LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GABRIELĖ DUOBLYTĖ
DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ SAUSOJO EKSTRAKTO
SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO ĮVERTINIMAS MAISTO PAPILDUOSE
CHROMATOGRAFINIAIS METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Rūta Marksienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ LAPŲ SAUSOJO EKSTRAKTO SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO ĮVERTINIMAS MAISTO PAPILDUOSE CHROMATOGRAFINIAIS
METODAIS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Doc. dr. Rūta Marksienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Gabrielė Duoblytė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų įvairovė ... 10
1.2 Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėtis ... 11
1.3 Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto komponentų farmakokinetika ... 13
1.4 Fiziologinis dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto poveikis ... 15
1.5 Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto vartojimo saugumas ... 17
1.6 Maisto papildų reguliavimas ir kokybės kontrolė ... 19
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 21
2.1 Metodikos pagrindimas ... 21
2.2 Reagentai, priemonės ir aparatūra ... 23
2.3 Tiriamųjų objektų junginių profilio nustatymas ... 24
2.3.1 Ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija ... 24
2.3.2 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ... 26
2.4 Tiriamųjų objektų kiekybinė analizė ... 27
2.4.1 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ... 27
2.4.2 Efektyvioji skysčių chromatografija su refraktometriniu detektoriumi ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1 Tiriamųjų objektų cheminių junginių profiliai ... 29
3.1.1 Ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija ... 29
3.1.2 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija ... 34
3.2 Tiriamųjų objektų kiekybinės analizės rezultatai ... 36
3.2.1.1 Metodo validacija ... 36
3.2.1.2 Tyrimo rezultatai ... 37
3.2.2 Efektyvioji skysčių chromatografija su refraktometriniu detektoriumi ... 38
3.2.2.1 Metodo validacija ... 38
3.2.2.2 Tyrimo rezultatai ... 39
3.3 Maisto papildų ženklinimo teisingumo įvertinimas ... 40
4. IŠVADOS ... 42
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44
SANTRAUKA
Gabrielės Duoblytės magistro baigiamasis darbas „Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėties įvairavimo įvertinimas maisto papilduose chromatografiniais metodais“. Mokslinė vadovė – doc. dr. Rūta Marksienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2017.
Tikslas: nustatyti dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėties įvairavimą
Lietuvoje parduodamuose maisto papilduose.
Uždaviniai:
1. Išanalizuoti pasirinktų maisto papildų cheminių junginių profilius; 2. Išanalizuoti pasirinktų maisto papildų kiekybinę sudėtį;
3. Įvertinti pasirinktų maisto papildų sudėties atitikimą ženklinimui.
Tyrimo objektai ir metodai: penkių Lietuvos rinkai tiekiamų maisto papildų su dviskiaučių
ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu kokybinė sudėties analizė ultra efektyviąja skysčių chromatografija su masių spektrometrija (UESC-MS/MS) ir efektyviąja plonasluoksne chromatografija (EPC) bei kiekybinė sudėties analizė efektyviąja plonasluoksne chromatografija (EPC) ir efektyviąja skysčių chromatografija su refraktometriniu detektoriumi (ESC-RI).
Rezultatai: Visuose tiriamuosiuose objektuose identifikuoti dviskiaučių ginkmedžių lapų
sausajam ekstraktui būdingi flavonoliai – kvercetinas, kemferolis, izoramnetinas. Nustatytas jų aglikonų kiekis sąlyginai didesnis negu glikozidų. Visuose tiriamuosiuose objektuose nustatytas rutinas, kurio kiekis svyruoja nuo 0,24% iki 1,86%.
Viename iš penkių maisto papildų nustatytas 6% suminis terpeno laktonų kiekis, trijuose suminis terpeno laktonų kiekis svyruoja tarp 2,90 ir 3,29%. Viename maisto papilde neidentifikuotas nė vienas būdingas terpeno laktonas.
Dviejų maisto papildų ženklinimo teisingumo įvertinti negalima, trijų maisto papildų ženklinimas nesutampa su analizės duomenimis.
Išvados: Atliktų analizių duomenimis, nė vienas maisto papilduose esantis dviskiaučių
ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas negali būti prilygintas Europos Farmakopėjoje aprašytam ekstraktui.
SUMMARY
The Master Thesis Composition evaluation of dietary supplements containing dry extract of
Ginkgo biloba L. leaves using chromatographic methods by Gabrielė Duoblytė. Scientific supervisor –
Assoc. Prof. Rūta Marksienė. Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.
The aim of the research was to evaluate the composition of dietary supplements containing
dry extract of Ginkgo biloba L. leaves.
Objectives:
1. To analyse profiles of chemical compounds of selected dietary supplements; 2. To analyse qantitative composition of selected dietary supplements;
3. To evaluate the compliance with label of selected dietary supplements.
The objects of the Thesis was five dietary supplements containing dry extract of Ginkgo biloba L. leaves which are available at the Lithuanian market.
Methods. Qualitative analysis was performed using ultra – high performance liquid
chromatography coupled with mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) and high performance thin layer chromatography (HPTLC). Quantitative analysis was performed using high performance thin layer chromatography (HPTLC) and high performance liquid chromatography with refractive index detector (HPLC-RI).
Results. Quercetin, kaempferol and isorhamnetin – common flavonols of ginkgo dry extract –
were identified in all selected dietary supplements. Relatively large amounts of aglycones of those flavonols were determined. All five dietary supplements had 0,24-1,86% rutin.
In one selected dietary supplement 6% and in three objects 2,90-3,29% of terpene lactones were determined. None of ginkgolides A, B, C or bilobalide were identified in one selected dietary supplement.
Two of dietary supplements proper labeling could not be evaluated. Three of selected dietary supplements did not conform to what was declared on the label.
Conclusions. The data of carried out analysis suggests that none of dry extract of Ginkgo biloba L. leaves of selected dietary supplements can be taken identical with extract as described in
SANTRUMPOS
JAV Jungtinės Amerikos Valstijos
ES Europos Sąjunga
EK Europos Komisija
CEP vaistinės medžiagos kokybės atitikties Europos Farmakopėjai sertifikatas (angl. Certificate of Suitability)
Cmax maksimali medžiagos koncentracija kraujyje
tmax laikas, per kurį pasiekiama maksimali medžiagos koncentracija kraujyje
t1/2 pusinės eliminacijos laikas
EVKD Europos vaistų kokybės direktoratas (angl. European Directorate for the
Quality of Medicines)
EMST Europos maisto saugos tarnyba (angl. European Food Safety Authority) FDA JAV Maisto ir vaistų administracija (angl. U.S. Food and Drug
Administration)
NMVRVI Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas VMVT Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba
PSO Pasaulio Sveikatos Organizacija
m.d. milijoninės dalys (angl. parts per million)
TAF trombocitus aktyvinantis faktoriaus (angl. platelet activating factor) ATC anatominė-terapinė-cheminė klasifikacija (angl. anatomical therapeutic
chemical classification)
DC dujų chromatografija
PC plonasluoksnė chromatografija (angl. thin-layer chromatography) EPC Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (angl. high performance thin
layer chromatography)
ESC Efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high performance liquid
chromatography)
ELSD garinantis šviesos sklaidos detektorius (angl. evaporative light scattering
detector)
RI lūžio rodiklio (refraktometrinis) detektorius (angl. refractive index
detector)
UESC- MS/MS Ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija su daugybine fragmentacija (angl. ultra high pressure liquid chromatography
m/z jonų masės-krūvio santykis
ĮVADAS
Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto produktai yra itin populiarūs. Pavyzdžiui, per dieną pasaulyje suvartojama vidutiniškai 1 milijonas populiariausio dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto EGb761 (120mg) dozių [1].
Lietuvoje gausus maisto papildų su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu pasirinkimas. Vartotojas pats negali įvertinti maisto papilde esančio ekstrakto sudėties – jam svarbu, kad pasirinkto produkto kokybė būtų užtikrinta ir papildas turėtų svarbiausius ekstrakto komponentus.
Šio magistro baigiamojo darbo tyrimo objektai – Lietuvos rinkai tiekiami maisto papildai su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu. Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti pasirinktų maisto papildų cheminių junginių profilius; 2. Išanalizuoti pasirinktų maisto papildų kiekybinę sudėtį;
3. Įvertinti pasirinktų maisto papildų sudėties atitikimą ženklinimui.
Šiame darbe išnagrinėta dviskiaučių ginkmedžių lapų sausųjų ekstraktų įvairovė, fiziologinis poveikis, sąveikos su vaistais. Atlikta analizė siekiant išsiaiškinti, kokios sudėties ekstraktai naudojami maisto papilduose, ir, ar ekstraktų sudėtis yra tapati Europos Farmakopėjoje aprašytam ekstraktui.
Ekstrakto kokybinei sudėčiai įvertinti darbe pateikiama nauja ir greita efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos analizė, kurios rezultatai sutampa su atliktų sudėtingų ultra efektyviosios skysčių chromatografijos su masių spektrometrija bei efektyviosios skysčių chromatografijos su refraktometriniu detektoriumi eksperimentų duomenis. Kiekybinės analizės rezultatai panaudojami maisto papildų ženklinimui įvertinti.
Šio darbo tikslas – nustatyti dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėties įvairavimą Lietuvoje parduodamuose maisto papilduose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: nustatyti dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėties įvairavimą
Lietuvoje parduodamuose maisto papilduose.
Uždaviniai:
1. Išanalizuoti pasirinktų maisto papildų cheminių junginių profilius; 2. Išanalizuoti pasirinktų maisto papildų kiekybinę sudėtį;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų įvairovė
Dviskiaučių ginkmedžių žaliava yra sėklos ir lapai [2]. Šiuo metu geriausiai ištirtas ir platų pritaikymą turi dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas. Į Europos Farmakopėją įtraukta valyto ir kiekybiškai įvertinto dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto monografija (1827) [3]. Europos Farmakopėjoje aprašytas ekstraktas laikomas ginkmedžių ekstraktų etalonu.
