MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MONIKA OVSIANAITĖ
LIETUVOJE AUGANČIŲ DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ
(GINKGO BILOBA L.) LAPŲ EKSTRAKTŲ
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS,
NAUDOJANT ABTS REAGENTĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Lekt. dr. Augusta Ževžikovienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto
Dekanas prof. Dr. Vitalis Briedis
LIETUVOJE AUGANČIŲ DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ
(GINKGO BILOBA L.) LAPŲ EKSTRAKTŲ
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS,
NAUDOJANT ABTS REAGENTĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Lekt. dr. Augusta Ževžikovienė
Recenzentas: Darbą atliko:
Magistrantė Monika Ovsianaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) apibūdinimas ir morfologinis aprašymas ... 10
1.1.1. Ginkgo biloba L. auginimas ir paplitimas ... 11
1.1.2. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) vaistinė augalinė žaliava ... 11
1.2. Dviskiaučio ginkmedžio lapų fitocheminė sudėtis ... 11
1.3. Ginkmedžio lapų ekstrakto biologinis poveikis ... 17
1.3.1. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) panaudojimas medicinoje ... 17
1.3.2. Dozavimas ... 20
1.3.3. Šalutinis dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto poveikis, sąveika su vaistais ... 20
1.3.4. Ekstraktų kokybės tikrinimas ... 21
1.4. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas, antioksidantai, antioksidacinio aktyvumo nustatymas21 1.4.1. Laisvieji radikalai ... 21
1.4.2. Oksidacinis stresas ... 22
1.4.3. Antioksidantai ... 23
1.4.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 25
1.4.5. ABTS (laisvųjų radikalų surišimo metodas) ... 25
2. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI ... 28
2.1. Tyrimo objektas ... 28
2.2. Naudoti reagentai ... 28
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės ... 28
2.4. Duomenų statistinis įvertinimas ... 29
2.5. Tiriamojo mėginio paruošimas ... 29
2.6. Spektrofotometriniai metodai ... 30
3.1. Bendro flavonoidų kiekio įvertinimas skirtingais metais rinktuose dviskiaučių ginkmedžių
lapų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu ... 33
3.2. Suminio flavonoidų kiekio priklausomybės nuo oro sąlygų įvertinimas ... 35
3.3. Suminio flavonoidų kiekio įvertinimas skirtinguose Lietuvos regionuose rinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose bei arbatose ... 36
3.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu, naudojant ABTS reagentą, skirtingu vegetacijos laikotarpiu rinktuose dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktuose ... 37
3.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas skirtinguose Lietuvos regionuose rinktuose Ginkgo biloba L. lapų ekstraktuose ... 39
3.6. Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų ir ginkmedžių lapų arbatų antioksidacinio aktyvumo palyginimas ... 40
3.7. Flavonoidų kiekio įtakos antioksidaciniam aktyvumui įvertinimas ... 41
3.8. Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas ir medžio amžius ... 42
3.9. Tyrimo rezultatų aptarimas ... 43
IŠVADOS ... 44
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
SANTRAUKA
M. Ovsianaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė lekt., Dr. Augusta Ževžikovienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.
Pavadinimas: Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas, naudojant ABTS reagentą.
Raktiniai žodžiai: Ginkgo biloba L., dviskiautis ginkmedis, flavonoidai, spektrofotometrija, antioksidacinis aktyvumas, ABTS.
Tyrimo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.
Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti suminį flavonoidų kiekį dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose skirtingu vegetacijos laikotarpiu. 2. Įvertinti Ginkgo biloba L. lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu. 3. Palyginti skirtingais metais ir skirtingose augavietėse surinktų ginkmedžio lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą. 4. Įvertinti koreliacinį ryšį tarp suminio flavonoidų kiekio ir ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
Tyrimo objektas ir metodika: Tyrimo objektas – dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba
L.) lapų mėginiai, bei vaistinėse įsigytos skirtingų gamintojų ginkmedžių lapų arbatos. Bendras
flavonoidų kiekis augalinėje žaliavoje nustatytas spektrofotometriškai po reakcijos su aliuminio chloridu. Antioksidacinis aktyvumas įvertintas ABTS spektrofotometriniu metodu.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Spektrofotometrinės analizės metu didžiausias (p<0,05) flavonoidų kiekis nustatytas 2015 metais liepos mėnesį Šiauliuose rinktoje žaliavoje (11,85 ± 2,3 mg/g). Nustatytos antioksidacinio aktyvumo reikšmės Ginkgo biloba L. lapų ekstraktuose įvairavo nuo 293,56 ± 21,99 μmol/g iki 453,06 ± 0,48 μmol/g. 2015 metais surinkti lapų ekstraktai pasižymėjo stipresniu antioksidaciniu poveikiu, nei 2014 metais rinktos žaliavos mėginiai (p<0,05). Nustatytas stiprus (rs=0,74, p<0,05) koreliacijos ryšys tarp suminio flavonoidų kiekio ir
SUMMARY
M. Ovsianaitė master‘s thesis/ supervisor lect., Dr. Augusta Ževžikovienė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analitic and Toxicological chemistry – Kaunas.
Title: The antioxidant activity evaluation of Ginkgo biloba L. leaves growing in Lithuania, using ABTS spectrophotometry method.
Keywords: Ginkgo biloba L., flavonoids, spectrophotometry, antioxidant activity, ABTS. The aim: To estimate the antioxidant activity of Ginkgo biloba L. leaves growing in Lithuania, using ABTS spectrophotometry method.
Objectives: 1. To evaluate the total flavonoid content in Ginkgo biloba L. leaves extracts during different growing season. 2. To assess the antioxidant activity of Ginkgo biloba L. leaves extracts using ABTS spectrophotometry method. 3. To compare the antioxidant activity of Ginkgo
biloba L. leaves samples collected in different places during different years. 4. Estimate correlation
between quantity of flavonoids and antioxidant activity in Ginkgo biloba L. leaves extracts.
Object and methods: Research object – the samples of Ginkgo biloba L. leaves and Ginkgo
biloba L. leaves tea. The total flavonoid content has been measured using the spectrophotometric
method after the reaction with aluminum choride. Spectrophotometric ABTS method was used to determine antioxidant activity.
Results and conclusions: The highest amount of flavonoids (11,85 ± 2,3 mg/g) in Ginkgo
biloba L. leaves from Šiauliai was determined in July (2015 y.). The antioxidant activity varied from
293,56 ± 21,99 μmol/g to 453,06 ± 0,48 μmol/g. It was determined, that plant material, which was collected in 2015 y, showed a higher (p<0,05) antiradical activity than samples collected in 2014 y. Strong correlative dependence (rs=0,74, p<0,05) has been established between the total amount of
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) DNR – deoksiribonukleorūgštis
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
LHMT – Lietuvos hidrometeorologijos tarnyba prie Aplinkos ministerijos QE – kvercetino ekvivalentas (angl. Quercetin equivalent)
rs – Spirmeno koreliacijos koeficientas
TE – trolokso ekvivalentas (angl. Trolox equivalent)
TEAC – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity) UV – ultravioletiniai spinduliai
ĮVADAS
Farmacijos pramonėje vis daugiau dėmesio skiriama naujų ir saugių augalinės kilmės vaistinių preparatų, pasižyminčių antioksidacinėmis savybėmis, kūrimui [1]. Šių preparatų veikliųjų medžiagų gydomosios savybės nenusileidžia cheminių vaistų poveikiui. Augaliniai preparatai rečiau sukelia nepageidaujamas reakcijas, yra geriau toleruojami. Dėl šių savo savybių, augaliniai vaistiniai preparatai dažnai vartojami lėtinių ligų gydyme bei profilaktikos tikslais [2].
Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) preparatai yra vieni iš dažniausiai parduodamų pasaulyje [3]. Dviskiaučio ginkmedžio ekstraktui yra skiriama daug dėmesio tiek farmacijos pramonėje, tiek vykdant laboratorinius tyrimus dėl jo plataus naudingų savybių spektro [4]. Alzheimerio liga, intelekto sutrikimai, koncentracijos problemos, depresija, spengimas ausyse, širdies ir plaučių ligos, įvairūs uždegimai yra oksidacinio streso pasekmės [4, 5, 6, 7]. Ginkmedžio ekstraktas yra nefermentinis (egzogeninis) antioksidantas neutralizuojantis laisvuosius radikalus, taip sumažinant arba visiškai sustabdant oksidacinio streso sukeltą ląstelių pažeidimą [8]. Farmakologinį dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto poveikį lemia ginkolidai, bilobalidai bei fenoliniai junginiai. Augalo kaupiamų veikliųjų junginių kiekybiniai ir kokybiniai rodikliai gali pakisti skirtingu vegetacijos laikotarpiu, veikiant išoriniams aplinkos veiksniams, vykstant įvairiems biocheminiams procesams. Norint įvertinti žaliavos kokybę, yra atliekami sudėties bei antioksidacinio aktyvumo nustatymo tyrimai [9, 10].
