LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTAS
Jurgita Deltuvytienė
KIAULIŲ BEI ŠERNŲ REPRODUKCIJOS
IR KVĖPAVIMO SINDROMO VIRUSO
PADERMIŲ SAVYBĖS IR MOLEKULINIS
CHARAKTERIZAVIMAS
Daktaro disertacijaŽemės ūkio mokslai, veterinarija (02A)
Disertacija rengta 2010–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Imunologijos laboratorijoje, Mikrobiologijos ir virusologijos instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje ir Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Serologinių tyrimų skyriuje.
Mokslinis vadovas
Doc. dr. Arūnas Stankevičius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Veterinarijos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkė
Prof. dr. Rasa Želvytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)
Nariai:
Dr. Raimundas Mockeliūnas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)
Prof. habil. dr. Aniolas Sruoga (Vytauto Didžiojo universitetas, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
Prof. habil. dr. Tomasz Stadejek (Varšuvos gyvybės mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)
Dr. Dainius Zienius (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A)
Disertacija ginama viešame Veterinarijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2015 m. rugsėjo 18 d. 14 val. dr. S. Jankausko auditorijoje.
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCE VETERINARY ACADEMY
THE INSTITUTE OF MICROBIOLOGY AND VIROLOGY
Jurgita Deltuvytienė
PORCINE AND WILD BOARS
REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY
SYNDROME VIRUS PROPERTIES AND
MOLECULAR CHARACTERIZATION
OF THE ISOLATED STRAINS
Doctoral Dissertation Agricultural Sciences,
Veterinary (02A)
The dissertation defence between 2010 and 2014 at Laboratory of Imunology in the Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences, Laboratory of Virology in the Institute of Microbiology and Virology and Serology unit in the National Food and Veterinary Risk assessment Institute.
Scientific Supervisor
Assoc. Prof. Dr. Arūnas Stankevičius (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)
Dissertation is defending at the Veterinary Research Council of
Lithuanian University of Health Sciences.
Chairperson
Prof. Dr. Rasa Želvytė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)
Members:
Dr. Raimundas Mockeliūnas (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)
Prof. Habil. Dr. Aniolas Sruoga (Vytautas Magnus University, Biomedical sciences, Biology – 01B)
Prof. Habil. Dr. Tomasz Stadejek (Warsaw University of Life Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)
Dr. Dainius Zienius (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A)
The public defence of doctoral dissertation in Veterinary Science council will take place at the Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy Dr. S. Jankauskas Auditorium at 14:00 p. m. on 18th September, 2015.
TURINYS SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS... 10 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 14 1.1. KRKS viruso struktūra... 14 1.2. KRKSV epidemiologiniai duomenys... 16
1.3. KRKSV ligos plitimo keliai... 18
1.4. Imuninis atsakas į KRKS virusinę infekciją... 19
1.5. KRKSV izoliavimas... 21
2. TYRIMŲ METODIKA ... 24
2.1. Tiriamųjų mėginių paėmimas, saugojimas ir transportavimas... 25
2.2. KRKSV specifinių antikūnų nustatymas kraujo serumo mėginiuose... 26
2.3. RNR išskyrimas tyrimams atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandinine reakcija... 28
2.4. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija... 28
2.5. Lizdinė polimerazės grandininė reakcija... 30
2.6. Elektroforezė ir lizdinės PGR vizualizacija ... 31
2.7. Komplimentarios cDNR gavimas ... 31
2.8. Realaus laiko TaqMan polimerazės grandininė reakcija... 31
2.9. Nukleotidų sekų nustatymas ... 33
2.10. Eksperimentinių gyvūnų užkrėtimas... 34
2.11. Tiriamosios medžiagos paruošimas KRKS virusui izoliuoti... 34
2.12. KRKSV etaloninės padermės ir jų pagausinimas MARK-145 ląstelių kultūroje... 35
2.13. KRKSV tyrimai ląstelių kultūrose ... 35
2.14. Alveolinių makrofagų paruošimas ... 36
2.15. Alveolinių makrofagų užkrėtimas... 36
2.16. Imunoperoksidazės reakcija... 37
2.17. Statistinė analizė ... 37
3. TYRIMŲ REZULTATAI... 39
3.1. Specifinių antikūnų tyrimų rezultatai kiaulių ir šernų populiacijose... 39
3.1.1. KRKSV specifinių antikūnų tyrimo rezultatai Lietuvos kiaulių populiacijoje 2009–2013 metais... 39
3.1.2. KRKSV specifinių antikūnų tyrimo rezultatai Lietuvos laukinių šernų populiacijoje 2009–2013 metais ... 39
3.2. Dažniausiai naudojamų ORF1, ORF5, ORF6, ORF7 srities oligonukleotidinių pradmenų bei žymenų įvertinimas diagnozuojant 3-ojo ir 4-ojo subtipo šernų KRKSV padermes klinikiniuose mėginiuose AT-PGR, lizdine AT-PGR, AT-PGR TaqMan Probe metodais... 40
3.2.1. Kiaulių ir šernų KRKSV padermių tyrimų rezultatai realaus laiko
TaqMan PGR... 40
3.2.2. KRKSV nustatymas lizdine polimerazės grandinine reakcija... 47
3.3. KRKSV biologinių savybių tyrimai ląstelių kultūrose... 49
3.4. KRKSV filogenetinė analizė... 67
3.5. Šernų KRKSV 3-ojo ir 4-ojo subtipo padermių patogeniškumo tyrimų rezultatai in vivo... 71
TYRIMŲ REZULTATŲ APTARIMAS... 77
IŠVADOS... 87 REKOMENDACIJOS... 89 LITERATŪROS SĄRAŠAS... 90 MOKSLINIAI STRAIPSNIAI... 105 PRIEDAI ... 109 SUMMARY... 130
SANTRUMPOS
AVA – arklių virusinis arteritas
Ag – antigenai
Ak – antikūnai
a.r. – amino rūgštys
ATCC-VR2332 – KRKSV Šiaurės Amerikos izoliatas
AT-PGR – atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
AT-nPGR – lizdinė atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
B ląstelės – B limfocitai
bp – bazių poros
CD4 – T limfocitų (dažniausiai T helperių) diferenciacijos antigenas
CD8 – T citotoksinių ląstelių antigenas CD14 – monocitų diferenciacijos antigenas
cDNR – transkribuota iš RNR deoksiribonukleorūgštis CL2621 – Afrikos beždionės inkstų ląstelių linija
CPE – citopatinis efektas
CRL11171 – Afrikos beždionės inkstų ląstelių linija Ct – ciklo slenkstis (angl. cycle threshold)
DMEM – Dulbeko modifikuota Eagle terpė (angl. Dulbecco’s modified Eagle's medium)
DMSO – Dimetilsulfoksidas
DNR – deoksiribonukleorūgštis
DTT – ditiotreitolis
E – KRKSV nukleokapsidės proteinas (membraninis glikoproteinas)
EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis ES – Europos Sąjunga
FVS – fetalinis veršelio serumas
GP2a – KRKSV membraninis glikoproteinas GP2b – KRKSV membraninis proteinas GP3 – KRKSV membraninis glikoproteinas GP4 – KRKSV membraninis glikoproteinas GP5, GP5a – KRKSV membraninis glikoproteinas
IF – imunofluorescencija
IFA – imunofermentinė analizė IgA – imunoglobulinas A
IgG – imunoglobulinas G IgM – imunoglobulinas M IL-2, 10 ir kt. – interleukinai
INF – interferonas INF-ά – alfa interferonas
INF-γ – gama interferonas
IPMA – imunoperoksidazės reakcijos metodas (angl. the immunoperoxidase monolayer assay)
JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos
kb – kilobazė
kDa – kilodaltonas (molekulinės masės vienetas) km2 – kvadratinis kilometras
KRKS – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromas KRKSV – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas KRKSV 1; EU – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo viruso
europinis genotipas
KRKSV 2; US – kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo viruso amerikinis genotipas
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas M – KRKSV nukleokapsidės proteinas MA-104 – Afrikos beždžionės inkstų ląstelės
MAk – monokloniniai antikūnai
mAk – motininiai (kolostriniai) antikūnai
MARK-145 – Afrikos žaliosios beždionės inkstų ląstelių linija
MC – monocitai
MEM – terpė (angl. minimum essencial medium) MLV – KRKSV gyva modifikuota vakcina MN-184 – KRKSV padermė
MRCA – labiausiai paplitusio paskutinio protėvio (MCRA) nustatymo analizės metodas (angl. most recent common ancestor)
mRNR – informacinė ribonukleino rūgštis M/T – mėginio ir teigiamos kontrolės santykis N – KRKSV nukleokapsidės proteinas NA – KRKSV neutralizuojantys antikūnai
NMVRVI – Nacionalinis maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institutas
n – bendras tirtų mėginių skaičius
nm – nanometrai
NR – neutralizacijos reakcija
nt – nukleotidai NVSL97-7895 – KRKSV amerikinė padermė
ORF – atviras nuskaitymo rėmelis (angl. open reading frame) nukleotidų sekos grandinėje
ORF1 – nestruktūrinius KRKSV baltymus koduojantis atviras nuskaitymo rėmelis
ORF5 – GP5 baltymą koduojantis atviras nuskaitymo rėmelis ORF6 – stambius membraninius proteinus koduojantis atviras
nuskaitymo rėmelis
ORF7 – Nukleokapsidės baltymą N koduojantis atviras nuskaitymo rėmelis
OT – optinis tankis
p – patikimumas (statistinis)
PAM – alveoliniai makrofagai (angl. porcine alveolar macrophage)
PBMC – periferinio kraujo mononuklearinių ląstelių kultūra PBS – fosfatinis buferinis tirpalas (angl. Phosphate Buffered
Saline)
pCMV-8129 – KRKSV cDNR klonas
pI – amino rūgščių sekos izoelektrinis taškas PGR – polimerazės grandininė reakcija
proc. – procentai
PT – palyginamieji tyrimai RNR – ribonukleino rūgštis
R-CCFM – (angl. Recovery – Cell Culture Freezing Medium)
SD – standartinė paklaida (statistinė) SDSU28983 – KRKSV amerikinė padermė TAE – buferis (angl. Tris–acetate–EDTA)
TCID50 – 50 proc. audinių kultūros užkrečianti dozė (angl. tissue
culture infection dose) Th 1 – T helperių tipas
TMB – tetrametilbenzidinas (substratas)
TNF-α – citokinas (naviko nekrozės faktorius alfa)
TV – tarptautiniai vienetai (antikūnų titro) VI – viruso išskyrimas
VMVT – Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba VNR – viruso neutralizacijos reakcija
VR-2332 – KRKSV amerikinis genotipas
VR-2385 – KRKSV didelio patogeniškumo padermė
LDV – pelių laktatdehidrogenazės virusas SHFV – beždžionių hemoraginės karštinės virusas
ĮVADAS
Kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas (KRKSV) turi viengubą, teigiamą, apvalkalo apsuptą apie 15 kb ilgio viengubos RNR grandinės genomą (Meulenberg et al., 1993). KRKSV priklauso Nidovirales
būrio Arteriviridae šeimai, ir sukelia kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo
ligą, kuri yra išplitusi daugelio šalių kiaulių populiacijose (Cho and Dee, 2006). Šis virusas paršavedėms sukelia reprodukcijos problemas, o kitoms kiaulėms ir ypač įvairaus amžiaus paršeliams – kvėpavimo organų ligas, sutrikdo paršelių augimą ir vystymąsi (Zimmerman et al., 1997; Suarez, 2000; Rowland, 2010). KRKSV šiuo metu yra laikomas vienu iš svarbiausių kiaulių ligų sukėlėjų visame pasaulyje, nes padaro didelių ekonominių nuostolių praktiškai visose išvystytos kiaulininkystės šalyse.