1965 metais gydytojas ir farmacininkas dr. Vilmaras Švabė (Willmar Schwabe III) pristatė dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto vartojimą medicinoje. Iš pradžių šis ekstraktas buvo pristatomas kaip flavonoidų glikozidų ir kitų komponentų turintis mišinys, skirtas kraujotakos sutrikimams gydyti. Vėliau dr. Vilmaras Švabė ekstraktą grynino bei koncentravo. Po pirmųjų terapinį efektą aprašančių straipsnių, Švabės kompanija ėmė bendradarbiauti su Beaufour-IPSEN ir 1973 m. Prancūzijoje buvo užregistruotas sudėtinis preparatas su ginkmedžių lapų ekstraktu venų patologijai gydyti. 1974 m. užregistruotas preparatas Tanakan, pristatytas ginkmedžių lapų ekstrakto paruošimo būdas. Šis unikalus ekstraktas buvo pavadintas EGb761. Netrukus Europoje ir JAV buvo pradėti skelbti nauji patobulinto ekstrakto patentai [4]. Šiandien šis gamintojas turi vaistinės medžiagos kokybės atitikties Europos Farmakopėjai sertifikatą (CEP).
Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto EGb761 gamyba iš viso apima 9 pakopas: nuo žaliavos surinkimo, lipidų valymo, taninų nusodinimo iki gryninimo, džiovinimo. Kad būtų patenkintas nuolatinis ginkmedžių lapų žaliavos poreikis, Vilmaro Švabės bei Beaufour-IPSEN kompanijos Prancūzijoje, JAV bei Kinijoje įkūrė 450-3000 hektarų dviskiaučių ginkmedžių plantacijas. Žaliava rankomis arba mechaniškai nurenkama liepos (JAV), rugpjūčio (Kinijoje) ir rugsėjo-spalio (Prancūzijoje) mėnesiais. Lapai džiovinami propanu specialiose džiovyklėse, tada supakuojami ir teikiami ekstrakto gamybai [5].
Į Europos Farmakopėją įtraukta dviskiaučių ginkmedžių lapų valyto ir kiekybiškai įvertinto sausojo ekstrakto monografija (1827) nurodo, jog jis gaminamas iš ginkmedžių lapų, ekstrahentas – 60% acetonas, vienai daliai ekstrakto pagaminti sunaudojama 35-37 dalys žaliavos, jo sudėtyje yra:
1. 22,0-27,0% flavonoidų, išreikštų flavonų glikozidais; 2. 2,6-3,2% bilobalido;
3. 2,8-3,4% ginkolidų A, B ir C;
4. Ne daugiau kaip 5 m.d. ginkolinių rūgščių.
Europos Farmakopėjoje nurodyto ekstrakto kokybę (t.y. gamintojai turi CEP) šiai dienai atitinka aštuonių gamintojų ekstraktai [6]: Schwabe Extracta, Vokietija (ekstraktas, vadinamas EGb 761, GBE-761, Tanakan, Tebonin arba Rökan); Zhejiang Comba Pharmaceutical, Kinija; Euromed
SA, Ispanija; Cara Partners, Airija; Ningbo Green-Health Pharmaceutical, Kinija; Finzelberg, Vokietija; Beijing Gingko Group Biological Technology, Kinija; Indena, Prancūzija.
Kiti ginkmedžių lapų sausieji ekstraktai savo sudėtimi žymiai skiriasi nuo Europos Farmakopėjoje aprašyto, pvz.: palyginus naujas ginkmedžių lapų ekstraktas P8A (kitaip vadinamas TTL) turi 70% terpeno laktonų [7]. Ginkmedžių lapų ekstraktas 50 (GBE50), išgaunamas Kinijoje, turi apie 44% flavonoidų bei 6% terpeno laktonų [8]. Ekstraktas BN 52021 – tai koncentruota ginkolido B ištrauka, BN52020 – koncentruota ginkolido A ištrauka, jie naudojami ginkolidų aktyvumui nustatyti [9]. Ekstraktas BN 52063 taip pat išvalytas nuo flavonoidų, o ekstraktai CP 205 bei VR456 atvirkščiai – išvalyti nuo terpeno laktonų [10]. Tokie ekstraktai naudojami tam tikrų junginių farmakologinėms savybėms išsiaiškinti.
Panaudojant daugiapakopį ekstrahavimą ir koncentravimą, skirtingus ekstrahentus, galima gauti įvairios sudėties ekstraktų. Dauguma maisto papildų gamintojų siekia kuo panašesnės į etaloninį ekstraktą sudėties [1].
Maisto papildų gamintojai dažniausiai nepatikslina, koks būtent dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas naudojamas, kai kurie ženklindami nurodo, jog tai „standartizuotas“ (t.y. etaloninis, atitinkantis Europos Farmakopėjoje aprašytą) ekstraktas. Kadangi skirtingos komponentinės sudėties ekstraktai gali pasižymėti ne tokiomis pačiomis savybėmis, maisto papildų gamintojai turėtų būti įpareigoti patikslinti savo naudojamo ekstrakto sudėtį.
1.2 Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėtis
Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausieji ekstraktai savo sudėtinių dalių kiekiais gali skirtis. Ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas EGb-761 yra pats populiariausias, su juo atliekama daugiausiai tyrimų. Jo sudėtiniai komponentai yra flavonolių glikozidai (24%), terpeno laktonai (6%), proantocianidinai (7%), karboksirūgštys (13%), alkilfenoliai (iki 5 m.d.), ne flavonolių glikozidai (20%), katechinai (2%) ir kiti, tarp kurių ir nežinomi, junginiai (28%) [9].
Flavonoidai – fenolinių junginių grupė, kurių pagrindą sudaro benzo--pirono fragmentas. Flavonoidai augaluose yra aglikonų ir glikozidų t.y. susijungę su cukrine dalimi, formos. Flavonoliai – viena iš flavonoidų klasių, kurios pagrindas – 3-hidroksiflavonas (žr. pav. nr. 1).
1 pav. Dviskiaučiams ginkmedžiams būdingų flavonolių struktūros
Ginkmedžių ekstrakte aptinkama apie 33 flavonoidų glikozidus, didžiausią dalį sudaro flavonolių kvercetino, izoramnetino ir kemferolio glikozidai. Flavonoidų aglikonai dažniausiai pasitaiko tik labai mažais kiekiais. Minėti flavonoliai nėra unikalūs dviskiaučių ginkmedžių junginiai, jie randami ir kituose augaluose [11].
Terpeno laktonai – ginkolidai ir bilobalidas, yra unikalūs ginkmedžio junginiai. Ginkolidai susideda iš spirononano žiedo, 3 laktono žiedų, tetrahidrofurano žiedo ir tretbutilo grupės ir skiriasi įvairiai prisijungusiomis hidroksi grupėmis (žr. pav. nr. 2). Tretbutilo grupė išskiria ginkolidus iš kitų augalinių junginių [9]. Bilobalidą sudaro izopreno ir laktono žiedų fragmentai (žr. pav. nr. 2) [2].
2 pav. Dviskiaučiams ginkmedžiams būdingų terpeno laktonų struktūros
Ekstraktuose aptinkami penki terpeno laktonai – ginkolidai A, B, C, J ir bilobalidas [12]. Ginkmedžių lapuose, šaknų žievėje bei sėklose nustatyti ginkolidai M, K, L, P, Q [6,13].
Ginkmedžių lapuose randama 4-12% proantocianidinų, o lapų ekstrakte – apie 7%. Ekstraktuose aptinkami: vienas trimerinis prodelfinidinas, trys dimeriniai prodelfinidinai [14].
EGB-761 yra 13% karboksirūgščių, jos būna ne fenolinės pvz.: askorbo, chininė, ir fenolinės pvz.: p-kumarininė. Laisvų rūgščių lapuose daugėja nuo pavasario ir daugiausia būna spalį. Tarp aptinkamų rūgščių yra viena reta, azoto turinti fenolinė rūgštis – 6-hidroksikinureninė rūgštis (6-HKA). Ji taip pat pasitaiko ekstraktuose [11].
Dviskiaučių ginkmedžių lapuose išskiriami šešių klasių alkilfenoliai: ginkolinės rūgštys, ginkoliai (kardanoliai), biloboliai, urušioliai, izorišioliai ir alfa-hidroksikardanoliai. Nevalytuose ekstraktuose jų aptinkama gana daug. Dėl savo įvairialypio neigiamo toksinio poveikio organizmui, ribojami etaloniniame ekstrakte iki 5 m.d. [11].
Kita klasė flavonoidų, aptinkamų ginkmedžių nevalytuose ekstraktuose – biflavonai: bilobetinas, ginkgetinas, izoginkgetinas, sciadopitisinas [11]. Jų, tiriant ekstraktus, galima rasti tik pėdsakus. Tai – palyginus nepoliniai junginiai, neišekstrahuojami gamybos metu naudojamais poliniais tirpikliais [12].
Aptikti pėdsakai izoflavonoido – genisteino. Kai kurių autorių nuomone – tai dviskiaučiui ginkmedžiui nebūdingas junginys, kuris rodo ekstrakto užteršimą [15].
Sausąjame dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakte nustatytos šios laisvosios aminorūgštys: prolinas (apie 1mg/100g) ir gama-aminosviesto rūgštis (77mg/100g). Kitų aminorūgščių kiekis neviršija 0,1 mg/100g pavyzdžio [16].
