LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
VAIVA VAIČAITYTĖ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR FLAVONOIDŲ KIEKYBINĖS SUDĖTIES
ĮVAIRAVIMO BEI ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ (Ginkgo biloba L.) AUGALINĖJE
ŽALIAVOJE IR VAISTINIUOSE PREPARATUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof., dr. L.Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas: Data:
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR FLAVONOIDŲ KIEKYBINĖS SUDĖTIES ĮVAIRAVIMO BEI ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS DVISKIAUČIŲ GINKMEDŽIŲ (Ginkgo biloba L.) AUGALINĖJE ŽALIAVOJE IR VAISTINIUOSE PREPARATUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof., dr. L.Ivanauskas
Data
Recenzentas: Darba atliko:
Magistrantė
Vaiva Vaičaitytė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 1. SANTRUMPOS ... 7 2. ĮVADAS ... 8 3. LITERATŪROS APŽVALGA ... 103.1 Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) morfologinis apibūdinimas ... 10
3.2 Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ir EGB 761 cheminė sudėtis ... 11
3.3 Flavonoidų struktūros savybės ir klasifikacija ... 12
3.4 Terpenoidų struktūros savybės ir klasifikacija ... 14
3.5 Ginkolinės rūgšties struktūros savybės ir pašalinis poveikis... 15
3.6 Dviskiaučių ginkemdžių (Ginkgo biloba L.) priešvėžinis poveikis ... 16
3.7 Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai ... 17
3.8 Flavonoidų kiekybinio nustatymo metodai ... 18
3.9 Antioksidacinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai ... 20
3.10 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 21
4. TYRIMO METODIKA ... 22
4.1 Tyrimo objektas ... 22
4.2 Naudoti reagentai ... 22
4.3 Naudota aparatūra ir prietaisai ... 23
4.4 Tiriamojo pavyzdžio paruošimas... 23
4.5 Tyrimų metodai ... 24
4.6 Statistinis duomenų įvertinimas... 26
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
5.1 Spektrofotometrinės analizės metodai ... 27
5.2 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu. ... 27
5.3 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose preparatuose, spektrofotometriniu metodu. ... 28
5.4 Bendro fenolinių junginių kiekio palyginimas tarp dviskiaučių ginkmedžių vaistinės žaliavos
ekstraktų ir vaistinių preparatų ekstraktų ... 29
5.5 Flavonoidų kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu. ... 29
5.6 Flavonoidų kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose preparatuose, spektrofotometriniu metodu ... 31
5.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH radikalų surišimo metodą dviskiaučių ginkmedžių augalinėje žaliavoje ... 32
5.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH radikalų surišimo metodą dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose preparatuose ... 33
6. IŠVADOS ... 35
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 36
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 37
SANTRAUKA
V. Vaičaitytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. L.Ivanauskas , Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2018.
Raktiniai žodžiai: Ginkgo biloba, dviskiautis ginkmedis, vaistiniai preparatai, fenoliai, flavonoidai,
spektrofotometrija, antioksidacinis aktyvumas.
Tyrimo objektas ir metodai: Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų ir vaistinių
preparatų ekstraktai. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatymas atliktas spektrofotometriniu metodu. Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant DPPH reagentą.
Darbo tikslas: Įvertinti skirtingose Lietuvos vietose augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo
biloba L.) lapuose bei Lietuvoje registruotuose vaistiniuose preparatuose kaupiamų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei įvertinti antioksidacinį aktyvumą, pritaikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uždaviniai: Spektrofotometriniu metodu nustatyti dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba
L.) augalinėje žaliavoje ir vaistiniuose preparatuose esančių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio įvairavimą. Įvertinti ar junginių kiekio skirtumas galėjo priklausyti nuo surinkimo vietos. Palyginti sudėties skirtumus tarp dviskiaučių ginkmedžių lapų ir vaistinių preparatų. Atlikti ekstraktų antioksidacinio aktyvumą nustatymą.
Išvados: didžiausias kiekis fenolinių junginių nustatytas dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.)
augalinėje žaliavoje surinktoje Kauno botanikos sode (16.03 GRE mg/g), taip pat šiuose lapuose nustatyti didžiausi kiekiai flavonoidų (5.09 RE mg/g). Mažiausi kiekiai fenolinių junginių gauti ištyrus lapus rinktus Šilutėje (8.99 GRE mg/g), taip pat gauti ir mažiausi kiekiai flavonoidų (2.30 RE mg/g). Atlikus dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) vaistinių preparatų tyrimą nustatyti didžiausi kiekiai fenolinių junginių Tanakan 40mg vaistiniame preparate (30.07 GRE mg/g), tačiau flavonoidų didžiausias kiekis gautas Bilobil 120mg (6.22 RE mg/g) vaistiniame preparate. Mažiausi fenolinių junginių kiekiai gauti ištyrus Ginkobil 120mg vaistinį preparatą (19.52 GRE mg/g). Mažiausiai kiekiai flavonoidų buvo nustatyti Gingium 120mg (3.02 RE mg/g) ir Ginkobil 120mg (2.98 RE mg/g) vaistiniuose preparatuose. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Kauno botanikos sode (81.95 μmol TE/g) ir Klaipėdos botanikos sode (80.83 μmol TE/g) surinkti dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapai. Vaistiniuose preparatuose didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Tanakan 40mg (86.11 μmol TE/g) bei Bilobil (84.47 μmol TE/g) vaistiniai preparatai.
SUMMARY
Key words: Ginkgo biloba, phenols, flavonoids, medicinal preparations, spectrophotometry, antioxidant activity.
Object and methods: Extracts of gingko biloba leaves and medical preparations. Determination of total phenolic compounds and flavonoids was done by spectrophotometric method. Antioxidant activity was determined by spectrophotometric method using DPPH reagent.
Aim: To evaluate the quantitative composition of phenolic compounds and flavonoids accumulated in ginkgo biloba leaves, collected in different places of Lithuania, and medical products registered in Lithuania and also to assess the antioxidant activity of the extracts using the spectrophotometric method.
Objective: to determine the diversity of phenolic compounds and flavonoids in leaves of ginkgo
biloba and medicinal preparations. To compare difference in the amount of compounds that could depend on the location of the collection. To evaluate quantity differences between gingko biloba leaves and medicinal preparations. To assess the antioxidant activity of the extracts.
Conclusions: The maximum amount of phenolic compounds was determined in ginkgo biloba
leaves grown in Kaunas Botanical Garden (16.03 GRE mg/g), as well as the maximum quantities of flavonoids (5.09 mg/g). The smallest amount of phenolic compounds obtained from the investigated leaves collected in Silute (8.99 GRE mg/g), also the lowest amount of flavonoids (2.30 RE mg/g). In test of ginkgo biloba medical products a maximum amount of phenol compounds was found in Tanakan 40 mg (30.07 GRE mg/g), but the highest amount of flavonoids was obtained with Bilobil 120 mg (6.22 mg/g) . The least amount of phenolic compounds was observed in Ginkobil 120 mg (19.52 GRE mg/g). The lowest levels of flavonoids were found in medical products of Gingium 120 mg (3.02 RE mg/g) and Ginkobil 120 mg (2.98 RE mg/g). The highest antioxidant activity was observed in leaves collected in the Kaunas Botanical Garden (82.95 μmol TE/g) and in Klaipeda Botanical Garden (81.66 μmol TE/g). In the medicinal products, the highest antioxidant activity was shown by Tanakan 40 mg (86.11 μmol TE/g) and Bilobil (84.47 μmol TE/g).
1. SANTRUMPOS
AA – antioksidacinis aktyvumas;
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;
EGb 761 – standartizuotas dviskiaučių ginkmedžių lapų sausasis ekstraktas; GRE – galo rūgšties ekvivalentas (angl. Gallic acid equivalent);
GBE – dviskiaučių ginkmedžių ekstraktas; Ph. Eur. – Europos farmakopėja;
RE – rutino ekvivalentas; R2 – regresijos koeficientas; TE – trolokso ekvivalentas; UV – ultravioletinė spinduliuotė; VAŽ – vaistinė augalinė žaliava.
2. ĮVADAS
Jau daugelį metų mokslininkai aktyviai tyrinėja vaistinius augalus, kurių sudėtyje randami dideli kiekiai biologiškai aktyvių junginių. Ypač didelis dėmesys skiriamas vaistiniams augalams pasižymintiems antioksidacinėmis savybėmis [1,2]. Augaliniai antioksidantai neleidžia susidaryti laisviesiems radikalams, juos slopina arba dalyvauja laisvųjų radikalų suardymo procese. Vienas iš tokių augalų, yra dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.), dėl savo ilgaamžiškumo ir patvarumo Č.Darvino pavadintas „gyvąja iškasena“ [3]. Šis vaistinis augalas pradėtas tyrinėti prieš daugelį metų ir iki šių dienų kelia didelį mokslininkų susidomėjimą.
Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) sudėtyje esantys fenoliai, flavonoidai, bilobalidai, terpenoidai pasižymi kraujagysles plečiančiu, atminti gerinančiu [4], laisvuosius radikalus surišančiu, trombocitų agregaciją slopinančiu [5] bei kitu teigiamu poveikiu žmogaus organizmui. Dabar vis dažniau yra analizuojamas dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) priešvėžinis poveikis. Prasta mityba, miego trūkumas, stresas ir kiti neigiamai veikiantys faktoriai gali iššaukti sunkias ligas ar net vėžį, kurio gydymui vis dar siekiama surasti tinkamiausią gydymo variantą [6,7] Dabartiniai atlikti moksliniai tyrimai yra dvejopi, išskiriamas teigiamas arba neigiamas dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) antikancerogeninis poveikis. Reikia atkreipti dėmesį, kad dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) efektyvumas labai priklauso nuo vaistinės augalinės žaliavos ar standartizuoto ekstrakto, esančio vaistiniuose preparatuose ar maisto papilduose, suvartojamo kiekio, taip pat kokios rūšies vėžį bandoma gydyti bei tai, kad didžioji dalis tyrimų kol kas atlikti tik in vitro.
Didžiausią įtaką vėžio ląstelių augimo slopinimui turi dviskiaučiuose ginkmedžiuose randami fenoliai junginiai bei flavonoidai, todėl jų kiekį esantį vaistinėje augalinėje žaliavoje ar vaistiniame preparate yra labai svarbu nustatyti. Vienas iš greičiausiu ir paprasčiausių nustatymo būdų yra spektrofotometrinis, pagrįstas junginių savybe sugerti šviesą UV-spektro dalyje.
Norint preparatą, kurio sudėtyje yra dviskiaučio ginkmedžio, pavadinti vaistiniu preparatu, jo sudėtyje privalo būti standartizuoto dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ekstrakto EGB 761, kuris užtikrina preparato kokybę. EGB 761 sudėtis yra griežtai reglamentuota ir privalo atitikti nustatytas normas [8].
Darbo naujumas ir aktualumas: dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) cheminė sudėtis bei
poveikis žmogaus organizmui yra plačiai tyrinėjami, tačiau Lietuvoje yra atlikta mažai tyrimų su dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ekstraktais pasitelkiant spektrofotometrinį metodą, taip pat mažai tyrimų atliktų su vaistiniais preparatais, kurių sudėtyje yra dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba
L.) ekstraktas. Šis tyrimas suteiks naujos informacijos, kuri ateityje galės būti panaudota, renkantis vaistinę augalinę žaliavą ar vaistinį preparatą.
Darbo tikslas:
Nustatyti skirtingose Lietuvos vietose augančių dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų bei Lietuvoje registruotų vaistinių preparatų su dviskiaučių ginkmedžių kaupiamų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį bei įvertinti antioksidacinį aktyvumą, pritaikant spektrofotometrijos metodą.
Darbo uždaviniai:
1. Spektrofotometrinio metodo pagalba nustatyti dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties įvairavimą augalinėje žaliavoje bei vaistiniuose preparatuose.
2. Nustatyti cheminės sudėties įvairavimą augalinėje žaliavoje priklausomai nuo surinkimo vietos. 3. Įvertinti fenolinių junginių kiekinės sudėties skirtumus tarp dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba
L.) augalinės žaliavos ir vaistinių preparatų su dviskiaučiu ginkmedžiu (Ginkgo biloba L.).
4. Nustatyti dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augalinės žaliavos ir vaistinių preparatų su dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ekstraktu antioksidacinį aktyvumą.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
3.1 Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) morfologinis apibūdinimas
Tai vasarą žaliuojantis dvinamis lapuotis. Šio augalo kamieno skersmuo nuo 1 iki 3 metrų, aukštis gali siekti 40 m. Žievė, priklausomai nuo dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) amžiaus, gali būti nuo šviesiai iki tamsiai pilkos spalvos, su stambiomis ar smulkiomis raukšlėmis. Skiriami vyriški ir moteriški augalai. Vyriškieji augalai siauromis lajomis, moteriškieji plačiomis laužytomis šakomis. Dviskiaučio ginkmedžio (Ginkgo biloba L.) vaisius – baltos spalvos, tribriaunis kaulavaisis. [9,10]
Vaistinė žaliava. Ginkmedžio lapai (Ginkgo biloba folium L.) - dviskiaučiai, ilgakočiai, vėduoklės formos. Gyslotumas primityvus, dichotominis. Skinami nuo medžių arba renkami nukritę, jiems pradėjus gelsti. [11]
1 pav. Dviskiaučių ginkmedžių lapų (Ginkgo biloba L.) formų skirtumai dėl augimo skirtingose klimato zonose, skirtingų augalo lyčių ir kt. [12]
3.2 Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ir EGB 761 cheminė sudėtis
Iki pat devynioliktojo amžiaus pabaigos dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) cheminė sudėtis tiksliai nebuvo žinoma. Japonijos tyrėjai pirmieji paskelbė sisteminių cheminių tyrimų rezultatus: Kawamura (1928) atrado stiprius odos dirgiklius, pasižyminčius fenolių savybėmis (ginkolines rūgštis), Furukawa (1932) išskyrė ginkolidus, o Nakanishi (1967) atliko šių junginių struktūrinę analizę. Galiausiai Corey iš Harvardo (JAV) laimėjo Nobelio premiją už ginkolidų sintezės chemiją [13,14].
Siekiant užtikrinti dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) efektyvumą sukurtas standartizuotas ekstraktas. EGB 761 išvalytas nuo kenksmingų bei nepageidaujamų medžiagų. Reglamentuota EGB 761 sudėtis: flavoniniai glikozidai 22% -27%, terpeniniai laktonai, įskaitant ginkgolidus A, B ir C (2,8% -3,4%) ir bilobalidą (2,6% -3,2%) ir mažiau kaip 5 ppm ginkgolinės rūgšties.
Dviskiaučių ginkmedžių lapų ir EGB 761 sudėtys (+ arba – žymima, kurie junginiai įeina į standartizuotą ekstraktą) [15]
Flavonoidai
o Ginkgo flavono glikozidai + o Ginkgo flavono aglikonai - o Bioflavonoidai - o Proantocianidinai/oligonomerai + o Katechinai - Neflavonoidiniai glikozidai + Terpenolaktonai o Ginkolidai A, B, C + o Bilobalidas + Kiti terpenai o Poliprenoliai - Sterodai - Organinės rūgštys o Ginkolinė rūgštis - o Kitos organinės rūgštys +
3.3 Flavonoidų struktūros savybės ir klasifikacija
Flavonoidai– tai viena didžiausių augalinių fenolinių junginių grupių, turinti daugiau nei 6 tūkstančius junginių, kurių cheminė sandara nustatyta. Daugelio augalų geltoną spalvą nulemia flavonoidai esantys juose, būtent pirmieji flavonoidų junginiai buvo išskirti geltonos spalvos, todėl šių junginių pavadinimas kilęs iš lotyniško žodžio flavus- geltonas.
Šios grupės junginių pagrindą sudaro benzo-γ pirono žiedas. Flavonoidai turi C6-c3-c6 molekulinę grupę, molekulėje yra du benzolo žiedai, kuriuos jungia propaninis fragmentas, dėl to daugelis šios grupės atstovų sudaro heterociklą. [16]
2 pav. Flavonoidų struktūra (žiedai: C6, C6- benzeno, C3- pirano)[16]
1 lentelė. Flavonoidų klasifikacija pagal junginių cheminę sandarą ir propaninio fragmento oksidacijos laipsnį.
Grupė Poveikis Atstovai
Flavonai [17] apigeninas, luteolinas, flavonas, viteksinas Flavonoliai [17] rutinas, flavonolis, kvercetinas, kemferolis, hiperozidas
Flavononai [17] hesperidinas, flavononas, likviritigeninas, eriodiktinas Flavan-3-oliai [18] katechinas Leukoantocianidin ai (flavan 3,4- dioliai) [19] leukoantocianidinas ir leukopianidinas Antocianai [17] antocianas, malvidinas, cianidinas, pelargonidinas Chalkonai [17] chalkonas, izolikviritinas, 3,4- dihidroksichalkonas Auronus [17] auronas ir 3,4- dihidroksiauronas
Izoflavonoidus [17] izoflavonas, ononinas, genistinas Neoflavanoidus [17] dalberginas, nivetinas
3.4 Terpenoidų struktūros savybės ir klasifikacija
Struktūros savybės: ginkolidų struktūra sudaryta iš šešių penkianarių žiedų, spiro–4,4-nonanokarboksilinio žiedo, tetrahidrofurano ir trijų laktonų. Tai vieninteliai natūralūs produktai, kurie turi tetrabutil grupę. Ji prisijungusi prie B žiedo. [20, 21]
Klasifikuojami:
Ginkolidai A, B, C, J, M (skiriasi tarpusavyje hidroksi grupių padėtimis ir jų skaičiumi) Bilobalidai (skiriasi nuo ginkolidų tik tetrafurano žiedu)
4 pav. Bilobalidų struktūrinė formulė [21]
3.5 Ginkolinės rūgšties struktūros savybės ir pašalinis poveikis
Struktūros savybės: ginkolinė rūgštis sudaryta iš karboksi rūgštis (salicilo rūgštis) ir hidrooksilo
grupė (ilga grandinė anglies pakaitų). Taip pat turi dvigubą jungtį alkilo grandinėje (5pav.) [22]
5 pav. Ginkolinės rūgšties struktūra [22]
Pašalinis ginkolinės rūgšties poveikis:
Ši rūgštis veikia neurotoksiškai, sukelia alergijas, odos ir kraujagyslių sistemos pažeidimus (ūmią dilgėlinę, eksfoliacinį dermatitą, niežulį), taip pat gali pažeisti kvėpavimo, širdies ir kraujagyslių bei reprodukcinę sistemas [23].
