmedžių lapuose išvys-tyta bei pritaikyta ESC metodika, pagal kurią galima atlikti efektyvų terpe-no laktonų komplekso išskirstymą, kokybinę bei kiekybinę analizę. Terpeterpe-no laktonų dviskiaučių ginkmedžių lapuose tyrimuose pritaikytas garinantysis šviesos sklaidos detektorius (ELSD) bei pasiūlytas naujas terpeno laktonų mėginių paruošimo sprendimas, kuris leidžia optimizuoti rutininį mėginių paruošimo etapą.
Pirmą kartą atliktas išsamus Lietuvos botanikos soduose ir privačiose ko-lekcijose auginamų dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių fitocheminės sudė-ties charakterizavimas, identifikuoti bioaktyviųjų junginių profilių žymenys bei nustatyti veikliųjų junginių kaupimosi dėsningumai vegetacijos metu. Dviskiaučių ginkmedžių lapuose esančių biologiškai aktyvių junginių kieky-binės sudėties kitimo augalo vegetacijos periodu tyrimai papildė ir patikslino turimas žinias apie Dfb klimato juostoje introdukuotų augalų biologiškai ak-tyvių junginių kaupimosi dėsningumus.
Atlikti dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių ekstraktų antioksidacinio ak-tyvumo tyrimai ESC-ABTS ir ESC-CUPRAC pokolonėliniais metodais. Nu-statytos dviskiaučių ginkmedžių lapuose kaupiamų kvercetino, kemferolio ir izoramnetino darinių antiradikalinės ir redukcinės savybės. Pirmą kartą, mo-difikuojant CUPRAC reagento tėkmės greitį, reakcijos kilpos ilgį bei reakci-jos temperatūrą, atliktas tinkamiausių ESC-CUPRAC pokolonėlinio metodo sąlygų parinkimas.
Atlikti Lietuvoje auginamų dviskiaučių ginkmedžių lapuose kaupiamų fla-vonoidų, terpeno laktonų bei ginkolinių rūgščių analitinių žymenų stabilumo tyrimai, apimantys veikliųjų junginių kiekio kitimo stebėjimą žaliavos laiky-mo metu.
Bendradarbiaujant su Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Vaistų tech-nologijos ir socialinės farmacijos katedros mokslininkais, pagamintos natrio karboksimetilceliuliozinės plėveles su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrak-tu. Atliktas flavonoidų atpalaidavimo iš plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu nustatymas bei plėvelių mechaninių savybių tyrimai. Tokio pobūdžio tyrimai yra naudingi ir aktualūs tolimesniam dviskiaučių
ginkme-džių lapų ekstraktų farmacinių formų technologiniam funkcionalizavimui ir preparatų asortimento plėtimui.
Praktinė ir teorinė reikšmė
Išvystyta ir pritaikyta ESC-ELSD metodika, leidžianti tiksliai ir atkarto-jamai atlikti ginkolidų C, A, B ir bilobalido kiekybinį įvertinimą dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiuose. Gautos validacijos parametrų skaitinės reikšmės patvirtino metodikos tinkamumą dviskiaučių ginkmedžių vaistinės augalinės žaliavos bei iš jos pagamintų farmacinių preparatų terpeno laktonų kokybinių bei kiekybinių charakteristikų įvertinimui.
Gauti duomenys apie Dfb klimato juostoje auginamų dviskiaučių ginkme-džių lapų cheminės sudėties skirtumus yra aktualūs vertinant introdukuotų augalų aklimatizaciją besikeičiančio klimato plotmėje. Gauti tyrimų rezul-tatai patikslina dviskiaučių ginkmedžių vaistinės augalinės žaliavos rinkimo rekomendacijas bei suteikia informacijos apie kryptingą augalų plantacijų formavimą.
Išsamiam dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinio akty-vumo įvertinimui pritaikyti skirtingais veikimo mechanizmais pasižymintys ESC-CUPRAC ir ESC-ABTS pokolonėliniai metodai. Tyrimų metu nusta-tyti pagrindiniai antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo žymenys, kurie gali būti naudojami antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių vaistinių augalinių žaliavų ir (arba) fitopreparatų kokybės kontrolei. Išvystytas ESC-CUPRAC pokolonėlinis metodas yra efektyvus įrankis dviskiaučių ginkmedžių vaisti-nės augalivaisti-nės žaliavos ir fitopreparatų antioksidantų sudėties pasiskirstymo, stabilumo bei antioksidacinio aktyvumo tyrimams, užtikrinant išsamią jų ko-kybės kontrolę.
Atlikti veikliųjų junginių stabilumo žaliavoje tyrimai parodė, kad flavo-noidų, terpeno laktonų ir ginkolinių rūgščių kiekis dviskiaučių ginkmedžių vaistinėje augalinėje žaliavoje išlieka stabilus žaliavą laikant 12 mėnesių. To-kio pobūdžio tyrimai yra labai aktualūs siekiant apibrėžti žaliavos laikymo sąlygas ir tinkamumo laiką bei parodo analitinių rodiklių išlikimą konkrečio-se ribokonkrečio-se, užtikrinančiokonkrečio-se preparato saugumą ir efektyvumą.
Pagamintos natrio karboksimetilceliuliozinės plėvelės su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu, įvertintos jų mechaninės savybės bei veikliųjų junginių tirpimas in vitro. Stabilumo tyrimai atlikti 25 ± 2 °C temperatūroje, 60 ± 5 proc. santykinėje drėgmėje ir 40 ± 2 °C temperatūroje, 75 ± 5 proc. santykinėje drėgmėje. Pagamintos natrio karboksimetilceliuliozinės plėvelės su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu, atsižvelgiant į veikliųjų junginių (flavonoidų) kiekį farmacinėje formoje, 6 mėn. išliko stabilios ilgalaikio ir pagreitinto stabilumo tyrimo sąlygomis. Ši informacija yra aktuali siekiant nustatyti produkto tinkamumo laiką. Atsižvelgiant į atliktų tyrimų rezultatus
galima teigti, kad dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktą galima funkcionali-zuoti į polimerinių plėvelių sudėtį, kurios gali būti naudojamos tolimesniam inovatyvių ir patentabilių technologijų ir produktų vystymui.
Darbo rezultatų aprobavimas
Tyrimų rezultatai pristatyti 8 mokslinėse konferencijose: 4th international
conference on pharmaceutical sciences and pharmacy practice dedicated to the 75th anniversary of Lithuanian Pharmacopoeia (2013 m. lapkričio 23 d.,
Kaunas, Lietuva); Young Scientists Meeting „Trends in Natural Products Re-search“ (2014 m. birželio 23–25 d., Olomoucas, Čekijos Respublika); 8th
In-ternational Scientific Conference „The Vital Nature Sign“ (2014 m. gegužės 28 d., Kaunas, Lietuva); 14th International Conference Scientific and
Prac-tical Conference of Young Scientists and Students „Topical issues of new drugs development“ (2017 m. balandžio 20 d., Charkovas, Ukraina); 75th FIP
World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences „Better practice – Science based, evidence drive“ (2015 m. rugsėjo 29 d.–spalio 3 d., Diusel-dorfas, Vokietija); 11th Baltic Conference on Food Science and
Technolo-gy FOODBALT-2017 „Food science and technoloTechnolo-gy in a changing world“ (2017 m. balandžio 27–28 d., Jelgava, Latvija); 16th International Conference
Scientific and Practical Conference of Young Scientists and Students „To-pical issues of new medicines development“ (2017 m. balandžio 10–12 d., Charkovas, Ukraina); 79th FIP World Congress of Pharmacy and
Pharmaceu-tical Sciences „New horizons for pharmacy – Navigating winds of change“ (2019 m. rugsėjo 22–26 d. Abu Dabis, Jungtiniai Arabų Emyratai). Tyrimų tematika paskelbtos 2 mokslinės publikacijos, išspausdintos tarptautiniuose mokslo leidiniuose, turinčiuose cituojamumo rodiklį Clarivate Analytics Web of Science (CA WoS) duomenų bazėje.