Su Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių augaline žaliava atlikta nedaug mokslinių tyrimų. Siekiant įvertinti Ginkgo biloba L. lapų ekstraktų panaudojimo galimybes, atliktas antioksidacinio aktyvumo įvertinimo tyrimas. Pagal nustatytą suminį flavonoidų kiekį ginkmedžio lapuose, galima spręsti kuriame vegetacijos laikotarpio tarpsnyje tikslinga rinkti augalinę žaliavą. Atliktų mokslinių tyrimų duomenys, apie natūraliai Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių žaliavą, galėtų būti panaudoti naujų efektyvių augalinių preparatų kūrime.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti suminį flavonoidų kiekį dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose skirtingu vegetacijos laikotarpiu.
2. Įvertinti Ginkgo biloba L. lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.
3. Palyginti skirtingais metais ir skirtingose augavietėse surinktų ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) apibūdinimas ir morfologinis
aprašymas
Dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.) yra seniausias medis žemėje, gyvuojantis daugiau nei 250 mln. metų [6]. Atrastas 1670 metais Azijoje [9]. Natūraliai auga Kinijoje, Japonijoje ir Korėjoje. Į Europą atvežtas XVIII amžiuje kaip dekoratyvinis augalas [11]. Šis augalas priklauso ginkmedainių (Ginkgoopsida) klasei ginkmedinių (Ginkgoaceae) šeimai. Dviskiautis ginkmedis yra vienintelis dar egzistuojantis savo genties atstovas. Ginkmedžio vardas kilęs iš japoniško žodžio „ginkyo“ ir kiniško žodžio „yinhsing“. Abiejų žodžių reikšmė vienoda, reiškianti sidabrinį abrikosą – taip apibūdinant riešutus augančius ant Ginkgo medžio. Terminą „Ginkgo“ 1712 metais pirmasis paminėjo vokiečių chirurgas E. Kaempfer. Dviskiaučio ginkmedžio pavadinimas buvo sugalvotas 1771 metais švedų mokslininko C. Linnaeus. Per 100 mln. metų ginkmedžio morfologija nelabai pasikeitė, tačiau laikui bėgant daugelis paplitusių ginkmedžio rūšių užleido vietą iki šių dienų gyvuojantiems žiediniams augalams.
Tai dvinamis, lapuotis, vasarą žaliuojantis medis, užaugantis iki 30 – 40 metrų aukščio. Kamieno skersmuo siekia iki 3 metrų. Vertikalus augimas paprastai sulėtėja medžio lytinės brandos pradžios metu, apie 25 augimo metus. Ginkmedžiai yra dviejų lyčių – moteriškos ir vyriškos, turi skirtingas chromosomas XY ir XX [12, 13]. Vyriškieji augalai siauromis lajomis, moteriškieji plačiomis laužytomis šakomis. Žievė pilka, senų kamienų tamsiai pilka, suaižėjusi. Ant šakų išauga dvejopi ūgliai: ilgaūgliai ir trumpaūgliai. Ilgaūglių lapai yra pavieniai, prisitvirtinę padrikai, o trumpaūglių – viršūnėse išaugę kuokštais po 5 – 7. Pavasarį ir vasarą žali, rudenį pagelstantys ir prieš žiemą nukretantys lapai – ilgakočiai, vėduokliški, dviskiautėmis viršūnėmis. Jų gyslotumas primityvus, dichotominis. Sėklos sunoksta spalį. Ginkmedžio vaisius – gintarinės spalvos, specifinio kvapo, 2 – 3 cm ilgio ir apie 3 cm skersmens, panašus į slyvos kaulavaisį. Kauliukas baltas, tribriaunis. Šaknų sistema plastiška, gili, medžiai atsparūs vėjui [13]. Ginkmedžio augimui neturi įtakos blogos aplinkos sąlygos – mažas šviesos kiekis, maisto medžiagų trūkumas. Ginkmedžiai atsparūs šalčiams, o dėl vėlyvos vegetacijos pradžios (gegužės viduryje) jiems nekenkia ir pavasarinės šalnos. Medis labai atsparus kenkėjų poveikiui – bakterijoms, grybams, virusams. Japonijoje, Šiaurės Amerikoje bei Europoje dažnai auga pakelėse, nes yra atsparus oro taršos poveikiui [12, 13].
1.1.1. Ginkgo biloba L. auginimas ir paplitimas
Ginkmedžiai dažnai dauginami sėklomis, tačiau Lietuvoje jų nesubrandina, todėl sėklos gaunamos iš kitų šalių (Kinijos, Japonijos, JAV, Vakarų Europos). Sėklos sėjamos rudenį, vazonėliai ar loveliai su pasėtomis sėklomis per žiemą paliekami vėsiose patalpose (-3 – 5 °C), nes sėkloms reikalingas stratifikavimas žemesnėje temperatūroje. Pavasarį, sudygus sėkloms, augalai sodinami į dirvą. Dirva turi būti silpnai rūgšti arba neutrali, puri, laidi orui. Patariama dirvą tręšti mineralinėmis trąšomis, nenaudoti organinių trąšų. Per 3 metus ginkmedžiai išauga iki 1 metro aukščio.
Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) gimtine laikoma Kinija. XII amžiuje medis iš Kinijos buvo atgabentas į Japoniją, o maždaug po 500 metų pasiekė Europą ir Šiaurės Ameriką. Daugelyje vidutinių platumų klimato juostos šalių dviskiautis ginkmedis auginamas botanikos soduose, parkuose, skveruose kaip dekoratyvinis medis. Lietuvoje aptinkamas retai. Dviskiaučiai ginkmedžiai auginami Vytauto Didžiojo Universiteto Kauno botanikos sode, Šiaulių botanikos sode, Dubravos miškų tyrimo stoties arboretume bei Obelynėje. Aukščiausias ir stambiausias ginkmedis auga Švėkšnos parke, jo aukštis siekia 17 metrų, o kamieno skersmuo 50 centimetrų [13].
1.1.2. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) vaistinė augalinė žaliava
Europos farmakopėjoje nurodyta dviskiaučio ginkmedžio vaistinė augalinė žaliava – lapai [14]. Šiuo metu daugiausia ginkmedžio augalinių preparatų yra gaminama iš sudžiovintų Ginkgo
biloba L. lapų. Žaliava renkama rudenį, rugsėjo mėnesį arba vėliau, pradėjus gelsti lapams. Lapai
džiovinami paskleidus pavėsyje vėdinamoje vietoje arba džiovykloje 40 – 50 °C temperatūroje. Išdžiūvę dviskiaučio ginkmedžio lapai yra gelsvai žalios arba gelsvai rudos spalvos. Išdžiovinta žaliava tinkama vartoti vienerius metus [13]. Iš sudžiovintų dviskiaučio ginkmedžio lapų yra gaminamas ekstraktas.
1.2. Dviskiaučio ginkmedžio lapų fitocheminė sudėtis
Ginkmedžio lapai turi daug cheminių sudedamųjų dalių. Pagrindinės yra šios: 1. Terpenai:
diterpenai seskviterpenai
triterpenai karotenoidai poliprenoliai monoterpenai 2. Flavonoidai: flavonai flavanoliai biflavonai flavonoliai 3. Organinės rūgštys 4. Neorganinės medžiagos 5. Angliavandeniai
6. Kiti organiniai junginiai
Terpenai
Pagrindinė sudedamoji dalis yra diterpenai (ginkolidai). Šiai junginių klasei yra skiriama daugiausia dėmesio dėl šioje klasėje esančių junginių cheminio unikalumo bei jų svarbos kokybės kontrolei. Jie turi tokį pat molekulinį geometrinį skeletą, skiriasi tik hidroksilo funkcinių grupių prisijungimo vieta. Ginkolidai sudaryti iš šešių penkianarių žiedų: spiro[4,4]nonano žiedo, trijų laktono žiedų ir tetrahidrofurano žiedo, prie B žiedo prisijungusio tretinio butilo grupę (žr. 1 pav. ir 1 lentelę) [10, 15].
1 lentelė. Ginkolidų A, B, C, J, M, K, L radikalai [10]. Ginkolidai R1 R2 R3 Ginkolidas A H H OH Ginkolidas B OH H H Ginkolidas C OH OH OH Ginkolidas J H OH OH Ginkolidas M OH OH H Ginkolidas K OH Ginkolidas L H
Tirdamas dviskiaučio ginkmedžio lapų sudėtį, olandų mokslininkas Van Beek nustatė, kad mažiausia ginkolidų ir bilobalidų koncentracija lapuose yra pavasarį. Daugiausia ginkolidų bei bilobalidų aptinkama vasaros viduryje. Veikliųjų junginių koncentracija ginkmedžio lapuose pradeda mažėti rudenį, pradėjus gelsti lapams [16].
Kita svarbi ginkmedžio lapų sudedamoji dalis yra bilobalidai. Jie kartu su ginkolidais yra atsakingi už biologinį ir farmakologinį ginkmedžio aktyvumą. Ginkolidai ir bilobalidai yra aptinkami tik ginkmedyje. Seskviterpenų – bilobalidų struktūra yra panaši į ginkolidų struktūrą (žr. 2 pav.), tačiau bilobalidai neturi tetrahidrofurano žiedo, jis yra pakeistas laktono žiedu [15, 17]. Bilobalidai didina antioksidacinių fermentų (superoksido dismutazės ir katalazės) aktyvumą bei gerina ląstelių gyvybingumą [9].