Taigi, nuo paprastų, ant medžio augančių, dviskiaučių ginkmedžių lapų, etaloninis ekstraktas skiriasi tuo, kad jame nėra ginkolidų M, K, L, P, Q, praktiškai nėra biflavonų, alkilfenolinių junginių, žymiai mažiau negu lapuose karboksirūgščių. Šie junginiai arba sunkiai ekstrahuojasi įprastai naudojamais tirpikliais, arba būna išvalomi.
1.3 Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto komponentų
farmakokinetika
Augalai ir jų ekstraktai savo sudėtyje turi labai daug skirtingų junginių, todėl farmakokinetiniai tyrimai, jei ir atliekami, ne visada naudingi – neaišku, kas veikia. Tačiau dviskiaučių ginkmedžių žaliava yra itin populiari, todėl mokslininkai net ir šiandien tyrinėja šio augalo pagrindinių junginių ir farmakokinetiką, ir farmakodinamiką [17]. Po daugelio farmakologinių tyrinėjimų prieita išvados, kad ginkmedžių ekstrakto poveikį sukelia terpeno laktonai bei flavonoliai. Farmakokinetiniai šių junginių rodikliai svarbūs nustatant fiziologinį bei farmakologinį poveikį, tinkamą vartojimo būdą bei išsiaiškinti galimas sąveikas su kitomis medžiagomis.
Pavartoti peroraliai ginkolidas A ir B bei bilobalidas nemetabolizuojami – jie patenka į kraujo plazmą nepakitę [18]. Vienintelis ginkolidas C – metilinamas ir į kraujo plazmą nepatenka [19,20]. Manoma, kad ginkolidai B, C ir J organizme gali būti dehidroksilinami ir paverčiami ginkolidu A. Tai
iš dalies paaiškina, kodėl ginkolidų C ir J praktiškai neaptinkama kraujo plazmoje. Tačiau šiai teorijai pagrįsti dar reikalingi papildomi tyrimai [21]. Tiriant žiurkių šlapimą, aptikti trys ginkolido B skilimo produktai. Šis metabolizmo kelias siejamas su CYP2D fermentais [22].
Terpeno laktonų maksimalios koncentracijos žmogaus kraujo plazmoje pasiekiamos gana greitai: tmax – 1-3h [23]. Įvairios studijos pateikia skirtingus rezultatus apie tai, kuris terpeno laktonas
maksimalią koncentraciją kraujo plazmoje (Cmax) pasiekia greičiau, kuris vėliau [20,23]. Terpeno
laktonų pusinės eliminacijos laikas (t1/2) žmogaus organizme varijuoja nuo 1 iki 11 valandų [23].
Ginkolido B t1/2 ilgiausias iš visų aktyvių komponentų [22], bet šio ginkolido Cmax yra mažesnis už
ginkolido A ar bilobalido. Pastebėta, kad ginkolido A bei bilobalido Cmax būna didesni, kai
pavartojamas ginkmedžių lapų ekstraktas, o ne grynos atitinkamo kiekio medžiagos. Vartojant ginkmedžių ekstraktą su maistu, terpeno laktonų tmax beveik padvigubėja, o Cmax sumažėja 30% [17].
Kadangi ginkmedžių ekstrakto veikimo taikinys gydant tam tikras ligas yra galvos smegenys, terpeno laktonai turėtų gebėti pereiti hematoencefalinį barjerą. Vieni autoriai nurodo, kad ginkolidai A ir B bei bilobalidas pereina šį barjerą [20], o bilobalidas egzistuoja neprisijungęs prie membranos tarpląsteliniame skystyje [24]. Kiti autoriai teigia, kad, nors terpeno laktonai palyginti vidutiniškai pereina membranas, sunkiai įtikima, jog pastarieji vis tiek galėtų pereiti hematoencefalinį barjerą [25].
Terpeno laktonai nedalyvauja enterohepatinėje cirkuliacijoje, tikslus jų metabolizmas nenustatytas. Iš dalies nepakitę jie greitai eliminuojami daugiausiai su šlapimu [17]. Žmogaus organizme jie šalinami ilgiau nei gyvūnų organizmuose. Trumpas t1/2 rodo menką šių junginių
kaupimąsi organizme [26]. Terpeno laktonų kiekis šlapime koreliuoja su pavartota ginkmedžių ekstrakto doze, todėl juos tinka naudoti kaip biožymenis [21].
Iš trijų daugiausiai dviskiaučių ginkmedžių ekstraktuose randamų flavonolių – kvercetinas aptinkamas gausiausiai [27]. Flavonoidų aglikonai yra absorbuojami prasčiau nei tų pačių flavonoidų glikozidai [26].
Flavonoliai gausiai metabolizuojami: pirmiausiai deglikozilinami storosios žarnos fermentų glikozidazių, likę aglikonai absorbuojami ir tulžies rūgščių surišami į gliukuronidus arba sulfatus, ir vėl išskiriami į žarnyną – vyksta enterohepatinė cirkuliacija. Dėl to flavonoliai išlieka organizme kur kas ilgiau nei terpeno laktonai [28].
Į plazmą neprasiskverbia nei flavonolių glikozidai, nei aglikonai. Plazmoje aptinkami keli šių junginių gliukuronidai, sulfatai, metilinti konjugatai. Flavonolių tmax yra apie 2h, t1/2 apie 2-4h [29].
Naudojant žiurkių modelį pastebėta, kad kartotinis ginkmedžių ekstrakto vartojimas padidina flavonolių koncentracijas kraujo plazmoje [30]. Galutiniai flavonolių metabolizmo produktai yra 3,4-dihidroksifenilacto rūgštis, homovanilinė rūgštis, 3-(4-hidroksifenil)propiono rūgštis, 3-(3-hidroksifenil)propiono rūgštis, benzoinė ir hipurinė rūgštys [17].
Ar flavonoliai ir/ar jų metabolitai, pereina hematoencefalinį barjerą, tvirtos nuomonės nėra. Vienur teigiama, kad flavonoidų metabolitai pereina barjerą, o tam tikrose smegenų srityse netgi aptinkami minimalūs kiekiai šių flavonolių aglikonų [30]. Kitur nurodoma, kad flavonolių glikozidai ir aglikonai blogai pereina membranas, todėl neprasiskverbia ir į smegenų audinius [25].
Intensyvus flavonolių metabolizmas galimai rodo, kad fiziologinį ir farmakologinį poveikį sukelia flavonolių metabolitai. Žmogaus storosios žarnos mikroflora, kurioje vyksta flavonolių deglikozilinimas, yra kur kas gausesnė nei žiurkių (su kuriomis atliekama dauguma tyrimų), todėl ar flavonolių metabolitų koncentracija koreliuoja su doze, dar lieka neaišku [28].
Apibendrinant galima sakyti, jog, nors terpeno laktonai žmogaus organizme praktiškai nemetabolizuojami, jie eliminuojasi greitai, o flavonoliai, nors metabolizuojami itin sparčiai, išlieka organizme ilgiau.
1.4 Fiziologinis dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto poveikis
Maisto papildai gali turėti tik mitybinį ar fiziologinį poveikį. Tačiau puikiai žinoma, kad dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas vartojamas ir kaip vaistas, t.y. sukelia farmakologinį poveikį – fiziologinius ar biocheminius pokyčius, kurie gali būti terapiniai, toksiniai arba mirtini. Europos Farmakopėjoje aprašytas ekstraktas PSO pripažintas vaistu demencijai gydyti, o nuo 2000 m. įtrauktas į ATC klasifikaciją [26]. Skirtumas tarp fiziologinio ir farmakologinio poveikio – dozė. Vokietijos Komisija E (Vokietijos valstybinė sveikatos agentūra) rekomenduoja ginkmedžių lapų ekstraktą kaip maisto papildą kasdien vartoti dozėmis nuo 80 iki 240mg, šį kiekį reikia suvartoti per 2 arba 3 kartus. Vidutiniškai siūloma vartoti 120mg kasdien. Dozė, kuri turi terapinį efektą, yra 120-300mg per dieną, vartojama nuo 3 iki 12 savaičių, priklausomai nuo gydomo sutrikimo. Pirmieji pastebimi teigiami pokyčiai galimi tik po mažiausiai 4 savaičių nepertraukiamo farmakologinės dozės vartojimo [31].Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto poveikis aiškinamas antioksidaciniu, laisvuosius radikalus surišančiu, trombocitų aktyvinantį faktorių (TAF) inhibuojančiu, membranas keičiančiu, gliukokortikoidų sintezę inhibuojančiu mechanizmu [31,32].
Kalbant apie maisto papildus, ginkmedžių lapų ir lapų sausojo ekstrakto sąvokos praktiškai sutapatinamos. Fiziologiniam maisto papildo poveikiui nurodyti vartojami teiginiai apie sveikatingumą. Teiginiai apie maistingumą dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto papildams netaikomi [33]. Šiuo metu Europos maisto saugos tarnyba (EMST) leidžia tokius su dviskiaučiu ginkmedžiu susijusius teiginius [34]:
1. Ginkmedžių lapai <kartu su nurodytomis kitomis augalinėmis žaliavomis> padeda apsaugoti nuo oksidacinio streso, nes juose esama polifenolių, katechinų, flavonolių
arba vitamino C. Poveikiui pasiekti vyresniems nei 14 metų vaikams ir suaugusiems reikia vartoti 200ml arbatos iš 1,5g ginkmedžių lapų 3-4 kartus per dieną;
2. Dviskiaučių ginkmedžių lapai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, t.y. augalas kaupia antioksidantus, medžiagas, apsaugančias ląsteles ir audinius nuo laisvųjų radikalų, ir tai gali padėti sustiprinti organizmo apsaugą. Antioksidacinis aktyvumas pasireiškia suvartojus 4,2-16,1 g grynų ginkmedžių lapų [35].