Darbo apimtis ir struktūra
Disertacija parašyta lietuvių kalba. Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apžvalga, tyrimo objektas ir metodai, rezultatai ir jų aptarimas, išvados, li-teratūros sąrašas (panaudoti 196 šaltiniai), disertacijos tema paskelbtų publi-kacijų sąrašas, mokslinių publipubli-kacijų disertacijos tema kopijos, santrauka (anglų k.), gyvenimo aprašymas. Darbe pateiktos 23 lentelės ir 28 paveikslai. Disertacijos apimtis 152 puslapiai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Ginkmedžių (Ginkgo L.) taksonomija, morfologija, paplitimas, vaistinė augalinė žaliava
Dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.) – vienintelė ginkūnų (Ginkgophyta) skyriaus, ginkmedainių (Ginkgoopsida) klasės, ginkmedinių ( Ginkgoaceae) šeimos, ginkmedžio genties (Ginkgo) rūšis [13, 125].
Domenas – eukarijai (Eukarya) Karalystė – augalai (Plantae)
Pokaralystė – žalieji augalai (Viridaeplantae) Skyrius – induočiai (Tracheophyta)
Poskyris – sėkliniai induočiai (Spermatophytina) Klasė – ginkmedainiai (ginkgoopsida)
Eilė – ginkmediečiai (Ginkgoales) Šeima – ginkmediniai (Ginkgoaceae) Gentis – ginkmedis (Ginkgo L.)
Rūšis – dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.)
Dviskiautis ginkmedis yra dvinamis, vasarą žaliuojantis lapuotis medis. Medžių aukštis varijuoja nuo 20 m iki 40 m [79]. Jaunų medžių laja pira-midės formos, senesnių – plačiai išsikerojusi, nusvirusiomis šakomis. Lapai dviskiaučiai, ilgakočiai, vėduoklės formos. Lapo viršutinė pusė yra tamsesnė už apatinę, lapalakščio ilgis varijuoja nuo 4 iki 9 cm. Viršutinis ir apatinis lapo paviršiai glotnūs, distaliniai kraštai nevienodu laipsniu netaisyklingomis skiltimis įpjauti, šoniniai lapo kraštai yra ištisi, siaurėjantys pagrindo link. Lapams būdingas primityvus, dichotominis gyslotumas [50, 92]. Vyriškieji individai nuo moteriškųjų skiriasi medžio lajomis. Vyriškosios lyties indi-vidai yra siauromis lajomis, kuriuose lapai yra padalinti į dvi dalis. Mote-riškosios lyties individų lajos nedidelio aukščio, žemai ant stiebo ir plačiai išsikerojusiomis laužytomis šakomis, lapai vientisiniai. Dviskiautis ginkme-dis lytiškai subręsta ir subrandina vaisius apie 20–30 gyvavimo metus, tik tuomet tiksliai yra nustatoma medžio lytis. Vaisius subrandina tik moteriš-kosios lyties individai. Dviskiaučių ginkmedžių vaisius – gintarinės spalvos, specifinio kvapo, 2–3 cm ilgio ir apie 3 cm skersmens tribriaunis kaulavaisis, panašus į slyvą [40, 165].
Tėvyne laikoma Rytų Kinija, Japonija ir Korėja. Šiuo metu savaime au-gančių dviskiaučių ginkmedžių aptinkama labai retai, dviskiaučių ginkme-džių medžiai savaime auga tik Pietryčių Kinijos kalnuose. Vaistinei augalinei žaliavai ruošti dviskiaučiai ginkmedžiai auginami didelėmis plantacijomis. Didžiausios plantacijos įkurtos Tolimuosiuose Rytuose, Pietų Karolinoje,
Kinijoje, Vokietijoje, Prancūzijoje, Naujojoje Zelandijoje, Argentinoje [125, 165]. Dviskiaučiai ginkmedž iai Lietuvoje natūraliai neauga, bet yra kultivuo-jami VDU Kauno botanikos sode, Dubravos miškų tyrimo stoties arboretume (Kauno raj.), Obelynėje (Kauno raj.), Šiaulių bei Klaipėdos universitetų bota-nikos soduose bei privačių asmenų kolekcijose [91]. Literatūros duomenimis, Lietuvoje stambiausias, aukščiausias ir seniausias ginkmedis auga Švėkšnos dvaro parke (Šilutės raj.). 1991 m. atliktais dendrologiniais tyrimais nustaty-ta, kad šio medžio amžius yra 125 m., aukštis – 18 m, skersmuo – 0,7 metro [14, 81].
Dviskiaučių ginkmedžių lapai kaip vaistinė augalinė žaliava aprašyta dau-gelio šalių farmakopėjose: Kinijos, JAV, Europos, Didžiosios Britanijos [18, 33, 55, 173]. Dviskiaučių ginkmedžių lapai JAV yra renkami liepos mėnesį, Kinijoje – rugpjūčio, o Prancūzijoje – rugsėjo / spalio mėnesiais. Vaistinė augalinė žaliava nurodytais mėnesiais renkama dėl didžiausios veikliųjų jun-ginių koncentracijos ir (arba) mažiausios žalos individui, kurią sukelia lapų skynimas [157]. Skiriamos keturios dviskiaučių ginkmedžių lapuose esančių flavonoidų kiekybinės sudėties kitimo tendencijos vegetacijos metu: pirma – didžiausias flavonoidų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapuose sukaupiamas rudenį (rugsėjo–spalio mėn.) ir pavasarį (gegužės mėn.), o mažiausias – va-sarą (liepos mėn.). Antra – flavonoidų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapuose tolygiai didėja nuo gegužės iki spalio mėn. Trečia – literatūroje nurodoma, kad didžiausias flavonoidų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapuose sukau-piamas ankstyvą pavasarį (balandžio mėn.) ir vasaros pabaigoje (rugpjūčio mėn.). Ketvirta – vieningos flavonoidų kiekio kitimo tendencijos dviskiaučių ginkmedžių lapuose nėra [32, 52, 53, 93, 192].
1.2. Dviskiaučių ginkmedžių lapų fitocheminės sudėties tyrimai
Moksliniais tyrimais nustatyta, kad ginkmedžių lapuose kaupiami šie bio-logiškai aktyvūs junginiai [7, 134]:
1. flavonoidai: flavonai, flavononai, flavonoliai, flavan-3-oliai, izoflavo-nai, antocianiizoflavo-nai, biflavonoidai;
2. terpenoidai: monoterpenai, diterpenai, seskviterpenai, fitosteroliai, ste-roidai, karotenoidai, poliprenoliai;
3. alkilfenoliai ir alkilfenolinės rūgštys; 4. kardanoliai;
5. kardoliai;
6. organinės rūgštys;
Dviskiaučių ginkmedžių lapuose identifikuota virš trisdešimt skirtingų fla-vonoidų. Svarbiausi dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto flavonoidai pri-klauso flavonolių (kvercetinas, kemferolis, izoramnetinas, miricetinas bei jų glikozidai: rutinas, kvercitrinas, hiperozidas, astragalinas), flavonų (apigeni-nas ir liuteoli(apigeni-nas) bei proantocianidinų (procianidi(apigeni-nas B1, procianidi(apigeni-nas B3) klasėms [26, 140]. Kita flavonoidų klasė, nustatoma ginkmedžių lapuose – biflavonoidai: ginkgetinas, izoginkgetinas, amentoflavonas, bilobetinas, sci-adopitisinas [41]. Skirtingi autoriai nurodo, kad flavonoidų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapuose varijuoja nuo 0,5 iki 2,0 proc. [54, 187]. Pagal Europos farmakopėjos reikalavimus kiekybiškai įvertintame sausajame dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte flavonoidų kiekis turi būti 22–27 proc., o lapuose ne mažiau kaip 0,5 proc. [55].
Dviskiaučių ginkmedžių lapuose daugiausia nustatyta diterpenų (ginkoli-dų A, B, C ir J) ir seskviterpenų (bilobalido). Identifikuoti ir mažesni kiekiai triterpenų ir sterolių (kampesterolis, stigmasterolis, β-sitosterolis) [181]. Ter-peno laktonų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapuose varijuoja nuo 0,02 proc. iki 0,2 proc. Pagal Europos farmakopėjos reikalavimus kiekybiškai įvertin-tame sausajame dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte terpeno laktonų turi būti: bilobalido 2,6–3,2 proc., ginkolidų A, B, C suma 2,8–3,4 proc., o la-puose terpeno laktonų kiekis nereglamentuojamas [55]. JAV farmakopėjoje nurodoma, kad dviskiaučių ginkmedžių lapuose terpeno laktonų (bilobalido ir ginkolidų A, B, C) suma turi būti ne mažiau kaip 0,1 proc. (skaičiuojant sausai medžiagai) [173].