Flavonoidai
Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginių grupė, plačiai paplitusi žaliuosiuose augaluose. Jie dalyvauja augalo pigmentacijos procesuose, padeda apsisaugoti nuo įvairių ligų, apsaugo nuo UV spinduliuotės. Didžiausia flavonoidų koncentracija randama lapų epidermyje ir vaisių žievėje. Ginkgo biloba L. lapų ekstrakte nustatyta virš 30 skirtingų flavonoidų. Flavonoidų kiekis, randamas augalo lapuose, priklauso nuo medžio amžiaus, fotosintezės intensyvumo, sezono, dirvožemio, nuo brandinamų lapų ir sėklų kiekio. Ginkmedžio lapuose daugiau flavonoidų randama rudenį nei pavasarį. Svarbiausi veiksniai, lemiantys flavonoidų susidarymą, yra tinkama temperatūra ir reikiamas drėgmės kiekis [18].
Šie junginiai veikia kaip antioksidantai, kovoja prieš laisvųjų radikalų sukeltą žalingą poveikį. Taip pat jie inhibuoja fermentų veikimą bei sujungia metalų katijonus. Flavonoidų biologinis aktyvumas nėra didelis, dėl jų ribotos absorbcijos ir greito pasišalinimo iš organizmo. Flavonoidai, ginkmedžio lapų sudėtyje, dažnai randami kaip glikozidų dariniai. Glikozidų forma, jie yra prastai absorbuojami žarnyne, tik aglikono pavidale gali būti įsisavinti tiesiogiai. Neabsorbuoti flavonoidai, kurie pasiekia gaubtinę žarną, yra paveikiami bakterijų fermentų ir tada įvyksta jų absorbcija. Kepenyse flavonoidai yra metabolizuojami į konjuguotus darinius. Nustatyta, kad flavonoidų metabolitai gali pasižymėti kitokiu biologiniu aktyvumu nei pirminis junginys [9].
Flavonoidams būdinga C6-C3-C6 struktūra. Struktūros pagrindą sudaro pirano žiedas prie kurio prisijungę du benzeno žiedai. Pagrindinis flavonoidų skeletas gali turėti daug pakaitų. Hidroksigrupės dažniausiai prisijungia 4, 5 ir 7 pozicijose (žr. 3 pav.) [19].
3 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas
Flavonoidai klasifikuojami atsižvelgiant į C žiedo struktūrą ir pakaitus A ir B žieduose (žr. 2 lentelė).
2 lentelė. Flavonoidų grupių struktūra ir atstovų pavyzdžiai [19].
Flavonoidų klasė Struktūra Atstovai
1. Flavonai luteolinas, apigeninas, diosmetinas 2. Flavanoliai (katechinai) epikatechinas, galokatechinas 3. Flavonoliai kvercetinas, kempferolis, izoramnetinas, galanginas, miricetinas 4. Flavononai naringeninas, hesperidinas
5. Antocianidinai pelargonidinas, malvidinas, cianidinas 6. Izoflavonai genisteinas, daidzeinas, gliciteinas
Flavonoliai (kvercetinas, kaemferolis, izoharmnetinas) - pagrindinė ginkmedžio lapuose aptinkama flavonoidų grupė. Kvercetino, kaemferolio, izoharmnetino struktūra yra panaši, aptinkami O – glikozidų forma. Kaemferolis yra kvercetino metabolitas, o izoharmnetinas yra kaemferolio metabolitas [19].
Kitos dviskiaučio ginkmedžio lapų sudedamosios dalys
Ginkmedžio lapuose aptinkama nefenolinių junginių, tokių kaip askorbo rūgštis ir fenolinių – p – hidroksibenzoinė rūgštis, kofeino rūgštis, p – kumarino rūgštis, chlorogeno rūgštis bei ginkolinė rūgštis. Taip pat, dviskiaučio ginkmedžio lapų sudėtyje randama organinių (amino rūgštys, cukrūs, vaškai, glicerolio dariniai, peptidai) medžiagų bei neorganinių (cinkas, varis, geležis, selenas, kalcio oksalatas) [17, 19]. Kartais standartizuotame ginkmedžio lapų ekstrakte pasitaiko proantocianidinų (žr. 4 pav. ir 3 lentelę), kurie jungiasi prie baltymų ir slopina fermentų veikimą, taip mažindami antioksidacinį ekstrakto aktyvumą [9].
4 pav. Proantocianidinų struktūra [9]. 3 lentelė. Proantocianidinų radikalai [9].
Pavadinimas R
Proantocianidinas H Prodelfinidinas OH
1.3. Ginkmedžio lapų ekstrakto biologinis poveikis
Ginkmedžio ekstraktas veikia keliais būdais – sukeldamas antioksidacinį poveikį slopinant trombocitus aktyvuojančio faktoriaus veikimą, keičiant membranos takumą (signalo transdukciją) bei inhibuojant gliukokortikoidų sintezę [15]. Ginkmedžio kaupiami flavonoidai neutralizuoja laisvuosius radikalus. Dalinai dėl savo antioksidacinio aktyvumo, ginkmedis slopina toksinį poveikį ir ląstelių mirtį, kurią sukelia beta-amiloido plokštelės būdingos Alzheimerio ligai. Nustatyta, kad gydomąjį dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto poveikį sukelia visi komponentai kartu, o ne atskiros sudedamosios dalys [6].
1.3.1. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) panaudojimas medicinoje
Ginkmedžio lapai jau ilgą laiką yra naudojami medicinoje. Kinijoje Ginkgo biloba L. lapų ekstraktas naudojamas jau tūkstančius metų. Juo gydomi intelekto sutrikimai, atminties ir koncentracijos problemos, nerimas, depresija, galvos svaigimas, spengimas ausyse, širdies ir plaučių
ligos, įvairūs uždegimai. Dviskiaučio ginkmedžio ekstraktui yra skiriama daug dėmesio tiek farmacijos pramonėje, tiek vykdant laboratorinius tyrimus dėl jo plataus naudingų savybių spektro [4, 5, 6]. 1970 metais vokiečių farmacijos įmonė „Dr. Willmar Schwabe Pharmaceuticals“ patobulino dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstrakto gamybos technologiją sukurdama labai koncentruotą ir stabilų preparatą [7]. Daugelyje valstybių ginkmedžio preparatai yra vartojami kaip maisto papildai. Vienos iš pirmųjų šalių užregistravusios ginkmedžio lapų ekstrakto preparatus kaip vaistą buvo Prancūzija ir Vokietija, ten iki šių dienų tai vienas iš dažniausiai išrašomų vaistų [9, 20].
Prieš-uždegiminis poveikis
Nustatyta, kad dviskiaučio ginkmedžio sudėtyje esantis ginkolidas B turi stiprų prieš-uždegiminį poveikį - slopina trombocitus aktyvuojantį faktorių, kuris yra svarbus astmos patogenezėje, slopina plaučių audinio hipersekreciją [21]. Taip pat inhibuoja opinio kolito uždegimo mediatorių veiklą [22].
Atminties sutrikimų gydymas
Atminties pablogėjimas yra susijęs su smegenų kraujotakos sutrikimais. Smegenų ląstelės yra jautrios oksidaciniam stresui, kuris atsiranda organizmui senėjant. Pablogėjusi atmintis gali varginti ne tik senyvo amžiaus žmones, bet ir jaunus asmenis. Daugybė klinikinių ir ikiklinikinių tyrimų parodė, kad dviskiaučio ginkmedžio preparatai yra veiksminga prevencijos bei gydymo priemonė prieš neurodegeneracinius sutrikimus, įskaitantant ir Alzheimerio ligą [7]. Buvo atliktas dvigubai aklas tyrimas, kuriame palygintas standartizuoto ginkmedžio lapų ekstrakto ir placebo poveikis. Tyrime dalyvavo sveiki, vidutinio amžiaus savanoriai. 6 savaites trukusio tyrimo rezultatai parodė žymiai pagerėjusią tiriamųjų, vartojusių ginkmedžio ekstraktą, atminties būklę [23]. Dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto vartojimas pagerina smegenų kraujotaką, mažina kraujo klampumą bei aktyvina medžiagų apykaitą ląstelėse. Ilgalaikis Ginkgo biloba L. vartojimas teigiamai veikia pažintines funkcijas, gerina atmintį, padeda sukoncentruoti dėmesį. Ginkmedžio preparatai skiriami vartoti insulto profilaktikai bei atgaunant jėgas jam įvykus [9].
Širdies ir kraujotakos sutrikimai
Ginkgo biloba L. ekstraktas padidina kraujo cirkuliaciją smegenyse bei periferinėje
kraujotakos sistemoje. Sumažina kraujagyslių pralaidumą, sukelia kraujagyslių susitraukimą, gerina venų tonusą, slopina fosfodiesterazę–4 [6]. Ginkmedžio lapų ekstraktas aktyvina antitrombocitinį faktorių (Anti - PAF), taip mažindamas trombocitų agregaciją [11]. Ginkolidai B pasižymi antitrombocitiniu poveikiu bei gerina vainikinių arterijų susitraukimo funkciją. Pietri ir kitų mokslininkų atlikti tyrimai parodė, kad ginkmedžio lapų ekstrakto vartojimas prieš širdies operaciją
padėjo sumažinti reperfuzijos sukeltą lipidų peroksidaciją, taip išvengiant askorbato išeikvojimo, audinių nekrozės ir širdies disfunkcijos [9].
