MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA
SIMONA ŠUŠTAUSKAITĖ
DARŢINIO DAŠIO (SATUREJA HORTENSIS L.) BIOLOGIŠKAI
VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ DINAMIKA VEGETACIJOS METU
LIETUVOJE
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovai:
doc. dr. Zita Barsteigienė, prof. dr. Ona Ragaţinskienė, prof. habil. dr. Audrius Maruška
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
VYTAUTO DIDŢIOJO UNIVERSITETAS GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
BIOCHEMIJOS IR BIOTECHNOLOGIJŲ KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
DARŢINIO DAŠIO (SATUREJA HORTENSIS L.) BIOLOGIŠKAI
VEIKLIŲJŲ JUNGINIŲ DINAMIKA VEGETACIJOS METU
LIETUVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovai:
doc. dr. Zita Barsteigienė prof. dr. Ona Ragaţinskienė prof. habil. dr. Audrius Maruška
Darbą atliko:
Magistrantė Simona Šuštauskaitė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
1.1.Darţinio dašio (Satureja hortensis L.) sistematika, nomenklatūra ir morfologiniai poţymiai ... 12
1.2. Satureja hortensis L. kilmė, paplitimas ir auginimo sąlygos ... 13
1.3. Satureja hortensis L. biologiškai aktyvūs junginiai ... 14
1.4. Satureja hortensis L. ţaliava, jos ruošimas ir laikymas, augaliniai preparatai ... 14
1.5. Satureja hortensis L. farmakologinės savybės ... 15
1.6. Satureja hortensis L. kitos panaudojimo sritys ... 17
1.7. Eterinių aliejų apţvalga ... 17
1.8. Fenolinių junginių apţvalga ... 19
1.9. Antioksidantinis poveikis ir jo nustatymo metodai ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.2. Naudoti reagentai ... 23
2.3. Metanolinių ekstraktų ruošimo metodika ... 24
2.4. Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu ... 24
2.5. Spektrofotometriniai metodai ... 25
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 25
2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas ... 26
2.5.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 27
2.6.Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija metodas ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Eterinio aliejaus komponentų identifikavimas ... 30
3.2. Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 34
3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai ... 35
4. IŠVADOS ... 39
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41
7. MAGISTRO DARBO TEMA SKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 46
SANTRAUKA
S. Šuštauskaitės magistro baigiamasis darbas/ moksliniai vadovai: doc. dr. Zita Barsteigienė, prof. dr. Ona Ragaţinskienė, prof. habil. dr. Audrius Maruška; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Vytauto Didţiojo universiteto, Gamtos mokslų fakulteto, Biochemijos ir biotechnologijų katedra – Kaunas.
Darţinis dašis (Satureja hortensis L.) – vienametis ţolinis augalas priklausantis Lamiaceae Lindl. šeimai. Vaistinė augalinė ţaliava yra antţeminė augalo dalis – dašių ţolė (Herba Satureae). Pagrindiniai biologiškai aktyvūs junginiai augalinėje ţaliavoje yra fenoliniai junginiai, flavonoidai ir eterinis aliejus. Dėl kaupiamų medţiagų, S. hortensis L. pasiţymi antimikrobiniu, antispazminiu, antidiarėjiniu, hipoglikeminiu ir antihipercholestereminiu poveikiu. Paţymėtina, kad didelės fenolinių junginių koncentracijos vaistinėje augalinėje ţaliavoje pasiţymi antioksidantiniu poveikiu.
Darbo tikslas buvo įvertinti darţinio dašio (Satureja hortensis L.) antţeminės dalies vaistinės augalinės ţaliavos cheminę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą skirtingais vegetacijos tarpsniais introdukcijos metu Lietuvoje. Uţdaviniai: atlikti S. hortensis L. eterinio aliejaus kokybinį ir kiekybinį nustatymą dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu; įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį ir DPPH radikalų surišimo galią spektrofotometriniu metodu bei palyginti šių reikšmių pasiskirstymą skirtingomis augalo vegetacijos fazėmis rinktoje ţaliavoje; nustatyti atskirų fenolinių rūgščių ir flavonoidų įtaką bendram ekstraktų antioksidantiniam aktyvumui, panaudojant efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija metodą.