Dviskiaučių ginkmedžių lapuose nustatomi dideli ginkolinių rūgščių kiekiai: 0,5–4,82 proc. [34, 158, 177]. Europos vaistų agentūra dviskiaučių ginkmedžių lapų monografijoje nurodo, kad alkilfenolių ir alkilfenolinių rūgš-čių vaistinėje augalinėje žaliavoje turi būti apie 0,1 proc. [54]. Europos farma-kopėja ginkolinių rūgščių kiekio dviskiaučių ginkmedžių vaistinėje augalinė-je žaliavoaugalinė-je nereglamentuoja [55]. Europos ir JAV farmakopėjose nurodoma, kad ginkolinių rūgščių kiekis kiekybiškai įvertintame sausajame dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte neturi viršyti 5 m.d. (5 mg/kg, 0,005 mg/g arba ne daugiau kaip 0,0005 proc.) ribos [55, 173]. Kinijos farmakopėjoje nurodomas leistinas ginkolinių rūgščių kiekis ekstrakte yra iki 10 m.d. [33]. Ginkolinės rūgštys pasižymi toksinėmis savybėmis, todėl iš ekstraktų dažniausiai yra pa-šalinamos gamybos proceso metu ir sudaro labai mažą procentą ekstraktuose esančių junginių [184].
Antrinių metabolitų kaupimasis dviskiaučių ginkmedžių lapuose priklauso nuo vidinių (amžiaus, lyties) ir išorinių (fotosintezės intensyvumo, dirvože-mio, klimato sąlygų: aplinkos temperatūros ir drėgmės kiekio) veiksnių [32, 56, 87, 95, 121, 133, 191, 193]. Cheng ir kt. teigimu, flavonoidų kiekis ma-žėja su individo amžiumi, kuo medis senesnis, tuo mažiau lapuose
sukaupia-ma flavonoidų, didžiausias flavonoidų kiekis nustatosukaupia-mas 3–5 metų amžiaus dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiuose [31, 32]. Kitų mokslininkų teigimu, ne tik flavonoidų, bet ir terpeno laktonų kiekis jaunesnių dviskiaučių ginkme-džių lapų ėminiuose yra didesnis, lyginant su senesnių individų lapų ėminiais [45, 191]. Skirtingi autoriai taip pat nurodo, kad vyriškos lyties dviskiau-čių ginkmedžių individai sukaupia didesnį kiekį biologiškai aktyvių junginių (flavonoidų ir terpeno laktonų), lyginant su moteriškos lyties individais [131, 191].
Didžioji dalis dviskiaučių ginkmedžių lapų fitocheminės sudėties tyrimų yra atlikta su Csa, Csb ir Cfa klimato juostose auginamais individais [45, 99, 191, 117, 154, 188]. C klimato kategorijai būdingos karštos vasaros ir švelnios žiemos. Literatūroje trūksta duomenų apie D klimato juostoje augi-namų dviskiaučių ginkmedžių lapuose kaupiamų veikliųjų junginių kaupimo-si ypatumus. D klimato kategorijai būdingos šiltos vasaros ir šaltos žiemos, vyrauja ryškus kontrastas tarp žiemos ir vasaros [99]. Karštos vasaros bei šaltos žiemos turi didelį neigiamą poveikį medžio augimui ir lajos formavi-muisi. Apžvelgus mokslinės literatūros šaltiniuose pateikiamus atliktus pa-našaus pobūdžio plikasėklių augalų tyrimus galima teigti, kad skirtinguose geografiniuose regionuose ir skirtingo tipo augavietėse auginamos tos pačios plikasėklių medžių rūšys skirtingai reaguoja į temperatūros ir kritulių kiekio pokyčius [21, 56]. Kritulių poveikis yra lemiamas veiksnys tose geografi-nėse vietovėse, kur vyrauja aukšta vidutine oro temperatūra, o tose klima-to vieklima-tovėse, kur vyrauja šalklima-tos sąlygos, dominuoja vegetacijos laikotarpio temperatūros įtaka [56, 130]. Nustatyta, kad medžių augimo reakcija į oro temperatūrą taip pat priklauso nuo geografinės padėties. Šiaurės platumų me-džių augimą labiausiai lemia vasaros mėnesių temperatūra, bet įtakos turi ir viso vegetacijos laikotarpio temperatūra, o pietinių platumų medžių augimą labiausiai limituojantis veiksnys yra krituliai bei jų kiekis [90, 130]. Nors plikasėklių medžių augimo reakcija į oro temperatūros ir kritulių kiekio po-kyčius yra skirtinga įvairiuose geografiniuose regionuose, pastebimi ir bendri augimo tendencijų bruožai, leidžiantys teigti, kad yra atskiroms teritorijoms bendrų medžių augimą ribojančių ir jam palankių klimato veiksnių.
Lietuvoje auginamų dviskiaučių ginkmedžių lapų cheminė sudėtis mažai tirta. Literatūros duomenimis, Lietuvoje auginamų dviskiaučių ginkmedžių lapų sudėties tyrimai atlikti tik su VDU Kauno botanikos sode auginamo individo vaistine augaline žaliava [122]. Tyrimo metu įvertintas antioksi-dacinis aktyvumas, fenolinių junginių sudėtis ir suminis flavonoidų kiekis, sukauptas dviskiaučių ginkmedžių lapuose vegetacijos metu. Tyrimo metu ginkmedžių lapuose didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti rugpjūčio mėn. (5990 mg rutino ekvivalento/100 g) [122]. M. Ellnain-Wojtaszek ir kt. tyrė dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą,
kieky-binės flavonoidų bei fenolinių rūgščių sudėties skirtumus lapų ėminiuose, rinktuose skirtingu vegetacijos laikotarpiu [52, 53]. Ellnain-Wojtaszek ir kt. nustatė, kad Dfb klimato juostoje auginamų dviskiaučių ginkmedžių lapuose didžiausi flavonoidų kiekiai sukaupiami rugpjūčio mėnesį (1,05 proc.) [52, 53, 99]. Kitos lenkų mokslininkų grupės teigimu, Dfb klimato juostoje augi-namų dviskiaučių ginkmedžių lapai turėtų būti renkami spalio mėn. [93, 99].
Teoriniu bei praktiniu požiūriu antrinių metabolitų tyrimai dviskiaučių ginkmedžių vaistinėje augalinėje žaliavoje išlieka perspektyvūs. Tikslinga at-likti išsamius Dfb klimato juostoje auginamų ginkmedžių lapų fitocheminės sudėties tyrimus bei įvertinti veikliųjų junginių kiekio kitimus priklausomai nuo sezoniškumo, augavietės bei klimato sąlygų [99]. Gauti duomenys pa-pildytų bei patikslintų jau turimas mokslines žinias apie introdukuotų augalų prisitaikymą augti įvairiomis klimato sąlygomis.
1.3. Dviskiaučių ginkmedžių lapų veikliųjų junginių nustatymo metodai
Klasikiniai ir dažniausiai literatūroje aprašomi dviskiaučių ginkmedžių lapų sudėtyje esančių flavonoidų atskyrimo ir identifikavimo metodai yra efektyvioji skysčių ir plonasluoksnė chromatografija [47, 109]. Rečiau nau-dojama kapiliarinė elektroforezė [22], dujų chromatografija [42] ar branduo-lių magnetinio rezonanso spektroskopija [126]. Dėl tikslumo ir efektyvumo skirstant daugiakomponenčius mišinius rutininiams dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose esančių flavonoidų tyrimams taikomas ESC metodas su fiksuoto šviesos bangos ilgio ar fotodiodų matricos detektoriais. Išskirsty-tų junginių detekcija atliekama prie 370 nm šviesos bangos ilgio [22, 109]. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose esantys flavonoidai taip pat gali būti nustatomi plonasluoksnės chromatografijos metodu. Šis metodas JAV ir Europos farmakopėjų monografijose pateikiamas kaip metodas, įvertinantis dviskiaučių flavonoidų kokybinę sudėtį dviskiaučių ginkmedžių lapuose [55, 173]. Plonasluoksnė chromatografija dažniausiai taikoma ,,piršto atspaudų“ analizei norint greitai įvertinti dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų flavo-noidų kokybinę sudėtį [46].