Neuropatijos
Viena dažniausių neuropatijos atsiradimo priežasčių yra cukrinis diabetas. Ši cukrinio diabeto komplikacija atsiranda beveik 50 % sergančiųjų. Diabetinė neuropatija pasireiškia galūnių silpnumu, tirpimu, dilgčiojimu, skausmu. Neuropatijai progresuojant, gali sutrikti virškinamojo trakto funkcija, atsirasti širdies aritmija, seksualinė disfunkcija [24]. Oksidacinis stresas yra viena iš priežasčių, lemiančių diabetinės neuropatijos atsiradimą ir progresavimą. Todėl antioksidantų vartojimas turi teigiamą poveikį šios ligos gydymui. Buvo atliktas tyrimas su cukriniu diabetu sergančiomis žiurkėmis, norint ištirti standartizuoto dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto poveikį tiesiosios žarnos neuronams. Tyrimo rezultatai parodė, kad ginkmedžio ekstraktas turi neuroprotekcinį poveikį, išsaugo neuronų populiaciją tiesiosios žarnos rezginiuose [25].
Tinitas (spengimas ausyse)
Beveik 10 % pasaulio gyventojų skundžiasi ūžimu ausyse, tačiau vieno veiksmingo preparato šiam sutrikimui gydyti nėra. Manoma, kad spengimą ausyse sukelia nepakankamas kraujo pritekėjimas į vidinę ausį. Pacientų teigimu, naudojant ginkmedžio ekstraktą, spengimas ausyse sumažėjo, tačiau visai nedingo. Manoma, kad dviskiaučio ginkmedžio ekstraktas galėtų būti vertingesnis smegenų kraujotakos nepakankamumo gydyme, kuris ir gali sąlygoti tinitą [26].
Priešvėžinis poveikis
Remiantis naujausiais laboratoriniais tyrimais, teigiama, kad dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktas turi teigiamą poveikį vėžio gydyme. Klinikiniais tyrimais nustatyta, kad vienas iš pagrindinių flavonoidų įeinančių į ginkmedžio ekstrakto sudėtį – kaemferolis, aktyviai slopina kasos vėžio ląstelių proliferaciją ir skatina vėžinių ląstelių apoptozę. Dėl šių savo savybių dviskiaučio ginkmedžio ekstraktas gali būti naudojamas kaip pagalbinė priemonė kasos vėžio gydyme [27]. Kiti ginkmedžio ekstrakto komponentai, kvercetinas ir ginkolidai A, B, stabdo kiaušidžių vėžinių ląstelių proliferaciją. In vitro tyrimais nustatyta, kad ginkolidai slopina vėžinių ląstelių dalijimąsi G0/ G1 fazėse, taip stabdant DNR replikaciją S fazėje [28].
Skrandžio opa
Ginkgo biloba L. ekstraktas slopina lipidų peroksidacijos procesus bei padeda išlaikyti
apsauginę skrandžio gleivinės funkciją. Todėl gali būti naudojamas kaip prevencinė ar pagalbinė priemonė, gydant skrandžio opaligę [29].
Kepenys
Ginkmedžio ekstraktas pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu, dėl savo antioksidacinių savybių [30]. Įrodyta, kad Ginkgo biloba L. ekstraktas slopina oksidacinį stresą, kuris yra viena iš priežasčių, sukeliančių kepenų fibrozę. Taip pat, padeda atstatyti kepenų fibrozės pažeistas kepenis. Slopindamas lipidų peroksidacijos procesus, ginkmedžio ekstraktas atkuria alkoholio pažeistų kepenų funkciją. Efektyviausias hepatoprotekcinis poveikis pasireiškia kartu vartojant dviskiaučio ginkmedžio ekstraktą ir silimariną [31, 32].
1.3.2. Dozavimas
Tinkama efektyvi dozė gali skirtis priklausomai nuo situacijos, tačiau farmakologijos ekspertai padarė išvadą, kad teigiamą poveikį sukelia 50 – 100 mg/kg, nors kai kuriais atvejais poveikis pasireiškia skiriant 10 mg/kg. Paprastai, paros dozė būna nuo 120 mg iki 240 mg, ekstraktas vartojamas tris kartus per parą. Poveikis centrinei nervų sistemai pasireiškia po maždaug keturių savaičių nuo ginkmedžio ekstrakto vartojimo pradžios [1].
1.3.3. Šalutinis dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto poveikis, sąveika su vaistais
Tyrimais įrodyta, kad dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktas yra ganėtinai saugus preparatas. Jis yra gerai toleruojamas, neturi įtakos pirminei homeostazei. Atlikti tyrimai su pelėmis parodė, kad 50 % pelių mirtina ginkmedžio ekstrakto dozė yra daugiau nei 9600 mg/kg. Tai yra 2100 kartų daugiau nei rekomenduojama paros dozė [10].
Dauguma klinikinių tyrimų parodė gerą arba labai gerą ginkmedžio ekstrakto toleravimą. Pasireiškė tik lengvi, trumpalaikiai ir grįžtami nepageidaujami poveikiai, tokie kaip pykinimas, vėmimas, galvos skausmas, galvos svaigimas. Kraujo spaudimo, širdies ritmo, cholesterolio bei trigliceridų lygio pokyčių ginkmedžio ekstraktas nesukėlė. Nebuvo mutageninio, kancerogeninio, teratogeninio ir embriotoksinio poveikio [10].
Ginkmedžio preparatai gali pakeisti kraujavimo laiką, todėl neturėtų būti vartojami kartu su aspirinu, varfarinu ar diazepamu [15]. Įvertinus kraujavimo laiką, krešėjimo parametrus, trombocitų
funkciją buvo nustatyta, kad kartu vartojant aspiriną ir ginkmedžio ekstrakto preparatą kraujavimo laikas pailgėja nuo 4,2 iki 6,3 min. [11].
1.3.4. Ekstraktų kokybės tikrinimas
Gamintojai privalo atlikti išsamią standartizuoto ginkmedžio ekstrakto kokybės kontrolę. Turi būti pateikiama ekstrakte esančių junginių koncentracija, atliktų tirpumo bei kokybinių pirštų antspaudų tyrimų rezultatai. Atliekami mikrobiologinio užterštumo tyrimai, tiriamas aflatoksinų kiekis, nustatomas sulfatinių pelenų bei ekstrakte likusio organinio tirpiklio kiekis. Be visų šių tyrimų, specifikacijoje taip pat turi būti pateiktos ekstrakto pH reikšmės, sunkiųjų metalų kiekiai, dalelių dydžiai. Daugelis šių bandymų yra gerai žinomi ir yra aprašyti Farmakopėjoje. Tiriant ginkmedį, didžiausias dėmesys yra sutelkiamas į kiekybinę cheminę analizę. Tiriami antriniai metabolitai, kurie susidaro ginkmedžio lapų ekstrakte [10, 16].
1.4. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas, antioksidantai, antioksidacinio
aktyvumo nustatymas
1.4.1. Laisvieji radikalai
Laisvieji radikalai – tai nestabilios, labai reaktyvios ir trumpai egzistuojančios dalelės (atomai arba molekulės), išorinėje orbitalėje turinčios vieną ar kelis nesuporuotus elektronus. Šios dalelės gali atiduoti arba paimti elektroną iš kitų molekulių – būti oksidatoriumi arba reduktoriumi. Dėl šios savo savybės laisvieji radikalai pasižymi dideliu cheminiu aktyvumu. Žmogaus organizme laisvieji radikalai formuojasi nuolat. Nedidelė jų koncentracija yra būtina normaliam ląstelės funkcionavimui. Laisvieji radikalai dalyvauja daugelyje organizme vykstančių fiziologinių procesų. Jie atlieka apsauginę organizmo funkciją – leukocituose susidaręs vandenilio peroksidas ir hipochlorito rūgštis yra stiprūs oksidatoriai veikiantys prieš mikroorganizmus [33].
Laisvieji radikalai susidaro įprastų organizmo reakcijų metu, vykstant fermentinėms ir nefermentinėms reakcijoms. Daugiausia jų susidaro kvėpavimo reakcijos metu mitochondrijose, vykstant prostaglandinų sintezei, fagocitozei ir citochromo P - 450 sistemoje. Svarbiausi laisvieji deguonies radikalai, sukeliantys neigiamus pokyčius organizme, yra superoksido anijonas (O2•-),
hidroksilo radikalas (OH•), peroksilo radikalas (RO2•), hidroperoksilas (OH•), alkoksilas (RO•), azoto oksidas (NO•), azoto dioksidas (NO2
•
). Neradikalai, tačiau taip pat labai reaktyvūs bei galintys sukelti laisvųjų radikalų reakcijas organizme yra vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl),
organiniai peroksidai (ROOH), ozonas (O3), aldehidai (HCOR), molekulinis deguonis (O2),
peroksinitritas (ONOOH) [33, 34, 35].