Rezultatai: Satureja hortensis L. eterinio aliejaus pagrindinis komponentas yra karvakrolis. Kiti identifikuoti junginiai: γ-terpineno, β-mirceno, p-cimeno ir β-kariofileno. Didţiausiu eterinio aliejaus kiekiu pasiţymėjo masinio ţydėjimo (Ţ2) fazės metu rinkta ţaliava. Bendras fenolinių junginių kiekis skirtingomis vegetacijos fazėmis rinktoje ţaliavoje svyruoja nuo 36,72 RE mg/g iki 46,01 RE mg/g, bendras flavonoidų kiekis nuo 9,74 RE mg/g iki 12,82 RE mg/g, o antioksidantinis aktyvumas nuo 36,93 RE mg/g iki 47,49 RE mg/g. Antiradikalinis aktyvumas yra statistiškai priklausomas nuo bendro fenolinių junginių kiekio (r2
= 0,798) ir bendro flavonoidų kiekio (r2 = 0,894). S. hortensis L. ţaliavoje identifikuoti fenoliniai junginiai: trans-sinapo r., trans-p-kumaro r., hesperetinas, rutinas ir rozmarino r. Vyraujantys Satureja hortensis L. metanolinių ekstraktų komponentai yra rutinas ir rozmarino r., didţiausias individualus antiradikalinis aktyvumas pastebimas masinio ţydėjimo (Ţ2) fazėje (26,16 RE mg/g), kurį lemia rozmarino r.
SUMMARY
Summer savory (Satureja hortensis L.) – annual herbaceous plant from Lamiaceae Lindl. family. Medicinal plant raw material are aerial parts of the plant – Savory herb (Herba Saturejae). The main biologically active substances in raw material are phenols, flavonoids and essential oil. Due these substances S. hortensis L. have antimicrobial, antispasmodic, antidiarrhoeal, hypoglycemic and antihypercholesteremic properties. Additionally, high content of phenolic compounds in the raw material establishes antioxidant activity.
The aim of this study was to evaluate chemical composition and antioxidant activity of Summer savory (Satureja hortensis L.) raw material during vegetation period in Lithuania. Tasks: to perform qualitative and quantitative essential oil determination of S. hortensis L. by method of gas chromatography-mass spectrometry method; to estimate the total phenolic compounds, total flavonoid content and DPPH radical scavenging activity using spectrophotometric analysis method and to compare the distribution of these values in raw material, collected at different vegetation phases of the plant; to determine impact of the individual phenolic acids and flavonoids on the antioxidant activity of S. hortensis L. extracts, by method high performance liquid chromatography combined with post-column DPPH reaction detection method.
The results: the main compound of Satureja hortensis L. essential oil is carvacrol. Others identified components are γ-terpinene, β-myrcene, p-cymene and β-cariophyllene. The highest concentracions of essential oil was observed in the raw material collected at massive flowering (Ţ2) phase. The total phenolic compounds were determinated from 36,72 RE mg/g to 46,01 RE mg/g, total flavonoids from 9,74 RE mg/g to 12,82 RE mg/g and antiradical activity from 36,93 RE mg/g to 47,49 RE mg/g in the raw material collected in different vegetation phases. Antiradical activity is statistically dependent on the total phenolics (r2 = 0,798) and total flavonoids (r2 = 0,894). Identified phenolic compounds of S. hortensis L. raw material: trans-sinapic ac., trans-p-cumaric ac., hesperetin, rutin and rozmarinic acid The main phenolic compounds of Satureja hortensis L. methanolic extracts are rutin and rozmarinic acid, the highest individual antiradical activity is observed in massive flowering phase (26,16 RE mg/g), wich is possesed by rosmarinic acid.
PADĖKA
Dėkoju darbo vadovams doc. dr. Zitai Barsteigienei, prof. dr. Onai Ragaţinskienei, prof. habil. dr. Audriui Maruškai uţ suteiktas ţinias ir naudingas konsultacijas.
Dėkoju Vytauto Didţiojo Universiteto, Gamtos mokslų fakulteto, Biochemijos ir biotechnologijų katedros doktorantams Mantui Stankevičiui, Tomui Drevinskui ir Gintarei Naujokaitytei uţ pagalbą bei patarimus organizuojant mokslinius tyrimus bei analizuojant rezultatus.