Šviežiuose ginkmedžio lapuose yra didelis ginkolinės rūgšties kiekis – 16–56 proc. Pagal farmakopėjos standartus Europoje, JAV, Japonijoje ir Kinijoje ginkolinės rūgštys dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ekstraktuose yra griežtai ribojamos. Europos ir Amerikos farmakopėjose ginkolinės rūgšties kiekis negali viršyti 5 ppm. Kinijos farmakopėjoje leistina iki 10 ppm [24].
3.6 Dviskiaučių ginkemdžių (Ginkgo biloba L.)
priešvėžinis poveikis
Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapuose randami dideli kiekiai flavonoidų, kurie pasižymi priešuždegiminiu, priešvirusiniu, kraujagysles plečiančiu, antineurodegeneraciniu ir kitais gydomasiais poveikiais žmogaus organizmui. Naujausi tyrimai skiria didžiulį dėmesį antioksidaciniam flavonoidų aktyvumui. Nepakankamas kiekis antioksidantų ar antioksidantinių fermentų slopinimas gali sukelti oksidacinį stresą, pakenkti ląstelėms arba jas sunaikinti. Flavonoidai pasižymi gebėjimu sumažinti laisvųjų radikalų susidarymą ir išgryninti laisvųjų radikalų kiekį.
Nustatyti įvairūs flavonoidų priešvežinio poveikio mechanizmai: kancerogeninė inaktyvacija, proliferacijos slopinimas, ląstelių apoptozės indukcija, navikų augimo slopinimas, angiogenezės slopinimas, stipraus antioksidacinio poveikio ar šių mechanizmų deriniai. [25,26]
Taip pat prieškancerogeninis poveikiu flavonoidai pasižymi veikdami į citochromą P450 tam, kad slopintų tam tikrų P450 izofermentų, kurie yra atsakingi už tam tikrų prokancerogenų gamybą, veiklą. Kitas jų veikimo būdas: flavonoidai padeda metabolizuojančių fermentų, tokių kaip glutationo-S-transferazė, chinono-reduktazė ir uridino 5-difosfogliukuronilterpenazė, gamybai, dėl kurios kancerogenai yra detoksikuojami ir todėl pašalinami iš organizmo. [26, 27]
Visgi dabartiniai duomenys apie flavonoidų antikarcinogeninį potencialą vis dar yra dviprasmiški. Kai kurie tyrimai, atlikti su gyvūnais ar įvairiais ląstelių modeliais, rodo, kad tam tikri flavonoidai gali slopinti vėžio pradžią ir progresavimą [10,28]. Tačiau eksperimentai su žiurkėmis, atlikti siekiant nustatyti tangeretino ir kvercetino poveikį vėžio rizikai, atsiradusiai dėl alfatoksino B1 indukcijos (kepenų vėžio inicijavimo ir skatinimo), parodė, kad nors tangeretinas, vartojamas navikų inicijavimo metu, sumažino iki vėžinių pažeidimų skaičių, kvercetinas nesukėlė jokio teigiamo poveikio [28].
Tyrimas, ar kvercetinas apsaugo nuo plaučių vėžio pelėse, parodė, kad ši medžiaga, nepaisant stipraus biologinio aktyvumo, nėra pakankamai efektyviai absorbuojama. Vis dėlto autoriai teigia, kad tolesnis darbas turėtų būti nukreiptas į tai, kad šios medžiagos adsorbcijos mechanizmas būtų efektyvesnis, kas greičiausiai skatintų laukiamus priešvėžinius veiksmus [29]. 2015 metais atliktame tyrime buvo siekiama ištirti dviskiaučių ginkmedžių ekstraktų apsauginius mechanizmus prieš anglies tetrachlorido (CCl4) sukelta kepenų fibrozę žiurkėms. Vyriškos žiurkės atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: kontrolinė grupė (C), modelinė grupė (M), mažos dozės grupės (L) ir didelės dozės grupė (H). Kepenų fibrozė buvo sukelta CCl4 grupių M, L ir HC grupėje buvo vartojamas fiziologinis tirpalas.
Hematoksilino ir eozino dažymo, Masson'o trichromo dažymo, kepenų funkcijos indekso ir kepenų fibrozės indekso rezultatai parodė, kad dviskiaučių ginkmedžių ekstraktų taikymas pastebimai sumažino fibrozę ir pagerino kepenų funkciją. Vakarų blotingų ir imunohistocheminių tyrimų duomenimis, GBE sumažino kepenų fibrozę ne tik slopindama p38 MAPK ir NF-κBp65, slopindama IκBα skilimą, bet taip pat slopindama hepatocitų apoptozę per Bax žemutinį reguliavimą, Bcl-2 padaugintą reguliavimą ir veikdami kaspase- 3 (Rezultatų 1 ir 2 pav. prieduose) [30].
Kitas tyrimas parodė, kad plaučių vėžio atsiradimas pelėms, buvo sustabdytas vartojant flavonoidus. Rezultatai parodė, kad katechinai gali apsaugoti nuo vėžio vystymosi. Tolesni tyrimai, atlikti su žmogaus kepenų ląstelėmis parodė, kad luteolinas ir apigeninas taip pat užtikrina veiksmingą apsaugą nuo vėžio vystymosi. Teigiama, kad šie flavonoidai slopina CDK. Tačiau atkreipiamas dėmesys, kad flavonoidai silpnesni in vivo veikloje, palyginti su in vitro [31].
Stebėjimo tyrimai, atlikti su žmonėmis, taip pat yra dviprasmiški [32]. Su moterimis atliktas tyrimas išanalizavo dietinių flavonoidų vartojimo poveikį plaučių, storosios žarnos, krūties ir kasos vėžio dažniui 34 708 moterims po menopauzės. Rezultatai parodė, kad reguliarus flavonoidų vartojimas žymiai sumažino plaučių vėžio riziką, ypač moterims, kurios nutraukė rūkymą. Tačiau flavonoidų vartojimo įtaka kitų vėžio rizikai nebuvo aiški [33]. Todėl būtina atlikti tolesnius tyrimus, kad būtų įvertintas teigiamas priešvėžinis flavonoidų poveikis.
3.7 Fenolinių junginių kiekybinio nustatymo metodai
Fenolinių junginių kiekybinės sudėties augalinėje žaliavoje nustatymas yra svarbus siekiant įvertinti žaliavos kokybę. Fenolinių junginių kiekybinės sudėties nustatymui yra sukurta įvairių metodų. Plačiausiai naudojami metodai yra ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija. Rečiau naudojama kapiliarinė elektroforezė, dujų chromatografija.
Galimi spektrofotometriniai fenolinių junginių nustatymo metodai: Reakcija su aliuminio (III) chloride [34];
Reakcija su 2,4- dinitrofenilhidrazinu (DNPH)[35]; Berlyno mėlio susidarymo metodas[36];
3.7.1 Spektrofotometrinis fenolinių junginių nustatymo metodas naudojant Folin-Ciocalteu reagentu
Reagentą sudaro 100 ml natrio volframato dihidrato, 25 ml natrio molibdato dihidrato, 50 ml 85 proc. fosforo rūgšties tirpalo ir 100 ml 36 proc. vandenilio chlorido rūgšties tirpalo [25]. Metodas paremtas nespecifine fenolinių junginių oksidacija dviem stipriais neorganiniais oksidatoriais (fosfomolibdato ir fosfovolframato rūgštimis) bazinėje terpėje. Reakcija vykdoma 30 min arba mišinys 5 min. pašildomas vandens vonioje esant 50°C. Matuojama 760-765 nm bangos ilgio šviesos absorbcija [36, 38, 39]. Naudojant šį metodą, priklausomai nuo fenolinių junginių struktūros gaunami skirtingi rezultatai. Folin-Ciocalteu reagentas kartu su fenoliniais junginiais gali oksiduoti ir keletą ne fenolinių organinių junginių bei tam tikras neorganines medžiagas, taip pervertinant fenolinių junginių kiekį mėginyje [38]. Nepaisant galimo fenolinių junginių kiekio pervertinimo, FolinCiocalteu metodas labai plačiai taikomas fenolinių junginių kiekybinės sudėties įvertinimui augalinės kilmės mėginiuose [36, 37, 38, 39]. Tai greitas, sudėtingos ir brangios įrangos nereikalaujantis metodas.
3.8 Flavonoidų kiekybinio nustatymo metodai
Vertinant augalinės žaliavos kokybę, svarbu nustatyti bendrą flavonoidų kiekį. Kiekybiniam nustatymui gali būti naudojama spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, kolorimetrinis metodas ir dar keletas metodų.