Laisvųjų radikalų padaroma žala priklauso nuo jų gyvavimo laiko ir galimybės pasiekti kitas ląstelės dalis. Pavyzdžiui, hidroksilo radikalai, gaminami mitochondrijose, yra labai reaktyvūs, todėl jų veikimo laikas yra trumpas. Dėl šios priežasties hidroksilo radikalai neišeina už ląstelės ribų, nepasiekia ląstelės branduolio, veikia ten, kur yra pagaminami. Mažiau reaktyvūs deguonies metabolitai (HO2) gali egzistuoti ilgesnį laiką ir pasiekti ląstelės dalis esančias toli nuo jų gamybos
vietos [33].
Manoma, kad laisvieji radikalai yra viena iš priežasčių, įtakojančių vėžio atsiradimą. Jie sukelia chromosomų pažeidimą ir onkogeno aktyvaciją, inicijuoja reakcijas, kurios veikia ląsteles kaip jonizuojanti spinduliuotė, taip sukeliant navikų atsiradimą. Kita galima leukemijos, piktybinio krūties, kiaušidžių, tiesiosios žarnos vėžio atsiradimo priežasčių yra suaktyvėjusi lipidų peroksidacija dėl per didelio riebalų suvartojimo [35].
1.4.2. Oksidacinis stresas
Oksidacinis stresas atsiranda tada, kai laisvųjų radikalų koncentracija tampa didesnė nei antioksidantų. Dėl nepakankamo antioksidantų apsauginio poveikio gali būti sutrikdyta daugelio organizmo ląstelių veikla. Oksidacinis stresas skatina neuronų pažeidimą ir moduliuoja intraląstelinį signalą, galiausiai vedantį į apoptozę arba nekrozę – ląstelės žūtį. Veikiant laisviesiems radikalams pažeidžiamos DNR grandinės, oksiduojami lipidai, struktūriškai modifikuojami baltymai. Trumpalaikis oksidacinis stresas atsiranda esant audinių pažeidimams, traumoms, infekcijoms, stresui. Aplinkos veiksniai taip pat sąlygoja oksidacinio streso atsiradimą. Laisvųjų radikalų susidarymą organizme gali paskatinti užterštas oras ir vanduo, UV spinduliai, pesticidai, nitratai, ozono poveikis, cigarečių dūmai, pramoniniai tirpikliai [33, 36]. Oksidacinis stresas sąlygoja daugelio lėtinių ligų atsiradimą, tokių kaip aterosklerozė, kvėpavimo takų ligos, uždegiminės ligos bei kai kurių vėžio formų atsiradimas (žr. 5 pav.). Taip pat, oksidacinis stresas yra pagrindinė senėjimo procesą skatinanti priežastis [36].
Sąnariai: reumatoidinis artritas, osteoporozė Plaučiai: astma, alergijos, lėtinės obstrukcinės plaučių ligos, vėžys Smegenys: Alzhaimerio, Parkinsono sindromai, autizmas, migrena Akys: katarakta, tinklainės ligos Oksidacinis stresas Širdis – kraujagyslės: aterosklerozė, hipertenzija, širdies nepakankamumas, insultas, išemija Imunitetas: lėtiniai uždegimai, autoimuninės ligos, vilkligė, vėžys Inkstai: glomerulonefritas, lėtinis inkstų nepakankamumas Įvairūs organai: diabetas, senėjimas, chroniško nuovargio sindromas
5 pav. Oksidacinio streso sukeliamos ligos [36].
1.4.3. Antioksidantai
Antioksidantai – tai medžiagos, kurios apsaugo ląsteles nuo oksidatorių sukeliamo žalingo poveikio. Neutralizuodami laisvuosius radikalus, antioksidantai sumažina arba visiškai sustabdo oksidacinį ląstelių pažeidimą [8]. Antioksidacinis poveikis yra grindžiamas dviem veikimo mechanizmais. Pirmasis – tiesioginis laisvųjų radikalų pašalinimas, antrasis – netiesioginis laisvųjų radikalų susidarymo slopinimas [9]. Antioksidantai geba surišti laisvuosius radikalus atiduodami laisvą elektroną, esantį išorinėje orbitalėje arba atiduodant vandenilio atomą [8, 33]. Apsaugos nuo oksidacinio streso mechanizmai pateikti 6 paveiksle.
6 pav. Ląstelėse veikiantys apsaugos nuo oksidacinio streso mechanizmai [33].
Antioksidantai yra skirstomi į fermentinius (endogeninius) ir nefermentinius (gaunamus iš maisto produktų). Fermentiniai antioksidantai: superoksido dismutazė (SOD), glutationo peroksidazė (GPX), katalazė (CAT). Superoksido dismutazė yra pagrindinis fermentinis antioksidantas, kovojantis su oksidaciniu stresu organizme. Ji redukuoja superoksido anijono radikalą (O2•-) į vandenilio
peroksidą (H2O2).
2O2•- + 2H-1 → H2O2 + O2
Glutationo peroksidazė ir katalazė yra randamos ląstelių citozolyje ir mitochondrijose. Šie fermentai susidariusį vandenilio peroksidą skaido į vandenį ir deguonį.
Nefermentiniai antioksidantai: vitaminas A (retinolis), vitaminas C (askorbo rūgštis), vitaminas E (tokoferolis), kofermentas Q10, šlapimo rūgštis, bilirubinas, feritinas, lipoinė rūgštis,
Antioksidacinė apsauga
Gynybos mechanizmas nuo oksidacinio streso Prevenciniai mechanizmai (metalų chelatų susidarymas su ROS) Fizikiniai mechanizmai (Biologinių sričių stabilizavimas) Atkūrimo mechanizmai (DNR atkuriantys fermentai) Mažos molekulinės masės antioksidantai (neutralizatoriai) Fermentai antioksidantai: tiesiogiai veikiantys (SOD, katalazė, peroksidazė) Netiesiogiai veikiantys mažos molekulinės masės antioksidantai (chelatoriai) Sintetiniai ląstelių junginiai (histidino dipeptidai) Junginiai gaunami su maistu (pvz: tokoferolis, karotenai) Atliekos (pvz: šlapimo rūgštis)
melatoninas, ceruloplazminas, glutationas, L – argininas, albuminas, „karščio šoko“ baltymai (heat
shock proteins), fenoliniai junginiai (flavonoidai, antocianai, proantocianidai), tioliai, taip pat
mikroelementai (cinkas, varis, selenas, geležis, manganas), kurie veikia kaip fermentiniai kofaktoriai [8, 33]. Vitaminai C ir E veikia sinergistiškai neutralizuojant laisvuosius radikalus. Tačiau per didelė vitamino C dozė (2000 mg/dieną), galimai, veikia kaip prooksidantas [37]. Nefermentinių antioksidantų trūkumas, per mažas jų suvartojimas su maistu yra viena iš pagrindinių lėtinių ligų atsiradimo priežasčių [37].
Tiek fermentiniai, tiek nefermentiniai antioksidantai gali būti intraląsteliniai arba ekstraląsteliniai [8]. Antioksidantai žmogaus organizme gaminasi nuolat, nes neutralizuojant laisvuosius radikalus antioksidantas virsta oksiduota forma [37]. Kiekvienas antioksidantas gali apsaugoti ląsteles nuo laisvųjų radikalų poveikio, tačiau esant tam tikroms aplinkybėms arba suvartojus per didelį antioksidantų kiekį, jie gali pradėti veikti kaip prooksidantai. Žmogaus organizmo antioksidacinės sistemos aktyvumas priklauso nuo endogeninės sistemos veiklos, kuri gamina fermentinius antioksidantus. Fermentinių antioksidantų kiekis organizme kinta priklausomai nuo fizinio aktyvumo, amžiaus, mitybos įpročių [8, 38].
1.4.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai
Yra sukurta nemažai metodų antioksidacinio aktyvumo įvertinimui. Dažniausiai naudojami spektrofotometriniai metodai - ABTS ((2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalų – katijonų surišimo metodas, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) radikalų surišimo metodas bei geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidacinės galios nustatymo metodai [8, 39]. Šių metodų veikimo mechanizmai yra skirtingi, tačiau esmė ta pati – bandymo metu sukuriami tam tikro tipo radikalai ir išmatuojama tiriamojo junginio antioksidacinio aktyvumo galia prieš sukurtus radikalus [40]. Minėtais metodais įvertinamas suminis mišinyje esančių sudedamųjų dalių aktyvumas [8].
1.4.5. ABTS (laisvųjų radikalų surišimo metodas)
ABTS radikalų – katijonų surišimo metodas yra vienas iš dažniausiai naudojamų kolorimetrinių antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodų. Pirmasis šį metodą aprašė N. J. Miller ir
pavadino jį TEAC metodu. TEAC atlikimo metodika skiriasi nuo šiuo metu naudojamos ABTS antioksidacinio aktyvumo nustatymo technikos. Miller aprašytame metode yra sukuriami ferilmetmioglobino radikalai, reaguojant metmioglobinui su vandenilio peroksidu. Šie radikalai oksiduoja ABTS molekulę į ABTS+, kuri įgauna jai būdingą mėlynai žalią spalvą. Tiriamasis junginys,
pasižymintis antiradikaliniu aktyvumu, suriša susidariusius ABTS radikalus – katijonus (žr. 7 pav.). Spektrofotometru išmatavus reakcijos mišinio absorbciją, įvertinamas nesurištų ABTS+
molekulių kiekis, taip nustatant junginio antioksidacinį aktyvumą. Miller aprašyto metodo trūkumai yra trumpas reagentų veikimo laikas (apie 48 valandas) bei didelė jų kaina. Greito veikimo antioksidantai esantys tiriamajame mėginyje, gali reaguoti su ferilmetmioglobinu taip sumažinant jų kiekį ir teigiamai paveikiant tyrimo rezultatus. Hemoglobinas ir H2O2 sukelia papildomos spalvos atsiradimą, kuri
neigiamai veikia tyrimo rezultatus [40].