Teiginių priėmimui labai svarbus teisingas jų suformulavimas. Pavyzdžiui, EMST atmetė siūlytą sveikatingumo teiginį, kad ginkmedžių lapų ekstraktas „padeda esant klausos ir/ar regos sutrikimams“, tačiau vis dar laukiama atsakymo dėl teiginio, jog ekstraktas „palaiko akių ir ausų periferinę kraujotaką, todėl gali būti naudingas regėjimo ir klausos funkcijai palaikyti“. Pastarąjį teiginį patvirtina tyrimai ir su gyvūnais [36,37], ir su žmonėmis [38], be to jis neturi nuorodos į gydymą.
Siekiama patvirtinti teiginius, kad ginkmedžių lapų ekstraktas „palaiko normalų tiesiosios žarnos venų tonusą, vientisumą bei mikrocirkuliaciją“ taip pat „gerina kraujo mikrocirkuliaciją, padeda palaikyti normalią kojų venų kraujotaką“. Šiems teiginiams paremti kaip pavyzdys gali būti tyrimas su gyvūnais, kuriuo išsiaiškintas ekstrakto vazodilatacinis poveikis [39]. Tiriant ginkolidą B išsiaiškinta, kad pastarasis sumažina oksidacinę pažaidą, pagerina azoto monoksido prieinamumą ir vandenilio sulfido išsiskyrimą ir dėl to kraujagyslės mažiau pažeidžiamos įvairių veiksnių [40].
Bene aiškiausiai apibrėžtas šis teiginys, laukiantis patvirtinimo: „ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas (35-45:1), turintis 6% terpeno laktonų bei 24,5% ginkmedyje aptinkamų flavonoidų, ir kurio ekstrahentas – acetono ir vandens mišinys, padeda palaikyti protinį stabilumą, kai reikia trumpam, bet intensyviai susikoncentruoti arba esant stresiniam momentui, taip pat padeda išsaugoti dėl senatvės nykstančią atmintį, palaikyti pažinimo funkcijas, išsaugoti ir prisiminti faktus, palaikyti dėmesio koncentraciją“. Šis teiginys glaudžiai siejasi su ginkmedžių ekstrakto kaip vaisto indikacija: gydyti pažinimo funkcijų sutrikimus, sergant įvairios kilmės demencija. Įvairių tyrimų rezultatai dėl tokio ginkmedžių ekstrakto poveikio ir galimos naudos yra prieštaringi.
Atliekant eksperimentus su žiurkėmis, nustatyta, kad kasdieninis ginkmedžių lapų ekstrakto vartojimas mažai, bet reikšmingai palengvina naujų dalykų išmokimą ir pagerina trumpalaikę atmintį. Tačiau tęsiamas ekstrakto vartojimas nedaro įtakos, kai užduotys jau išmoktos. Kitaip sakant, pažinimo funkcijų gerinimas vartojant ekstraktą priklauso nuo mokymosi stadijos [41]. Senoms žiurkėms ekstrakto vartojimas pagerino erdvinę atmintį [42]. Ilgalaikis ginkmedžių ekstrakto vartojimas (14 dienų) šių gyvūnų kaktinėje smegenų dalyje padidino ekstraląstelinio dopamino ir šiek tiek mažiau noradrenalino kiekius. Pagerintas signalo perdavimas kaktinėje smegenų dalyje gali būti paaiškinimas, kodėl ginkmedžių ekstraktas pagerina pažinimo funkcijas [43].
Pažintinių funkcijų (budrumo, dėmesio, koncentracijos, atminties) stiprinimas vaistais ar maisto papildais kitaip gali būti vadinamas „kosmetine neurologija“ ar „akademiniu dopingu“. Šis terminas taikomas sveikiems žmonėms. Priešingai, nei tyrimuose su gyvūnais, tyrimai su žmonėmis rodo, kad nesvarbu, kokia doze ar kiek ilgai yra vartojamas dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas, sveikiems žmonėms nepagerėja jokios pažintinės funkcijos (atmintis, koncentracija, išmokimas, kalbėsena, reakcijos laikas ar dėmesys) [44,45]. Be to ekstraktas nepadeda išvengti demencijos, nei sveikiems, nei tiems, kurių pažintinė funkcija sutrikusi [46]. Tačiau pažintinių funkcijų nykimas gali būti šiek tiek lėtesnis [47].
Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto poveikių nagrinėjimas ir galimų pritaikymų ieškojimas vis dar domina mokslininkus. Kol kas tikslus šio ekstrakto dozės – poveikio profilis neapibrėžtas.
1.5 Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto vartojimo saugumas
Maisto papildas nelaikomas vaistu, jo reguliavimas yra paprastas, bet jį sudarantys augaliniai ekstraktai gali turėti sąveikų su vaistais, netikti nėščiosioms, žindyvėms ar vaikams bei paaugliams.Dėl dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto poveikio CYP fermentų sistemai šaltiniai pateikia skirtingas išvadas. Vieni autoriai teigia, kad ginkmedžių ekstraktas nesąveikauja su svarbiausiais CYP fermentais: CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1, ir CYP3A [48]. Kiti teigia, jog ginkolidai A ir B indukuoja CYP1A2, CYP3A [49], nurodo, kad didelė koncentracija ginkmedžių ekstrakto skatina CYP2D6 aktyvumą ir slopina CYP1A2 aktyvumą ir atvirkščiai, kai vartojama maža ekstrakto dozė [50,51]. Galimai nuo pavartotos dozės gali priklausyti ir CYP2C19 aktyvumas. Išaiškintas CYP2E1 aktyvumo ir CYP2B1/2 ekspresijos didėjimas priklausomai nuo bilobalido dozės [51]. Nuolatinis ginkmedžių ekstrakto vartojimas kartu su midazolamu (kuris gali būti laikomas indikatoriu CYP3A4 aktyvumui nustatyti), sumažina pastarojo metabolizmą. Toks ginkmedžio ekstrakto poveikis CYP3A4 taip pat yra ginčytinas – dažnai gaunami paradoksalūs rezultatai – midazolamo koncentracijos kraujyje sumažėja, dėl CYP3A4 indukcijos [52,53]. Dėl daugybės prieštaringų rezultatų. vartojimo su tam tikrais vaistais saugumą apibrėžti gali būti sunku.
P-glikoproteinas yra vienas geriausiai aprašytų vaistus pernešančių junginių. Flavonoliai kvercetinas, izoramnetinas ir kemferolis yra jo substratai [54]. Stipriau prisijungdami, jie didina kai kurių vaistų, kurie taip pat yra p-glikoproteino substratai, pvz.: talinololis, koncentraciją kraujyje ir taip prailgina veikimą. Todėl geriau ekstrakto nevartoti, kai vartojami vaistai, kurių farmakokinetikoje dalyvauja p-glikoproteinas [55].
Kiti tyrimai rodo, jog vartojant ginkmedžių ekstraktą kartu su metforminu, gliukozės kiekis kraujyje padidėja [56], ekstrakto trumpalaikis vartojimas kliniškai reikšmingai nekeičia bupropiono ir
hidroksibupropiono [57] bei per os vartojamo digoksino [58] farmakokinetikos, ekstraktas neturi adityvaus poveikio su risperidonu [59] bei skatina simvastatino metabolizmą [60].
Ginkolidai yra silpnai veikiančio trombocitų aktyvinamojo faktoriaus (TAF) antagonistai. Taigi, ekstraktas pasižymi trombocitų agregaciją mažinančiu poveikiu. Šis ginkolidų poveikis priklauso nuo ekstrakto dozės, yra greitai prasidedantis ir ilgai besitęsiantis [61]. Kol kas nepatvirtinta, kad ginkmedžių ekstraktas yra kliniškai reikšmingai trombocitų agregaciją mažinantis preparatas [62,63]. Analizuojant atskirus klinikinius atvejus, susijusius su ekstrakto vartojimu bei kraujavimu, neįrodyta, kad ekstraktas sukėlė kraujavimus, bet tokia tikimybė nepaneigiama [64]. Tikėtina, kad kraujavimai gali atsirasti dėl idiosinkrazinio arba, jeigu ekstraktas blogai išvalytas, ginkolinių rūgščių poveikio [63].
Dėl galimos kraujavimo rizikos ypatingai atidžiai nagrinėjamos sąveikos su krešėjimo sistemą veikiančiais vaistais. Nustatyta, kad, nuolat vartojant ginkmedžių ekstraktą, pavartojus vienkatinę varfarino dozę, vaisto farmakodinamika nepakinta [65]. Tiriant pacientus, kurie nuolat vartojo varfariną, ir skyrus jiems 100mg ginkmedžių ekstrakto keturias savaites, klinikinis varfarino poveikis taip pat nepakito [66]. Pavartojus ekstraktą kartu su aspirinu [67], tiklopidinu [68], klopidogreliu ir cilostazoliu [69], nenustatytas pernelyg didelis trombocitų agregacijos slopinimas, t.y. rizika krešėjimo funkcijai nepastebėta. Tačiau tai nereiškia, kad preparatų poveikis nėra adityvus [69,70] Visgi dauguma autorių, atlikę savo tyrimus, rekomenduoja atsargiai vartoti arba nevartoti ginkmedžių lapų ekstrakto žmonėms, kuriems padidėjusi kraujavimo rizika, bei kartu su krešėjimą veikiančiais vaistais.
Daugybės klinikinių tyrimų su etaloniniu ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu dėka, sukaupta nemažai informacijos apie ekstrakto toksikologines savybes. Ekstraktas nėra genotoksiškas, mutageniškas, nors tyrimuose in vitro (bet ne in vivo!) kemferolis ir kvercetinas rodo šiokį tokį mutageninį poveikį [71]. Ginkolinės rūgštys pasižymi citotoksiniu, mutageniniu, karcinogeniniu, genotoksiniu poveikiu [72]. Ypač didelių ekstrakto dozių (1-2 g/kg) vartojimas sukėlė vėžio vystymąsi graužikams [71]. Per didelės ginkmedžių ekstrakto dozės galėtų būti pavojingos ir žmonėms [73].