Kolorimetrinis metodas
Pagrįstas flavonoidų gebėjimu su tam tikrais reagentais (citrinos-boro rūgšties), įvairių metalų druskomis (aliuminio, cirkonio, titano, chromo, alavo) ir oksidacijos – redukcijos reakcijų metu (su cinku arba magniu rūgščioje aplinkoje) sudaryti spalvotus junginius. [16]
Efektyvioji skysčių chromatografija
Dažniausiai atliekama atvirkštinių fazių chromatografija, naudojant C8 ar C18 kolonėles. Gradientiniam
eliuavimui naudojamos dviejų tirpiklių sistemos: acetonitrilo-vandens arba metanolio-vandens mišiniai. Kartais naudojami ir kiti tirpikliai, tokie kaip tetrahidrofuranas, izopropanolis, n-propanolis. Pridedama
ir rūgščių, kurios slopina fenolinių hidroksilo grupių jonizaciją ir taip leidžia gauti ryškesnes smailes. Efektyvioji skysčių chromatografija dažniausiai atliekama kambario temperatūros aplinkoje, tačiau temperatūra gali būti ir 40°C, kuomet norima sutrumpinti analizės laiką. [40]
Dujų chromatografija
Tai metodas, kuriame judri fazė yra dujos. [41] Dujų chromatografijoje gali būti skirstomi tik lakūs ir aukštoje temperatūroje neskylantys junginiai, o tai reikalauja papildomo organinių junginių apdorojimo, nes nedidelis kiekis jų atitinka minėtus reikalavimus. Fenolinių junginių analizei dažniausiai naudojama derivatizacija su 30 m ilgio lydyto kvarco kapiliarinėmis kolonėlėmis, kurių skersmuo 25 – 32 μm, o pastovios nejudrios fazės dalelių dydis – 0,25 μm. Tai paprastas ir jautrus metodas, dar efektyvesnis atliekamas kartu su masių-spektrometrija. [42,43]
Spektrofotometrija
Vienas dažniausiai pasirenkamų metodų - spektrofotometrinis metodas, pagrįstas junginių savybe sugerti šviesą UV-spektro dalyje. Spektrofotometriškai matuojama kiek šviesos medžiaga absorbuoja. Matuojamas šviesos intensyvumas, kuris eina per medžiagos tirpalą. Pagrindinis principas yra toks, kad kiekvienas junginys sugeria arba praleidžia šviesą per tam tikrame diapazone esantį bangos ilgį. [16]
Kiekvienas flavonoidų aglikonas savo sudėtyje turi bent vieną aromatinį žiedą, kuris aborbuoja UV šviesą. Flavonoidų spektras susideda iš dviejų absorbcijos maksimumų. Pirmąjį maksimumą, kuris randamas 240-285 nm bangos ilgių srityje, nulemia A žiedas, o antrąjį, kuris randamas 300-550 nm bangos ilgių srityje, nulemia pakaitai ir C žiedo konjugacija [44]. Šis metodas leidžia nustatyti suminį flavonoidų kiekį augale [45]. Flavonoidų sąveika su įvairiais reagentais sukelia absorbcijos spektro poslinkį. Tokiais reagentais gali būti šarminis dietilenglikolio reagentas, magnis ir vandenilio chlorido rūgštis, 1-nitrozo-2-naftolio ir azoto rūgštis .
Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti dažniausiai naudojamas aliumino ir flavonoidų kompekso sudarymas ir jų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu. Galimos įvairios šio metodo modifikacijos, kurias galima suskirstyti į dvi pagrindines rūšis. Vieno metodo atvėju naudojamas 2-10 proc. (m/v) koncentracijos AlCl3 tirpalas. Reakcija vykdoma acto rūgšties arba natrio acetato aplinkoje. Šviesos absorbcija matuojama po 2-60 min. esant 404–430 nm šviesos bangos ilgiui. Gauti rezultatai gali būti išskiriami skirtingais flavonolių (kvercetino, rutino, kvercitrino, galangino) ar katechino ekvivalentais. Kitu metodu komplekso sudarymo reakcija vykdoma bazinėje terpėje, pridedant NaNO2. Metodo modifikacijos
Matuojama 510 nm ilgio šviesos absorbcija. Rezultatai išreiškiami tik katechino ekvivalentais. Pirmasis metodas yra jautrus tik flavonoliams ir flavonui liuteolinui. Antrasis metodas, atliekamas bazinėje terpėje, yra jautrus rutinui, liuteolinui, katechinams bei fenolinėms rūgštims. Tiriant tuos pačius augalinės kilmės mėginius skirtingomis metodo modifikacijomis, gaunami skirtingi rezultatai [38].
3.9 Antioksidacinis aktyvumas ir jo nustatymo metodai
Laisvieji radikalai (toksinai) oksidacinio streso metu pažeidžia ląsteles ir jų DNR [46,47]. Jie yra daugelio ligų bei įvairių sveikatos sutrikimų prieižastis. Antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčios medžiagos slopina oksidacijos procesus. Jos mažiną nestabilių molekulių susidarymo riziką bei neutralizuoja jau susidariusius laisviuosius radikalus sudarydamos netoksiškus arba mažai toksiškus junginius taip padeda išvengti ar sumažinti galimus oksidacinius pažeidimus. Norint apsaugoti organizmą nuo laisvųjų radikalų labai svarbu vartoti pakankamą kiekį antioksidaciniu aktyvumu pasižyminčių medžiagų.[48,49] Dviskiaučių ginkmedžių augalinė žaliava ar vaistiniai preparatai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis.
Antioksidacinio aktyvumo nustatymui yra sukurta nemažai skirtingų metodų. Pagrindiniai spektrofotometriniai metodai yra: ABTS ((2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalų – katijonų surišimo metodas, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) radikalų surišimo metodas bei geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidacinės galios nustatymo metodai [50,51,52]. Pagrindinis šių metodų principas yra panašus, nors veikimo mechanizmai yra skirtingi. Bandymo metu sukuriami tam tikro tipo radikalai ir išmatuojama tiriamojo junginio antioksidacinio aktyvumo galia prieš sukurtus radikalus.
DPPH. Šis metodas paremtas elektronų mainais, kai reakcijos metu DPPH radikalai, dėl radikale
esančio azoto atomo nelyginio elektrono, redukuojami antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčių junginių į geltonos spalvos hidraziną (5pav). Antioksidacinis aktyvumas nustatomas matuojant nustatomojo bandinio absorbciją prie 515-520 nm bangos [40,53,54].
6 pav. DPPH radikalo reakcija su antioksidantu (A-H)[59]
3.10 Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Skiriami vyriški ir moteriški Ginkgo biloba L. medžiai, kurių lapai yra dviskiaučiai, ilgakočiai, vėduoklės formos, naudojami kaip vaistinė augalinė žaliava. Subrandintas vaisius - baltos spalvos, tribriaunis kaulavaisis. Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapų pagrindinės veikliosios medžiagos flavonoidai, terpenoidai. Taip pat ginkolinė rūgštis, kurios dideli kiekiai veikia neurotoksiškai, gali sukelti alergijas. Gaminant vaistinius preparatus naudojamas EGB 761 ekstraktas, kuris yra kiekybiškai įvertintas, tai yra tikslus kiekiai veikliųjų medžiagų ir minimalus leistinas ginkolinės rūgšties kiekis.
Vis daugiau atliekamų tyrimų su dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augaline žaliava ar vaistiniais preparatais parodo teigiamą veikliųjų medžiagų poveikį slopinant vėžinių ląstelių progresavimą. Reikėtų atkreipti dėmesį, kad kol kas didžioji dalis tyrimų atlikta in vitro.
Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui gali būti naudojami įvairūs metodai: spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija. Rečiau pasirenkami kapiliarinė elektroforezė, dujų chromatografija. Kiekybiniam flavonoidų nustatymui galima pasirinkti spektrofotometrija, plonasluoksne chromatografiją, efektyviają skysčių chromatografiją, dujų chromatografiją, kapiliarinę elektroforezę, kolorimetrinį metodą ir dar keletą kitų metodų. Vienas dažniausiai pasirenkamų metodų - spektrofotometrinis metodas, pagrįstas junginių savybe sugerti šviesą UV-spektro dalyje. Spektrofotometriškai matuojama kiek šviesos medžiaga absorbuoja.
Dviskiaučių ginkmedžių augalinė žaliava ir vaistiniai preparatai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu. Pagrindiniai spektrofotometriniai antioksidaciniu aktyvumo nustatymo metodai: ABTS, DPPH, FRAP ir CUPRAC.