Šiuo metu naudojamame ABTS radikalų – katijonų surišimo metode, tiriamasis bandinys yra įdedamas tada, kai susidaro pakankamas kiekis ABTS+
radikalų. Įvykus tiesioginei reakcijai su antioksidantu, spektrofotometru išmatuojamas tirpalo absorbcijos dydis, kuris yra proporcingas mėginyje likusiai ABTS+
koncentracijai. Absorbcijos maksimumai yra prie 415, 650, 734 ir 815 nm bangos ilgių [41]. ABTS radikalų – katijonų surišimo metodas parodo tiriamajame junginyje esančių sudedamųjų dalių, pasižyminčių antioksidaciniu aktyvumu, pajėgumą neutralizuoti ABTS katijonus. ABTS antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais [42].
ABTS laisvųjų radikalų surišimo metodas yra patikimas, nebrangus, lengvai atliekamas, nereikalaujantis ypatingos aparatūros, todėl naudojamas daugelyje laboratorijų. ABTS reagentas yra tirpus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, todėl galima tirti lipofilinius ir hidrofilinius junginius. ABTS metodu antioksidacinis aktyvumas nustatomas neutralioje terpėje [42]. ABTS tyrimo metodas naudojamas ne tik antioksidacinio aktyvumo įvertinimui, bet ir antioksidantų klasifikavimui bei struktūros – aktyvumo ryšio įvertinimui. ABTS+
radikalų reakcijos su antioksidantais yra greitos, skirtingai nei DPPH tyrimo metode [40, 43, 44].
2. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapai, surinkti 2014 – 2015 metais bei vaistinėse įsigytos skirtingų gamintojų “Dr. P. Karvelio” (arbata Nr. 1) ir “Acorus” (arbata Nr. 2) ginkmedžių lapų arbatos. Lapų žaliava surinkta iš dviejų skirtingų augaviečių, esančių skirtinguose miestuose. Dešimt tiriamojo augalo lapų mėginių surinkta Klaipėdos botanikos sode, devyni - Šiaulių botanikos sode. Ginkgo biloba L. lapai rinkti skirtingais augalo vegetacijos laikotarpiais: nuo birželio pabaigos iki spalio vidurio. Surinkti lapai buvo džiovinami 30 – 40ºC temperatūroje.
2.2. Naudoti reagentai
Metanolis (>99,9 %, Sigma-Aldrich, Seelze, Vokietija);
Distiliuotas vanduo pagamintas naudojant „Milipore“ (JAV) vandens gryninimo sistemą; Etanolis (96,3 %, AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva);
Koncentruota acto rūgštis (99,8 %, „Standart“, Lenkija);
Aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma – Aldrich“, Vokietija); Heksametilentetraminas („Lachema“, Čekija);
Kvercetino dihidratas (,,Carl Roth GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija); Kalio persulfatas (,,Alfa Aesar GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija);
ABTS reagento ruošimui: 2,2‘-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) diamonio druska (ABTS) (Buchs, Switzerland);
Troloksas („Sigma – Aldrich“, Vokietija).
2.3. Naudota aparatūra ir priemonės
Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); Elektrinis malūnėlis (Retsch 200, Haan, Vokietija);
Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);
Q-Max membraninis filtras (25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija);
Mikrošvirkštai (Camag Linomat Syringe, Muttenz, Šveicarija); Termostatinė vonelė (Heidolph, Schwabach, Vokietija);
Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija).
2.4. Duomenų statistinis įvertinimas
Gauti tyrimų duomenys apdoroti naudojant statistinius duomenų analizės paketus Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV) ir SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV). Apskaičiuoti rezultatų standartiniai nuokrypiai (SE). Duomenų apdorojimui naudotas Spirmano koreliacijos koeficientas. Rezultatai laikyti statistiškai patikimais, kai p<0,05.
2.5. Tiriamojo mėginio paruošimas
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakcija buvo atlikta remiantis Europos farmakopėjos 01/2008:1828 straipsnyje nurodytu metodu [45]. Sausa žaliava mechaniškai susmulkinta elektriniu malūnėliu į miltelius. Vaistinėje įsigytos ginkmedžių arbatos buvo smulkinamos papildomai. Ekstraktai ruošti sveriant po 0,5 g susmulkintos žaliavos ir beriant ją į kaitinimui skirtą buteliuką. Žaliava užpilta 2,5 ml metanolio ir mišinys gerai suplaktas. Ekstrakcija vykdyta termostatinėje vonelėje 10 min, palaikant pastovią 65º C temperatūrą. Po ekstrakcijos buteliukas supurtytas ir paliktas kambario temperatūroje atvėsti. Atvėsęs mišinys filtruotas pro metanoliu sudrėkintą membraninį filtrą. Gauti ekstraktai išpilstyti į rudo stiklo buteliukus, sandariai uždaryti ir laikyti vėsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.
2.6. Spektrofotometriniai metodai
1. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas augalinį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu parūgštintoje terpėje. Rezultatai įvertinti, naudojant kvercetino kalibracinę kreivę. Tiriamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml praskiestos (1:10) vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 2 ml 96 % V/V etanolio, 0,1 ml 30 % acto rūgšties tirpalo, 0,3 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo. Po 30 minučių į tirpalų mišinį įpilama 0,4 ml 5 % heksametilentetramino tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant 407 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę pilant 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 2 ml 96 % V/V etanolio, 0,1 ml 30 % acto rūgšties tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki žymės.
Kvercetino kalibracinei kreivei gauti ruošiami etaloniniai kvercetino rūgšties tirpalai. Jie ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj 0,2 ml vaistinės žaliavos ištraukos, pilama 0,2 ml šešių žinomų koncentracijų (0,5 mg/ml, 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml, 0,0625 mg/ml, 0,03125 mg/ml, 0,015625 mg/ml) kvercetino tirpalai. Kalibracinė kreivė pavaizduota 8 paveiksle.
Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais (QE) gramui sausos žaliavos. Apskaičiuojama remiantis formule:
, kur
C- kvercetino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml);
8 pav. Kvercetino kalibracinė kreivė
2. ABTS radikalų – katijonų surišimo gebos įvertinimas
Pirminis ABTS tirpalas ruošiamas 0,0549 g ABTS miltelių ištirpinus 50 ml distiliuoto vandens (tamsaus stiklo buteliuke). Praėjus 4 min. į gautą tirpalą beriama 0,0095 g kalio persulfato miltelių. Tirpalas sumaišomas ir paliekamas 16 valandų tamsioje vietoje, kambario temperatūroje [46]. Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas praskiedžiant pradinį tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo. Tirpalas spektrofotometriniam tyrimui ruošiamas sumaišant 3 ml darbinio ABTS tirpalo su 20 µl dviskiaučio ginkmedžio ekstrakto. Mišinys laikomas 60 min tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija esant 734 nm bangos ilgiui [47].
Trolokso kalibracinei kreivei gauti etaloniniai tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tačiau vietoj vaistinės žaliavos ekstrakto pilama 20 µl šešių žinomų koncentracijų (800 μmol/L, 600 μmol/L, 400 μmol/L, 200 μmol/L, 100 μmol/L, 50 μmol/L) trolokso tirpalai. Trolokso kalibracinė kreivė pavaizduota 9 paveiksle.
Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartiniais antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) vienam gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:
TEABTS = c × V/m (μmol/g), kur
y = 1,7522x + 0,0292 R² = 0,9973 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5 0,55 A b sor b ci ja Kvercetino koncentracija, mg/ml
c- trolokso koncentracija (μmol/L) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (L);
m- tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
9 pav. Trolokso kalibracinė kreivė
y = 0,0002x + 0,0163 R² = 0,9976 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 A b sor b cij os p ok yti s
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Bendro flavonoidų kiekio įvertinimas skirtingais metais rinktuose
dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose spektrofotometriniu metodu
Atlikto tyrimo metu nustatytas suminis flavonoidų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose. Ekstraktai buvo ruošiami iš 2014 bei 2015 metais surinktos žaliavos. Tyrimui naudoti ginkmedžio lapai rinkti birželio – spalio mėnesiais.
2014 metais Šiauliuose rinktų lapų ekstraktuose suminis flavonoidų kiekis svyravo nuo 7,04 ± 0,32 mg/g iki 10,07 ± 1,29 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas birželio bei spalio mėnesiais, mažiausias – rugpjūčio mėnesį. Bendras flavonoidų kiekis proporcingai mažėjo nuo birželio iki rugpjūčio mėnesio ir vėl pradėjo didėti rugsėjį bei spalį. Padidėjusį flavonoidų kiekį rugsėjo ir spalio mėnesių mėginiuose galėjo lemti sulėtėjęs medžio augimas bei metabolizmo procesai, kai sunaudojama mažiau maistinių medžiagų, todėl daugiau jų sukaupiama lapuose [48]. Šie flavonoidų kiekio svyravimai visiškai priešingi 2015 metais Šiauliuose rinktos žaliavos mėginiuose nustatytiems flavonoidų kiekio kitimams. Rezultatai pateikti 10 paveiksle.