Tyrimais nustatyta, kad endeminės padermės kiekvienoje šalyje turi nemažai genetinių skirtumų, kurie skirtingai veikia molekulinę diagnostiką, AT-PGR, virulentiškumą, specifinių antikūnų reakcijas, vakcinų veiksmingumą, klinikinius simptomus. Šiuo metu pasaulyje vyrauja genetiškai skirtingos KRKSV padermės, kurios dėl didelio heterogeniškumo apsunkina ligos diagnozavimą, prevenciją ir kontrolę (Dewey et al., 2000; Goldberg et al., 2003; Fang et al., 2007).
Lietuvos kiaulių populiacijoje paplitusios labai skirtingos KRKSV padermės, kurių ORF5 srities nukleotidų sekos buvo tik 71,5 proc. identiškos Vakarų Europoje paplitusioms padermėms (Stadejek et al., 2002; Stankevičius ir kt., 2003a). KRKSV ORF5 ir ORF7 regionų tyrimai parodė, kad Baltarusijoje ir Rusijoje KRKSV nukleotidų sekos gerokai skiriasi nuo Vakarų Europoje cirkuliuojančio KRKSV (Stadejek et al., 2006; 2008).
Gamtinių infekcijų šaltiniu ir daugelio infekcinių ligų sukėlėjų rezervuaru yra laikomi laukiniai šernai (Sus scrofa), kurie infekciją gali
išplatinti ne tik kitos rūšies gyvūnams, bet taip pat naminėms kiaulėms ar net žmonėms (Laddomada, 2000; Al Dahouk et al., 2005; Ruiz-Fons et al., 2008). E. Albina (2000) ištyrė ir aprašė klasikinio kiaulių maro, Aujeskio ligos virusinių infekcijų paplitimą šernams ir naminėms kiaulėms. Informacijos ir publikacijų apie KRKSV paplitimą tarp šernų yra labai nedaug, todėl ši tema tiek moksliniu tiek ir praktiniu ligos kontrolės požiūriu yra labai aktuali. Antikūnai prieš KRKSV šernams buvo nustatyti tik keliose šalyse pavieniais atvejais (Albina et al., 2000; Closa – Sebastia et al., 2011; Albayrak et al., 2013; Rodriguez et al., 2013), taip pat KRKSV buvo nustatyta atliekant molekulinius AT-PGR tyrimus (Reiner et al., 2009). Daugelyje kitų publikacijų buvo pranešama apie neigiamus KRKSV specifinių antikūnų tyrimų rezultatus (Vicente et al., 2002; Zupančič et al.,
2002; Ruiz-Fons et al., 2006; Vengust et al., 2006). Lietuvoje iki šių tyrimų
šernų KRKSV infekcija iš viso nebuvo tyrinėta, nors šernų skaičius per paskutinius penkerius metus nuolatos didėjo. Tą patvirtina ir Lietuvos Respublikos Aplinkos Ministerijos pateikti duomenys apie sumežiotų šernų skaičių (Lietuvos Respublikos Aplinkos ministerija. Internetinė prieiga 2014.08.08.: http://www.am.lt/VI/index.php#r/966). Jais remiantis, 2009 metais Lietuvoje buvo sumedžioti 50126 šernai, 2010 metais – 54608 šernai, 2011 metais – 57805 šernai, 2012 metais – 56203 šernai, 2013 metais – 61795 šernai. Mokslinių publikacijų analizė parodė, kad KRKSV šernai dažniau užsikrečia nuo naminių kiaulių, tačiau aiškių įrodymų, kad šernai yra gamtinis KRKSV rezervuaras, nebuvo pateikta (Ruiz-Fons et al., 2007; Meng et al., 2009). Siekiant įvertinti KRKSV infekcijos svarbą Lietuvos šernų populiacijoje ir norint nustatyti ląstelių kultūrose izoliuotų šernų KRKSV padermių pagrindines savybes buvo atlikti serologiniai, virusologiniai ir molekuliniai tyrimai.
Darbo tikslas
Ištirti šernų KRKSV paplitimą ir įvertinti ląstelių kultūrose izoliuotų padermių savybes in vitro ir in vivo.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti KRKSV paplitimą šernų populiacijoje ir palyginti su epidemiologine situacija Lietuvos kiaulininkystės ūkiuose atliekant serologinius tyrimus.
2. Nustatyti tinkamiausius šernų KRKSV diagnostikai oligonukleotidinius pradmenis ir zondus, plačiai naudojamus ir pritaikytus kiaulių KRKSV diagnostikai TaqMan AT-PGR ir AT-nPGR metodais.
3. Nustatyti šernų KRKSV 3
-
ojo ir 4-
ojo subtipų padermių replikacines galimybes ir poveikį pirminei alveolinių makrofagų ir persėjamajai MARK-145 ląstelių kultūrai.
4. Atlikti šernų ir kiaulių PAM ir MARK
-
145 ląstelių kultūrų izoliatų ORF5 srities nukleotidų ir aminorūgščių sekų filogenetinę analizę.5. Šernų 3
-
ojo ir 4-
ojo subtipų KRKSV izoliatų patogeniškumą įvertintiin vivo.
Darbo mokslinė reikšmė ir naujumas
1. Pirmą kartą serologiniais tyrimais buvo nustatyta, kad Lietuvos šernų populiacijoje KRKSV infekcija labiau paplitusi nei kiaulininkystės ūkiuose.
2. Šernų KRKSV tyrimai AT-nPGR, TaqMan PGR metodais, naudojant
ORF1, ORF5, ORF6 ir ORF7 koduojančių sričių oligonukleotidinius pradmenis, parodė, kad Lietuvoje šernai yra aktyvūs europietiškojo genotipo užkrato pernešėjai.
3. Atlikti tyrimai in vitro įrodė, kad šernų KRKSV padermės gali būti
sėkmingai izoliuojamos ne tik pirminėje alveolinių makrofagų kultūroje, bet ir persėjamojoje MARK-145 ląstelių linijoje.
4. Šernų KRKSV padermių ORF5 srities nukleotidų sekos buvo susekvenuotos ir paskelbtos GenBank duomenų bazėje (Nr. KC714037
-KC714042 ).
5. Tyrimo metu buvo nustatytos 3-ojo ir 4-ojo subtipų europietiškojo
genotipo KRKSV padermės, kurios paprastai neaptinkamos Lietuvos kiaulių populiacijoje.
6. Pirmą kartą Lietuvoje eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad alveoliniuose makrofaguose izoliuotos 3-ojo ir 4-ojo subtipų šernų KRKSV
padermės yra patogeniškos paršeliams.
7. Atlikti tyrimai pateikia įrodymus, kad šernai yra KRKSV gamtinis rezervuaras Rytų Europoje.
Darbo praktinė reikšmė
1. Naujausi KRKSV infekcijos tyrimų rezultatai iš Lietuvos kiaulininkystės ūkių įrodo, kad naujosios kiaulių auginimo technologijos ir biologinio saugumo priemonės gali efektyviai sumažinti KRKSV paplitimą kiaulių bandose.
2. Tyrimų metu išbandyta ir rezultatais įrodyta, kad imunofermentinės analizės komerciniai rinkiniai IDEXX PRRS X3 (IDEXX, Switzerland) ir INGEZIM PRRS Europa (INGENASA, Spain) sėkmingai gali būti naudojami KRKSV specifinių antikūnų nustatymui šernų kraujo serumo mėginiuose.
3. AT-nPGR ir realaus laiko TaqMan PGR tyrimų metodais buvo
sėkmingai išbandyti ORF1, ORF5, ORF6 ir ORF7 nukleotidiniai pradmenys, naudoti, nustatant kiaulių KRKSV padermes, buvo pritaikyti tirti šernų KRKSV padermėms.
4. Persėjamoji MARK-145 ląstelių kultūra, kuri iki tol sėkmingai buvo naudota tik amerikinio genotipo KRKSV izoliavimui, pagausinimui ir tyrimams, gali būti naudojama 3-ojo ir 4-ojo subtipų KRKSV padermėms izoliuoti.
5. Įrodžius, kad ir šernai yra KRKSV infekcijos gamtinis rezervuaras Lietuvoje, KRKSV infekcijos tyrimai, kaip klasikinis kiaulių maras ir Aujeskio liga, turėtų būti šernų infekcinių ligų monitoringo programoje.
6. Šio disertacinio darbo rezultatai padės veterinarijos gydytojams ir kiaulininkystės ūkių specialistams geriau suvokti KRKSV infekcijos situaciją Lietuvos šernų populiacijoje ir sėkmingiau taikyti apsaugos nuo KRKSV priemones.
1.LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. KRKS viruso struktūra
Kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusas (KRKSV) priklauso Nidovirales būrio Arterividae šeimos Artevirus genčiai
(Cavanagh, 1997; de Groot et al., 2012; Faaberg et. al., 2012). Arterividae
šeimos virusams be KRKSV taip pat priklauso arklių virusinio arterito (AVA) virusas, beždžionių hemoraginės karštinės virusas (SHFV), pelių laktatdehidrogenazės virusas (LDV) (den Boon et al., 1991; Snijder et al., 1998; Pasternak et al., 2006). KRKSV yra 50–60 nm diametro, apvalkalu apgaubtas virusas, turintis 20–35 nm nukleokapsidę (Benfield et al., 1992; Meulenberg et al., 1993). KRKSV taip pat turi apie 15,1–15,5 kb ilgio viengubos, susuktos RNR grandinės genomą (Meulenberg et al., 1993), kuriame yra net devyni atviri nuskaitymo rėmeliai (ORF), koduojantys apie 20 įvairių baltymų: virusinę replikazę (ORF1a ir ORF1b), keturis su membranomis surištus glikoproteinus (nuo ORF2a, ORF3, ORF4, ORF5), du membraninius proteinus (ORF2b ir ORF6) ir nukleokapsidės proteiną N (ORF7) (Mardassi et al., 1996; Meulenberg et al., 1995; Meng et al., 1994; Meulenberg, 2000; Wu et al., 2001; Tian et al., 2007).