4. TYRIMO METODIKA
4.1 Tyrimo objektas
Tirti dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapai, surinkti iš skirtingų Lietuvos vietovių bei Lietuvos rinkoje registruoti vaistiniai preparatai. Surinkta vaistinė augalinė žaliava buvo išdžiovinta, susmulkinta elektriniu malunėliu ir laikoma tamsaus stiklo buteliukuose, kambario temperatūroje. Vaistiniai preparatai iki tyrimo buvo laikomi orginaliose pakuotėse.
o Kaunas, botanikos sodas o Kaunas, Rokai
o Klaipėda, botanikos sodas o Utena, miesto aplinkės o Šiauliai, botanikos sodas
o Šilutės rajonas, Švėkšnos parkas
Ginkgo Biloba Pharma Nord (105mg) Ginkobil (120mg)
Bilobil (120mg) Tanakan (40mg) Gingium (120mg)
4.2 Naudoti reagentai
Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) ekstraktuose esančių junginių analizei atlikti naudoti reagentai:
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”);
Metanolis 99,8% (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Rutino reagentas (97,11%, “HWI ANALYTIK GMBH”);
Ledinė acto rūgštis (99,5% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Aliuminio chloridas (99,99% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija);
DPPH reagentas (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, ALDRICH, Vokietija); Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV).
4.3 Naudota aparatūra ir prietaisai
Dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augalinės žaliavos smulkinimui naudotas elektrins malūnas (Retsch 200, Haan, Vokietija). Tikslus žaliavos kiekis atsvertas naudojant analitines svarstykles (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija). Tyrimui skirti ekstraktai buvo ruošiami naudojant termostatinę vonelę (Heidolph, Schwabach, Vokietija). Mišinių filtravimas atliktas su Q-Max membraniniu filtru (25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija). Darbo metu taip pat naudotos automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV). Bendras dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) fenolinių junginių, flavonoidų kiekis bei antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica, HALO DB-20). Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
4.4 Tiriamojo pavyzdžio paruošimas
Ekstrakcija atlikta remiantis Europos farmakopėjos 01/2008:1828 straipsnyje nurodytu metodu. Ekstraktai ruošti sveriant po 0,5 g (tiksli masė) susmulkintos žaliavos ir beriant ją į kaitinimui skirtą buteliuką. Žaliava užpilta 5ml 70% (v/v) metanolio ir mišinys gerai suplaktas. Ekstrakcija vykdyta termostatinėje vonelėje 10 min, palaikant pastovią 65º C temperatūrą. Po ekstrakcijos buteliukas išimtas, supurtytas ir paliktas kambario temperatūroje atvėsti. Mišinys filtruotas pro metanoliu sudrėkintą membraninį filtrą. Perkeltas į tikslaus tūrio matavimo kolbą ir praskiestas 70% (v/v) metanoliu iki 5ml. Gauti ekstraktai išpilstyti į rudo stiklo buteliukus, sandariai uždaryti ir laikyti vėsioje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. [55]
4.5 Tyrimų metodai
4.5.1 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras flavonoidų kiekis dviskiaučių ginkmedžių lapuose ir vaistiniuose prepraratuose su dviskiaučiu ginkmedžiu nustatytas plačiai naudojamu, nesudėtingu metodu, pagrįstu flavonoidų reakcija su aliuminio chloridu. Aliuminio ir flavonoidų komplekso formavimas ir jų kiekio nustatymas spektrofotometru yra dažniausiai naudojamas metodas bendram flavonoidų kiekiui nustatyti.
Tyrimui pirmiausia gaminamas reagentas iš 4ml, 96% etanolio, 0,2 ml, 33% ledinės acto rūgšties, 0,8ml, 5% heksametilentetramino (5g medžiagos tirpinami 100ml distiliuoto vandens), 0,6ml, 10% aliuminio chlorido (10g aliuminio chloride miltelių tirpinami 100ml distiliuoto vandens), distiliuoto vandens ir 0,2ml vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 30min. kambario temperatūroje, tamsoje.
Lyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoje augalinio ekstrakto naudojamas 70% (v/v) etanolis.
Praėjus inkubaciniam laikotarpiui (30min.) atliekami matavimai su spektrofotometru prie 407nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus.
Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 1,0 mg/ml) rutino tirpalai. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5 skirtingų tirpalo koncentracijų.
Duomenys įvertinami pagal rutino kalibracinio grafiko (nr.3 prieduose) tiesinės regresijos lygtį:
y=0,9465x – 0,0950;
R2 = 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
4.5.2 Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu
Tyrimams atlikti paruošiamas darbinis reagentas: 7% natrio karbonato tirpalas paruošiamas 17,5g medžiagos tirpinant 250ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, kuris sumaišomas su 1ml Folin-Ciocalteu reagento, 9ml distiliuoto vandens ir po 5min. įpilama 10ml 7% natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90min kambario temperatūroje, tamsoje. Po inkubacinio laikotarpio spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 750nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai kartojami tris kartus.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamas tirpalas, tačiau vietoje dviskiaučių ginkmedžių augalinės žaliavos ekstrakto yra pilamas 1ml distiliuoto vandens.
Etanoliniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1ml ekstrakto imama 1ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant galo rūgšties 70proc. Metanolinį tirpalą paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ir 2,5mg/ml.
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko (nr.4 prieduose) tiesinės regresijos lygtį.
y = 0,9068x + 0,0617;
R2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
4.5.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazil hidrato) radikalų surišimo metodą.
Darbinio DPPH tirpalo gamyba: 60 μM DPPH tirpalas skiedžiamas 96,3 proc. (v/v) etanoliu, kol matuojant 515 nm bangos ilgio šviesos absorbciją 25 pasiekiami 0,8±0,03 absorbcijos vienetai. 10 μl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 3 ml darbinio DPPH tirpalo. Kaip tuščias mėginys naudojamas 96,3 proc. (v/v) etanolis. Po 30 min. matuojamas tiriamojo tirpalo šviesos absorbcijos sumažėjimas esant 515 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį.
y = -0,227x + 0,782
R² = 0,999
Trolokso koncentracijų intervalas 0 – 2 mg/ml
Absoliučiai sausos žaliavos antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g apskaičiuojamas iš formulės:
čia: X1 - antioksidacinis aktyvumas mg TE/ml;
V - žaliavos ekstrakto gamybai naudoto ekstrahento tūris ml;
m - absoliučiai sausos žaliavos masė g.
4.6 Statistinis duomenų įvertinimas
Duomenų analizė ir vertinimas atliktas „Microsoft Office Excel 2015“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, suvesti į duomenų bazę, statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, kai p<0,05.
5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
5.1 Spektrofotometrinės analizės metodai
Spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami naudojant metanolinius (70%) (v/v) dviskiaučių ginkemdžių (Ginkgo biloba L.) lapų ir dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) vaistinių preparatų ekstraktus. Tiriant ekstraktus buvo nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų įvairavimas augalinėje žaliavoje ir vaistiniame preparate, taip pat jų antioksidacinis aktyvumas. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/g , o bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu RE mg/g. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas buvo atliekamas pagal DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazil hidrato) radikalų surišimo metodą. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas mg TE/ml pagal trolokso kalibracinę lygtį.
5.2 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių lapų
ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu.
Rezultatuose išreikštuose galo rūgšties ekvivalentu, matyti, kad didžiausia fenolinių junginių gausa pasižymi dviskiaučių ginkmedžių lapai surinkti Kauno rajone, panašus kiekis nustatytas tiek lapų surinktų Kauno botanikos sode (16.03 GRE mg/g), tiek lapų surinktų Rokuose (15.71 GRE mg/g). Šiek tiek mažesnis fenolinių junginių kiekis (15.61 GRE mg/g) nustatytas dviskiaučių ginkmedžių lapuose surinktuose Klaipėdos botanikos sode. Dar mažesni kiekiai nustatyti Utenos miesto apylinkėse surinktuose lapuose (12.60 GRE mg/g) bei Šiaulių botanikos sode (11.93 GRE mg/g). Mažiausias fenolinių junginių kiekis gautas iš vaistinės augalinės žaliavos surinkos Šilutės rajone (8.99 GRE mg/g). Apskaičiavus vidutinį fenolinių junginių kiekį augalinėje žaliavoje rinktoje Kauno botanikos sode ir Šilutės rajone, gauti statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0.05). Kauno rajone nustatytas 1.78 karto didesnis fenolinių junginių kiekis. Rezultatai pateikti 7 paveiksle.
7 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas dviskiaučių ginkmedžių augalinėje žaliavoje (n=3)
5.3 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose
preparatuose, spektrofotometriniu metodu.
2014 metų monografijoje patvirtina vienkartinė dviskiaučių ginkmedžių lapų sausojo ekstrakto dozė suaugusiems yra 120-240 mg. Prieš atliekant tirtų vaistinių preparatų duomenų analizę, buvo atlikti dviskiaučių ginkmedžių ekstraktų koncentracijos perskaičiavimai. Tanakan pirminė koncentracija buvo padidinta keturis kartus, o Gingko biloba Pharma Nord padidinta 1,14 karto (Tanakan 40mg perskaičiuota į 120mg, Gingko biloba Pharma Nord iš 105mg perskaičiuota į 120mg). Kituose vaistiniuose preparatuose su dviskiaučiu ginkmedžiu buvo nurodytas reikalingas 120mg ekstrakto kiekis, todėl papildomi perskaičiavimai jiems netaikyti.