Literatūros duomenimis, dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose nusta-tyta daugiau kaip trisdešimt skirtingų flavonoidų glikozidų, kurių aglikonai dažniausiai yra kemferolis, kvercetinas, izoramnetinas, rutinas, liuteolinas [26, 140, 150]. Išskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti flavonoidus gin-kmedžių lapų ekstraktuose ESC metodu yra sudėtinga dėl pamatinių medžia-gų trūkumo rinkoje. Siekiant efektyviai išskirstyti bei identifikuoti dviskiau-čių ginkmedžių lapų ekstraktuose esančius flavonoidus, mėginių paruošimo procese yra taikoma rūgštinė hidrolizė. Rūgštinės hidrolizės metu hidroliza-vus glikozidus, lapų ekstraktuose nustatomi trys pagrindiniai aglikonai:
kver-cetinas, kemferolis ir izoramnetinas [104]. Dviskiaučių ginkmedžių lapuo-se esantiems flavonoidams identifikuoti po hidrolizės galima taikyti ir dujų chromatografiją su masių spektrometriniu detektoriumi [42]. Norint identifi-kuoti flavonoidus DC-MS metodu prieš analizę svarbu juos paversti lakiais bei termiškai stabiliais dariniais atliekant alkilinimo, sililinimo ar acilinimo procedūras [177].
Terpeno laktonams atskyrimui ir identifikavimui gali būti taikomi šie meto-dai: dujų chromatografija su masių spektrometriniu arba liepsnos jonizacijos detektoriumi, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, efektyvioji skysčių chromatografija su įvairiais detekcijos būdais [86], rečiau taikoma plonasluoksnė chromatografija [177]. Ilgą laiką terpeno laktonams aptikti naudotas ultravioletinės spinduliuotės detektorius, tačiau terpeno laktonuo-se esančios chromoforinės grupės pasižymi silpna absorbcija 200–220 nm šviesos bangos ilgio diapazone [51]. Analizuojant terpeno laktonus šiuo de-tektoriumi chromatogramoje smailės būna su absorbcijos pėdsakais junginių, likusių dalinai išvalytame ekstrakte. Vienas iš naujausių ir sparčiai populia-rėjančių ginkolidų ir bilobalidų nustatymo metodų yra efektyvioji skysčių chromatografija su garinančiu šviesos sklaidos detektoriumi [179]. Tyrimams naudojant garinantį šviesos sklaidos detektorių bazinė linija stabilesnė, me-todas jautresnis (nanogramų tikslumu), reikalingas mažesnis tiriamo mėginio tūris [86]. Terpeno laktonų identifikavimo procese naudojamo refraktometri-nio detektoriaus jautrumas mažas, reikalingas didelis koncentruoto tiriamo mėginio tūris, todėl analičių chromatografinis atskyrimas tampa ypač komp-likuotas, suprastėja atskyrimo efektyvumas, rezultatų tikslumas [29].
Analizuojant dviskiaučių ginkmedžių augalinius ekstraktus, terpeno lak-tonų kokybinis ir kiekybinis nustatymas komplikuotas dėl didelio flavonoidų kiekio mėginiuose. Pagrindine terpeno laktonų nustatymo problema išlieka pirminių ekstraktų valymas nuo flavonoidų bei kitų junginių, kurie kompli-kuoja terpeno laktonų išskyrimą ir aptikimą [47]. Mokslininkai, siekdami iš-vengti šios problemos, identifikuodami dviskiaučių ginkmedžių kaupiamus terpeno laktonus pirmiausia mėginius išvalo naudodami kolonėles, užpildytas silikageliu ar kizelguru, ir tuomet juos identifikuoja [169, 177, 189]. Europos farmakopėjoje reglamentuotas terpeno laktonų kiekio nustatymas kiekybiš-kai įvertintame sausajame dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte atliekamas naudojant mėginio valymo kizelguru etapą [55]. Toks tiriamųjų mėginių pa-ruošimo būdas reikalauja daug sąnaudų ir trunka daug laiko. Ruošiant mėgi-nius siekiama, kad mėginio paruošimo procedūra susidarytų iš kuo mažiau etapų, nes kiekvienas analitės paruošimo žingsnis padidina galimų klai-dų riziką bei sumažina metodo atkartojamumą. Fitocheminėje dviskiaučių ginkmedžių lapų terpeno laktonų analizėje reikalingi nauji mėginių
paruoši-mo sprendimai, kurie pagreitintų ir leistų atlikti tikslesnę komplikuotos sudė-ties fitopreparatų analizę.
Dviskiaučių ginkmedžių lapuose nustatomų ginkolinių rūgščių išskyrimas ir nustatymas dažniausiai atliekamas naudojant ESC-UV metodą [127]. Šis ginkolinių rūgščių identifikavimo metodas sukritikuotas dėl mažo selektyvu-mo ir ilgo skirstyselektyvu-mo laiko, tačiau selektyvu-mokslinėse laboratorijose ESC-UV meto-das ir toliau išlieka rutininiu ginkolinių rūgščių nustatymo metodu [57, 178]. DC-MS yra ginkolinių rūgščių identifikavimo metodas, leidžiantis jas iden-tifikuoti mišiniuose. Šis metodas perspektyvus, kai siekiama nustatyti mažų koncentracijų junginius. Dujų chromatografija yra naudojama lakiesiems or-ganiniams junginiams atskirti, todėl prieš ginkolinių rūgščių nustatymą šiuo metodu reikalinga atlikti mėginių derivatizaciją, kurios metu junginys yra chemiškai modifikuojamas [185]. Rečiau naudojamas ginkolinių rūgščių nu-statymo metodas yra branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, tačiau šio metodo taikymas yra ribojamas dėl brangaus eksploatavimo rutininei ana-lizei [34, 69].
1.4 . Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto biologinis poveikis
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto biologinį poveikį lemia sinergisti-nis lapų sudėtyje esančių flavonoidų ir terpeno laktonų veikimas [1, 26].
Antioksidacinis dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis sieja-mas su flavonoidų kompleksu . Klinikiniais tyrimais įrodyta, kad dviskiaučių ginkmedžių lapų sudėtyje esantys flavonoidai sujungdami laisvuosius radi-kalus pašalina žalingą jų poveikį ląstelių membranoms [134]. Kvercetino, kemferolio aglikonai geba sujungti O2•, •OH, ONOO•, NO• radikalus, slopina
jų gamybą, skatina antioksidacinių baltymų (feritino, transferino, laktoferi-no) sintezę bei slopina fermentų (katalazės, glutationo peroksidazės,laktato dehidrogenazės), dalyvaujančių aktyviųjų deguonies formų susidaryme, ak-tyvumą [59].
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto vartojimas pagerina kraujo cir-kuliaciją smegenyse ir periferinėje kraujotakoje, sumažina ritmo sutrikimus po išemijos, padeda išvengti insulto ir (arba) infarkto [94, 169]. Ginkolidai, veikdami kaip trombocitus aktyvuojančio faktoriaus antagonistai, slopina trombocitų agregaciją, didina eritrocitų atsparumą bei palengvina kraujo te-kėjimą [115].
Neuroprotekcinis (atmintį gerinantis, dėmesio koncentraciją didinantis) dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto poveikis siejamas su veikliųjų jungi-nių antioksidacinėmis bei kraujo cirkuliaciją gerinančiomis savybėmis [1]. Flavonoidai veikdami kaip antioksidantai šalina laisvuosius radikalus bei slopina ląstelių membranų lipidų superoksidaciją. Ginkolidai gerina
mikro-cirkuliaciją galvos smegenyse, skatina neuronų regeneraciją esant įvairiems smegenų pažeidimams. Išsiplėtusiomis kraujagyslėmis audinius lengviau pa-siekia deguonis ir maistingosios medžiagos, ko pasėkoje pagerėja smegenų funkcija bei protinis aktyvumas.
Tyrimais in vivo įrodytas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto vartojimo efektyvumas tam tikrų vėžio formų gydyme [39]. Kvercetinas ir kemferolis slopina ciklooksigenazės-2 aktyvumą bei su vėžio formavimusi ir vystymusi susijusius procesus: ląstelių proliferaciją, apoptozę, angiogenezę [30, 196]. Park ir kt., tyrę dviskiaučių ginkmedžių lapuose kaupiamų flavonoidų po-veikį melanomos ląstelėms, nustatė, kad flavonoidai, melanomos ląstelėse padidindami baltymų ekspresiją, sukelia vėžinių ląstelių žūtį [132].