ORF1a ir ORF1b, koduojantys virusinę replikazę ir polimerazę, nėra viriono struktūriniai elementai, todėl priskiriami nestruktūriniams baltymams, yra išsidėstę 5’ RNR gale ir sudaro 75 proc. KRKSV genomo (Nelson et al., 1993). S. Yongming nuomone (2012), ORF1 sritis sudaro apie 80 proc. viruso genomo ir taip pat koduoja proteazes, replikazes bei kitus baltymus darančius įtaką reguliavimo funkcijoms. Likę baltymai ORF2–ORF7 koduoja viruso struktūrinius elementus (Snijder et al., 1998; Pasternak et al., 2006), todėl laikomi struktūriniais baltymais: ORF2a, ORF3, ORF4, ir ORF5 koduoja su membranomis surištus mažus glikoproteinus (GP2a, GP3, GP4 ir GP5a ir E), ORF2b ir tris stambius membraninius proteinus ORF6 – (GP2b ir M) ir, kaip minėta prieš tai, ORF7 labai konservatyvi sritis, koduojanti nukleokapsidės proteiną N (Mardassi et al., 1994; Meng et al., 1994; Meulenberg et al., 1995; Snijder and Meulenberg, 1998; Wu et al., 2001; Music et al., 2010; Johnson et al., 2011).
Didžiausią dalį – 20–40 proc. baltymų viruso struktūroje užima 14–15 kDa dydžio nukleokapsidės proteinas N, sudarytas iš 123 amino rūgščių ir apsupantis viriono genetinės informacijos nešiklį mRNR (Snijder et al., 1998; Yoo and Wootton., 2001; Pasternak et al., 2006). Virusui dauginantis, šio baltymo ženkliai padaugėja, dėl to aktyvinama specifinių antikūnų
sintezė. Skirtingos KRKSV padermės turi skirtingus epitopus, todėl paruošus specifinius monokloninius antikūnus, buvo nustatyti tiek amerikinio, tiek europinio KRKSV bendri ir individualūs epitopai (Oleksiewicz ir kt., 2001).
Kitas KRKSV struktūrinis baltymas – 18–19 kDa dydžio baltymas M, koduojamas ORF6 srities, taip pat dalyvauja formuojant viruso virioną. Jis kartu su GP5 baltymu sudaro heterodimerinį kompleksą, kuris dalyvauja KRKSV prisitvirtinant prie ląstelės – taikinio receptorių (Snijder and Meulenberg, 1998; Dea et al., 2000; Delputte et al., 2002). Baltymas M dalyvauja ląstelinio imuninio atsako į KRKSV infekciją aktyvacijoje, taip pat yra naudojamas bioinžinerijoje, modeliuojant bei kuriant vakcinas nuo KRKS (Wang et al., 2014).
KRKSV 24,5–26 kDa dydžio struktūrinis glikoproteinas GP5, koduojamas ORF5 genomo regiono, yra sudarytas iš apytikriai 200 aminorūgščių. Pagrindinis ir stipriai veikiantis kiaulių imuninę sistemą GP5 yra labiausiai kintantis proteinas, kurio aminorūgščių sekos KRKSV 1 ir KRKSV 2 genotipų yra tik 51–55 proc. tarpusavyje panašios (Indik et al., 2000; Kapur et al., 1996; Madrassi et al., 1995; Wissink et al., 2004). Nustatyta, kad šis baltymas turi tris mažame ektodomene, apimančiame 40 aminorūgščių seką, išsidėsčiusias N-glikolizacijos vietas, kurių (Meulenberg
et al., 1995; Mardassi et al., 1996) dėka virusai geba išvengti imuninės sistemos poveikio ir ilgą laiką persistuoti organizme, sumažinant arba visiškai neleidžiant specifiniams neutralizuojantiems antikūnams paveikti viruso (Ansari et al., 2006; Faaberg et al., 2006). Remiantis naujausiais tyrimų duomenimis, buvo nustatytas 51 amino rūgštį turintis struktūrinis baltymas GP5a, koduojamas alternatyvios OPRF5 srities (Liu et al., 2014).
Glikoproteinas GP5 yra labai svarbus kiaulių imuniniam atsakui į KRKSV infekciją. Nustatyta, kad kartu su baltymu M jis sudaro heterodimerus. Daroma prielaida, kad glikoproteinas GP5 sąveikauja su šeimininko ląstelių receptoriuose esančiu sialoadhezinu, todėl KRKSV prasiskverbia į alveolinius makrofagus gyvame organizme (Delputte and Nauwynck, 2004).
Eksperimentinė kiaulių vakcinacija su GP5 koduojančiu DNR fragmentu sukėlė plazminių ląstelių proliferaciją ir specifinių antikūnų sintezę (Pirzadeh and Dea., 1998; Dea et al., 2000). Taip pat buvo nustatyta struktūrinio GP5 baltymo reikšmė virulentiškumui, nors šis teiginys galutinai nebuvo įrodytas eksperimentiškai. Pastebėta, kad šis baltymas svarbus virusui prasiskverbiant į ląstelės – taikinio citoplazmą ir virusui prisitvirtinant prie ląstelės receptorių (Snijder et al., 2003). Taip pat nustatyta, kad GP5 turi B ląsteles neutralizuojantį epitopą (Ostrowski et al., 2002; Plagemann, 2002, 2006; Fang et al., 2006).
Membraninis proteinas E, koduojamas ORF2b srities, yra laikomas labai konservatyviu 10 kDA dydžio viruso baltymu, tačiau jo funkcija nėra išaiškinta (Wu et al., 2001; Yoo and Wootton, 2001).
Tiriant mažuosius struktūrinius baltymus nustatyta, kad 26 kDa dydžio GP2 glikoproteinas, kurį koduoja ORF2a sritis yra susijęs su viriono išorine membrana (Meng et al., 1995; Mulenberg et al., 1995). GP2 funkcija nėra išaiškinta, tačiau buvo įrodyta, kad šis glikoproteinas svarbus viruso replikacijai. GP3, kaip ir GP5, yra labai greitai struktūriškai kintantis baltymas, koduojamas ORF3 genomo srities, kuriai būdingos mutacijos (Oleksiewicz et al., 2000), leidžiančios identifikuoti tam tikras KRKSV genomo sritis (Fosberg et al., 2001). GP4 funkcija taip pat nėra išaiškinta, tačiau žinoma, kad šio baltymo neutralizuojantys epitopai nėra konservatyvūs, kaip GP5, o specifiniai antikūnai šias sritis neutralizuoja daug silpniau (Meulenberg et al., 1997; Weiland et al., 1999). Sarah Costers su kolegomis (2010) nustatė, kad GP4 neutralizuojantys epitopai yra labai jautrūs antikūnams in vitro, todėl tolesni šių baltymų tyrimai ateityje gali
turėti įtakos vakcinų nuo KRKSV kūrimui.
1.2. KRKSV epidemiologiniai duomenys
Pirmą kartą apie KRKSV paskelbta 1987 m. Jungtinėse Amerikos Valstijose ir Kanadoje (Loula, 1990; Keffaber, 1989), Japonijoje (Yoshii et al., 2005) ir Filipinuose – 1987 m. (Thanawongnuwech et al., 2003), Tailande – 1989 m. (Thanawongnuwech et al., 2004). Vakarų Europoje, Vokietijoje – 1990 m. 1991–1992 m. KRKS virusinė infekcija pasireiškė Nyderlanduose, Ispanijoje, Prancūzijoje, Belgijoje, Danijoje (Ludermann et al, 2010). Lietuvoje pirmieji KRKS būdingi klinikiniai simptomai pastebėti 1997 m. pradžioje, tačiau apie ligos išplitimą kiaulių ūkiuose pranešta tik 2000 m. (Janutėnaitė ir kt., 2000).
KRKSV pirmą kartą buvo izoliuotas Nyderlanduose (Wenstvoort et al., 1991), kaip Lelystad virusas (GenBank: M96262), kartu su pirmuoju šiaurės Amerikos izoliatu ATCC-VR2332 (GenBank: U87392) sudarė du KRKSV genotipus: Europinį (EU genotipas 1) ir Šiaurės Amerikos (US genotipas 2) (Snijder et al., 2004). Tyrimais buvo nustatyta, kad Europinio ir Šiaurės Amerikos izoliatų nukleotidų sekos buvo 55–70 proc. panašios (Meulenberg et al., 2000; Stadejek et al., 2006). Todėl R. Forsbergas (2005) ir K. Hanada (2005) remdamiesi filogenetine analize, iškėlė hipotezę, kad daugiau nei prieš amžių abu KRKSV genotipai turėjo bendrą protėvį, paraleliai vystėsi abiejuose žemynuose, kol pasiekę kiaulių populiaciją, sukėlė virusinę infekciją, pasireiškiančią vienodais klinikiniais simptomais. Tyrimais taip pat nustatyta, kad KRKSV 1 genotipo padermė yra įvairesnė nei KRKSV 2
(Forsberg et al., 2002; Stadejek et al., 2006). Ypač didelis šios padermės genetinis įvairumas buvo nustatytas Danijoje (Oleksiewicz et al., 2000), Čekijos Respublikoje (Indik et al., 2000), Lenkijoje (Stadejek et al., 2002), Lietuvoje (Stankevičius ir kt., 2003a), Ispanijoje (Mateu et al., 2003), Vokietijoje, Nyderlanduose (Pesh et al., 2005) ir Tailande (Thanawongnuwech et al., 2004), o pats didžiausias – Italijoje (Forsberg et al., 2002). Nustatyta, kad KRKSV 1 genotipo genomo nukleotidų sekų skaičius yra 220 nt, KRKSV 2 – 190 nt, o nukleotidų sekos kiekvieno genotipo grupėje gali skirtis daugiau kaip 10 proc., (Lu et al., 2011; Gao et al., 2013). Pagrindinis skirtumas tarp Europinio ir Šiaurės Amerikos KRKSV genotipų yra 51 nukleotidų sekos nebuvimas nestruktūrinio baltymo NSP2 regione. Devintajame dešimtmetyje 2 genotipo KRKSV buvo įvežtas į Europą, o 1999 metais 1 genotipo KRKSV buvo nustatytas Šiaurės Amerikoje ir todėl pavadintas Šiaurės Amerikos (toliau – amerikinis) (NA) 1 genotipo KRKSV, kuris savo filogenetine analize ir virulentiškumu skyrėsi nuo Vakarų Europoje aptinkamo „Lelystad“ viruso padermės (Fang et al., 2007). Tyrimais nustatyta, kad endeminės padermės kiekvienoje šalyje turi nemažai genetinių skirtumų, kurie veikia molekulinę diagnostiką, AT-PGR, virulentiškumą, specifinių antikūnų reakcijas, vakcinų veiksmingumą, klinikinius simptomus (Van Doorsseelaere et. al., 2011). Šiuo metu pasaulyje vyrauja genetiškai skirtingos KRKSV padermės, kurios dėl didelio heterogeniškumo apsunkina ligos diagnozavimą, prevenciją ir kontrolę (Dewey et al., 2000; Goldberg et al., 2003; Fang et al., 2007).