Gauti fenolinių junginių kiekiai įvairuoja nuo 19.52 – 30.07 mg/g ribose. Nustatyas didžiausias fenolinių junginių kiekis (30.07 GRE mg/g) Tanakan vaistiniame preparate. Mažesni kiekiai gauti ištyrus Ginkgo biloba Pharma Nord (20.19 GRE mg/g), Bilobil (20.33 GRE mg/g) ir Gingium (20.15 GRE mg/g) dviskiaučių ginkmedžių vaistinius preparatus. Mažiausias kiekis gautas ištyrus Ginkobil (19.52 GRE mg/g) vaistinį preparatą. Palyginus gautus duomenis nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05), Tanakan vaistiniame preparate fenolinių junginių 1.5 karto daugiau nei Ginkobil vaistiniame preparate. Rezultatai pateikti 8 paveiksle.
16.03 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Kauno miestas, botanikos sodas Kauno miestas, Rokai Klaipėdos miestas, botanikos sodas Utenos miestas, miesto apylinkės Šiaulių miestas, botanikos sodas Šilutės rajonas, švėkšnos parkas F ENOL INI Ų JU NG INIŲ KIEKIS M G /G VIETOVĖ
8 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas dviskiaučių ginkmedžių vaistiniame preparate (n=3)
5.4 Bendro fenolinių junginių kiekio palyginimas tarp dviskiaučių ginkmedžių
vaistinės žaliavos ekstraktų ir vaistinių preparatų ekstraktų
Atliktas dviskiaučių ginkmedžių lapų ir augalinių vaistinių preparatų ekstraktų palyginimas. Galima teigti, kad augalinė dviskiaučių ginkmedžių žaliava bei vaistiniai preparatai yra naudingi fenolinių junginių šaltiniai. Gautuose tyrimo rezultatuose nustatyti dideli fenolinių junginių kiekiai vaistiniuose preparatuose su dviskiaučiu ginkmedžiu. Norint gauti tokį fenolinių junginių kiekį kaip vaistiniuose preparatuose reikėtų suvartoti didesnius vaistinės augalinės žaliavos kiekius. Siekiant gauti 30.07 GRE mg/g (didžiausias nustatytas fenolinių junginių kiekis vaistiniame preparate) fenolinių junginių iš dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstrakto reikėtų suvartoti apie 1g augalinės žaliavos surinktos Kauno botanikos sode, tačiau pasirinktus žaliavą surinktą Šilutės rajone, Švėkšnos parke, jos reikėtų suvartoti beveik 2g.
5.5 Flavonoidų kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių lapų ekstraktuose,
spektrofotometriniu metodu.
30.07
0 5 10 15 20 25 30 35
Ginkgo biloba Pharma Nord Ginkobil
Bilobil Tanakan Gingium
Fenolinių junginių kiekis GRE mg/g
Vaisti n is p rep ar atas
Pagal rutiną išreikštas bendras flavonoidų kiekis, gauti rezultatai pavaizduoti 9 paveiksle. Didžiausias flavonoidų kiekis (5.09 RE mg/g) nustatytas dviskiaučių ginkmedžių lapuose surinktuose Kauno botanikos sode. Taip pat didelis kiekis rastas Klaipėdos botanikos sode surinktoje žaliavoje (5.04 RE mg/g). Šiek tiek mažesnis kiekis nustatytas Kauno rajone, Rokuose (4.44 RE mg/g) ir Šiaulių (3.58 RE mg/g) botanikos sode surinktuose lapuose. Mažiausi kiekiai nustatyti Utenoje (2.82 RE mg/g) ir Šilutės rajone (2.30 RE mg/g) rinktuose lapuose. Palyginus rezultatus gauti statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0.05) tarp Kauno, Utenos bei Šilutės rajone surinktos dviskiaučių ginkmedžių augalinės žaliavos, Rokuose surinktoje žaliavoje flavonoidų kiekis yra 2.2 karto didesnis nei lapuose surinktuose Šilutės rajone bei 1.8 karto didesnis nei Utenoje rinktoje augalinėje žaliavoje.
9 pav. Suminis flavonoidų įvairavimas (mg/g) dviskiaučių ginkmedžių augalinėje žalaivoje taikant spektrofotometrinį tyrimo metod (n=3)
Tyrimo rezultatus lygininat su Xin Yao ir kitų mokslininkų atliktu tyrimu su dviskiaučių ginkmedžių augaline žaliava pasitelkiant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą, galima teigti, kad spektrofotometrinio tyrimo metodu nustatytas mažesnis flavonoidų kiekis nei ESC metodu. Tiriant tokios pačios augalinės žaliavos mėginius, naudoti skirtingi metodai, gauti skirtingi rezultatai įrodo, kad įtakos rezultatams gali turėti ir metodo metu naudoti skirtingi reagentai. [56] 2012 metais atliktame tyrime siekiama palyginti skirtingo amžiaus bei lyties dviskiaučių ginkmedžių lapuose kaupiamų flavonoidų kiekį. Gauti rezultatai, kurie įvariuoja nuo 0.76% (augalo amžius 300metų) ir 3.01% (mot.lytis.) iki 6.47% (augalo amžius 1 metai) ir 3.59% (vyr.lytis), tai įrodo, jog flavonoidų kiekis priklauso nuo augalo amžiaus bei lyties. Taip pat šis tyrimas įrodo, kad labai didelę įtaką cheminės sudėties įvairavimui turi dviskiaučio ginkmedžio
5.09 0 1 2 3 4 5 6 Kauno miestas, botanikos sodas Kauno miestas, Rokai Klaipėdos miestas, botanikos sodas Utenos miestas, miesto apylinkės Šiaulių miestas, botanikos sodas Šilutės rajonas, švėkšnos parkas Flav o n o id ų kiek is R E m g/g Vietovė
augimo vieta. Palyginus šiuos rezulatatus su tyrime gautais rezulatatais, galima teigti, jog tokia pati tendencija vyrauja ir šiame tyrime. Kultūros paveldo departamento prie kultūros ministerijos [57] duomenimis Šilutės rajone, Švėkšnos parke augantis dviskiautis ginkmedis yra vienas seniausių šios rūšies atstovų visoje Lietuvoje, būtent iš šio augalo lapų ekstrakto buvo gauti mažiausi kiekiai flavonoidų, tai patvirtina prieš tai aprašytame tyrime įrodytą tendenciją, kad ginkmedžui senstant mažėja jo kaupiamų flavonoidų kiekis. Taip pat šiame tyrime gauti skirtingi flavonoidų kiekiai iš skirtingose vietovėse surinktų dviskiaučių ginkmedžių lapų, įrodo, kad dviskiaučių ginkmedžių augavietė turi įtakos sukauptam flavonoidų kiekiui. Svarbu pabrėžti, kad gautiems rezultatams taip pat įtakos galėjo turėti ir augalinės žaliavos surinkimo laikas.
5.6 Flavonoidų kiekio nustatymas dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose preparatuose,
spektrofotometriniu metodu
Pagal gautus flavonoidų kiekio rezultatus sudaryta diagrama. Didžiausias kiekis flavonoidų nustatytas Bilobil dviskiaučių ginkmedžių vaistiniame preparate, jis siekė 6.22 RE mg/g. Šiek tiek mažesni kiekiai gauti Ginkgo biloba Pharma Nord (5.18 RE mg/g) ir Tanakan (5.69 RE mg/g) vaistiniuose preparatuose. Mažiausi kiekiai gauti ištyrus Gingium (3.02 RE mg/g) ir Ginkobil (2.98 RE mg/g) vaistinius preparatus. Palyginus skirtingas flavonoidų koncentracijas esančias vaistiniuose preparatuose su dviskiaučių ginkmedžių ekstraktu, nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0.05) tarp Bilobil, Gingium ir Ginkobil preparatų. Bilobil flavonoidų kiekis yra 2 kartus didesnis nei flavonoidų kiekis nustatytas Gingium ar Ginkobil vaistiniuose preparatuose su dviskiaučių ginkmedžių ekstraktu. Rezultatai pateikti 10 paveiksle.
10 pav. Suminis flavonoidų įvairavimas (mg/g) dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose preparatuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą (n=3)
5.7 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH radikalų surišimo metodą
dviskiaučių ginkmedžių augalinėje žaliavoje
Antioksidacinis aktyvumas augalinėje žaliavoje priklauso ne tik nuo flavonoidų, bet taip pat gali priklausyti nuo antocianų [52], fenolinių rūgščių, lignanų, taninų, kumarinų, ksantų ir kitų veikliųjų medžiagų kiekio [53], todėl nedideli kiekiai dviskiaučių ginkmedžių lapų pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu.
Įvertinus antioksidacinį aktyvumą DPPH (radikalų surišmo) metodu, nustatyta, kad augalinės žaliavos ekstraktuose antioksidacinio aktyvumo reikšmės svyravo nuo 75.15 μmol TE/g iki 81.95 μmol TE/g. Ddidžiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas Kauno botanikos sode surinktuose dviskiaučių ginkmedžių lapuose (81.95 μmol TE/g), panašiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Klaipėdos botanikos sode (80.83 μmol TE/g) rinktų lapų ekstraktai. Tarpusavyje panašus antioksidacinis aktyvumas nustatyas Utenos rajone (80.66 μmol TE/g) bei Kauno rajone (80,37 μmol TE/g) surinktoje augalinėje žaliavoje. Mažiausiu antikoksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Šiaulių botanikos sode (78.07 μmol TE/g) ir Švekšnos parke (75,15 μmol TE/g) surinkti dviskiaučių ginkmedžių lapai. Statistiškai reikšmingų skirtumų (p<0.05) tarp augalinės žaliavos nenustatyta. Rezultatai pateikti 11 paveiksle.