SANTRUMPOS
A, B, Ţ1, Ţ2, Ţ3 augalo vegetacijos fazės: intensyvus augimas, butonizacija, ţydėjimo pradţia, masinis ţydėjimas, ţydėjimo pabaiga
ABTS 2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgštis
BAJ biologiškai aktyvūs junginiai
CUPRAC (angl. cupric reducing antioxidant capacity) vario jonų redukcijos antioksidantinė galia
DC–MS dujų chromatografija–masių spektrometrija
DNR deoksiribonukleorūgštis
DPPH 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas
DVB/PDMS divinilbenzenas/polidimetilsiloksanas
ESC efektyvioji skysčių chromatografija
ESC-DPPH efektyvioji skysčių chromatografija su 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalo
reakcijos detektoriumi
FRAP (angl. ferric reducing antioxidant power) geleţies jonų redukcijos antioksidantinė galia
HAT (angl. hydrogen atom transfer) vandenilio atomo perdavimas
JAV Jungtinės Amerikos Valstijos
n imtis
ORAC (angl. oxygen radical absorbance capacity) deguonies radikalų absorbcijos galia
r2 Pirsono korealiacijos koeficientas
R2 regresijos koeficientas
RE rutino ekvivalentas
RNS (angl. reactive nitrogen species) reaktyviosios azoto formos
ROS (angl. reactive oxygen species) reaktyviosios deguonies formos
SET (angl. single electron transfer) elektronų perdavimas
SN standartinis nuokrypis
SSN santykinis standartinis nuokrypis
UV ultravioletinės šviesos spinduliuotė VAŢ vaistinė augalinė ţaliava
ĮVADAS
Pagal pasaulinę augalų apsaugos strategiją ir priimtus biologinės įvairovės konvencijos nuostatus sprendţiamos vaistinių, prieskoninių (aromatinių) augalų rūšių įvairovės, gausinimo bei ţmogaus sveikatos stiprinimo problemos [10, 25]. Pasaulinės sveikatos organizacijos 2002 – 2005 m. strategijoje vaistiniai augalai ir jų produktai priskirti klasikinei medicinai [62]. Augalinės kilmės vaistiniai preparatai yra pranašesni uţ sintetinius vaistus, nes jie turi platesnį farmakologinį poveikį ir sukelia maţiau šalutinių reakcijų.
Šiuolaikinės medicinos progresas skatina didesnį augalinių vaistinių preparatų vartojimą pasaulyje, todėl reikalingi gausesni vaistinių augalų resursai. Vaistinė augalinė ţaliava ruošiama: augalus auginant pramoninėse plantacijose – 3,3 %, augalus auginant bei renkant iš natūralių augaviečių – 22,3 % ir tik natūraliose augavietėse – 40,5 % [34]. Lietuvoje natūraliai auga apie 1400 aukštesniųjų augalų rūšių. Tradicinėje ir liaudies medicinoje naudojamos 462 spontaninės, adventyvinės bei introdukuotos induočių augalų rūšys [1].
Šio darbo objektas – darţinis dašis (Satureja hortensis L.) – vaistinis (aromatinis), maistinis, dekoratyvinis, vienametis, ţolinis notrelinių (Lamiaceae Lindl.) šeimos augalas. Šis vaistinis augalas plačiausiai ištyrinėtas Irane, taip pat JAV, Kroatijoje, Turkijoje, Rumunijoje, Gruzijoje, Lenkijoje ir Serbijoje [16, 17, 36, 45]. Lietuvoje darţinis dašis kultivuojamas nuo 1962 metų [5]. Dėl kaupiamų biologiškai aktyviųjų junginių S. hortensis L. pasiţymi antimikrobiniu, antioksidantiniu, antiuţdegiminiu, antispazminiu, antidiarėjiniu, hipoglikeminiu ir antihipercholestereminiu poveikiais [28, 45].
Farmakoterapinį panaudojimą Satureja hortensis L. ţaliavoje daugiausiai sąlygoja eterinis aliejus, flavonoidai, ir fenoliniai junginiai. Biologiškai aktyvių junginių analizė, atliekama moderniais dujų chromatografijos-masių spektrometrijos, spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais, leidţia įvertinti vaistinės augalinės ţaliavos kokybę bei palyginti kaip šie BAJ pasiskirsto skirtingomis vegetacijos fazėmis surinktoje ţaliavoje. Tyrimų metu gauti rezultatai gali būti naudingi sprendţiant kuriuo vegetacijos periodu tikslingiausia rinkti S. hortensis L. vaistinę augalinę ţaliavą.