Daugelyje pasaulio šalių KRKSV infekcija sukelia endeminius kiaulių susirgimus, atnešdama didžiulius ekonominius nuostolius. Viruso paplitimui įtakos turi didelis KRKSV virulentiškumas (Stankevičius ir kt., 2008) ir auginamų kiaulių tankis (Luderman et al., 2010). Didelėse kiaulių auginimo įmonėse, kur išplitusios ir kitos infekcinės ligos, susidaro puikios sąlygos KRKSV persistencijai. Šie virusai gali ilgą laiką išlikti veislinėse ir penimų kiaulių grupėse, periodiškai sukeldami reprodukcijos sutrikimus paršavedėms ir kvėpavimo sistemos patologijas nujunkytiems paršeliams (Mortensen et al., 2002; Stankevičienė ir kt., 2008). Tyrimais nustatyta, kad pakaitinės kiaulaitės kelia didžiausią riziką naujų KRKSV padermių plitimui bandoje (Tummaruk and Tantilertcharoen, 2012; Nilubol et al., 2014). J. H. Sur (2001) nustatė, kad KRKSV gali būti aptinkamas 21 dieną po užsikrėtimo kiaulaičių kiaušidžių audinyje (Tummaruk et al., 2014). Vietinis viruso paplitimas priklauso nuo kiaulių populiacijos dydžio tam tikroje teritorijoje bei atstumo tarp kaimyninių užkrėstų fermų (Mortensen et al., 2002; Stankevičienė ir kt., 2008).
1.3. KRKSV ligos plitimo keliai
KRKS infekcijos sukėlėjas gali plisti tiesioginio kontakto ar aerozoliniu būdu (Wenstvoort et al., 1991). Ūkyje KRKSV tarp kiaulių plinta horizontaliu keliu, kai kiaulės tiesiogiai kontaktuodamos užsikrečia, bei vertikaliu, kai sukėlėjas per placentą vėlyvajame vaikingumo laikotarpyje perduodamas vaisiui (Christianson et al., 1992; Yager et al., 1993). Horizontalus plitimas gali vykti tiesiogiai ir netiesiogiai (Zimmermann et al., 2006). Tiesioginio kontakto metu KRKSV gali plisti su sergančių gyvūnų seilėmis (Wills et al., 1997; Prickett et al., 2008), pienu (Wagstrom et al., 2001), nosies išskyromis (Rossow et al., 1994), sperma (Swenson et al., 1994). KRKSV, persistuodamas kiaulių bandose nedideliais kiekiais, apsunkina ankstyvą ligos diagnozavimą, dėl to virusas sėkmingai plinta tarp kiaulių tiesioginio kontakto metu (Allende et al., 2000; Batista et al., 2004).
Tyrimais nustatyta, kad net 73 proc. išbrokuotų pakaitinių kiaulaičių, turinčių įvairių reprodukcijos sutrikimų, buvo užsikrėtusios KRKSV (Tummaruk and Tantilertcharoen, 2012), o 33 proc. dėl abortų išbrokuotoms kiaulaitėms gimdos audinyje buvo nustatytas KRKSV Ag. Net ir po kelių mėnesių gimdos audinyje galima nustatyti KRKSV, nepaisant kiaulėms atliktos vakcinacijos (Olanratmanee et al., 2011).
Netiesioginio kontakto metu virusas gali plisti per nešvarius, užkrėstus apyvokos daiktus (Dee et al., 2002), adatas (Otake et al., 2002), transporto priemones (Otake et al., 2002; Dee et al., 2004), aerozolius (Mortensen et al., 2002; Otake et al., 2010; Dee et al., 2009; Pitkin et al., 2009). Vabzdžiai yra laikomi pagrindiniu KRKSV plitimo mechaniniu vektoriumi (Otake et al., 2003; Schurrer et al., 2004; 2005). Aerozolių ir vabzdžių pagalba KRKSV gali plisti iki 3 km atstumu (Dee et al., 2004). Kiaulių aplinkoje ir srutose virusas gyvybingas išlieka nuo 7 iki 11 parų ar daugiau (Pirtle and Beran, 1996; Dee et al., 2005).
B. Brito (2014) nustatė, kad didelį kiaulių tankį turinčiuose ūkiniuose rajonuose KRKSV kiekis ore svyruoja nuo 29–42 proc., o atlikus filogenetinę analizę, buvo nustatytas didelis tiek laukinių, tiek vakcininių padermių skaičius, kuris proporcingai didėjo, didėjant kiaulių skaičiui tiriamajame rajone.
Laukiniai šernai yra laikomi daugelio infekcinių ligų rezervuaru, o tuo pačiu ir KRKSV pernešėjais bei platintojais, nes gali kontaktuoti su kiaulėmis (Elbers et al., 2000; Laddomada 2000; Al Dahouk et al., 2005).
1.4. Imuninis atsakas į KRKS virusinę infekciją
KRKS virusinė infekcija ne tik pažeidžia įvairaus amžiaus kiaules, sukėlėjas gali būti perduodamas su sperma, plinta tarp ūkių, bet ir nustatomos didelės KRKSV mutacijos, taip pat ji neigiamai veikia kiaulių imuninę sistemą, ją susilpnindama (Butler et al., 2014). Kad KRKSV išliktų organizme ir sėkmingai galėtų daugintis, virusas pirmiausia turi pažeisti organizmo gynybinius mechanizmus, koduojančius baltymus ir perduodančius signalus organizmo imuninei sistemai. Tyrimais nustatyta, kad KRKSV susilpnina interferono gamybą ir signalų perdavimą, citokinų ekspresiją, moduliuoja apoptozės procesą ir keičia adaptacinį imunitetą (Huang et al., 2014).
Skirtingo amžiaus kiaulės ir šernai yra imlūs KRKS virusinei infekcijai. KRKSV patekus į organizmą, prasideda viremija, kuri gali tęstis iki 5–9 savaičių. Ūminės stadijos metu KRKSV pirmiausia infekuoja plaučių alveolinius makrofagus (Yoon et al., 1993; Sur et al., 1997). Taip pat KRKSV replikacija vyksta ir kitų organų makrofaguose (Tanawongnuwech et al., 2000). Paršeliams viremija tęsiasi apytiksliai 28 dienas (Rowland et al., 2003). Tuo metu nustatomas viruso dauginimasis plaučių makrofaguose, migdolinėse liaukose, limfiniuose mazguose, užkrūčio liaukoje, blužnyje, kraujyje (Halbur et al., 1996; Wills et al., 1997). Eksperimentinių tyrimų duomenimis, jau 9–14 dieną po užkrėtimo aukščiausias viruso titras buvo nustatomas plaučiuose ir migdolinėse liaukose iki 35 po užkrėtimo dienos, o limfiniuose mazguose – 3 dieną po užkrėtimo (Halbur et al., 1996; Wills et al., 1997). Viremijos laikotarpiu virusui išplitus į kitus organus, infekcijos stiprumas ir pasireiškimo pobūdis priklauso nuo gyvūno amžiaus ir paveldėto (specifinio) imuniteto (Swenson et al., 1994). Tyrimais buvo nustatytas KRKSV paplitimas dėl reprodukcijos sutrikimų išbrokuotų kiaulaičių endometriumo subepitelinio jungiamojo audinio sluoksnio makrofagų citoplazmoje (Olanratmanee et al., 2011). KRKSV iš limfinių mazgų gali būti izoliuotas praėjus daugiau kaip 100 dienų po užsikrėtimo. Viruso dauginimasis palaipsniui mažėja iki 200
-
osios po užsikrėtimo dienos (Rowland et al., 2003).KRKSV pirmiausia pažeidžia fagocituojančias ląsteles – plaučių, migdolinių liaukų, limfinių mazgų, blužnies makrofagus, kur ir dauginasi, bei aktyvintus monocitus (Beyer et al., 2000). Taip pat buvo nustatytas KRKSV dauginimasis mikroglijos ląstelėse (Molitor et al., 1996).
Kiaulių imuninis atsakas į KRKSV infekciją nustatomas kraujyje aptikus antikūnus prieš KRKSV. Specifiniai antikūnai kiaulėms nedideliais viruso titrais jau nustatomi praėjus 7–10 dienų po užsikrėtimo (Plagemann, 2006), jų pikas – praėjus 5–6 savaitėms po užsikrėtimo ir infekcija kraujyje
persistuoti gali iki 42 savaičių. IgM antikūnai kraujyje nustatomi 7 dieną, jų pikas 14–21 dieną ir mažėja iki 35–42 po užsikrėtimo dienos. IgG antikūnai aptinkami 11–14 dieną po užsikrėtimo, pikas nustatomas 21–28 dieną ir kraujyje išlikti gali kelis mėnesius (Labarque et al., 2000). Virusus neutralizuojantys antikūnai (NA) kraujyje aptinkami 4–6 savaitę nuo infekcijos pradžios, o jų pikas – 10–12 savaitę (Labarque et al., 2000; Delputte et al., 2005). NA sumažėjimas kraujyje rodo viruso eliminavimą iš organizmo (Rowland et al., 2003).
E. Nelson (1994) nustatė humoralinio imuninio atsako į amerikinio genotipo KRKSV tyrimo rezultatus, kurie parodė, kad pirmiausia identifikuojami antikūnai prieš 15 kDa dydžio nukleoproteiną N, vėliau prieš 19 kDa dydžio proteiną M, ir tik tada prieš 26 kDa dydžio glikoproteiną 5 (GP5). Taip pat buvo nustatyta, kad nestruktūrinis proteinas 2 (nsp2) turi B limfocitus neneutralizuojančius epitopus ir yra labiausiai imuninę sistemą veikiantis KRKSV proteinas (Oleksiewicz et al., 2001; de Lima et al., 2006). Europinio ir amerikinio genotipų KRKSV proteinai N turi konservatyvius ir tuo pačiu skirtingus epitopus, kurie yra nustatomi monokloninių antikūnų pagalba (Nelson et al., 1993). Dėl šių savybių N proteinas yra naudojamas diagnostiniuose testuose kaip antigenas (Dea et al., 2000; Witte et al., 2000; Seuberlich et al., 2002). Antikūnai prieš N proteiną nustatomi jau pirmą savaitę po užsikrėtimo KRKSV ir išlieka iki keleto mėnesių, tačiau nedaro įtakos organizmo gynybiniams mechanizmams (Mateu and Diaz, 2008).