6.22
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ginkgo biloba Pharma Nord Ginkobil Bilobil Tanakan Gingium Flavonoidų kiekis RE mg/g Vais ti n is p rep ar atas
11 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas dviskiaučių ginkmedžių augalinės žaliavos antioksidacinis aktyvumas (n=3)
5.8 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH radikalų surišimo metodą
dviskiaučių ginkmedžių vaistiniuose preparatuose
Atlikus antioksidacinio aktyvumo nustatymo tyrimą su dviskiaučių ginkmedžių vaistiniais preparatais buvo nustatyta, kad didžiausiu aktyvumu pasižymi Tanakan (86.11 μmol TE/g) vaistinis preparatas. Labai panašiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Bilobil (84.47 μmol TE/g) vaistinis preparatas. Mažesnis antioksidacinis aktyvumas nustatytas Ginkobil (82.67 μmol TE/g) ir Ginkgo biloba, Pharma Nord (81.13 μmol TE/g) vaistiniuose preparatuose. Mažiausias antioksidacinis aktyvumas nustatyas Gingium (78.11 μmol TE/g) vaistiniame preparate. Statistiškai reikšmingų skirtumų (p<0.05) tarp vaistinių preparatų su dviskiaučiu ginkmedžiu nenustatyta. Rezultatai pateikti 12 paveiksle.
L.Mensor bei kitų mokslininkų atliktame dviskiaučių ginkmedžių EGB 761 ekstrakto antioksidacinio aktyvumo tyrime, pasitelkiant spektrofotometrinį DPPH radikalų surišimo metodą, gauti rezultatai 81.4467 μmol TE/g [58] ir šiame tyrime gauti rezultatai, kurie įvairuoja nuo 78.11 μmol TE/g iki 86.11 μmol TE/g., rodo antioksidacinio aktyvumo panašumą dviskiaučių ginkmedžių sausajame lapų ekstrakte.
81.95 68 70 72 74 76 78 80 82 84 Kauno miestas, botanikos sodas Kauno miestas, Rokai Klaipėdos miestas, botanikos sodas Utenos miestas,
miesto apylinkės botanikos sodasŠiaulių miestas,
Šilutės rajonas, švėkšnos parkas A nt ioksi daci ni s akt y v um as μm o l T E /g Vietovė
12 pav. DPPH spektrofotometriniu metodu nustatytas dviskiaučių ginkmedžių vaistų antioksidacinis aktyvumas (n=3)
86.11
70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90
Ginkgo biloba Pharma Nord Ginkobil
Bilobil Tanakan Gingium
Antioksidacinis aktyvumas μmol TE/g
Vaisti n is p rep ar atas
6. IŠVADOS
1. Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augalinėje žaliavoje surinktoje Kauno botanikos sode (16.03 GRE mg/g), taip pat šiuose lapuose nustatyti didžiausi kiekiai flavonoidų (5.09 RE mg/g), labai panašus kiekis flavonoidų gautas augalinėje žaliavoje surinktoje Klaipėdos botanikos sode (5.02 RE mg/g). Atliekant dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) vaistinių preparatų tyrimą nustatyti didžiausi kiekiai fenolinių junginių Tanakan 40mg vaistiniame preparate (30.07 GRE mg/g), tačiau flavonoidų didžiausias kiekis gautas Bilobil 120mg (6.22 RE mg/g) vaistiniame preparate. Palyginus rezultatus buvo nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp vaistinių preparatų (p<0.05).
2. Atlikus dviskiaučių ginkmedžių augalinės žaliavos tyrimą pagal surinkimo vietą ir įvertinus gautus rezultatus, kurie tiriant fenolinius junginius įvairuoja nuo 16.03 GRE mg/g iki 8.99 GRE mg/g ribose, tiriant flavonoidus įvairuoja nuo 5.09 RE mg/g iki 2.30 RE mg/g ribose, galima teigti, kad vietovė, kurioje auga dviskiautis ginkmedis (Ginkgo biloba L.) turi įtakos jo lapuose kaupiamų fenolinių junginių, bei flavonoidų kiekiui. Palyginus rezultatus buvo gauti statistiškai reikšmingi skirtumai tarp Kauno botanikos sode ir Šilutėje rinktos augalinės žaliavos (p<0.05).
3. Norint gauti tokius fenolinių junginių kiekius iš dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augalinės žaliavos kokie buvo nustatyti vaistiniuose preparatuose su dviskiaučiu ginkmedžiu (Ginkgo biloba L.), priklausomai nuo lapų surinkimo vietovės jų reikėtų naudoti nuo 2 iki 4 didesnius kiekius už tyrimui pasirinktą kiekį.
4. Atlikas dviskiaučių ginkmedžių lapų (Ginkgo biloba L.) ir vaistinių preparatų antioksidacinio aktyvumo tyrimas. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas nustatytas Kauno botanikos sode (81.95 μmol TE/g) ir Klaipėdos botanikos sode (80.83 μmol TE/g) surinktoje augalinėje žaliavoje. Vaistiniuose preparatuose didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Tanakan 40mg (86.11 μmol TE/g) bei Bilobil (84.47 μmol TE/g) vaistiniai preparatai. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (p<0.05).
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktais spektrofotometriniais tyrimais ir gautais rezultatais galima teigti, jog dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) augalinę žaliavą geriausia rinkti Kauno botanikos sode ar Kauno rajone, taip pat Klaipėdos botanikos sode. Šiose vietovėse dviskiaučių ginkmedžių lapai yra sukaupę didžiausią kiekį fenolinių junginių, flavonoidų kiekį bei pasižymi didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu.
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Asif Mohammad. Chemistry and antioxidant activity of plants containing some phenolic compounds. (2015) 35-52
2. Cai Yizhong, Qiong Luo, Mei Sun, Harold Cork. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. 12 March 2004
3. Sati Riyanka, Anita Pandey. Influence of Age on Ginkgo Biloba Phytochemicals in Antimicrobial Activity Perspective. 57-65, 2016
4. JP Spencer.The impact of fruit flavonoids on memory and cognition. Br J Nutr. 2010 October [online]. From National Library of Medicine.
5. Ihl R. Effects of Ginkgo biloba extract EGb 761 in dementia with neuropsychiatric features: review of recently completed randomized, controlled trials. Psychiatry Clin Pract. 2013 November [online]. From National Library of Medicine
6. K. Kandola, Browman A, Birch-Machin AM. Oxidative stress – a key emerging impact factor in health, ageing, lifestyle and aesthetics. International Journal Cosmetic Science 2015;37(2):1-8 7. Watson J. Oxidants, antioxidants and the current incurability of metastatic cancers. Open biology
2013;3:1-9
8. Jaskovikienė V. Ginkgo Biloba istorija ir chemija. Farmacija ir laikas [interaktyvus], 2005 gegužė.
Prieiga per internetą
<http://www.emedicina.lt/site/files/farmacija_ir_laikas/2005_05/ginkgo_biloba.pdf>.
9. Veit Martin Dörken. Morphology, anatomy and vasculature in leaves of Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae, Ginkgoales) under functional and evolutionary aspects. 13 October 2014
10. Siess M.H., Le Bon A.M., Canivenc-Lavier M.C., Suschetet M.: Mechanisms involved in the chemoprevention of flavonoids. 2000; 12(1-4):193-199.
11. Nakanishi Koji. Terpene trilactones from Gingko biloba: From ancient times to the 21st century. 28 June 2005
12. Klimko Małgorzata, Stanisława Korszun, Joanna Bykowska Poznań. COMPARATIVE MORPHOLOGY AND ANATOMY OF THE LEAVES OF Ginkgo biloba L. CULTIVARS.2015, 169-189
13. Chahar MK, Sharma N, Dobhal MP, Joshi YC. Flavonoids: A versatile source of anticancer drugs. 2011 Jan;5(9):1-12.
14. Nobelio premijos, prieiga per internetą https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1990/press.html
15. Jaskovikienė V. Ginkgo Biloba istorija ir chemija. Farmacija ir laikas [interaktyvus]. Prieiga per internetą <http://www.emedicina.lt/site/files/farmacija_ir_laikas/2005_05/ginkgo_biloba.pdf>. (49) 16. Valdimaras Janulis, Genė Puodžiukienė, Faustas Malinauskas. Fitocheminė analizė. Kaunas, 2008. 17. Friedli G.L. Flavonoids [interaktyvus] Prieiga per internetą
<http://www.friedli.com/herbs/phytochem/flavonoids.html>.
18. Shashank K, Abhay KP. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview. Iš The Scientific World Journal [Interaktyvus] 2013 Prieiga per internetą <http://www.hindawi.com/journals/tswj/2013/162750/>.