Darbo naujumas – pirmą kartą nustatyti ir palyginti Lietuvoje introdukuojamo darţinio dašio
(Satureja hortensis L.) eterinio aliejaus komponentai, fenoliniai junginiai ir antioksidantinis aktyvumas skirtingomis vegetacijos fazėmis rinktoje ţaliavoje.
Darbo tikslas – įvertinti darţinio dašio (Satureja hortensis L.) antţeminės dalies vaistinės
augalinės ţaliavos cheminę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą skirtingais vegetacijos tarpsniais introdukcijos metu Lietuvoje.
Tyrimų rezultatai pristatyti 5-iose vietinėse ir tarptautinėse konferencijose Lietuvoje bei uţsienyje (4, 5, 6, 7, 9 priedai). 5-ojoje Tarptautinėje farmacijos mokslų konferencijoje pristatytas ţodinis pranešimas buvo įvertintas II-ąja vieta (8 priedas).
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti darţinio dašio (Satureja hortensis L.) antţeminės dalies vaistinės
augalinės ţaliavos cheminę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą skirtingais vegetacijos tarpsniais introdukcijos metu Lietuvoje.
Darbo uţdaviniai:
1. Atlikti S. hortensis L. eterinio aliejaus kokybinį ir kiekybinį nustatymą dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu.
2. Įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį ir DPPH radikalų surišimo galią spektrofotometriniu metodu bei palyginti šių reikšmių pasiskirstymą skirtingomis augalo vegetacijos fazėmis rinktoje ţaliavoje.
3. Nustatyti atskirų fenolinių rūgščių ir flavonoidų įtaką bendram ekstraktų antioksidantiniam aktyvumui, panaudojant efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija metodą.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Darţinio dašio (Satureja hortensis L.) sistematika, nomenklatūra ir
morfologiniai poţymiai
1 pav. Darţinis dašis (Satureja hortensis L.), Vytauto Didţiojo universiteto Kauno Botanikos sodas, 2014 m.
Darţinis dašis (Satureja hortensis L.) (1 pav.) yra vienametis notrelinių (Lamiaceae Lindl.) šeimos, notreliečių (Lamiales) eilės, notreliaţiedţių (Lamiidae Takht. Ex Reveal) poklasio,
magnolijainių (Magnoliopsida Bronan.) klasės, magnolijūnų (Magnoliophyta Cronquist, Takht. Et W. Zimm. Ex. Reveal) skyriaus augalas. Mokslinėje literatūroje ankščiau vadintas Calamintha hortensis Hort. Kiti sinonimai: „asilų pipirai”, „česnakiniai pipirai”, „Šv. Juliaus ţolė”, „pikantiški sodai” [61].
Darţinis dašis uţauga iki 20–45 cm aukščio, turi smarkiai šakotą tiesų stiebą padengtą
trumpais, ţemyn nulinkusiais plaukeliais. Lapai trumpakočiai, neblizgantys, linijiškai lancetiški, 10–30 mm ilgio, 2–5 mm pločio, smailiomis viršūnėmis, lygiakraščiai, šiek tiek plaukuoti, liaukingi. Ţiedai smulkūs, balsvi, švelniai violetiniai ar rausvi, susitelkę į netikrus menturius lapų paţastyse. Ţydi liepos –rugsėjo mėnesiais, vaisius subrandina rugpjūtį–spalį. Vaisius – tribriaunis, apie 1,5 mm ilgio, pilkai ţalias riešutėlis. Darţinis dašis turi stiprų, aštriai malonų, čiobrelį primenantį aromatą, yra šiek tiek aštraus skonio [56].