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto sudėtyje esančios ginkolinės rūgš-tys pasižymi citotoksiniu, mutageniniu, neurotoksiniu, karcinogeniniu, geno-toksiniu poveikiu [10, 110]. Jos gali sukelti alergines reakcijas (ūmią dilgėli-nę, eksfoliacinį dermatitą, niežulį), odos, širdies ir kraujagyslių, kvėpavimo, reprodukcinės sistemų pažeidimus, sutrikdyti virškinamojo trakto veiklą [80]. Berg ir kt., atlikę tyrimus in vitro, įrodė, kad ginkolinės rūgštys pasižy-mi citotoksiniu poveikiu V79 ląstelėms, tačiau nepasižypasižy-mi mutageniniu bei genotoksiniu poveikiais [10]. Be neigiamo poveikio, nustatytas ir ginkolinių rūgščių antibakterinis, priešgrybelinis, priešvirusinis bei antidepresinis po-veikiai [84, 110, 111, 113]. Hausen ir kt., atlikę tyrimus su gyvūnais, nustatė, kad Ginkgo biloba lapų ekstraktai, vartojami per burną arba infuzijos būdu, gali būti laikomi saugiais, net jei ekstraktų sudėtyje ginkolinių rūgščių kiekis yra iki 1000 m.d. [68].
1.5. Dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų vartojimas medicinos praktikoje
Dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų skiriama toliau išvardytų ligų simptominiam gydymui bei profilaktikai:
1. Simptominiam kognityvinių sutrikimų gydymui pacientams, sergan-tiems lengva ir vidutine demencija [44, 75, 156].
2. Senatvinių kraujo apytakos smegenyse bei smegenų funkcijos sutriki-mų simptominiam gydymui [44].
3. Pradinių stadijų protarpinio šlubumo simptomų lengvinimui [135]. 4. Dėl kraujotakos sutrikimų atsiradusiam sunkumui kojose, šąlančių
plaštakų bei pėdų pojūčio mažinimui [63].
5. Vyresnio amžiaus žmonių lengvo ir vidutinio smegenų kraujotakos ne-pakankamumo, pasireiškiančio nuovargiu, susilpnėjusia atmintimi ir dėmesio koncentracija, simptominiam gydymui [44, 75].
6. Kraujagyslinės kilmės galvos svaigimo ar galvos skausmo simptomi-niam gydymui [63].
7. Spengimo ar ūžimo ausyse gydymui [77].
8. Blogos nuotaikos gerinimui sergant depresija [159, 161].
Medicinoje komplementaraus gydymo bei profilaktikos tikslais naudoja-mos dviskiaučių ginkmedžių lapų arbatos, tinktūros, lašai, kapsulės, tabletės. Didžiausią ginkmedžių preparatų dalį sudaro kapsulės ir tabletės. Pagal Vals-tybinės vaistų kontrolės pateiktus duomenis, Lietuvoje yra registruoti šie skir-tingų dozuočių vaistiniai preparatai, kurių sudėtyje yra kiekybiškai įvertinto sausojo dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto: Tanakan, Ginkor fort, Bilobil, Ginko biloba Pharma Nord, Ginkobil, Gingium bei vienas geriamasis tirpalas (Ginkomed), kurio sudėtyje yra dviskiaučių ginkmedžių lapų tinktūros [138, 176]. Maisto papildų tarpe daugiakomponenčių dviskiaučių ginkmedžių lapų preparatų Lietuvos farmacijos rinkoje yra daugiau nei vienkomponenčių. Daugiakomponenčių preparatų sudėtyse, kartu su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu yra ir skirtingų augalinių žaliavų ekstraktų ar džiovintų au-galų miltelių, vitaminų, mikro- ir makroelementų, natūralių antioksidantų [129]. Kosmetikos pramonėje gausu produktų, kurių sudėtyje yra dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto. Didžioji dalis yra odos priežiūros priemonės, įvai-rūs kūno kremai, aliejai, purškalai, muilai [16, 97, 98]. Kosmetikos pramonė-je gausu produktų, kurių sudėtypramonė-je yra dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto. Didžioji dalis yra odos priežiūros priemonės, įvairūs kūno kremai, aliejai, purškalai, muilai [16, 97, 98]. Indijos mokslininkų grupė plėtoja in vitro tyri-mus, siekdami sukurti ir optimizuoti standartizuoto dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto mikroemulsijos sistemą intranazaliniam naudojimui [166].
Naujų farmacinių formų su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu plėto-jimas yra perspektyvi tyrimų sritis. Kaip viena iš alternatyvų tablečių / kap-sulių vartojimui galėtų būti sparčiai farmacijos pramonėje populiarėjančios greitai burnoje tirpstančios polimerinės plėvelės [137].
1.6. Polimerinių plėvelių charakteristikos bei pritaikymo galimybės
Polimerinės plėvelės – plonas ir lankstus polimero sluoksnis su plastifika-toriumi arba be jo. Polimerinės plėvelės pagrindą (matricą) sudaro polimeras, o veikliosios medžiagos į reikiamą terpę iš matricos yra atpalaiduojamos di-fuzijos ar matricos ištirpinimo metu [137]. Plėvelės matrica gali būti sudaryta iš vieno ar daugiau polimerų, turinčių skirtingas fizikines ir chemines bei funkcines savybes [164].
Gaminant plėveles labai svarbu parinkti tinkamą polimero tipą ir jo kon-centraciją. Skiriama keletas charakteristikų, kurios gali būti kontroliuojamos
priklausomai nuo polimerų tipo: veikliųjų junginių atpalaidavimo laikas, mechaninis stiprumas, elastingumas [164]. Plėvelių gamyboje daugiausiai naudojami plačiai prieinami ir ekonomiškai naudingi celiuliozės eteriai: me-tilceliuliozė, hidroksipropilceliuliozė, hidroksipropilmeme-tilceliuliozė, karbok-simetilceliuliozė. Minėti polimerai gali būti naudojami modeliuojant biopoli-merines plėveles, kurios yra lanksčios, stiprios, beskonės, bekvapės ir tirpsta vandenyje [58].
Norint gauti optimalios sudėties polimerinę plėvelę, svarbu pasirinkti tin-kamą plastifikatorių, kuris sumažintų polimerinių grandinių nelankstumą bei pagerintų plėvelės kokybę. Naudojant plastifikatorių pagerėja plėvelės mechaninės savybės, lankstumas, išvengiama įtrūkimų ir porų susidarymo bei dažnu atveju yra pagerinamas vaistinės medžiagos atpalaidavimas [180]. Dažniausiai naudojami plastifikatoriai yra glicerolis, polietilenglikolis, sor-bitolis, propilenglikolis. Efektyviausi plastifikatoriai turi struktūrinius požy-mius, panašius į polimerą, į kurį jie yra įterpti [37]. Kaip ir polimerų atve-ju plastifikatoriaus koncentracija labai svarbi plėvelių savybėms. Per didelė plastifikatoriaus koncentracija gali pakenkti plėvelių lipnumui, o esant per mažai koncentracijai susidaro trapios polimerinės plėvelės bei pablogėja veikliųjų medžiagų atpalaidavimas iš polimero [153].
Polimerinės plėvelės plačiai naudojamos farmacijos, biomedicinos, kos-metikos ir maisto pramonėje. Farmacijos srityje polimerinės plėvelės gali būti taikomos bukaliniam, oraliniam bei oftalminiam vartojimui. Mokslinėje literatūroje aprašomos per os vartojamos plėvelės, skirtos hipertenzijos [149], depresijos gydymui [2, 12], alergijos simptomų mažinimui [28, 35], migre-nos gydymui [38]. Plėvelės, į kurių sudėtį įterpta skirtingų grupių antibiotikų (tetraciklino, eritromcino, amoksiclino) arba nesteroidinių vaistų nuo užde-gimo (ketorolako, meloksikamo, piroksikamo), skiriamos periodontito gydy-mui. Taip pat literatūroje minimos ir plėvelės, kurių sudėtyje yra analgetinių medžiagų [124] bei vitaminų [196]. Literatūroje duomenų apie polimerinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu tyrimus pateikiama labai mažai. Hu ir kt. pagamino valgomąsias želatinines plėveles su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu bei įrodė tokių plėvelių antibakterinį poveikį [73]. Tikslinga toliau vykdyti polimerinių plėvelių su dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktu eksperimentinę plėtrą bei funkcionalizavimo tyrimus.