Per pirmąjį mėnesį po užsikrėtimo KRKSV neutralizuojantys antikūnai (NA), nėra nustatomi įprastomis virusą neutralizuojančiomis reakcijomis (VNR). Norint nustatyti virusą NA anksčiau, siūloma pridėti šviežio komplemento, prailginti viruso ir serumo mišinio inkubacijos laiką, dėl to padidėja VNR jautrumas ir NA gali būti nustatomi jau 9–12 dieną po užsikrėtimo. Pridėjus 2-merkaptoetanolio, modifikuotos VNR jautrumas sumažėja, tokiu atveju tikėtina, kad IgM NA gali būti nustatomi ankstyvojoje infekcijos stadijoje, tačiau, kaip rodo tyrimai, net ir praėjus 42 dienoms po užsikrėtimo, nustatomi labai maži NA titrai (Takikawa et al., 1996).
Europinio ir amerikinio genotipo KRKSV NA įprastai yra nustatomi nuo 28 po užsikrėtimo dienos (Diaz et al., 2005) ir daugiausia būna nukreipti prieš GP5 proteiną, turintį daugiausia neutralizuojančių epitopų (Nelson et al., 1994; Gonin et al., 1999). Daugelis autorių teigė, kad GP4 ir M proteinai taip pat turi neutralizuojančius epitopus (Meulenberg et al., 1997; Gonin et al., 1999; Yang et al., 2000; Cancel-Tirado et al., 2004).
Tyrimais nustatyta, kad KRKS virusinei infekcijai įtakos turi ankstyvas negalinčių neutralizuoti antikūnų pasirodymas, nes jie sustiprina viruso
replikaciją alveoliniuose makrofaguose, o pats reiškinys įvardijamas kaip nuo antikūnų priklausomas sustiprėjimas (Yoon et al., 1996; Yoon et al., 1997). Negalinčių neutralizuoti antikūnų taikiniai yra GP5 ir N proteinai (Yoon et al., 1996; Cancel-Tirado et al., 2004), kurių pagalba virusas
patenka į makrofagų vidų (Mateu and Diaz, 2008).
Tyrimais nustatyta, kad NA vaidmuo natūralios infekcijos ir vakcinacijos atveju gali skirtis. KRKSV buvo izoliuotas iš kiaulių kraujo, kuriame buvo nustatyti NA (Vezina et al., 1996), o eksperimentiškai užkrėtus kiaules, viremija buvo pašalinta nenustačius NA. KRKSV imlių makrofagų dinamika gali turėti įtakos viremijos lygiui (Diaz et al., 2006). Jei dėl aktyvios ląstelių citolizės ar apoptozės išsenka infekcijai imlūs makrofagai, infekcija apsiriboja makrofagais turtingais organais, tokiais kaip limfiniai mazgai (Mateu and Diaz, 2008).
Antikūnai taip pat gali būti nustatomi ir seilėse, kaip teigia I. Decorte (2014), tai vienas paprasčiausių ir pigiausių neinvazinių tyrimo metodų, leidžiančių nustatyti aktyvintą humoralinį imunitetą. Seilėse gali būti nustatomas IgA, IgG ir IgM. Kiaulių seilėse gali būti nustatomi antikūnai prieš Afrikinį kiaulių marą, klasikinį kiaulių marą, 2 tipo kiaulių cirkovirusą bei kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo virusą, tačiau nėra tikslių duomenų, kokie antikūnų kiekiai būna vienų ar kitų virusinių ligų atvejais (Langenhorst et al., 2012).
KRKSV taip pat labai svarbus ląstelinis imunitetas. Eksperimentinio tyrimo metu KRKSV užkrėtus kiaules, po 4 savaičių sveikstančioms kiaulėms buvo nustatyta stipri limfocitų proliferacija, buvo aiškiai matyti suaktyvėjusi citokinų gamyba, ypač IFN-γ, kiek mažiau IL-2 (Fuertes et al.,
1999). Pastebėta, kad IFN-γ gamyba, kaip atsakas, gali tęstis ir būti
nustatomas kiaulių kraujo serume maždaug 3 savaites (Wesley et al., 2006).
1.5. KRKSV izoliavimas
Siekiant išsamiai in vitro arba in vivo ištirti KRKSV padermes, yra
naudojamas virusų izoliavimo jautrių ląstelių kultūrose metodas, panaudojant kiaulių makrofagus bei persėjamųjų ląstelių linijas. KRKSV sėkmingai auga Afrikos beždžionės inkstų ląstelėse MA
-
104 (Kim et al., 1993), taip pat jų linijų ląstelėse MARK-145, CL2621 (Collins et al., 1992; Bautista et al., 1993), ir CRL11171 (Meng et. al., 1994; 1996). KRKSV taip pat gali daugintis kuilių sėklidžių germinatyvinėse ląstelėse in vivo (Sur etal., 1997), širdies ir limfoidinio audinio ląstelėse (Halbut et al., 1995), kiaulių kraujo monocituose (Voicu, 1994), mikroglijos ląstelėse (Mengeling et al., 1996a), kaip minėta alveoliniuose makrofaguose (Meulenberg, 2000), inkstų ir gimdos gleivinės endotelio ląstelėse (Feng et al., 2013).
KRKSV išskyrimui naudojamas kraujo serumas, nugaišusių paršelių plaučiai, blužnis, krūtinės ląstos ir pilvo ertmės eksudatas. Pažymėtina, kad patologinė medžiaga, dėl galimos autolizės inaktyvinant KRKSV, turi būti kuo šviežesnė, o mumifikuoti gemalai virusų išskyrimui netinka (Van Alstine et al., 1993). Nustatyta, kad iš paršelių amžiaus grupės paimta patologinė medžiaga yra tinkamesnė viruso izoliavimui dėl daug didesnės viruso koncentracijos. KRKSV gali būti izoliuotas iš kraujo serumo, praėjus 4–6 savaitėms po paršelių užsikrėtimo (Mengeling et al., 1995) arba praėjus 1–2 savaitėms po kuilių ir paršavedžių užsikrėtimo (Christopher – Hennings et al., 1995a; 1997; Mengeling et al., 1996a).
KRKSV padermės izoliuojamos, alveolinių makrofagų kultūrą užkrečiant patologinės medžiagos suspensija. Praėjus 2–7 dienoms po užkrėtimo, gali būti stebimas citopatinis efektas (CPE), o viruso replikacijai išryškinti naudojama imunoperoksidazės reakcija (IPMA) (Wensvoort et al., 1991). Dėl mažo viruso kiekio tiriamojoje medžiagoje, rekomenduojama po 7 parų atlikti pakartotinį alveolinių makrofagų užkrėtimą (Mengeling et al., 1995; Lundenmann et al., 2004; Tahar et al., 2007).
Tyrimais nustatyta, kad europinio genotipo KRKSV padermių izoliavimui geriausiai tinka 3–4 savaičių amžiaus paršelių alveoliniai makrofagai (Ludemann et al., 2004). Taip pat įtakos turi ir kiaulių veislė. Praktiškai įrodyta, kad landrasų veislės kiaulių makrofaguose KRKSV replikacija yra mažesnė nei kitų veislių kiaulių, nes makrofagus užkrėtę virusai suaktyvina daug didesnę TNF-α ir IL-8 citokinų sekreciją, kuri
sulėtina KRKSV replikaciją (Tahar et al., 2007).
E. M. Bautista (1993) atliko KRKS viruso ATCCVR–2332 padermės izoliavimo jautrių ląstelių kultūroje palyginamąjį tyrimą ir nustatė, kad tiek CL2621 linijos ląstelės, tiek PAM vienodai jautrios ir tinka viruso izoliavimui iš audinių mėginių. Tačiau PAM ląstelės buvo jautresnės virusą izoliuojant iš kraujo serumo mėginių, galbūt dėl to, kad antikūnai skatina viruso replikaciją PAM. Šis teiginys buvo patvirtintas eksperimentiškai užkrėtus kiaules (Rossow et al., 1992).
Kadangi KRKSV infekcijai būdingas stiprus makrofagų tropizmas in vivo, dėl ko sukeliama persistuojanti infekcija organizme, ankstesni KRKSV
izoliatai buvo išskiriami iš kraujo serumo, plaučių ar smegenų audinių (Tian et al., 2007; Li et al., 2010; Li et al., 2011). 2011 metais Kinijoje buvo nustatyta WUH4 KRKSV padermė, kuri buvo išskirta iš paršelių išmatų mėginių. Šios padermės citopatinis efektas pasireiškė alveolinių makrofagų sunykimu, sulipimu, sukibimu. Siekiant įvertinti ir charakterizuoti KRKSV evoliucionavimą, buvo nustatyta KRKSV WUH4 padermės genomo seka ir patalpinta į GenBank, suteikiant JQ326271 prieigos kodą. Tokiu būdu tyrimais patvirtinamas galimas fekalinis – peroralinis KRKSV plitimo
kelias, o tai savo ruožtu reikalauja tolesnių tyrimo įrodymu, kaip sėkmingai KRKSV gali dauginti virškinamajame trakte (Song et al., 2012).
Tyrimais nustatytas skirtingas įvairių KRKSV padermių tropizmas skirtingose ląstelių kultūrose. R. Wang (2013) nustatė skirtingą INF signalų perdavimą įvairioms KRKSV padermėms. Ištyrus 6 KRKSV padermes (VR-2385, Ingelvac PRRS MLV, VR-2332, NVSL97-7895, MN184 ir
Lelystad) nustatyta, kad MN184 padermė slopina INF signalų perdavimą, virusą izoliuojant MARK-145 ląstelių kultūroje, o Ingelvac PRRS MLV ir
NVSL97-7895 blokuoja IFN aktyvaciją, virusą izoliuojant PAM ląstelių
kultūroje (Wang et al., 2013a).
Y. Sang (2012) atliko tyrimus, siekiant sustiprinti įgimtą ir įgytą imuninį atsaką į virusinę infekciją po vakcinacijos per interferonų ekspresiją. Tuo tikslu buvo sukonstruotas KRKSV cDNR klonas (pCMV-P129), kuris
efektyviai dauginosi ir imitavo motininio viruso elgesį MARK-145 ir PAM ląstelių kultūrose. Viruso dauginimuisi stebėti buvo naudojama realaus laiko AT-PGR. Tyrimo metu buvo panaudotos dvi US KRKSV padermės NVSL97-7895 ir SDSU28983 (Kim et al., 2007; Kim et al., 2009). Klono
izoliatams aptikti buvo panaudoti ORF6 (TRS6) srities pradmenų kopijos, turinčios dvi restrikcijos vietas tarp ORF1b ir ORF2a sričių (Yoo et al., 2004; Pei et al., 2009). Naujai gautos KRKSV sekos buvo adaptuotos dauginimuisi MARK-145 ir PAM ląstelių kultūrose. Nustatyta, kad
rekombinantinio KRKSV baltymų replikacija ir infekcijos dinamika tokia pat kaip ir kamieninio viruso MARK-145 ir PAM ląstelių kultūrose, todėl
gali būti naudojamas infekcijos metu pasireiškiantiems klinikiniams simptomams paaiškinti (Konig et al., 2010; Karlas et al., 2010).