10 pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas dviskiaučio ginkmedžio lapų (rinktų Šiaulių regione) ekstraktuose vegetacijos eigoje (birželio – spalio mėn.).
2015 metais Šiauliuose rinktų ginkmedžio lapų ekstraktuose suminis flavonoidų kiekis įvairavo nuo 8,25 ± 0,31 mg/g iki 11,85 ± 2,3 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas liepos
9,89 8,68 7,04 7,5 10,07 10,15 11,85 11,53 11,13 8,25 6 7 8 9 10 11 12
Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
Flav o n o id ų kiekis , m g/g
Lapų rinkimo laikas
2014 metai 2015 metai
mėnesį rinktoje žaliavoje, esant visiškam medžio sulapojimui (p<0,05). Šie rezultatai sutampa su kitų mokslininkų atliktų tyrimų duomenimis, kai daugiausia fenolinių junginių nustatoma liepos mėnesį žaliuose ginkmedžio lapuose. Lapams susiformavus sukaupiama daugiau fenolinių junginių, nes vyksta mažiau metabolizmo procesų [49]. Mažiausias flavonoidų kiekis užfiksuotas spalio mėnesį, visiško lapų pageltimo metu.
Įvertinus rezultatus, nustatyta, kad 2015 metais Šiauliuose surinktos žaliavos ekstraktuose suminis flavonoidų kiekis yra 1,2 karto didesnis, nei 2014 metais rinktų ginkmedžio lapų mėginiuose.
2014 metais Klaipėdoje rinktuose dviskiaučio ginkmedžio lapų mėginiuose suminis flavonoidų kiekis svyravo nuo 4,81 ± 0,24 mg/g iki 7,34 ± 0,56 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis užfiksuotas liepos mėnesį, mažiausias – rugsėjo. Nustatytas proporcingas bendro flavonoidų kiekio didėjimas birželio, liepos mėnesiais ir mažėjimas liepos – rugpjūčio mėnesiais. Spalio mėnesį, esant visiškam lapų pageltimui, nustatytas flavonoidų kiekio padidėjimas (5,54 ± 0,24 mg/g). Rezultatai pateikti 11 paveiksle.
11 pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas dviskiaučio ginkmedžio lapų (rinktų Klaipėdos regione) ekstraktuose vegetacijos eigoje (birželio – spalio mėn.).
2015 metais Klaipėdos regione rinktos žaliavos ekstraktuose nustatyti neproporcingi bendro flavonoidų kiekio kitimai. Duomenys svyravo nuo 5,57 ± 2,2 mg/g iki 7,36 ± 1,3 mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis užfiksuotas rugsėjo mėnesį, pradėjus gelsti lapams, mažiausias - spalio mėnesį.
Palyginus duomenis, nustatyta, kad 2015 metais Klaipėdoje rinktų ginkmedžio lapų ekstraktuose suminis flavonoidų kiekis yra 1,1 karto didesnis nei 2014 metų mėginiuose.
6,78 7,34 6,32 4,81 5,54 7,32 5,9 6,53 7,36 5,57 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
Flav o n o id ų kiekis , m g/g
Lapų rinkimo laikas
2014 metai 2015 metai
Suminis flavonoidų kiekis, skirtingų metų mėginiuose, įvairavo nuo 4,81 ± 0,24 mg/g iki 11,85 ± 2,3 mg/g. Didžiausias (p<0,05) flavonoidų kiekis nustatytas 2015 metais liepos mėnesio antroje pusėje Šiauliuose rinktoje žaliavoje, jis siekė 11,85 ± 2,3 mg/g. Taip pat, didelis flavonoidų kiekis nustatytas toje pačioje vietoje rugpjūčio bei rugsėjo mėnesiais rinktuose lapuose (11,53 ± 0,23 mg/g ir 11,13 ± 0,28 mg/g). Mažiausias flavonoidų kiekis (4,81 ± 0,24 mg/g) užfiksuotas 2014 metais rugsėjo pabaigoje Klaipėdos regione rinktuose dviskiaučio ginkmedžio lapuose.
3.2. Suminio flavonoidų kiekio priklausomybės nuo oro sąlygų įvertinimas
Flavonoidų kiekio kitimus dviskiaučių ginkmedžių lapuose įtakoja ne tik vieta, kurioje auga medis ar augalo amžius, bet ir meteorologinės sąlygos: temperatūra, oro drėgmė. Daugiausia flavonoidų nustatoma augalo vegetacijos laikotarpiu (birželio – spalio mėnesiais) [18]. Išanalizavus LHMT duomenis, pastebėta, kad 2015 metų liepos, rugpjūčio ir rugsėjo mėnesiais, kuomet nustatytas didžiausias flavonoidų kiekis ginkmedžio lapų ekstraktuose, buvo fiksuojama 1,8 °C aukštesnė oro temperatūra nei vidutinė daugiametė temperatūra minėtais mėnesiais. Liepos mėnesį kritulių iškrito daugiau nei nustatyta vidutinė daugiametė kritulių norma, o rugpjūčio mėnesį kritulių kiekis siekė tik 15 % tuo laikotarpiu iškrintančio kritulių kiekio. Išanalizavus duomenis, galima teigti, kad 2015 metais daugiausia fenolinių junginių buvo sukaupta karščiausiais mėnesiais, kai vidutinė oro temperatūra siekė 17 – 19,3 °C, o dienomis - net ekstremalius rodiklius (37,4 °C) [50]. Flavonoidų sintezės intensyvumo padidėjimą lemia sustiprėjęs saulės poveikis [18]. Nustatyta statistiškai reikšminga priklausomybė tarp oro temperatūros ir flavonoidų kiekio dviskiaučio ginkmedžio lapuose rinktuose 2015 metais Šiauliuose (p<0,05) (žr. 4 lentelę).
4 lentelė. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas dviskiaučio ginkmedžio lapų (rinktų Šiaulių regione) ekstraktuose esant skirtingai vidutinei oro temperatūrai.
Lapų rinkimo datos (2015 metais) Temperatūra °C Flavonoidų kiekis mg/g Birželis 14,9 10,15 Liepa 17 11,85 Rugpjūtis 19,3 11,53 Rugsėjis 13,8 11,13 Spalis 5,9 8,25
Klaipėdoje rinktoje žaliavoje reikšmingos priklausomybės tarp oro temperatūros ir flavonoidų kiekio nenustatyta (p˃0,05). Taip pat, nenustatyta reikšminga priklausomybė tarp iškritusių kritulių kiekio ir suminio flavonoidų kiekio dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose (p˃0,05).
2014 metais vidutinė liepos, rugpjūčio ir rugsėjo mėnesių temperatūra buvo 1,3 °C laipsnio žemesnė nei 2015 metais. Ypač vėsus buvo 2014 metų spalio mėnuo, kai vidutinė mėnesio temperatūra nesiekė 5 °C [51]. Nepaisant žemos temperatūros, spalio mėnesį rinktos žaliavos ekstraktuose užfiksuotas gana didelis flavonoidų kiekis (10,07 ± 1,2 mg/g). J. Kobus ir kitų mokslininkų atliktais tyrimais nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis aptinkamas ne tik žaliuose lapuose liepos, rugpjūčio mėnesiais, bet ir spalio mėnesį, po masinio lapų pageltimo [52]. Statistiškai reikšmingos priklausomybės tarp flavonoidų kiekio kitimo 2014 metais rinktuose ginkmedžio lapuose ir meteorologinių sąlygų nenustatyta (p˃0,05).
3.3. Suminio flavonoidų kiekio įvertinimas skirtinguose Lietuvos regionuose
rinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose bei arbatose
Apskaičiavus vidutinį flavonoidų kiekį 2014 ir 2015 metais Klaipėdoje ir Šiauliuose rinktos žaliavos mėginiuose, gauti statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0,05). Šiauliuose rinktuose dviskiaučio ginkmedžio lapų ekstraktuose nustatytas 1,5 karto didesnis flavonoidų kiekis nei Klaipėdoje rinktuose mėginiuose (žr. 12 pav.).
12 pav. Skirtingose augavietėse rinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų suminio flavonoidų kiekio palyginimas. 6,35 9,55 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Klaipėda Šiauliai Flav o n o id ų kiekis , m g/g Vietovės
Bendras flavonoidų kiekis nustatytas ir dviejų skirtingų gamintojų ginkmedžių lapų arbatų metanoliniuose ekstraktuose. „Arbatoje Nr. 1“ ir „Arbatoje Nr. 2“ suminis flavonoidų kiekis nedaug skyrėsi. Pirmojoje ginkmedžių lapų arbatoje flavonoidų kiekis siekė 8,49 ± 0,8 mg/g, antrojoje flavonoidų buvo aptikta daugiau – 8,69 ± 1,1 mg/g.