1.7. Antioksidantai, antioksidacinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai
Dėl natūralaus ląstelių metabolizmo ir išorinio aplinkos poveikio žmogaus organizme nuolat susidaro laisvieji radikalai, kuriuos organizmas sugeba pašalinti per antioksidacinius apsauginius mechanizmus. Laisvieji radikalai mažomis koncentracijomis yra naudingi žmogaus organizmui: palaiko
krau-jagyslių tonusą, aktyvuoja leukocitus, kovoja su organizmui pavojingomis bakterijomis, virusais, grybeliais bei vėžinėmis ląstelėmis, dalyvauja regu-liuojant kraujo spaudimą [112, 143]. Laisvųjų radikalų perteklius gali sukelti širdies ir kraujagyslių, odos ligas, nervų ir imuninės sistemos susirgimus, art-ritą, kataraktą, vėžį, jie yra labai svarbūs senėjimo procese [43, 175]. Antiok-sidantais vadinamos medžiagos, kurios efektyviai slopina laisvųjų radikalų veikimą bei stabdo jų susidarymą arba sumažina oksidacinio streso sukeltus pažeidimus [64, 190]. Šios medžiagos, atiduodamos elektroną nestabiliam laisvajam radikalui, jį neutralizuoja suformuodamos naują jau stabilų radi-kalą. Antioksidantai pagal kilmę gali būti suskirstyti į dvi grupes: fermen-tiniai antioksidantai ir nefermenfermen-tiniai antioksidantai [23, 116]. Fermenfermen-tiniai antioksidantai ardo aktyviąsias O2 formas ir užkerta kelią tolimesnei reakcijų eigai. Nefermentiniai antioksidantai, prisijungdami / atiduodami elektroną, nutraukia grandinines reakcijas taip sudarydami stabilius tarpinius produktus [65, 100].
Antioksidantai laisvuosius radikalus neutralizuoja atiduodami vandenilio atomą arba prisijungdami laisvą elektroną. Pagal tai išskiriami du pagrindi-niai antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodai, pagrįsti skirtingais veiki-mo mechanizmais:
1. metodai, paremti vandenilio atomo perdavimu [4, 85]; 2. metodai, paremti laisvo elektrono perdavimu [4, 85].
Dažiausiai taikomi vandenilio atomo perdavimo reakcijomis pagrįsti anti-oksidacinio aktyvumo nustatymo metodai yra šie:
1. Deguonies radikalų absorbcijos galia (angl. oxygen radical absorbance capacity – ORAC). Metodas yra paremtas peroksido radikalo reakcija su fluorescuojančia medžiaga. Metodas leidžia įvertinti ir lipofilinius, ir hidrofilinius antioksidantus [160].
2. Antioksidanto sugaudytų radikalų suminis matas (angl. total radical- trapping antioxidant parameter – TRAP). Šis metodas dažniausiai nau-dojamas kraujo plazmos antioksidantams nustatyti [160].
3. β-karoteno ir krocino išblukimo metodas. Šis metodas paremtas tuo, kad antioksidantai, perduodami vandenilio joną, stabdo peroksidų le-miamą β-karoteno ar krocino išblukimą [139].
Dažiausiai taikomi metodai, paremti elektrono pernešimo reakcijomis, yra šie:
1. Geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl. Ferric reducing antioxi-dant power – FRAP), kuria įvertinama geležies 2,4,6-tripiridil-s-triazi-no redukcija iki mėly2,4,6-tripiridil-s-triazi-nos spalvos junginio. Tyrimus atliekant šiuo meto-du reakcija gali vykti tik rūgštinėje terpėje (pH 3,6), todėl metodas nėra
tinkamas visiems antioksidantams tirti. Lyginant su kitais metodais, skirtais bendram antioksidaciniam aktyvumui nustatyti, šis metodas yra paprastas, pigus bei greitai atliekamas [11, 82].
2. Vario redukcijos antioksidacinė galia (angl. Cupric ion reducing anti-oxidant capacity – CUPRAC). Metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į vienvalenčio vario ir neokuproino kompleksą. CUPRAC reagentas yra stabilesnis ir lengviau pagamina-mas nei chromogeniniai radikalų reagentai, jo neveikia tokie faktoriai kaip saulės spinduliai, tirpiklio tipas, pH. Vienas iš svarbiausių šio reagento pritaikymo trūkumų: reagentas nereaguoja su izoliuotomis angliavandenilių dvigubomis jungtimis [3, 148]. Antioksidacinio akty-vumo įvertinimas CUPRAC metodu atliekamas neutraliomis sąlygomis (kai pH yra 7,0), kurios artimos fiziologinėms, tuo tarpu FRAP metodo pH yra 3,6 [3].
3. ABTS radikalų ir katijonų surišimo metodas, kuriuo yra matuojama antioksidantų geba sumažinti spalvoto radikalo spalvos intensyvumą (aktyvacijos metu nespalvotas ABTS radikalas paverčiamas spalvotu ABTS●+ katijonu) [123, 160]. Metodas tinkamas nustatyti hidrofilinius
ir hidrofobinius antioksidantus, yra paprastas, galimas platus tinkamo pH spektro pritaikymas. Prieš atliekant tyrimus yra reikalinga ABTS reagento aktyvacija, todėl antioksidacinio aktyvumo įvertinimo rezulta-tai gali būti mažesni, lyginant su kirezulta-tais tyrimo metodais [20].
4. DPPH radikalų surišimo metodas. Radikalui reaguojant su antioksi-dantu spalva iš tamsiai violetinės pasikeičia į geltoną. Spalvų pokytis išmatuojamas ties 515 nm šviesos bangos ilgiu [121, 160]. Šio tyrimo pagrindinis trūkumas yra tas, kad DPPH reagentas netirpsta vandenyje, tirpsta tik organinėje terpėje ir tai apriboja hidrofilinių antioksidantų įvertinimą. Nepaisant trūkumų, minėtas antioksidacinio aktyvumo įver-tinimo metodas yra greitas ir nesudėtingas [88, 148].
Didele perspektyva antioksidacinio aktyvumo tyrimams pasižymi ESC pokolonėliniai metodai su įvairiomis derivatizacijos metodikomis. ESC po-kolonėliniai metodai tuo pačiu metu leidžia nustatyti tikslų junginio kiekį au-galinių žaliavų ekstraktuose, įvertinti jų antioksidacinį aktyvumą bei atskirų junginių antioksidacines savybes [146].
ESC-DPPH. Koleva ir kt. pirmieji išvystė ESC-DPPH pokolonėlinį
me-todą ir pradėjo jį taikyti antioksidacinio aktyvumo įvertinimo tyrimams [96]. ESC-DPPH pokolonėlinis antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodas yra paprastas, universalus, greitas, tačiau DPPH radikalų aktyvumui didelės įta-kos turi tirpiklis bei reakcijos terpė. Reakcijos terpėje esant didesniam kie-kiui vandens, antioksidacinis aktyvumas ima mažėti bei įvyksta reagento
ko-aguliacija [168]. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas ESC-DPPH metodu tampa komplikuotas, kai antioksidanto reakcija su DPPH reagentu yra labai lėta arba antioksidantai yra inertiški šiam reagentui [88]. Nepaisant galimų trūkumų, šis antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodas sėkmingai pritai-kytas tiriant antioksidacines kviečių grūdų, sėlenų, įvairių daržovių, vaistinių augalinių žaliavų savybes [128].
ESC-ABTS. Pirmieji ESC-ABTS pokolonėlinį metodą aprašė Koleva ir
kt. [96]. ESC-ABTS antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodas plačiai naudojamas daugelyje mokslinių tyrimų, nes yra jautrus, nebrangus bei jaut-resnis nei ESC-DPPH metodas. Metodas gali būti taikomas plačiame pH reikšmių intervale, todėl gali būti naudojamas daugelyje tyrimų nustatant hidrofilinių ir lipofilinių antioksidantų oksidacinį pajėgumą ekstraktuose [20]. Metodas taip pat turi ir trūkumų: junginiai, kurių redokso potencialas mažes-nis nei ABTS●+ (0,68 V), gali reaguoti su šiuo radikalu-katijonu, taip pat
reak-cija tarp antioksidanto ir ABTS●+ trunka virš 30 min. Metodas pritaikytas
kininio arbamedžio (Camellia sinensis L.), sirinės timsros (Sideritis syriaca L.), kvapiojo rozmarino (Rosmarinus officinalis L.), krūminės sidabražolės (Potentilla fruticosa L.), paprastosios jonažolės (Hypericum perforatum L.) bei kitų augalų augalinės žaliavos standartinių antioksidantų tyrimams [128].