2. TYRIMŲ METODIKA
Mokslinis darbas buvo atliktas 2010–2014 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos Imunologijos laboratorijoje, Mikrobiologijos ir virusologijos instituto Virusologinių tyrimų laboratorijoje ir Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto, Serologinių tyrimų skyriuje. Skirtingais tyrimų metodais buvo ištirti 996 Lietuvos laukinių šernų (n=570) ir kiaulių (n=426) kraujo serumo (n=420) ir plaučių (n=576) patologiniai mėginiai. KRKSV epidemiologiniams tyrimams 2010–2014 m. mėginiai buvo imami iš įvairių Lietuvos ir Latvijos geografinių regionų. Serologiniai tyrimai skirtingose kiaulių grupėse buvo atliekami suskirsčius kiaules pagal amžių ir paskirtį į paršavedžių ir kiaulaičių, įvairaus amžiaus kuilių, paršelių iki trijų mėnesių amžiaus ir penimų kiaulių. Laukinių šernų mėginiai buvo suskirstyti pagal amžių į jauniklių iki 12 mėn., jaunų šernų (12–24 mėn.) ir suaugusių (24 mėn. ir vyresnių) šernų grupes. Tyrimams su gyvūnais arba eksperimentinio užkrėtimo metu buvo užkrėsti 60–70 dienų amžiaus paršeliai, atsižvelgiant į Europos Sąjungoje ir Lietuvos Respublikoje galiojančius teisės aktus, reglamentuojančius eksperimentus su gyvūnais (2012 lapkričio 23 d. Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas atlikti eksperimentus su gyvūnais Nr. 0241 (4 priedas)). Tyrimai buvo atlikti laikantis 2012 m. spalio 31 d. Lietuvos Respublikos Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymu Nr. B1-866 „Dėl mokslo ir mokymo tikslais
naudojamų gyvūnų laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo“ („Valstybės žinios“, 2012-11-10, Nr. 130-6595) bei 2015 m.
balandžio 3 d. Lietuvos Respublikos Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymu Nr. B1-314 „Dėl Valstybinės maisto ir
veterinarijos tarnybos direktoriaus 2012 m spalio 31 d įsakymo Nr. B1-866
„Dėl Mokslo ir mokymo tikslais naudojamų gyvūnų laikymo priežiūros ir naudojimo reikalavimų patvirtinimo“ pakeitimo“ įsakymu patvirtintų reikalavimų. Taip pat 1997 m. lapkričio 6 d. Lietuvos Respublikos gyvūnų gerovės ir apsaugos įstatymu („Valstybės žinios“, 2012-10-20, Nr. 122-6126), ES Direktyva 86/609/EEC ir EK rekomendacijomis 2007/526 EC dėl „Gyvūnų naudojimo ir laikymo eksperimentiniais ir kitais tikslais“.
2.1. pav. Darbo tyrimų schema
2.1. Tiriamųjų mėginių paėmimas, saugojimas ir transportavimas
Kiaulių kraujo serumo mėginiai buvo pristatomi identifikuoti pagal gyvūnų laikymo vietą, numeruoti. Visi tyrimams gauti kraujo mėginiai buvo paliekami 12 valandų 5,0±1,0 ºC temperatūroje, centrifuguojami 1500 aps./min., atskiriamas serumas iki tyrimų pradžios, laikomi užšaldyti ≤-18,0 ºC temperatūroje. Visi kraujo serumo mėginiai prieš bei po tyrimų, saugojami kontroliuojamų temperatūrinių režimų (-15/-25 ºC) šaldikliuose. Apie šiuos mėginius ūkiuose buvo gauta tiksli bei išsami informacija, pažymint kiaulių amžių, lytį, veislę, rajoną ir ūkį. Renkant kiaulių bei šernų kraujo serumo mėginius, laikytasi atsitiktinio mėginių pasirinkimo principo.
Nušautų šernų kraujo mėginiai buvo skubiai renkami lauko sąlygomis tiesiogiai iš krūtinės ertmės, talpinami į šaldytuvą +4 ºC temperatūroje 24 valandoms, atskirtas kraujo serumas surenkamas ir laikomas
-
18–(-
20) ºC temperatūroje, kol bus atliekamas serologinis specifinių antikūnų tyrimasMėginiai
IFA AT-
PGR Lizdinė AT-
PGR Elektroforezė Filogenetinė analizė Eksperimentinis užkrėtimas TaqMan PGR KRKSV tyrimai PAM ir MARK-
145 ląstelių kultūrosearba PGR. Patologinė medžiaga – plaučių audinių fragmentai, laikantis biologinės saugos reikalavimų, buvo sudedama į sandarius plastikinius transportavimo maišus. Visa patologinė medžiaga buvo ženklinama. Pristačius į laboratoriją, jeigu nebuvo galimybės iš karto atlikti tyrimus, medžiaga buvo laikoma šaldikliuose apie -10 ºC temperatūroje sandariuose
transportavimo maišuose. Mėginiai į laboratoriją buvo transportuojami drėgmei atspariuose ir skysčių nepraleidžiančiuose konteineriuose, laikantis biosaugos reikalavimų.
2.2. KRKSV specifinių antikūnų nustatymas
kraujo serumo mėginiuose
KRKSV specifinių antikūnų nustatymui buvo panaudotas netiesioginės imunofermentinės analizės (IFA) metodas ir tyrimai atliekami šiuo metu Lietuvoje KRKSV antikūnams tirti skirtais komerciniais IDEXX PRRS X3 (IDEXX, Šveicarija) ir INGEZIM PRRS Europa (INGENASA, Ispanija) diagnostiniais rinkiniais. Šie rinkiniai buvo įvertinti pagal R. H. Jacobsono (1998) aprašytas IFA metodo patikrinimo procedūras. Rinkinių validacijai buvo atrinkti kontroliniai, referentiniai ar standartiniai serumų mėginiai su KRKSV specifiniais antikūnais ir be jų, buvo optimizuotos atlikimo procedūros, naudojant įvairių skiedimų ar antikūnų lygmens serumus, taip pat, įvertintas jautrumas bei specifiškumas, nustatytos standartinės paklaidos ir tyrimo rezultatų atkartojamumas.
Tyrimai buvo atliekami pagal IFA diagnostinių rinkinių gamintojų metodines rekomendacijas. Mikroplokštelių šulinėliai padengiami rekombinantiniu KRKSV antigenu. Tiriami praskiesti mėginiai inkubuojami šulinėliuose. Visi kraujo serume ir plazmoje esantys specifiniai KRKSV antikūnai susijungia su antikūnu ir suformuoja kompleksą. Nesurišti junginiai pašalinami iš šulinėlių plovimo metu. IgG konjugatas, žymėtas krienų peroksidaze, susijungia su antikūnu, esančiu šulinėlyje. Nesusirišęs konjugatas pašalinamas plovimo metu. Įdėjus TMB substrato, šulinėlio spalva pasikeičia. Spalvos intensyvumas proporcingas susijungusių specifiškų KRKSV antikūnų kiekiui.
Palyginamųjų tyrimų rezultatų kokybiniam patikimumui užtikrinti, buvo naudojami kontroliniai referentiniai serumai (kokybinė standartizacija), gauti 2011 metais iš KRKSV referentinės R&D Laboratorijos, įsikūrusios Deventeryje, Olandijoje, dalyvaujant tarptautiniuose žiediniuose bandymuose „Kiaulių reprodukcijos ir kvėpavimo sindromo viruso (KRKSV) antikūnų aptikimas serumo mėginiuose“.
Tyrimų rezultatai buvo nuskaitomi spektrofotometro (SunriseTM,Tecan, Šveicarija) pagalba, naudojant metodikoje nurodytą filtrą. Visų tyrimų
rezultatų galinių taškų matavimui naudota kontrolės ir informacijos redukcijos „Magellan Standard“ (Tecan, Šveicarija) programinė įranga.
KRKSV specifinių antikūnų nustatymui kraujo serumo mėginiuose naudojant HerdChek* PRRS X3 diagnostinį rinkinį (IDEXX, Šveicarija), reakcijos rezultatai buvo vertinami naudojant 650 nm filtrą, kai skirtumas tarp teigiamos ir neigiamos kontrolės reikšmių buvo ≥0,150, o neigiamos kontrolės reikšmė (NKx) ≤0,150. Tokiu atveju antikūnų prieš KRKSV kiekis tiriamuosiuose mėginiuose buvo nustatomas apskaičiuojant mėginio ir teigiamos kontrolės santykį M/T:
1. M/T<0,40 – mėginiai laikomi neigiamais (neturi KRKS viruso antikūnų);
2. M/T≥0,40 – mėginiai laikomi teigiamais (turi KRKS viruso antikūnų). Reakcija atliekama, kai į mikroplokštelę, kurios visi šulinėliai padengti rekombinantiniu KRKSV antigenu, du šilinėlius išpilstoma po 100 µl neigiamos ir į kitus du šulinėlius – po 100 µl teigiamos kontrolės. Į likusius šulinėlius išpilstoma po 100 µl 40 kartų praskiestų tiriamųjų mėginių (t. y. 5 µl mėginio ir 195 µl mėginių skiediklio) ir 30 min. inkubuojama kambario (18–25 ºC) temperatūroje. Po inkubavimo šulinėlių turinys nupilamas ir plokštelė 3–5 kartus praplaunama, į šulinėlį įpilant po 300 µl plovimo tirpalo. Plokštelių šulinėliai nusausinami ir į kiekvieną šulinėlį išpilstoma po 100 µl kiaulių IgG krienų peroksidaze žymėto konjugato. Plokštelė vėl 30 min. inkubuojama kambario (18–25 ºC) temperatūroje. Po inkubavimo plokštelės vėl nukratomos ir 3–5 kartus praplaunamos plovimo tirpalu. Po to į kiekvieną šulinėlį išpilstoma po 100 µl TMB substrato tirpalo ir 15 min. inkubuojama kambario (18–25 ºC) temperatūroje. Po 15 min. užpilama po 100 µl STOP tirpalo ir spektrofotometro pagalba įvertinami rezultatai.