Ginkmedžių ekstraktas yra gerai toleruojamas. Šalutiniai ekstrakto vartojimo poveikiai yra virškinamojo trakto sutrikimai (viduriavimas, vidurių užkietėjimas, pilvo skausmas, pykinimas, vėmimas), galvos skausmas, nemiga, svaigulys, kraujavimas (iš nosies, iš virškinamojo trakto), odos išbėrimas, paraudimas, niežulys, pabrinkimas. Šios šalutinės reakcijos dažniausiai pavienės ir spontaniškos registruojamos įvairiuose klinikiniuose tyrimuose [1,31]. Ginkmedžių ekstrakto vienkartinis pavartojimas neturi įtakos vairavimui [74].
Kaip minėta anksčiau, ginkmedžių ekstrakto, kaip maisto papildo, vidutinė paros dozė – 120mg. Ekstraktas neskirtas vartoti jaunesniems nei 18 metų vaikams, nėščiosioms ir žindyvėms.
Apibendrinant galima teigti, kad dėl naujai atsirandančių ar netvirtų mokslinių išvadų, ginkmedžių ekstrakto reikėtų vengi vartojant vaistinių preparatų – CYP1A2, CYP2D6, CYP2E1,
CYP3A4, CYP2C19, p-glikoproteino substratų, taip pat su antikoaguliantais, trombocitų agregaciją slopinančiais vaistais, kitais vaistiniais preparatais, didinančiais kraujavimo riziką (pvz.: nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo).
1.6 Maisto papildų reguliavimas ir kokybės kontrolė
Europos Sąjungoje (ES) maisto papildų kontrole užsiima Europos Komisija (EK). Ji leidžia nurodymus, direktyvas, susijusias su maisto papildais, tvirtina leidžiamus sveikatingumo teiginius, nurodo rekomenduojamas paros normas ir panašiai. Visa maisto papildų politika vykdoma remiantis Direktyva 2002/46/EC, kuri daug kartų buvo skundžiama ES Teisingumo Teismui, kaip netinkama tarpvalstybiniam maisto papildų politikos harmonizavimui. Naujų maisto papildų reguliavimas apibrėžtas Nurodyme (EC) 258/97 [75]. Kol kas ne visi žingsniai atlikti, siekiant vieningos sistemos ES, klasifikuojant maisto papildus bei vaisinius preparatus. Įvairioms ES šalims būdingi skirtingi įstatymai ir registravimo procedūros [76].
Europos maisto saugos tarnyba (EMST), EK prašymu, taip pat ir savarankiškai, analizuoja mokslinę literatūrą, parengia informaciją apie sveikatingumo teiginius, vertina sveikatingumo teiginių priimtinumą, formuoja saugaus papildų vartojimo gaires [77].
„Teiginys apie sveikatingumą“ — teiginys, kuriuo teigiama ar užsimenama, kad esama ryšio tarp maisto produkto ir sveikatos [78]. Tokie teiginiai vartojami norint nurodyti fiziologinį poveikį, kurį sukelia maisto papildas. EMST specialistų grupė teiginį pripažįsta arba atmeta įvertinę visus atliktus tyrimus tam teiginiui pagrįsti: analizuojamas tyrimų mastas, nuoseklumas, patikimumas, kokybė, tiriamieji, tyrimai su gyvūnais ir in vitro. Analizuojami ir tie tyrimai, kurių rezultatai prieštarauja norimam patvirtinti teiginiui. Teiginys priimamas, jeigu išaiškinamas ir patvirtinamas ryšys tarp maisto papildo vartojimo ir jo sukeliamo poveikio, bei atmetamas, jeigu ryšys nerandamas arba nepakanka mokslinės informacijos jo įvertinimui. EMST gali pasiūlyti tinkamą teiginio formulavimą, bet neatsako už tai, kaip pirkėjas supranta teiginį [77-79].
JAV maisto papildų reguliavimu užsiima Maisto ir vaistų administracija (FDA). Ši organizacija taip pat tikrina maisto papildų saugumą, po jų patekimo į rinką. Gamintojai, įsidiegę Geros Gamybos Praktiką, gali rinkai pateikti savo produktus ir neregistruodami jų FDA, bet turi užtikrinti, kad jų pateiktas ženklinimas ant pakuotės yra teisingas [76].
Nuo 1998 m. įkurtas Tarptautinis Maisto Papildų Asociacijų Aljansas – IADSA (angl.
International Alliance of Dietary/Food Supplement Associations). Dabar jis apima daugiau nei 9500
kompanijų. Šio aljanso pagrindinis tikslas – užtikrinti, kad gamintojai atsižvelgtų ir laikytųsi įstatymų, susijusių su maisto papildais [76].
Lietuvos Respublikoje nuo 2016 metų balandžio 15 dienos maisto papildų notifikavimą (pranešimą apie papildą) iš Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto (NMVRVI) perėmė Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba (VMVT) [80]. Remiantis LR įsakymu B1-275, Lietuvos Respublikoje draudžiama parduoti nenotifikuotus, t.y. neįtrauktus į Maisto papildų sąrašą, maisto papildus [80]. Notifikuodamas maisto papildą, subjektas privalo pateikti laboratorinius duomenis su naudotais metodais, įrodančiais, kad maisto papilde esančių medžiagų, darančių poveikį (mitybinį, fiziologinį ar turinčių maistinių medžiagų), kiekis atitinka papildo etiketėje nurodytą [80].
Ženklinant, pristatant bei reklamuojant maisto papildus, jiems negali būti priskiriamos gydomosios ar profilaktinės savybės [81]. Tik tam tikrais atvejais, teiginiai apie ligos profilaktiką yra leistini [78]. Prekybos subjekto ir ženklinimo teisingumo patikrinimai yra vieni iš VMVT vykdomų maisto papildų kontrolės veiklų. Šie tikrinimai atliekami pagal galiojančius Lietuvos Respublikos teisės aktus. VMVT užtikrina, kad notifikuojamas maisto papildas tikrai nėra vaistinis preparatas.
Aprašytos institucijos turėtų užtikrinti, kad vartotojams pasiekiami maisto papildai su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu būtų autentiški. Ginkmedžių lapų ekstrakto sudėties klastojimas susijęs su didele ekstrakto produktų paklausa ir apima:
1. Pigiau išgaunamų flavonolių glikozidų/aglikonų (ypač rutino ir kvercetino) pridėjimą į ekstraktą [82,83];
2. Kitų augalų ekstraktų, kurių sudėtis panaši į ginkmedžių lapų ekstrakto, pridėjimą; 3. Kitų dviskiaučio ginkmedžio žaliavų (žievės, šaknų, sėklų) panaudojimą
ekstrahavimui;
4. Ekstrahavimo technologijos pakeitimą, pavyzdžiui, pigesnių, bet nuodingesnių ektrahentų (pvz.: vandenilio chlorido rūgšties) panaudojimą [84,85].
Nors veikia ne viena institucija, reguliuojanti maisto papildų kokybę, mokslinėje literatūroje vis dar aprašomas dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto falsifikavimas, kuris vartotojui yra nepastebimas.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1 Metodikos pagrindimas
Augalinių žaliavų ir ekstraktų kokybės nustatymui naudojami specifiniai žymenys, kurie gali būti 7 rūšių [86]. Ginkmedžių ekstrakto kokybei nustatyti ieškomi cheminiai „pirštų anspaudai“, t.y. tokie junginiai, kurie turi spektroskopiškai ar chromatografiškai nustatytus profilius. Šie žymenys yra flavonolių glikozidai (aglikonai: kvercetinas, kemferolis ir izoramnetinas) ir terpeno laktonai (ginkolidai A, B, C ir bilobalidas) [87,88].
Ginkolidai yra aukštos lydimosi temperatūros, nelakūs junginiai. Ginkolidas B yra mažiausiai poliškas, ginkolidas C — labiausiai poliškas. Bilobalidas yra žymiai nepatvaresnis palyginus su kitais terpeno laktonais (esant pH > 7, tampa nestabilus, negali būti derivatizuotas dujų chromatografijos (DC) metodui). Bilobalidas nesuyra flavonoidų hidrolizei naudojant vandenilio chlorido rūgštį, tačiau rūgštis gali veikti ginkolidą A [11].
Terpeno laktonus geriausia ekstrahuoti poliniais ar vidutiniškai poliniais tirpikliais, tokiais kaip žemesnieji alkoholiai, tetrahidrofuranas, acetonas, etilacetatas. Ginkolidai ir bilobalidas vidutiniškai tirpsta dietilo eteryje, vandenyje. Netirpsta tokiuose nepoliniuose tirpikliuose kaip chloroformas, toluenas, heksanas. Dažniausiai naudojami vandens ir metanolio mišiniai [11,89].