ESC-FRAP. Pirmi straipsniai apie antioksidacinio aktyvumo vertinimą
panaudojant FRAP reagentą publikuoti 1996 ir 1999 m. Benzie mokslininkų grupės [8, 9]. Pirmiausia reagentas panaudotas kraujo plazmos antioksidaci-nio aktyvumo tyrimui, o vėliau pritaikytas ir antioksidantams iš augalinės ža-liavos analizuoti. ESC-FRAP metodas įvertina antioksidantų gebėjimą rūgšti-nėje terpėje redukuoti geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+
kompleksą į intensyviai mėlynos spalvos [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksą.
Absorbcijos pokyčiai fiksuojami kaip teigiamos smailės ties 593 nm šviesos bangos ilgiu [148]. ESC-FRAP metodas išsiskiria iš kitų pokolonėlinių me-todų tuo, kad redokso reakcijos vyksta labai greitai (~ 4–6 min.). ESC-FRAP metodas netinka tiolio antioksidantų (glutationo) tyrimams. Metodas sėkmin-gai pritaikytas šermukšnių (Sorbus L.) lapų [144], naminių obelų (Malus domestica Borkh.) vaisių, minkštimo bei žievelių [145], kavos pupelių [82] ekstraktuose esančių junginių antioksidaciniam aktyvumui nustatyti.
ESC-CUPRAC. Metodas 2007 m. pirmą kartą paskelbtas turkų
moksli-ninkų grupės [3]. Metodas pagrįstas dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-di-metil-1,10-fenan-trolino) komplekso (Cu(II)-Nc) redukcija į chromogeninį Cu(I)-Nc kompleksą, kurio absorbcijos maksimumas yra prie 450 nm šviesos bangos ilgio. ESC-CUPRAC antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodas yra greitas, nebrangus, universalus, tinkamas hidrofiliniams ir lipofiliniams antioksidantams įvertinti. ESC-CUPRAC pokolonėlinis metodas pritaikytas sėjamosios petražolės (Petroselinum sativum Hoffm.) lapų, valgomojo
salie-ro (Apium graveolens L.) lapų, didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) žolės [194], juoduogio šeivamedžio (Sambucus nigra L.) žiedų [25], kininio arbat-medžio (Camellia sinensis L.) lapų bei kvapiojo mairūno (Origanum majora-na L.) žolės [24] ekstraktuose esančių junginių antioksidaciniam aktyvumui įvertinti.
Pokolonėlinės reakcijos metodikų sąlygų parinkimas yra reikšmingas me-todikų vystymo ir optimizavimo žingsnis, turintis didžiulę įtaką galutinių re-zultatų tikslumui ir patikimumui. Raudonis ir kt. tyrė ESC pokolonėlinius metodus augalinių antioksidantų tyrimams. Eksperimentų metu optimizuo-ti ir validuooptimizuo-ti ESC-ABTS, ESC-DPPH, ESC-FRAP pokolonėliniai metodai [147]. Nustatyta, kad antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatus gali lemti reagento tėkmės greitis ir koncentracija bei reakcijos laikas [146]. Marksa ir kt. atliko optimalių antioksidacinio aktyvumo nustatymo sąlygų parinkimą kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) vaistinei augalinei žaliavai at-liekant temperatūros bei pokolonėlinės reakcijos kilpos modifikacijas ESC-ABTS bei ESC-DPPH pokolinėliniams metodams [118].
ESC pokolonėlinių metodų vystymas yra perspektyvi tyrimų sritis, lei-džianti greitai ir atrankiai nustatyti tuos antioksidaciniu aktyvumu pasižy-minčius junginius, kurių reakcijos greitis su modeliniu oksidaciniu junginiu yra didelis. Minėti metodai yra tinkami greitai veikiantiems didelio pajėgumo antioksidantams aptikti bei tokių antioksidantų aktyvumo žymenims identifi-kuoti. Antioksidacinio aktyvumo žymenys gali būti naudingi užtikrinant au-galinių žaliavų kokybę, kurios galėtų būti potencialiai įterptos į vaistų, maisto produktų bei kosmetikos sudėtį [119].
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – Lietuvoje auginamų dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapai. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiai veikliųjų junginių kie-kybinės sudėties įvairavimui įvertinti rinkti 2014–2015 m. ir 2019 m. birže-lio–spalio mėnesiais, 25–28 mėnesio dienomis trijuose Lietuvos klimatiniuo-se rajonuoklimatiniuo-se (2.1.1 lentelė). Ėminiai rinkti intensyvaus sulapojimo (06.25), maksimalaus lapų išsivystymo (07.28 ir 08.28) bei lapų senėjimo (09.25 ir 10.25) tarpsniuose. Ėminiai rinkti nuo virš žemės 1–3 m aukštyje augančių šakų. Kiekvieno augalinės žaliavos ėminio metu rinkta apie 40 lapų nuo skirtingų dviskiaučių ginkmedžių lajos vietų. Siekiant gauti reprezentatyvų dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminį, nuo individo surinkti lapai sumaišyti su-darant vieną sudėtinį ėminį.
Išdžiovinta žaliava supakuota į popierinius maišelius ir laikyta iki analizės apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių ir drėgmės, kambario temperatūro-je (25 °C ±2) esant 60 ±5 proc. santykinei drėgmei. Dviskiaučių ginkmedžių lapų nuodžiūvis nustatytas KERN MLS (Vokietija) drėgnomačiu. Tyrimų re-zultatai perskaičiuoti absoliučiai sausai augalinei žaliavai.
2.1.1 lentelė. Dviskiaučių ginkmedžių lapų žaliavos rinkimo vietos Žymėjimas
augavietėje Rinkimo vieta Radavietės geografinė padėtis Klimatinis rajonas
G1 Klaipėdos universiteto
botanikos sodas 55° 39′ 40″ Š plat.21° 10′ 30″ R ilg. Pajūrio G2 Klaipėdos universiteto
botanikos sodas 55° 39′ 40″ Š plat.21° 10′ 30″ R ilg. Pajūrio G3 Šiaulių universiteto
botanikos sodas 55° 55′ 20″ Š plat.23° 19′ 0″ R ilg. Vidurio žemumos G4 Šiaulių universiteto
botanikos sodas 55° 55′ 20″ Š plat.23° 19′ 0″ R ilg. Vidurio žemumos G5 VDU Kauno botanikos
sodas 54° 53′ 50″ Š plat.23° 54′ 10″ R ilg. Vidurio žemumos G6 Lazdijų rajonas, Valentų
kaimas 54° 14′ 10″ Š plat.23° 31′ 0″ R ilg. Pietryčių aukštumų G7 Vilkaviškio miestas 54° 38′ 50″ Š plat.
23° 2′ 10″ R ilg. Vidurio žemumos
Pagal 2014 m. Klaipėdos universiteto botanikos sodo pateiktus duomenis, jų dviskiaučių ginkmedžių individų amžius yra 9 ir 18 metų. Pagal 2014 m. Šiaulių universiteto botanikos sodo pateiktus duomenis, botanikos sode
augi-namų individų amžius yra 12 ir 14 metų. Pagal 2014 m. VDU botanikos sodo pateiktus duomenis, dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminiai rinkti nuo 77 metų amžiaus individo. 2014 m. duomenimis, Lazdijų rajone auginamo dviskiau-čio ginkmedžio amžius 5 metai, o Vilkaviškio mieste – 8 metai. Klimatinis Lietuvos teritorijos rajonavimas atliktas remiantis Lietuvos hidrometeorolo-ginės tarnybos pateiktu skirstymu [89].
2.2. Tyrimo laikotarpio meteorologinės sąlygos
Meteorologinėms sąlygoms apibūdinti apskaičiuoti hidroterminiai koefi-cientai (HTK). HTK taikomas apibūdinant drėgmės sąlygas aktyvios augalų vegetacijos laikotarpiu. HTK apskaičiuoti pagal žemiau pateiktą G. Seliani-novo formulę [49] ir pateikti 2.2.1 lentelėje.
HTK = P
,ଵ σ tభబ , (1)
kur P – skaičiuojamo laikotarpio kritulių suma mm; t10 – paros vidutinės oro temperatūros, didesnės nei 10 °C, suma per tą patį laikotarpį.