Palyginti rezultatai tarp Klaipėdoje ir Šiauliuose surinktų mėginių kaupiamo flavonoidų kiekio bei vaistinėse parduodamų ginkmedžių lapų arbatų ekstraktų (žr. 13 pav.). Nepaisant to, kad žaliava ginkmedžio arbatoms yra auginama ne Lietuvoje, o šalyse labiau atitinkančiose ginkmedžio auginimo sąlygas, Šiauliuose rinktuose dviskiaučio ginkmedžio lapuose buvo nustatytas didesnis bendras flavonoidų kiekis nei arbatoje Nr. 1 ir arbatoje Nr. 2. Klaipėdoje rinktos žaliavos ekstraktuose flavonoidų kiekis buvo mažesnis nei arbatų mėginiuose.
13 pav. Skirtingose Lietuvos vietose augančių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų ir ginkmedžių lapų arbatų suminio flavonoidų kiekio palyginimas.
3.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu,
naudojant ABTS reagentą, skirtingu vegetacijos laikotarpiu rinktuose
dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ekstraktuose
Įvertinus antioksidacinį aktyvumą ABTS (radikalų – katijonų surišimo metodu) nustatyta, kad 2014 metais Šiauliuose rinktos žaliavos ekstraktuose antioksidacinio aktyvumo reikšmės svyravo nuo 333,43 ± 0,97 μmol/g iki 452,49 ± 0,43 μmol/g. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas
6,35 9,55 8,49 8,69 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
Klaipėda Šiauliai Arbata Nr. 1 Arbata Nr. 2
Fl av o n o id ų ki e ki s, m g/ g
spalio mėnesį, mažiausias – rugpjūčio. 2015 metų mėginiuose mažiausia antioksidacinio aktyvumo reikšmė nustatyta spalio mėnesį (349,55 ± 1,28 μmol/g), didžiausia – liepos, rugpjūčio mėnesiais (453,06 ± 0,48 μmol/g), esant visiškam augalo sulapojimui. Šiais mėnesiais dviskiaučių ginkmedžių lapuose aptinkama daugiausia fenolinių junginių [49]. Rezultatai pateikti 14 paveiksle.
14 pav. Antioksidacinio aktyvumo (TE, μmol/g) įvairavimas dviskiaučio ginkmedžio lapų (rinktų Šiaulių regione) ekstraktuose vegetacijos eigoje (birželio – spalio mėn.).
2014 metais Klaipėdoje rinktų ginkmedžio lapų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo reikšmės įvairavo nuo 293,56 ± 21,99 μmol/g iki 337,68 ± 5,9 μmol/g. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas užfiksuotas liepos mėnesį, mažiausias – rugsėjį, pradėjus gelsti lapams. 2015 metais rinktų lapų ekstraktų didžiausia antioksidacinio aktyvumo reikšmė užfiksuota birželio mėnesį (333,43 ± 0,98 μmol/g), mažiausia – liepos mėnesį (309,96 ± 14,09 μmol/g). Rezultatai pateikti 15 paveiksle.
452,22 451,65 333,43 335,98 452,49 450,71 453,06 453,06 453,04 349,55 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
An tio ksi d acin is a kt yv u m as T E, µ m o l/g
Lapų rinkimo laikas
2014 metai 2015 metai
15 pav. Antioksidacinio aktyvumo (TE, μmol/g) įvairavimas dviskiaučio ginkmedžio lapų (rinktų Klaipėdos regione) ekstraktuose vegetacijos eigoje (birželio – spalio mėn.).
Skirtingais metais bei įvairiais augalo vegetacijos laikotarpiais rinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas įvairavo nuo 293,56 ± 21,99 μmol/g iki 453,06 ± 0,48 μmol/g. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas liepos ir rugpjūčio mėnesiais rinktos žaliavos mėginiuose, esant visiškam augalo sulapojimui. Didžiausia antioksidacinio aktyvumo reikšmė užfiksuota 2015 metais liepos ir rugpjūčio mėnesiais Šiauliuose surinktų Ginkgo biloba L. lapų ekstraktuose. Mažiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas rudeninio lapų geltimo pradžioje, 2014 metais rugsėjo mėnesį Klaipėdoje rinktoje žaliavoje.
Palygintas Klaipėdoje bei Šiauliuose 2014 ir 2015 metais rinktos žaliavos ekstraktų antioksidacinis aktyvumas kiekvienu vegetacijos laikotarpiu. Remiantis gautais rezultatais, galima teigti, kad 2015 metais surinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų antioksidacinis aktyvumas yra 0,98 karto didesnis, nei lapų rinktų 2014 metais.
3.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas skirtinguose Lietuvos regionuose
rinktuose Ginkgo biloba L. lapų ekstraktuose
Buvo palygintas Klaipėdoje bei Šiauliuose surinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Ekstraktų, paruoštų iš Šiauliuose surinktos žaliavos, didžiausias antiradikalinis aktyvumas siekė 453,06 ± 0,48 μmol/g, o ekstraktų, ruoštų iš Klaipėdoje surinktų lapų,
325,79 337,68 319,01 293,56 324,67 333,43 309,96 323,25 333,15 331,74 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350
Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis
An tio ksi d acin is a kt yv u m as TE , µmol/ g
Lapų rinkimo laikas
2014 metai 2015 metai
didžiausia antioksidacinio aktyvumo reikšmė buvo 337,68 ± 5,95 μmol/g. Apskaičiavus matematinį gautų rezultatų vidurkį, nustatyta, kad Šiauliuose augančių Ginkgo biloba L. lapų antioksidacinis aktyvumas yra 0,78 karto didesnis, nei Klaipėdoje rinktų ginkmedžio lapų (atitinkamai 414,94 μmol/g ir 323,69 μmol/g) . Rezultatai pateikti 16 paveiksle.
16 pav. Skirtingose augavietėse rinktų L. Ginkgo biloba lapų antioksidacinio aktyvumo palyginimas.
3.6. Lietuvoje augančių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų ir ginkmedžių
lapų arbatų antioksidacinio aktyvumo palyginimas
Spektrofotometru, naudojant ABTS reagentą, buvo nustatytas vaistinėje įsigytų ginkmedžių lapų arbatų mėginių antioksidacinis aktyvumas. Dviejų skirtingų gamintojų arbatų nustatyta antioksidacinio aktyvumo galia skyrėsi mažai. „Arbatos Nr. 1” antiradikalinis aktyvumas siekė 446,28 ± 57,90 μmol/g, „Arbatos Nr. 2“ – 450,24 ± 57,01 μmol/g. Vaistinėje įsigytų arbatų mėginių antioksidacinis aktyvumas buvo didesnis nei ekstraktų, pagamintų iš Klaipėdoje ir Šiauliuose surinktų ginkmedžio lapų. Arbatų gamybai skirta žaliava importuojama iš Kinijos, Japonijos, JAV, Vakarų Europos šalių, kur yra palankesnės sąlygos šiems medžiams augti, todėl ginkmedžių lapų arbatos pasižymi stipresniu antioksidaciniu poveikiu. Rezultatai pateikti 17 paveiksle.
323,69 414,94 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Klaipėda Šiauliai An tio ksi d acin is a kt yv u m as TE , µ m o l/g Vietovės
17 pav. Skirtingose Lietuvos vietose augančių dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktų ir ginkmedžių lapų arbatų antioksidacinio aktyvumo palyginimas.
3.7. Flavonoidų kiekio įtakos antioksidaciniam aktyvumui įvertinimas
Nustačius bendrą flavonoidų kiekį ir antioksidacinį aktyvumą skirtingu laikotarpiu rinktuose dviskiaučių ginkmedžių lapuose, įvertinta antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo flavonoidų koncentracijos tiriamuose ekstraktuose. Didžiausias suminis flavonoidų kiekis (11,85 ± 2,3 mg/g) fiksuojamas 2015 metų liepos mėnesį Šiaulių regione rinktuose dviskiaučio ginkmedžio lapuose (p<0,05). Stipriausias antioksidacinis aktyvumas (453,06 ± 0,48 μmol/g) nustatytas toje pačioje žaliavoje (p<0,05). Mažiausiu antioksidaciniu aktyvumu (293,56 ± 21,99 μmol/g) pasižymėjusioje žaliavoje, rinktoje Klaipėdos regione 2014 metų rugsėjo mėnesį, nustatyta mažiausia flavonoidų koncentracija (4,81 ± 0,24 mg/g).
Naudojant Spirmeno koreliacijos koeficientą, buvo įvertintas koreliacijos ryšio stiprumas tarp suminio flavonoidų kiekio dviskiaučių ginkmedžių lapuose ir antioksidacinio aktyvumo. Atlikus gautų duomenų analizę, nustatytas stiprus (rs=0,74, p<0,05) koreliacijos ryšys tarp suminio flavonoidų kiekio
ir antioksidacinio aktyvumo.
Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, kad antioksidacinis aktyvumas tiesiogiai priklauso nuo bendro flavonoidų kiekio augalinėje žaliavoje. Kuo flavonoidų kiekis didesnis, tuo antioksidacinis aktyvumas stipresnis. 323,69 414,94 446,28 450,24 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
Klaipėda Šiauliai Arbata Nr. 1 Arbata Nr. 2
An tio ksi d acin is a kt yv u m as TE , µ m o l/g