Atliekant tyrimą su „INGEZIM PRRS Europa“ (INGENASA, Ispanija) diagnostiniu rinkiniu, tiriamieji kraujo serumo mėginiai buvo vertinami spektrofotometru, naudojant 405 nm bangos ilgį. Reakcija atliekama, kai tiriamieji kraujo serumo mėginiai 100 kartų atskiedžiami skiedimo tirpalu. Tada į šulinėlius išpilstoma po 100 µl mėginio ir 60 min. inkubuojama 37 ºC temperatūroje. Po inkubavimo šulinėliai 4 kartus praplaunami 10 kartų dejonizuotu vandeniu atskiestu tirpalu. Į šulinėlius pilama po 100 µl šimta kartų atskiesto konjugato ir 45 min. inkubuojama kambario (18–25 ºC) temperatūroje. Šulinėliai 5 kartus praplaunami ir užpilama po 100 µl 10 kartų substrato buferiu atskiesto substrato tirpalo. 15 min. inkubuojama kambario (18–25 ºC) temperatūroje. Reakcija stabdoma užpilant 100 µl STOP tirpalo. Tiriamieji mėginiai vertinami apskaičiuojant tiriamojo kontrolinio mėginio optinį tankį, dauginant iš 0,15. Gauto skaičiaus suma laikoma riba, nuo kurios skaičiuojami reakcijos rezultatai. Jei gauta suma
yra didesnė už apskaičiuotą ribinę – mėginys yra laikomas teigiamu; jei gauta suma mažesnė – neigiamu.
2.3. RNR išskyrimas tyrimams atvirkštinės transkripcijos
polimerazės grandinine reakcija
KRKSV RNR buvo išskiriama iš kiaulių ir šernų kraujo serumo ir plaučių audinių mėginių. Šiam tikslui buvo panaudotas komercinis ,,GeneJETTM RNA Purification Kit‘‘ (ThermoScientific, Lietuva) RNR išskyrimo rinkinys (ISO 9001, ISO 14001), kurio veikimas pagrįstas modifikuotu Chomczynski ir Boom metodais (Chomczynski and Sacchi, 1987; Boom et al., 1990). Viruso RNR izoliavimo procedūra buvo atliekama vadovaujantis gamintojo (ThermoScientific) pateiktu aprašymu. Juo remiantis, imama 200 μl tiriamo kraujo serumo arba 10–30 mg plaučių
audinio mėginio skutenų, užpilama 300 μl lizuojančio buferio ir 6 µl DTT
tirpalo mišinio, 10 s purtoma „Vortex“ kratyklėje (IKA, JAV), vėliau užpilama 590 μl šarminio TE buferio ir 10 µl proteinazės K mišinio, taip pat
intensyviai kratoma ir 10 min. inkubuojama 15–25°C kambario temperatūroje. Vėliau lizatas 5 min. centrifuguojamas 12 tūkst. aps./min. greičiu centrifuga (Nippon Genetics Europe, Korėja), paviršinė frakcija, kurioje yra RNR, perkeliama į naują mėgintuvėlį be R-nazių (Eppendorf, Vokietija) ir užpilama 450 μl (96–100 proc.) etanolio, gerai išmaišoma
pipetuojant ir vėl po 700 μl mėginio perkeliama į naują mėgintuvėlį ant
kolonėlės, turinčios RNR imobilizuojančią membraną ir nucentrifuguojama. Vėliau tris kartus praplaunama, RNR išplauti/išgryninti skirtais plovimo buferiais, turinčiais 96 proc. etanolio, centrifuguojant. RNR nusausinama papildomai centrifuguojant 1 minutę 12 tūkst. aps./min. greičiu. Kolonėlės perkeliamos į naujus sterilius komercinio rinkinio mėgintuvėlius, o ant kiekvienos membranos užpilama po 100 μl nuo R
-
nazių ar kitų inhibitoriniųmedžiagų išvalyto vandens ir 1 min. centrifuguojama 12 tūkst. aps./min. greičiu. Išskirta RNR iki naudojimo laikoma užšaldyta
-
20 °C temperatūroje, o naudojama atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininėje reakcijoje.2.4. Atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija
Atvirkštinė transkripcija (AT) buvo atliekama siekiant prieš tai aprašytos reakcijos metu gautą viruso RNR transkribuoti į komplementarią viengrandę DNR (cDNR). AT-PGR mišinys buvo paruoštas pagal gamintojo instrukciją, sumaišant 2,5 µl RNR su 12,5 µl ,,DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)”
(ThermoScientific, Lietuva) reakcijos mišinio, 7,07 µl vandens be nukleazių (ThermoScientific, Lietuva), po 1 µl išorinių pradžios ir pabaigos oligonukleotidinių pradmenų, kurių darbinė koncentracija – 20 pmol/µl (amerikinio ir europinio genotipų pradmenų sekos pateiktos 2.4.1. lentelėje), 0,5 µl 10 % tritonu-X (Sigma, JAV), 0,3 µl atvirkštinės transkriptazės ,,Revert AidTM‘‘ (200 u/µl) (ThermoScientific, Lietuva), 0,13 µl R-nazių inhibitoriumi ,,RiboLockTM‘‘ (20 u/µl) (ThermoScientific, Lietuva).
2.4.1. lentelė. AT-PGR KRKSV oligonukleotidiniai pradmenys Eil.
Nr.
Oligonukleoti-dinių pradmenų
pavadinimai Oligonukleotidinių pradmenų seka 5’-3’
AT-PGR produkto ilgis bp Genomo regionas ir literatūros šaltinis
1. EU PRRSV1-1 EU PRRSV1-2 CAA CCT CCT GTA TGA ACT TGC AGG TCC TCG AAC TTG AGC TG 258 (Reiner et ORF 1 al., 2009) 2. EU ORF 5B EU ORF 5C TAT GTI ATG CTA AAG GCT AGC AC CAA TGA GGT GGG CIA CAA CC 719
ORF 5 (Oleksie-wicz et al.,
1998) 3. US 208F US 331R GTA CGG CGA TAG GGA CAC C CCA GAA TGT ACT TGC GGC C 914 (Umthun et ORF 5
al., 1999) 4. EU ORF 7B EU ORF 7C TCG CCC TAA TTG AAT AGG TGA GCC CCT GCC CAI CAC G 636 (EU) 659 (ŠA)
ORF 7 (Oleksie-wicz et al.,
1998) 5. EU PLR EU PLS TCG CCC TAA TTG AAT AGG TG ATG GCC AGC CAG TCA ATC A 432
ORF 7 (Mardassi
et al., 1994) Pastaba: I=TAD; EU – Europos; ŠA – Šiaurės Amerikos
Reakcija buvo atliekama remiantis M. B. Oleksiewicz (1998) pateikta metodika. Mėginiai buvo amplifikuoti „Mastercycler® personal“ (Eppendorf, Vokietija) amplifikatoriuje tokiomis sąlygomis (2.4.2. lentelė).
2.4.2. lentelė. Atvirkštinės transkripcijos PGR amplifikavimo sąlygos Etapai Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius
Atvirkštinė transkripcija 42 30 min 1
Pradinė denatūracija 95 5 min 1
Denatūracija 94 1 min
Hibridinimas 55 1 min
DNR sintezė 72 1 min 30 s 40
AT-PGR produktai po amplifikavimo buvo naudojami lizdinėje polimerazės grandininėje reakcijoje, o iki tol laikomi šaldytuve +4 °C temperatūroje.
2.5. Lizdinė polimerazės grandininė reakcija
Lizdinės PGR mišinys buvo paruoštas pagal gamintojo instrukciją, sumaišant 2,5 µl AT-PGR produkto su 12,5 µl ,,DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)” (ThermoScientific, Lietuva) reakcijos mišinio, 8 µl vandens be nukleazių (ThermoScientific, Lietuva), po 1 µl vidinių pradžios ir pabaigos 20 pmol/µl darbinės koncentracijos oligonukleotidinių pradmenų (lizdinėje PGR naudoti pradmenys pateikti 2.5.1. lentelėje).
2.5.1. lentelė. Lizdinės PGR KRKSV oligonukleotidiniai pradmenys Eil.
Nr.
Oligonukleo-tidinių pradmenų
pavadinimai Oligonukleotidinių pradmenų seka 5’-3’
AT-PGR produkto ilgis bp Genomo regionas ir literatūros šaltinis
1. EU PRRSV1-3 EU PRRSV1-4 CTG TAT GAA CTT GCA GGA TG CGA CAA TAC CAT GTG CTG 186 (Reiner et ORF 1 al., 2009) 2. EU ORF 5R EU ORF 5F CTA GGC CTC CCA TTG CTC AGC CGA AGT 606 ATG AGA TGT TCT CAC AAA TTG GGG CG (Suarez et ORF 5 al., 1996) 3. US ORF 5B US ORF 5C AAA GGT GCA GAA GCC CTA GC GCT CCA TTT CAT GAC ACC TG 818
ORF 5 (Meulen-berg et al.,
1993) 4. EU F1343 EU R133 CGA GCT GTT AAA CGA GGA TGT TCG CCC TAA TTG AAT AGG TGA 418 (Drew et ORF 7
al., 1997) 5. EU 7-as EU 7-s CTG TAT GAG CAA CCG GCA GCA T ATG ATA AAG TCC CAG CGC CAG 219 (Pesch et ORF 7 al., 2003)
Mėginiai amplifikuoti „Mastercycler® personal“ amplifikatoriuje (Eppendorf, Vokietija). Amplifikavimo sąlygos pateiktos 2.5.2. lentelėje.
2.5.2. lentelė. Lizdinės PGR amplifikavimo sąlygos
Etapai Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 95 5 min 1
Denatūracija 94 1 min
Hibridinimas 55 1 min
DNR sintezė 72 1 min 30 s 40
2.6. Elektroforezė ir lizdinės PGR vizualizacija
Lizdinės PGR produktai buvo frakcionuojami 1,8 % agarozės gelyje (Top Vision™ GQ Agarose, ThermoScientific, Lietuva), dažytame 1 µl/ml etidžio bromidu (Life Technologies, JAV). Elektroforezė buvo atliekama 1xTBE buferyje (ThermoScientific, Lietuva), 67 minutes leidžiant 120 V įtampos elektros srovę. Elektroforezei atlikti naudojamas ,,Consort EV243‘‘ (Sigma Aldrich, JAV) elektroforezės aparatas. Lizdinės PGR elektroforezės rezultatai buvo matomi UV lempos ,,UV T-20M‘‘ (Herolab, Vokietija) spinduliuose ir vertinami ties atitinkamo susidariusio produkto dydžio (bp) molekulinės masės žymeklio ,,GeneRuler™ Low Range DNA Ladder“ arba ,,MassRulerTM Low Range DNA Ladder, ready to use“ (ThermoScientific, Lietuva) atitinkama pozicija ir pagal produkto švytėjimo intensyvumą, kuris buvo įvertintas Qubit 2.0 Fluorimetru (Invitrogen by Life Technologies,
JAV) pagal susidariusio specifinio PGR 186 bp dydžio produkto koncentraciją, kuri buvo įvardijama ,,+” – teigiamas KRKSV atžvilgiu mėginys (+++ – specifinio PGR 186 bp produkto koncentracija >30 ng/10 µl; ++ – specifinio PGR 186 bp produkto koncentracija 10–30 ng/10 µl; + – specifinio PGR 186 bp produkto koncentracija <10 ng/10 µl), ,,–“ – neigiamas KRKSV atžvilgiu mėginys.