2.2.1 lentelė. HTK reikšmės 2014 m., 2015 m. ir 2019 m. birželio–spalio
mė-nesiais skirtingose Lietuvos vietovėse
Mėnuo laikotarpisTyrimų Vietovė
Klaipėda Šiauliai Kaunas Lazdijai Vilkaviškis
Birželis 2014 1,7 2,0 1,3 1,6 1,3 2015 0,6 0,4 0,4 0,4 0,4 2019 0,4 0,3 0,8 0,5 0,4 Liepa 2014 0,3 1,5 1,1 1,4 1,0 2015 1,8 1,3 1,3 1,3 1,4 2019 1,9 2,0 1,1 1,4 1,8 Rugpjūtis 2014 1,7 2,1 2,0 1,1 1,9 2015 0,2 0,1 0,1 0,1 0,2 2019 1,0 0,8 1,2 1,3 0,9 Rugsėjis 2014 1,2 0,4 0,6 0,7 0,6 2015 1,8 1,1 1,4 1,5 0,9 2019 3,1 1,5 1,3 1,3 1,3 Spalis 2014 5,7 5,0 7,0 2,3 3,4 2015 0,8 0,8 4,0 4,7 3,4 2019 4,3 1,7 1,9 2,3 1,8
2014 m., 2015 m. ir 2019 m. birželio–spalio mėnesiais skirtingose Lie-tuvos vietovėse meteorologinės sąlygos skyrėsi. Literatūros duomenimis, 2014 m. vegetacijos laikotarpio pradžia (vertinant pagal HTK reikšmes)
api-būdinama kaip pakankamai drėgna. Lietuvos hidrometeorologijos tarnyba nurodo, kad stichinė sausra 2014 m. nefiksuota [105, 174]. 2015 m. stichinės sausros rodiklis pasiektas Vilkaviškio, Kazlų Rūdos ir Kauno savivaldybėse [105, 174]. Lietuvos hidrometeorologijos tarnybos duomenimis, 2019 m. sti-chinės sausros rodiklis buvo pasiektas tik Elektrėnų, Trakų ir Varėnos savi-valdybėse [106].
Klimato juostų kodavimas atliktas remiantis Köppen‘o klimato klasifika-cijos principu, pateiktu Kottek ir kt. publikacijoje [99].
2.3. Medžiagos ir reagentai
Naudoti šių junginių standartai: kvercetinas (99,49 proc., HWI ANALY-TIK GmbH, Vokietija); kemferolis (99 proc., Extrasynthese, Prancūzija); izo-ramnetinas (99 proc., Extrasynthese, Prancūzija); ginkolidas C (99,9 proc., ChromaDex, JAV); bilobalidas (97,9 proc., ChromaDex, JAV); ginkoli-das A (95 proc., ChromaDex, JAV); ginkoliginkoli-das B (95 proc., ChromaDex, JAV); dviskiaučių ginkmedžių terpeno laktonų lyginamasis standartas (U.S. Pharmacopeia, JAV); ginkolinių rūgščių lyginamasis standartas (EDQM, Prancūzija); ginkolinė rūgštis C 15:1 (98,1 proc., ChromaDex, JAV), sau-sasis dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktas (LINNEA SA, Šveicarija, se-rijos Nr. G2460809003). Naudoti analitinio ir chromatografinio švarumo reagentai: gradientinio švarumo acetonitrilas (Sigma-Aldrich, Šveicarija); trifluoracto rūgštis (99,8 proc. Carl Roth GmbH, Vokietija); metanolis (Roth GmbH, Vokietija); 96,3 proc. (v/v) etanolis (AB Stumbras, Kaunas, Lietuva); acetonas (Sigma-Aldrich Production GmbH, Šveicarija); vandenilio chlori-do rūgštis (37 proc., Sigma-Aldrich Production GmbH, Šveicarija); skruz-džių rūgštis (95 proc., Sigma–Aldrich, Vokietija); fosforo rūgštis (85 proc., Sigma-Aldrich Production GmbH, Šveicarija); stabilizuotas tetrahidrofura-nas (99,9 proc., Sigma-Aldrich Production GmbH, Šveicarija); n-heksatetrahidrofura-nas (99 proc., Sigma-Aldrich, Vokietija); dichlormetanas (99,8 proc., Carl Roth GmbH, Vokietija); trichlormetanas (99,8 proc., Carl Roth GmbH, Vokietija); 2,2’-azinobio (3-etilbenzotiazolin-6-sulforūgšties) diamonio druska (ABTS, 98 proc., Fluka Chemie, Šveicarija); kalio persulfatas (Fluka Chemie, Švei-carija); geležies (III) chlorido heksahidratas (FeCl3 · 6H2O, Sigma–Aldrich GmbH, Vokietija); vario (II) chlorido dihidratas (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija ); amonio acetatas (Sigma-Aldrich, Belgija); 2,9-dimetil-1,10-fenan-trolinas (98 proc., Neokuproinas, Sigma-Aldrich Production GmbH, Šveica-rija), (R)-6-metoksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksirūgštis (troloksas, Fluka Chemie, Šveicarija), trimetilsulfonio hidroksidas (TMSH, 0,25 M tirpalas metanolyje, Sigma-Aldrich, JAV); polietilenglikolis (PEG – 1500, Sigma-Aldrich, JAV); gumiarabikas (E414, Sigma-Aldrich, Prancūzija),
natrio karboksimetilceliuliozė (200-400 cP, 2 proc. vandenyje, vidutinės klam-pos, Sigma-Aldrich, JAV), išgrynintas dejonizuotas vanduo (18,2 mΩcm–1),
ruoštas „Milipore“ (JAV) vandens valymo sistema.
2.4. Tiriamųjų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų paruošimas Dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių puošimas flavonoidų analizei.
Orasausė žaliava susmulkinama smulkintuvu („Bosh MKM6003“, Vokietija) iki dalelių, praeinančių pro 355 μm sietą. Tyrimams atsveriama 2,5 g (tikslus svėrinys, sverta 0,001 g tikslumu) susmulkintų dviskiaučių ginkmedžių lapų. Į 100 ml apvaliadugnę kolbą įdedamas atsvertas mėginys, užpilama 50 ml 60 proc. acetono ir vandens mišiniu (v/v). Ekstrakcija atliekama 30 min. kai-tinant ne žemesnėje nei 100 °C temperatūroje prijungus grįžtamąjį šaldytu-vą. Ekstrakcija kartojama du kartus. Acetonas iš gauto ekstrakto pašalina-mas išgarinant 50 ± 5 °C vakuuminiame rotaciniame garintuve (Heidolph Instruments GmbH & Co, Vokietija). Į likusį tirpalą pilama 30 ml metanolio ir 4,4 ml praskiestos vandenilio chlorido rūgšties. Gautas ekstraktas filtruoja-mas pro popieriaus filtrą į 50 ml matavimo kolbutę ir skiedžiafiltruoja-mas vandeniu iki 50 ml žymės. 10 ml gauto tirpalo perpilama į 10 ml talpos buteliuką ir tvirtai uždarytas buteliukas kaitinamas verdančio vandens vonelėje 25 min. Tirpalas vėsinamas iki kambario temperatūros ir filtruojamas per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,45 μm (Nalge Nunc International, JAV).
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių paruošimas terpeno laktonų analizei. Tyrimams atsveriama 1,5 g (tikslus svėrinys, sverta 0,001 g
tikslu-mu) susmulkintų dviskiaučių ginkmedžių lapų. Atsvertas mėginys supilamas į plastikinius centrifugavimo mėgintuvėlius, užpilamas 7,5 ml metanolio ir vandens mišiniu (1:1 v/v) ir 5 min. laikomas ultragarso vonelėje (WiseClean, Witeg Labortechnik GmbH, Vokietija). Tirpalas nuskaidrinamas centrifuguo-jant (Centurion Scientific C2 Series Centrifuges, Didžioji Britanija) ir nuo-pylos atsargiai nupilamos į 25 ml tūrio matavimo kolbutę. Likusios nuosėdos užpilamos 7,5 ml metanolio ir praskiestos vandenilio chlorido rūgšties miši-niu (1:1 v/v), gerai sumaišoma ir 5 min. laikoma ultragarso vonelėje. Karto-jama 2 kartus. Į matavimo kolbutę surinkus visas frakcijas, turinys praskie-džiamas metanolio ir vandens mišiniu (1:1 v/v) iki 25 ml žymės. 10 ml gauto tirpalo kaitinama verdančio vandens vonelėje 150 min. Tirpalas vėsinamas iki kambario temperatūros ir filtruojamas per 0,45 μm porų dydžio membra-ninius filtrus.
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ėminių paruošimas ginkolinių rūgščių (išreikštų ginkolinės rūgšties C 17:1 ekvivalentu) analizei. Tyrimams
atsveriama 0,5 g (tikslus svėrinys, sverta 0,001 g tikslumu) susmulkintų dviskiaučių ginkmedžių lapų. Mėginys supilamas į konusinę kolbutę,