19. Cushnie T.P.T, Lamb A.J. Antimicrobial activity of flavonoids. Iš International Journal of Antimicrobial Agents [Interaktyvus] Prieiga per internetą <http://www.idpublications.com/journals/PDFs/IJAA/ANTAGE_MostCited_1.pdf>.
20. Wei Zuo, Feng Yan, Bo Zhang, Jiantao Li1, Dan Mei. Advances in the Studies of Ginkgo Biloba Leaves Extract on Aging-Related Diseases. 2017, 812-826.
21. Rossi, Rossana & Basilico, Fabrizio & De Palma, Antonella & Mauri, Pierluigi. Analytical Methods for Characterizing Bioactive Terpene Lactones in Ginkgo Biloba Extracts and Performing Pharmacokinetic Studies in Animal and Human. Biomed. Eng. Trend Res. Technol. 2011 10.5772/13068.
22. Fukuda I1, Ito A, Hirai G, Nishimura S, Kawasaki H, Saitoh H, Kimura K, Sodeoka M, Yoshida M. Ginkgolic acid inhibits protein SUMOylation by blocking formation of the E1-SUMO intermediate. 2009 Feb 27; 133-40.
23. Baron-Ruppert G, Luepke NP. Evidence for toxic effects of alkylphenols from Ginkgo biloba in the hen's egg test (HET). 2001 Mar;8(2):133-8.
24. Martin BK. Potential interaction of Ginkgo biloba leaf with antiplatelet or anticoagulant drugs: What is the evidence? mnf-journal 2008:764-771.
25. Ren W, Qiao Z, Wang H, et a. al. Flavonoids: promising anticancer agents.(2003) Med Res Rev 23, 519–534
26. Chahar MK, Sharma N, Dobhal MP, Joshi YC. Flavonoids: A versatile source of anticancer drugs. 2011 Jan;5(9):1-12.
27. Hui C., Qi X., Qianyong Z., Xiaoli P., Jundong Z., Mantian M.: Flavonoids, flavonoid subclasses and brest cancer risk: a meta-analysis of epidemiologic studies. 2013
28. Dong H., Lin W., Jing W., Taosheng C.: Flavonoids activate pregnane x receptor-mediated CYP3A4 gene expression by inhibiting cyclin-dependent kinases in HepG2 liver carcinoma cells. 2010; 11:23. 29. Tan, B.-J., Liu, Y., Chang, K.-L., Lim, B.K. and Chiu, G.N. (2012) Perorally Active Nanomicellar Formulation of Quercetin in the Treatment of Lung Cancer. International Journal of Nanomedicine, 7, 651-661.
30. Wang Y, Wang R, Wang Y, Peng R, Wu Y, Yuan Y. Ginkgo biloba extract mitigates liver fibrosis and apoptosis by regulating p38 MAPK, NF-κB/IκBα, and Bcl-2/Bax signaling 2015;9:6303-6317. 31. Comalada M, Camuesco D, Sierra S, et al. In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down-regulation of the NF-κB pathway. 2015 35, 584–592.
32. Hui C., Qi X., Qianyong Z., Xiaoli P., Jundong Z., Mantian M.: Flavonoids, flavonoid subclasses and brest cancer risk: a meta-analysis of epidemiologic studies. 2013
33. Cutler G.J., Nettleton J.A., Ross J.A., Harnack L.J., Jacobs D.R., Scrafford C.G., Barraj L.M., Mink P.J., Robien K.: Dietary flavonoid intake and risk of cancer in postmenopausal women: The Iowa Women’s Health Study. Int J Cancer 2008; 123(3):664-671.
34. Perumalla S, Nayeem N. Research Article Determination of Total phenolic acids , condensed tannins and flavonoids in the leaves of Caesalpinia pulcherrima ( Linn .). 2012 16–9.
35. Mir SA, Bhat AS, Ahangar AA. A simplified 2 , 4-dinitrophenylhydrazine assay for Flavonoids and its comparison with a Standard flavonoid assay. 2014;6(2):751–8.
36. González M, Guzmán B, Rudyk R, Romano E, Molina MAA. Spectrophotometric Determination of Phenolic Compounds in Propolis. Lat Am J Pharm 2003; 22(3):243-8
37. Kähkönen MP,. Hopia AI, Vuorela HJ, Rauha JP, Pihlaja K, Kujala TS et al. Antioxidant Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds. J Agric Food Chem. 1999 Oct; 47(10):3954-62 38. Pękal A, Pyrzynska K. Evaluation of Aluminium Complexation Reaction for Flavonoid Content
Assay. Food Anal Methods. 2014; 7:1776–82
39. Stratil P, Kubáň V, Fojtová J. Comparison of the Phenolic Content and Total Antioxidant Activity in Wines as Determined by Spectrophotometric Methods. Czech J Food Sci. 2008; 26(4):242–53 40. Andrzej L. Dawidowicz, Dorota Wianowska, Małgorzata Olszowy. On practical problems in
estimation of antioxidant activity of compounds by DPPH method (Problems in estimation of antioxidant activity). Food Chemistry 2012;131: 1037–43
41. Shadkami F, Estevez S, Helleur R. Analysis of catechins and condensed tannins by thermally assisted hydrolysis/methylation-GC/MS and by a novel two step methylation. J Anal Appl Pyrolysis. 2009;85(1–2):54–65.
42. Brunetti C, Ferdinando MD, Fini A., Pollastri S, Tattini M. Flavonoids as Antioxidants and Developmental Regulators: Relative Significance in Plants and Humans Int J Mol Sci 2013;14:3450-3555
43. Zadernowski R, Czaplicki S, Naczk M. Phenolic acid profiles of mangosteen fruits (Garcinia mangostana). Food Chem. 2009;112(3):685–9.
44. De Rijke E, Out P, Niessen WMA, Ariese F, Gooijer C, Brinkman UAT. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A 2006; 1112: 31–63.
45. Zhu H, Wang Y, Liu Y, Xia Y, Tang T. Analysis of Flavonoids in Portulaca oleracea L. by UV–Vis Spectrophotometry with Comparative Study on Different Extraction Technologies. Food Analytical Methods 2010; 3: 90–97.
46. Kumar V, Lemos M, Sharma M, Shriram V. Antioxidant and DNA damage protecting activities of Eulophia nuda Lindl. Free Radicals and Antioxidants.2013;3:55-60
47. Kandola K, Browman A, Birch-Machin AM. Oxidative stress – a key emerging impact factor in health, ageing, lifestyle and aesthetics. International Journal Cosmetic Science 2015;37(2):1-8 48. Gill SS, Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in
crop plants. Plant Physiology and Biochemistry 2010; 48:909-930
49. Rahal A, Kumar A, Singh V, Yadav B, Tiwari R, Chakraborty S, Dhama K. Oxidative Stress, Prooxidants, and Antioxidants: The Interplay. BioMed Research Int 2014;1-19
50. Etsuo N. Assessment of Antioxidant Capacity in vitro and in vivo. 2010;10:503-515.
51. Apak R, Guclu K, Ozyurek M, Celik SE. Mechanism of antioxidant capacity assays and the CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity) assay. 2008;160:413-419
52. Biskup I, Golonka I, Gamian A, Sroka Z. Antioxidant activity of selected phenols estimated by ABTS and FRAP methods. Postepy Hig Med Dosw 2013;67:958-963
53. Monica Locatelli, Roberto Gindro, Fabiano Travaglia, Jean-Daniel Coïsson, Maurizio Rinaldi, Marco Arlorio. Study of the DPPH-scavenging activity: Development of a free software for the correct interpretation of data. Food Chemistry 2009;114: 889-97.
54. Stjepan Milardovic, Damir Ivekovic, Bozidar S. Grabaric. A novel amperometric method for antioxidant activity determination using DPPH free radical. Bioelectrochemistry 2006;68: 175–80. 55. European Pharmacopoeia 8.0 Volume 1. Strasbourg: Council of Europe; 2014.
56. Xin Yao, Erxin Shang, Guisheng Zhou, Yuping Tang, Sheng Guo, Shulan Su, Chun Jin, Dawei Qian,Yong Qin, ir Jin-Ao Duan. Comparative Characterization of Total Flavonol Glycosides and Terpene Lactones at Different Ages, from Different Cultivation Sources and Genders of Ginkgo biloba Leaves. 2012; 13(8): 10305–10315.
57. Kultūros paveldo departamento prie kultūros ministerijos prieiga per internetą http://www.kpd.lt/ 58. Mensor Luciana L. , Fabio S. Menezes , Gilda G. Leita , Alexandre S. Reis, Tereza C. dos Santos,
Cintia S. Coube and Suzana G. Leita. Screening of Brazilian Plant Extracts for Antioxidant Activity by the Use of DPPH Free Radical Method15, 127–130 (2001)
59. Teixeira J, Gaspar A, Garrido EM, Garrido J, Borges F. Hydroxycinnamic acid antioxidants. Biomed Res Int (2013)
9. PRIEDAI
Pav.2 GBE poveikis sukeltai kepenų fibrozei, kaip rodo hematoksilino ir eozino dažymas.
Pav.3 Rutino kalibracinė kreivė bendram flavonoidų kiekiui nustatyti.