Terpeno laktonų atskyrimui mažai tinka dujų chromatografija, nes tai – nelakūs junginiai, juos reikia sililinti (t.y. įterpti į molekules keletą sililo grupių, kad junginys taptų lakesnis, labiau garuotų, būtų gauta geresnė jo fragmentacija), be to bilobalidas negali būti derivatizuojamas. Ginkolidus ir bilobalidą gana lengva atskirti plonasluoksne chromatografija (PC) silikagelyje, tik prieš tai silikagelį reikia impregnuoti, galima naudoti kelias tirpiklių sistemas. Be impregnacijos chromatografavimo plokštelėje visi tiriamieji junginiai susilieja į vieną bendrą dėmę, o ne išsiskiria fragmentais. Impregnuojant per ilgai (pvz.: 20sek.), tiriamieji gaunami suartėję vienas prie kito, sunku juos atskirti. Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra tinkamas metodas terpeno laktonams analizuoti tiek kokybiškai, tiek kiekybiškai, nereikalinga derivatizacija. Rutininiam nustatymui tinkami garinantis šviesos sklaidos (ELSD) ir lūžio rodiklio (refraktometrinis) (RI) detektoriai. Pirmasis detektorius yra jautresnis. ELSD nustatomas junginys turi būti labai švarus, bet koks prie ieškomo junginio prisijungęs komponentas, labai padidina chromatografinę smailę. Lūžio rodiklio detektorius yra mažiau jautrus, bet labiau prieinamas. UV detektoriai netinka, nes terpeno laktonai yra blogi chromoforai, moliniai absorbcijos koeficientai ε yra maži, spektrai susilieja su kitų medžiagų, absorbuojančių 200-220 nm ilgio bangas, spektrais. Net ir mažas kiekis pašalinių junginių trukdo nustatyti juos efektyviąją skysčių chromatografija su UV detektoriumi. ESC tinkamas masių spektrometras, tačiau jis yra brangus, nenaudojamas rutininei analizei. Dėl tos pačios priežasties terpeno laktonai retai tiriami kapiliarine
elektroforeze, superkritinių skysčių chromatografija, infraraudonųjų spindulių spektroskopija, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija [11].
Nors ginkmedžių ekstrakte aptinkama daug flavonoidų, po rūgštinės hidrolizės lieka trys pagrindiniai aglikonai: kvercetinas, izoramnetinas ir kemferolis. Flavonoidų hidrolizė yra būtina, nes prisijungę skirtingo dydžio cukrūs dažniausiai trukdo analizei. Patys aglikonai pasitaiko tik labai mažais kiekiais [11].
Flavonoidų ekstrakcijai naudojami vandens ir etanolio, vandens ir acetono mišiniai, grynas metanolis. Flavonoidų atskyrimui ir analizei po hidrolizės tinka dujų chromatografija, tačiau juos taip pat reikia sililinti, detektoriumi dažniausiai naudojamas masių spektrometras. Paprastesnis atskyrimo būdas – ESC, aptikimui naudojamas UV detektorius, esant 330nm – 370nm UV šviesos ilgio bangai. Taip pat aptikimui po ESC tinka densitometrija (atliekama 280nm bangos ilgyje). Kokybiniam greitam ir dažnam nustatymui tinkama plonasluoksnė chromatografija. Rutininei analizei, taip pat kaip ir terpeno laktonams, nenaudojami brangūs analizės metodai [11,84].
Įgyvendinant šio mokslinio darbo tikslą – nustatyti ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėties įvairavimą maisto papilduose, – nuspręsta analizuoti pasirinktų tyrimo objektų kokybinę bei kiekybinę sudėtį. Kaip minėta anksčiau, ginkmedžių ekstrakto cheminiai žymenys yra flavonoliai bei terpeno laktonai [11,87,88], todėl pasirinkti tyrimo metodai būtent šių junginių analizei. Maisto papildų cheminių junginių profiliui nustatyti buvo pasitelkta ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija su daugybine fragmentacija (UESC-MS/MS) bei efektyvioji plonasluoksnė chromatografija (EPC). Atliekant UESC-MS/MS analizę naudoti tiriamųjų objektų nehidrolizuoti ekstraktai, nes tai leidžia atsiskleisti visumą flavonoidų, kurie natūraliai egzistuoja tiriamajame objekte. EPC pasirinkta dėl metodo paprastumo bei efektyvumo. EPC taip pat pritaikyta kiekybiniam rutino nustatymui. Kiekybinei terpeno laktonų analizei taikyta ESC su RI detektoriumi.
Tiriamieji objektai buvo rinkti iš Lietuvoje notifikuotų maisto papildų sąrašo, kurį skelbia VMVT savo internetiniame puslapyje. Pasirinkti tie papildai su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu, kurių notifikavimo nagrinėjimas tuo metu (2016 m. rugsėjo mėn.) buvo baigtas. Pirmenybė teikta maisto papildams, kurių kilmės šalimi nurodyta Lietuva, taip pat tiems, kurių deklaruojamas ekstrakto kiekis didžiausias, atsižvelgta į maisto papildo populiarumą (reklamavimą, dažnai taikomas nuolaidas). Pagal šiuos kriterijus nuspręsta tirti penkis maisto papildus (žr. lentelę nr. 1). Dviejų maisto papildų gamintojai nurodo, kad jų dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas yra „standartizuotas“, daroma prielaida, kad tai etaloninis ekstraktas – aprašytas Europos Farmakopėjoje. Vienas gamintojas deklaruoja, kad jo teikiamame ginkmedžių ekstrakte yra 24% flavonų glikozidų ir 6% terpeno laktonų. Kiti du gamintojai savo dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto sudėties nedetalizuoja.
1 lentelė Pasirinkti tiriamieji objektai
Pavadinimas Farmacinė
forma Ekstrakto kiekis 1 vnt., mg
Gamintojas Kilmės šalis
GinkoPrim max tabletė 100 WALMARK Čekija
HighWay Ginkgo
Memory Complex kapsulė 80 UAB Losbalt Lietuva
Memoril forte kapsulė 80 UAB Aconitum Lietuva
AMBIO ginkmedis kapsulė 70
Laboratorium Galenowe Olsztyn Sp. z o.o. ES, pagaminta pagal UAB „Limedika“ užsakymą „Gamtos namai“
Ginkmedžio ekstraktas tabletė 60 UAB „Biosola“ Lietuva
Parinkti tiriamieji objektai toliau darbe minimi koduoti raidėmis D, E, G, H ir J. Vienas tiriamasis visada atitinka tą pačią raidę.
2.2 Reagentai, priemonės ir aparatūra
Reagentai: distiliuotas vanduo, metanolis, 96% etanolis, natrio acetatas, toluenas, etilo
acetatas, acetonas, acto rūgštis, bevandenė acto rūgštis, skruzdžių rūgštis, NP reagentas (0,01g/ml difenilboro rūgšties aminoetilesterio tirpalas metanolyje), makrogolio reagentas (0,05g/ml polietilenoglikolio 400 tirpalas dichlormetane), praskiesta vandenilio chlorido rūgštis, benzenas, chloroformas, acto rūgšties anhidridas, 0,1% aliuminio chlorido metanolinis tirpalas, acetonitrilas, tetrahidrofuranas.
Standartai:
1. Dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis kiekybiškai įvertintas ir valytas ekstraktas, milteliai (CEP (atitinka EF 1827 monografiją), EDQM);
2. Terpeno laktonų standartų mišinys, milteliai (USP, Rockville, MD, JAV): 1 mg yra 0,47mg bilobalido; 0,28mg ginkolido A; 0,17mg ginkolido B; 0,041mg ginkolido C; 0,11mg ginkolido J, tirpiklis – metanolis;
Priemonės:
1. 10x10cm dydžio stiklinės efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos plokštelės, padengtos silikageliu 60 F254 (Merck KGaA Sigma-Aldrich);
2. EPC švirkštai 10,0 ml 695,0014 (Linomat, CAMAG); 3. Kaitinimo vonelė;
4. 10,0 ml talpos kaitinimo buteliukai su spaudimui atspariomis membranomis ir padidintam vidiniam slėgiui atspariais kamšteliais;
5. Chromatografavimo kamera 10x10cm (CAMAG); 6. Plaukų džiovintuvas su vėsaus oro pūtimo funkcija; 7. Ultragarso vonelė;
8. Centrifuga;
9. Kolonėlė C18 (100*2,0 mm) (YMC Triart); 10. Kolonėlė – ACE 5 C8 (250*4,6 mm).
Aparatūra:
1. Mėginių užnešimo aparatas Linomat 5200894 (CAMAG);
2. Chromatografinių plokštelių kaitlentė TLC Plate Heather III (CAMAG); 3. Aparatas Visualizer 201669 (CAMAG) (UV šviesos šaltinis);
4. Ryškinimo reagentų užpurškimo aparatas;
5. Ultra efektyvusis skysčių chromatografas Acquity H-class (Waters, JAV); 6. Masių spektrometras su trigubu kvadrupoliniu masių analizatoriumi Xevo TQD
(Waters, JAV);
7. Efektyvusis skysčių chromatografas Waters e2695 (Waters, JAV); 8. Refraktometrinis detektorius 2414 RI Detector (Waters, JAV).
Statistinis duomenų apdorojimas: kiekybinės analizės duomenys apdoroti naudojant IBM
SPSS Statistics (24.0.0.0 versija, 2016) programos paketą įvertinant trijų matavimų rezultatus. Skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, kai reikšmingumo lygmuo p<0,05.
2.3 Tiriamųjų objektų junginių profilio nustatymas
2.3.1 Ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija
Tiriamųjų objektų ir valyto ir kiekybiškai įvertinto dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto tirpalų paruošimas: po 1g susmulkintų atskirų maisto papildų pavyzdžių (D, E, G, H, J) bei20mg ginkmedžių lapų ekstrakto užpilama 10ml metanolio ir vandens mišiniu (8:2 V/V). Užkimšus gumine membrana ir aliuminio dangteliu šildoma vandens vonelėje 10 min. Atvėsus nufiltruojama.
Tirpalai analizuojami ultra efektyviuoju skysčių chromatografu bei masių spektrometru su trigubu kvadrupoliniu masių analizatoriumi. Naudojama elektropurkštuvinė jonizacija neigiamame režime. Eliuentas A – vanduo su 0,1% skruzdžių rūgštimi, eliuentas B – acetonitrilas, tėkmės greitis – 0,5ml/min, kolonėlės temperatūra – 40°C, kapiliaro įtampa – 2,50 kV (neigiama). Lentelėje nr. 2 nurodytas naudotas gradientas.