2.7. Komplimentarios cDNR gavimas
Mėginio komplimentariajai DNR gauti buvo paruoštas mišinys pagal gamintojo instrukciją, naudojant komercinį ,,RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit‘‘ (ThermoScientific, Lietuva) rinkinį (ISO 9001, ISO 14001): sumaišius 5 µl RNR, 6 µl vandens be nukleazių, 1 µl oligonukleotido ,,Oligo(dT)18 primer“, 4 µl 5X reakcijos buferio, 1 µl R-nazių inhibitorio ,,RiboLockTM“ (20 u/µl), 2 µl 10 mM dNTP mišinio, 1 µl atvirkštinės transkriptazės ,,Revert AidTM“ (200 u/µl). Mėginių cDNR mišiniai buvo inkubuojami amplifikatoriuje „Mastercycler® personal“ (Eppendorf, Vokietija) 60 minučių 42 °C temperatūroje, o po to kaitinami 70 °C temperatūroje 10 minučių. Gauta cDNR iki naudojimo buvo laikoma užšaldyta
-
20 °C temperatūroje.2.8. Realaus laiko
TaqManpolimerazės grandininė reakcija
Realaus laiko TaqMan polimerazės grandininei reakcijai skirtas mišinys
buvo paruoštas pagal gamintojo instrukciją, sumaišant 5 µl cDNR su 12,5 µl ,,TaqMan Universal Master Mix II No UNG’’ (Life Technologies, JAV) mišiniu, 5,8 µl vandens be nukleazių (ThermoScientific, Lietuva), 0,5 µl
žymens ir po 0,6 µl pradžios ir pabaigos oligonukleotidiniais pradmenimis (naudoti pradmenys ir žymenys pateikti 2.8.1. lentelėje). Mėginiai amplifikuoti ,,Mastercycler Realplex S‘‘ (Eppendorf, Vokietija) amplifikatoriuje, amplifikacijos sąlygos pateiktos 2.8.2. lentelėje.
2.8.1. lentelė. Realaus laiko TaqMan PGR oligonukleotidiniai pradmenys ir žymenys Eil. Nr. Oligonuk-leotidinių pradmenų ir žymenų pavadinimai Oligonukleotidinių pradmenų (5’-3’) ir žymenų (3’ – 5’) sekos Hibri-dinimo temp. °C AT-PGR produk-to ilgis bp Genomo regionas ir literatūros šaltinis
EU6-343f GTA GAA AGT GCT GCA GGT CTC CA EU6–462r CAC GAG GCT CCG AAG TCC T 1.
EU6-MGB FAM-CGC TGT GAG AAA GCC CGG ACT AAC A- TAMRA
60 119 ORF6 Revilla-Fernandez et al., 2005. 2. US6-289F US6-412R US6-MGB TCCAGATGCCGTTTGTGC GACGCCGGACGACAAATG Fam-CCCTGCCCACCA8GT-ZNA3-BHQ1 60 123 ORF6 Revilla-Fernandez et al., (2005) PRRSV- EU-2.1F GCACCACCTCACCCRRAC PRRSV- EU-2.1R CAGTTCCTGCRCCYTGAT 3. PRRSV-
EU-2.1FAM FAM-CCT CTG YYT GCA ATC GAT CCA GAC-BHQ-1-3
58 77 Kleiboeker ORF7(A) et al., 2005. EUFrossfor GAT GAC RTC CGG GAY C
EUFrossrev CAG TTC CTG CGC CTT GAT 4. EUFross
probe Fam-TGC AAT CGA TCC AGA CGG CTT-Tamra
55 66 Frossard et ORF7(B) al., 2012. Pastaba: Y=C+T; R=A+G.
Realaus laiko TaqMan AT-PGR rezultatai vertinami, analizuojant tiriamųjų mėginių Ct reikšmę – PGR produkto susidarymo ciklą, pasireiškiantį švytėjimu (fluorescencijos signalu). Gautiems rezultatams įvertinti naudojamos ribinės (Ct) vertės, kurios apskaičiuojamos remiantis 2-ΔΔCT metodu, kurių dydis parodo, kuriame cikle švytėjimo kreivė kirto ribinį slenkstį.
Reakcijos mišinio ir pradmenų kiekiai gali būti apskaičiuojami remiantis gamintojo pateikta skaičiuokle: http://www.thermoscientificbio.com/ webtools/qpcrreaction/.
2.8.2. lentelė. Realaus laiko TaqMan PGR amplifikavimo sąlygos
Etapai Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius
Pradinė denatūracija 95 10 min 1
Denatūracija 94–95 15–20 s
Hibridinimas 55–60 30–45 s
Išplėtimas 72 30 s 40
2.9. Nukleotidų sekų nustatymas
Prieš nustatant pasirinktų sričių (ORF5, ORF1, ORF6, ORF7) nukleotidų sekas, atlikus elektroforezę 1,5 proc. agarozės gelyje, AT-PGR produktai buvo išplauti nuo pašalinių druskų, panaudojant komercinį PGR produktų valymo rinkinį „GeneJET™ Gel Extraction Kit“ (ThermoScientific,
Lietuva). Specifinės molekulinės masės AT-PGR produktų juostelės išpjaunamos su juose esančiais amplifikuotais DNR fragmentais, talpinamos į 1,5 ml talpos mėgintuvėlius ir pasveriama. Toliau priklausomai nuo svorio, 100 mg agarozės gelio kiekiui užpilama 100 μl specialaus surišančio
buferio. Inkubuojama 10 min. 50–60° C temperatūroje kol ištirps gelis.
Toliau 800 μl ištirpusio gelio tirpalo pernešama ant GeneJET™ surišančios
kolonėlės, 1 min. centrifuguojama 12000 x g greičiu, centrifugatas nupilamas. Toliau ant kolonėlės užpilama 100 μl specialaus surišančio
buferio, 1 min. centrifuguojama 12000 x g greičiu, centrifugatas nupilamas. Ant kolonėlės užpilama 700 μl plovimo buferio, 1 min. centrifuguojama
12000 x g greičiu, centrifugatas nupilamas. Dar kartą tuščia GeneJET™
surišanti kolonėlė nucentrifuguojama 1 min. 12000 x g greičiu, perkeliama į švarų 1,5 ml talpos mėgintuvėlį, ant kolonėlės membranos užpilama 50 μl
vandens, ir 1 min. centrifuguojama 12000 x g greičiu. Gautas centrifugatas su joje išplauta DNR saugomas
-
20° C temperatūroje.Gelyje išvalytų, bet neklonuotų AT-PGR produktų nukleotidų sekos buvo nustatytos panaudojant „BigDye Terminator Cycle Sequencing“ rinkinį (v2.0, Applied Biosystems, JAV) ir ABI Prism® 310 genetinį analizatorių (Applied Biosystems, JAV), esantį Biotechnologijos instituto sekvenavimo centre. Tam tikslui buvo naudojami tie patys nukleotidiniai pradmenys, kurie buvo panaudoti amplifikuojant lizdinės PGR produktus. Toliau sekvenatoriaus nustatytos chromatogramos buvo analizuojamos, tikrinamos ir tvarkomos naudojant kompiuterinę programą SeqMan ir
2.10. Eksperimentinių gyvūnų užkrėtimas
Eksperimentiniam gyvūnų užkrėtimui buvo pasirinkti 60–70 dienų amžiaus paršeliai, kurie buvo gauti iš veislinio ūkio, laisvo nuo pagrindinių kiaulių infekcinių ligų, taip pat ir KRKSV. Visi gyvūnai prieš eksperimentą
in vivo buvo ištirti KRKSV specifinių antikūnų atžvilgiu ir AT-PGR
metodu, kurie parodė neigiamus tyrimų rezultatus. Buvo sudarytos keturios paršelių grupės po 3 paršelius kiekvienoje, kurios visą eksperimento laikotarpį buvo laikomos atskirtos viena nuo kitos, skirtingose laikymo vietose. Viena trijų paršelių grupė visą eksperimento laikotarpį buvo laikoma kontroline – neužkrėsta. Antrosios grupės paršeliai buvo užkrėsti referentine KRKSV paderme „Lelystad“, o likusios dvi atitinkamai iš šernų izoliuotomis apie 105 TCID
50/paršeliui 58LT ir apie 104,5 TCID50/paršeliui 118LT padermėmis, kurios priklausė 3
-
ojo ir 4-
ojo subtipo KRKSV padermėms, sutinkamomis Vakarų ar Centrinėje Europoje, taip pat būdingos Lietuvos, Latvijos, Baltarusijos ir Rusijos regionams. Eksperimentinio užkrėtimo metu buvo imama po apytiksliai 104 TCID50/paršeliui „Lelystad“, apie 105 TCID
50/paršeliui 58LT padermės ir apie 104,5 TCID50/paršeliui 118LT padermės, atskiedžiama 2 ml fosfatinio buferinio tirpalo ir po 1 ml sušvirkščiama paršeliams į kiekvieną šnervę, palaikoma, kad neišbėgtų. Taip užkrėsti paršeliai buvo stebimi ir klinikiniai požymiai vertinami 22 paras iki eksperimento pabaigos. Po eksperimentinio užkrėtimo paršeliai buvo eutanazuoti Euthanimal 20 % injekciniu tirpalu (Alfasan Nederland BV, Nyderlandai), suleidžiant po 0,5 ml/kg paršelio svorio į veną. Eutanazuoti paršeliai buvo utilizuoti UAB „Rietavo veterinarinė sanitarija“.
2.11. Tiriamosios medžiagos paruošimas KRKS virusui izoliuoti
KRKSV izoliavimui buvo atrinktos tos KRKSV padermės, kurios gerai AT-PGR amplifikavosi ORF5 ir ORF7 srityse ir, atlikus filogenetinę analizę bei nustačius nukleotidų sekas, gerokai skyrėsi nuo Vakarų Europoje paplitusių padermių. KRKSV izoliuoti buvo atrinkti 1–2 metų amžiaus sumedžiotų šernų plaučių gabalėliai, limfmazgių, migdolinių liaukų, blužnies fragmentai arba kraujo serumo mėginiai, kuriems KRKSV buvo patvirtintas taikant AT-PGR metodą. Iš organų audinių fragmentų buvo paruošiama suspensija, kuri buvo centrifuguojama, filtruojama ir pridėjus penicilino G (100 vnt. ml), streptomicino (100 μg/ml) bei 50 μg/ml gentamicino buvo naudojama užkrečiant alveolinių makrofagų kultūrą arba MARK