2 lentelė UESC-MS/MS naudotas gradientas Laikas, min Tėkmės greitis,
ml/min Eliuentas A, % Eliuentas B, %
0,00 0,5 95,0 5,0 1,00 0,5 95,0 5,0 5,00 0,5 70,0 30,0 7,00 0,5 50,0 50,0 7,50 0,5 0,0 100,0 8,00 0,5 0,0 100,0 8,10 0,5 95,0 5,0 10,00 0,5 95,0 5,0
Atlikus UESC-MS/MS analizę gauti dviskiaučių ginkmedžių lapų valyto ir kiekybiškai įvertinto sausojo ekstrakto bei penkių tiriamųjų objektų cheminių junginių masių spektrai – profiliai. Šis gautas „pirštų anspaudų“ profilis netinka tiksliai kiekybei įvertinti, tačiau yra gana išsamus ir gali parodyti tam tikrų junginių nebuvimą produkte. Metodas netinka tiksliam terpeno laktonų nustatymui, nes vyksta dimerų formavimasis, be to tokį patį sulaikymo laiką (RT) turi ir kiti fragmentai – vyksta koaliucija – smailės spektre neatsiskiria.
Atitinkami junginiai pagal sulaikymo laiką (RT) ir masės-krūvio santykį (m/z) identifikuojami naudojantis žinynais bei mokslinės literatūros šaltiniais (žr. lentelę nr. 3) [90].
3 lentelė UESC-MS/MS spektruose nustatomi junginiai Sulaikymo
laikas RT, min Fragmento m/z Galimas junginys
4,35 577; 739 Proantocianidinas, kemferolis + 3 cukrūs
4,49 771 Kemferolis + 3 cukrūs
4,69 625 Kvercetinas + 2 cukrūs
Lentelės tęsinys
Sulaikymo
laikas RT, min Fragmento m/z Galimas junginys
4,75 253; 415; 461 Dihidroksiflavonas ir du nežinomi junginiai
4,76 755 Kemferolis + 3 cukrūs
5,15 609 Rutinas (kvercetin-3-rutinozidas)
5,30 383; 439; 879 Ginkolidas C ir kiti du junginiai
5,53 593 Kemferolis + 2 cukrūs 5,62 623 Izoramnetinas + 2 cukrūs 5,73 477 Kvercitrinas (aglikonas) 5,75 577 Proantocianidino dimeras 5,80 431 Apigeninas + 1 cukrus 5,86 593 Kemferolis + 2 cukrūs 6,19 755 Kemferolis + 3 cukrūs 6,50 739 Kemferolis + 3 cukrūs
6,60 351; 367; 423; 847 Ginkolidas B, fenolinės rūgštys
6,72 285 Liuteolinas (aglikonas)
6,88 301 Kvercetinas (aglikonas)
7,43 269 Apigeninas (aglikonas)
7,53 285 Kemferolis (aglikonas)
7,66 315 Izoramnetinas (aglikonas)
BPI (angl. base peak intensity) chromatogramose to paties junginio sulaikymo laikas RT gali skirtis ±0,01 reikšme.
2.3.2 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija
Naudojami UESC-MS/MS metodikoje aprašyti ir pagaminti tirpalai (žr. sk. 2.3.1).
Kokybinis terpeno laktonų nustatymas tiriamuosiuose objektuose: 8g natrio acetato
ištirpinama 200ml etanolio ir vandens mišinyje (6:4 V/V). Chromatografavimo plokštelė įmerkiama į šį tirpalą 2 sekundes, džiovinama kambario temperatūroje traukos spintoje 5 min. Po to 30 minučių aktyvuojama kaitinant ant 90°C temperatūros įkaitintos plonasluoksnės chromatografijos plokštelių kaitlentės. Naudojant mėginių užnešimo aparatą Linomat, chromatografavimo plokštelė padengiama 8mm ilgio ruoželiais terpeno laktonų standartų mišinio (3µl), dviskiaučio ginkmedžio lapų kiekybiškai įvertinto ir valyto ekstrakto (7µl) bei tiriamųjų (po 5µl) tirpalais. Mėginių užpurškimui naudojamos
azoto dujos. Tarp ruoželių išlaikomas mažiausiai 2mm tarpas, nuo apatinio krašto paliekamas ne mažiau kaip 8mm atstumas. Plokštelė patalpinama į garų prisotintą chromatografavimo kamerą su tirpiklių sistema: tolueno – etilacetato – acetono – metanolio (10:5:5:0,6 V/V) mišinys. Ištraukiama, kai mobilioji fazė užkyla likus 1cm iki plokštelės viršutinio krašto. Išdžiovinama kambario temperatūroje traukos spintoje. Plokštelė tiesiogiai derivatizuojama apipurškiant acto rūgšties anhidridu. Tada pakaitinama 180°C t-roje 10min. Detekcija atliekama prie 366nm UV šviesos bangos ilgio Visualizer aparatu. Ginkolidų A, B, C ir bilobalido buvimas nustatomas pagal vaizdo atitikimą standartui bei apskaičiavus Rf reikšmes. Eksperimentas kartojamas tris kartus.
Kokybinis flavonoidų nustatymas ginkmedžių maisto papilduose: kokybinis flavonoidų
nustatymas atliktas nustatant rutiną. EPC plokštelė padengiama 8mm ilgio ruoželiais rutino standarto (6µl), dviskiaučių ginkmedžių lapų kiekybiškai įvertinto ir valyto ekstrakto (7µl) bei tiriamųjų (po 5µl) tirpalais. Tarp ruoželių išlaikomas mažiausiai 2mm tarpas, nuo apatinio krašto paliekamas ne mažiau kaip 8mm atstumas. Užnešimui naudojamos azoto dujos. Plokštelė patalpinama į garų prisotintą chromatografavimo kamerą su tirpiklių sistema: etilacetatas – acto rūgštis – skruzdžių rūgštis – vanduo (10:1,1:1,1:2,7 V/V). Kai tirpiklių sistema užkyla likus 1 cm iki plokštelės viršutinio krašto, plokštelė išimama ir išdžiovinama pučiant vėsų orą plaukų džiovintuvu. Ryškiausi rezultatai gaunami, kai plokštelė 3 minutes kaitinama ant kaitlentės 100°C temperatūroje, po to vis dar šilta apipurškiama NP reagentu ir, išdžiūvus jai, apipurškiama makrogolio reagentu, analizuojama esant 366nm UV šviesos bangos ilgiui. Rutinas identifikuojamas pagal būdingą vaizdą bei Rf reikšmę. Eksperimentas
kartojamas tris kartus.
Mokslinėje literatūroje nerasta duomenų apie EPC metodiką, paremtą būdingų kvercetino (be kvercetino glikozido – rutino), izoramnetino ar kemferolio aglikonų ir/ar glikozidų nustatymu.
2.4 Tiriamųjų objektų kiekybinė analizė
2.4.1 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija
Efektyviosios plonasluoksnės chromatografijos plokštelė, naudota flavonoidų kokybei analizuoti, apšviečiama 366nm ilgio UV šviesos banga, gautas vaizdas užfiksuojamas Vizualizer aparatu. Eksperimentas kartojamas tris kartus. Rutino kiekis tiriamuosiuose objektuose apskaičiuojamas pagal rutino kalibracinės kreivės lygtį:
Y=1,57*105*x+7,53*103, čia x – rutino koncentracija mg/ml, Y – tiriamojo objekto rutino chromatografinės smailės plotas.
2.4.2 Efektyvioji skysčių chromatografija su refraktometriniu detektoriumi
Tiriamųjų tirpalų paruošimas: atsveriama po 1,250 g (tikslus svėrinys) kiekvieno tiriamojo objekto (kapsulių turinio arba sutrintos tabletės), užpilama 7,5ml metanolio ir vandens mišiniu (1:1 V/V), gerai sumaišoma ir laikoma ultragarso vonelėje 5min. Tirpalas nuskaidrinamas centrifuguojant ir viršutinis tirpalo sluoksnis nupilamas į 25ml tūrio matavimo kolbutę. Likusios nuosėdos užpilamos 7,5ml metanolio ir praskiestos vandenilio chlorido rūgšties R mišiniu (1:1 V/V), gerai sumaišoma ir laikoma ultragarso vonelėje 5min. Tirpalas nuskaidrinamas centrifuguojant ir viršutinis tirpalo sluoksnis nupilamas į tą pačią 25ml tūrio matavimo kolbutę. Ekstrakcija kartojama dar kartą užpilant 7,5ml metanolio ir praskiestos vandenilio chlorido rūgšties R mišinio (1:1 V/V). Į matavimo kolbutę surinkus trečią frakciją, praskiedžiama iki 25ml žymės tirpikliu metanolis-vanduo (1:1 V/V), sumaišoma. 10ml gauto tirpalo perkeliama į 10ml talpos buteliuką su spaudimui atsparia membrana ir padidintam vidiniam slėgiui atspariu kamšteliu. Buteliukas kaitinamas vandens vonelėje 2,5 val. Tirpalas vėsinamas kambario temperatūroje. Jeigu krenta nuosėdos, palaukiama, kol jos nusistovės, ir filtruojama per ne didesnio nei 0,45µm porų diametro membraninį filtrą. Tiriamųjų tirpalai perkeliami į chromatografo darbui pritaikytus buteliukus taip, jog buteliukuose neliktų oro.Izokratinėmis sąlygomis naudojamas eliuentas tetrahidrofuranas – metanolis – vanduo (10:20:75 V/V), tėkmės greitis – 1ml/min. Injekcijos tūris - 100µl, kolonėlės temperatūra – 25°C, detektoriaus – 35°C. Kiekvienam tiriamajam eksperimentas kartojamas tris kartus. Ginkolidai A, B, C bei bilobalidas tiriamuosiuose objektuose identifikuojami pagal terpeno laktonų standartų mišinio komponentų sulaikymo laikus (žr. priedus nr. 6-11), kiekiai nustatomi pagal kalibracines ginkolidų A, B, C ir bilobalido kreivių lygtis.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Tiriamųjų objektų cheminių junginių profiliai
3.1.1 Ultra efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija
Visų tiriamųjų objektų cheminių junginių profiliai lyginami su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo valyto ir kiekybiškai įvertinto ekstrakto profiliu, gautu tokiu pačiu metodu (žr. pav. nr. 3).3 pav. Dviskiaučių ginkmedžių lapų valyto ir kiekybiškai įvertinto sausojo ekstrakto UESC-MS/MS chromatograma
Etaloninio ekstrakto spektre matyti aiškios, charakteringos smailės: dauguma junginių – kemferolio glikozidai. Etaloniniame ekstrakte flavonoidų aglikonų turėtų būti tik minimalus kiekis, nes jie atsiranda po flavonoidų hidrolizės ir rodo netinkamą produkto ekstrakciją, gamybos išvystymą arba laikymą [91]. Kemferolio ir izoramnetino aglikonų procentinis kiekis mažas, kvercetino aglikono – didelis. Šio ekstrakto spektre nėra apigenino „piršto anspaudo“. Pastarojo flavonoido dviskiaučių ginkmedžių lapuose randama apie pusantro karto mažiau nei rutino [92].
4 pav. Tiriamojo objekto D UESC-MS/MS chromatograma
Tiriamojo objekto D spektras siauresnis už etaloninio ekstrakto – ryškios kvercetino, kemferolio aglikonų smailės, išskiriami trys kemferolio glikozidai (žr. pav. nr. 4).
Mažiau atsiskyrusios chromatogramos smailės stebimos tiriamojo objekto E spektre (žr. pav. nr. 5). Tiriamajam E būdingas apigeninas, galima išskirti penkis kemferolio glikozidus.
6 pav. Tiriamojo objekto G UESC-MS/MS chromatograma
Tiriamojo objekto G profilis išsiskiria charakteringa apigenino smaile (žr. pav. nr. 6). Šiame profilyje taip pat išskiriamas liuteolinas. Paprastai dviskiaučių ginkmedžių lapuose liuteolino būna apie penkis kartus mažiau nei rutino, įvairiose ekstrakto formose jo randami kiekiai skiriasi [92]. Spektre galima išskirti tris kemferolio glikozidus.
7 pav. Tiriamojo objekto H UESC-MS/MS chromatograma
Tiriamojo objekto H ekstrakte (žr. pav. nr. 7) išskiriami septyni kemferolio glikozidai, ryški kvercetino ir apigenino aglikono smailė.
J maisto papildo (žr. pav. nr. 8) spektre išskiriami septyni kemferolio glikozidai. Pavyzdyje identifikuotas apigeninas ir jo glikozidas, nemažas kiekis kvercetino, kemferolio, izoramnetino aglikonų.
Visuose tiriamuosiuose objektuose identifikuoti būdingi ginkmedžių ekstraktui flavonoliai – kvercetinas, kemferolis, izoramnetinas. Laisvų aglikonų kiekis yra sąlyginai didelis lyginant su flavonolių glikozidais. Visi tiriamieji turi rutino.
Iš penkių tirtų maisto papildų, keturiuose nustatyta būdinga kemferolio glikozidų (sulaikymo laikai atitinkamai 5,86, 6,19 ir 6,50) triada. Ji neišryškėjo maisto papildo G spektre.
Penkiems maisto papildams būdingas apigeninas (RT – 7,43). Tiriamąjame D apigenino kiekis minimalus, o kituose tiriamuosiuose – santykinai didelis. Apigenino smailė nebūdinga etaloniniam ekstraktui.
Tiriamųjų profiliuose, išskyrus papildą G, yra duomenų apie ginkolido B ir C buvimą (RT atitinkamai 6,60 ir 5,50).
Tokius pačius dviskiaučių ginkmedžių lapų maisto papildų ekstraktus (metanolio ir vandens mišinio 8:2) tyrė Ispanijos mokslininkai [93]. Ultra efektyviąja skysčių chromatografija su kvadrupoline jonų gaudykle ir masių spektrometro detektoriumi (UHPLC-Orbitrap-MS) tirti lenkiški bei ispaniški maisto papildai. Šešiuose iš vienuolikos aptikti sąlyginai dideli kemferolio aglikono kiekiai lyginant su glikozidais. Šie mokslininkai pritaria minčiai, kad tokie dideli aglikonų kiekiai gali būti klastojimo arba degradacijos pasekmė. Iš vienuolikos tiriamųjų, penkiuose liuteolinas nenustatytas, o keturiuose papilduose liuteolino aptikta gana daug. Ypatingai tarp papildų besiskiriančius liuteolino ir kitų flavonoidų kiekius autoriai aiškina skirtingu žaliavos rinkimo metu, laikymo sąlygomis, produkto yrimo procesais [93].
JAV mokslininkai ultra efektyviąja skysčių chromatografija diodų matricos analizatoriumi bei kvadrupoliniu lėkio trukmės analizatoriumi su masių spektrometro detektoriumi (UHPLC-DAD-QToF-MS) tyrė 25 metanolines ištraukas iš maisto papildų su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu [15]. Šie mokslininkai identifikuotus didelius flavonolių aglikonų kiekius aiškina ne tik galimai vykusia hidrolize, bet ir ekstraktų klastojimu pridedant japoninio svirmedžio (lot.
Styphnolobium japonicum) vaisių arba žiedų ekstraktų. Minėto augalo žaliava gana gausiai kaupia
rutino bei kvercetino, taip pat kemferolio, izoramnetino bei genisteino [94]. Autoriai aiškina, jog genisteinas visai nebūdingas ginkmedžių ekstraktams, todėl jo iš viso neturėtų būti randama. Mokslininkai teigia, kad 11 iš 25 maisto papildų buvo užteršti japoninio svirmedžio žaliavų ekstraktais, vienas iš tiriamųjų pasižymėjo ypatingai dideliais, ginkmedžių lapams nebūdingais, flavonolių kiekiais.
Lietuvoje parduodamuose maisto papilduose su dviskiaučių ginkmedžių lapų sausuoju ekstraktu taip pat sąlyginai didelis flavonolių aglikonų kiekis, vienur liuteolino aptinkama, kitur – ne, kai kur būdingi dideli apigenino kiekiai.
Šis tyrimas atskleidė bendrą tiriamųjų maisto papildų profilį, iš kurio galima spręsti apie naudojamų ginkmedžių ekstraktų kokybę: palyginamas būdingų flavonolių aglikonų ir glikozidų santykinis kiekis, charakteringų smailių atitikimas etalonui, įvertinamas kitų flavonoidų (apigenino, liuteolino) santykinis kiekis bei ginkolido B ir C galimas buvimas ekstrakte.
3.1.2 Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija
EPC metodu nustatytas terpeno laktonų buvimas tiriamuosiuose objektuose (žr. pav. nr. 9).
9 pav. Tiriamųjų objektų terpeno laktonų chromatograma po derivatizacijos esant 366nm UV šviesos ilgio bangai (1 - terpeno laktonų standartų mišinys; 2 - ginkmedžių lapų valytas ir kiekybiškai įvertintas sausasis ekstraktas; 3 – tiriamasis objektas D; 4 – tiriamasis objektas E; 5 –
tiriamasis objektas G; 6 – tiriamasis objektas H; 7 – tiriamasis objektas J)
Remiantis JAV Farmakopėja, terpeno laktonų standartų mišinio junginiai išsidėsto tokia Rf
mažėjančia tvarka: bilobalidas, ginkolidas A, B, J ir C [95]. Rf reikšmės atitinkamai 0,41; 0,32; 0,26;
kiekybiškai įvertintame sausajame ekstrakte identifikuoti visi terpeno laktonai. Keturiuose iš tirtų maisto papildų (D, E, H ir J) taip pat nustatytas bilobalido bei ginkolidų buvimas. G maisto papilde neidentifikuotas nė vienas terpeno laktonas. Pastarasis rezultatas atitinka UESC-MS/MS chromatogramą, kurioje taip pat nėra ginkolido B ar C buvimą rodančių smailių.
Tokia pačia metodika tiriant 35 maisto papildus iš Didžiosios Britanijos rinkos, keturiuose nenustatytas joks terpeno laktonas, dviejų chromatogramos buvo itin neryškios, o terpeno laktonų buvimas – ginčytinas [83].
Ši metodika yra tinkama greitam terpeno laktonų identifikavimui maisto papilduose.
Vertinant flavonoidų buvimą tiriamuosiuose objektuose pagal rutiną, ryškiausi rezultatai gauti po derivatizacijos bei esant 366nm ilgio bangai (žr pav. nr. 10).
10 pav. Tiriamųjų objektų flavonoidų chromatograma po derivatizacijos esant 366nm UV šviesos bangos ilgiui (1 – rutinas; 2 - ginkmedžių lapų valytas ir kiekybiškai įvertintas sausasis
ekstraktas; 3 – tiriamasis objektas D; 4 – tiriamasis objektas E; 5 – tiriamasis objektas G; 6 – tiriamasis objektas H; 7 – tiriamasis objektas J)
Rutinas (Rf=0,28) identifikuotas visuose tiriamuosiuose objektuose. Gautas rezultatas atitinka