1.2. Satureja hortensis L. kilmė, paplitimas ir auginimo sąlygos
Naujausiais duomenimis Lamiaceae Lindl. šeimai priklauso apie 7000 rūšių aromatinių augalų, kurių pagrindinė kaupiamų medţiagų grupė yra eteriniai aliejai [48]. Dėl turtingos cheminės sudėties, iš notrelinių šeimos atstovų ţaliavos gaminamos tinktūros, ekstraktai ir kiti vaistiniai augaliniai preparatai, kurie šimtus metų naudojami medicinoje įvairiems susirgimams gydyti. Lamiaceae Lindl. šeimai priklauso ir Satureja L. gentis, kurią sudaro daugiau nei 30 rūšių augalų plačiai paplitusių visame pasaulyje. Tai vienmečiai ar daugiamečiai ţoliniai augalai ar puskrūmiai daţniausiai auginami maisto pramonei.
2 pav. Satureja hortensis L. paplitimas [61]
Darţinis dašis (Satureja hortensis L.) kilęs iš Artimųjų Rytų šalių ir Vidurţemio jūros baseinų pakrantės. Į Centrinę Europą dašis buvo atveţtas apie 9 a. Savaime auga Vidurţemio ir Juodosios jūros regionuose, Azijoje, Kanarų salose bei Šiaurės Amerikoje (2 pav.) [45]. Priklauso holarktinei florai. Lietuvoje savaime neauga, introdukuojamos dvi Satureja L. genties rūšys: darţinis dašis ir kalninis dašis (Satureja montana L.).
Darţiniui dašiui auginti tinka atvira saulėta vieta, lengvas ir vidutinio sunkumo derlingas, vandeniui gerai pralaidus dirvoţemis. Toleruoja rūgštų, neutralų, bazinį ir stipriai bazinį dirvoţemio pH, sausras. Dauginamas sėklomis, sėjant jas į nuolatinę augimo vietą balandţio – geguţės mėnesiais.
1.3. Satureja hortensis L. biologiškai aktyvūs junginiai
Eterinis aliejus. Iš orasausės ţaliavos išskirto eterinio aliejaus išeiga svyruoja nuo 1,28% iki 4,7 %. Kultivuojamų dašių pagrindinę eterinio aliejaus dalį sudaro karvakrolis (42-63 %), o savaime augančiuose dominuoja timolis (29-43 %). Augalas taip pat kaupia didelius kiekius kitų terpenoidų: γ-terpineno ir p-cimeno, maţesnius α-γ-terpineno, o-cimeno, β-kariofileno, β-bisaboleno, α ir β-citralio, mirceno, α-tujeno, α ir β-pineno ir linalolio [16, 17, 28, 31, 40, 43, 50].
Flavonoidai. Augalinėje ţaliavoje nustatyta 6,2 % flavonoidų. Randama laisvų aglikonų: flavonų liuteolino ir apigenio, flavanolių katechino ir epikatechino, flavonolis kemferolis bei maţesni kiekiai flavanono naringenino. Pagrindinę glikozidų mišinio dalį sudaro rutinas (= kvercetino-3-O-rutinozidas), taip pat nustatytas flavanonas hesperetinas ir jo glikozidas hesperidinas, flavonų glikozidai: apigenio-7-glikozidas luteolinas, cinarozidas (= glikozidas), luteolino-7-rutinozidas ir kiti luteolino dariniai [8, 12, 20, 36, 44].
Fenolinės rūgštys. Orasausėje darţinio dašio ţaliavoje daugiausiai randama hidroksicinamono rūgščių: rozmarino, kavos ir ferulo. Didţiausią dalį sudaro rozmarino rūgštis, kurios nustatoma 0,25-2,14 %. Išskiriamos ir kitos fenolinės rūgštys: p-kumaro bei chlorogeno [20, 36, 44, 54].
Dašių ţolėje nustatyta: 201,1 mg/dl amino rūgščių (prolinas, tirozinas, apsarto rūgštis, treoninas+alaninas, glutamo rūgštis, valinas, fenilalaninas, lizinas, serinas, glicinas, izoleucinas, argininas, metioninas, leucinas, histidinas, cisteinas) taninai, steroliai, gleivės, dervos, rauginės medţiagos, pirokatecholiai, 0,05 % askorbo rūgšties ir mikroelementai: 5,32 % kalio, pėdsakai Na, Si, Fe, Cu, Mn, Ni, Pb, Zn, Cr ir Al [36, 45, 59].
1.4. Satureja hortensis L. ţaliava, jos ruošimas ir laikymas, augaliniai preparatai
Vaistinė augalinė ţaliava – dašių ţolė (Herba Satureae) (3 pav.), ruošiama ţydėjimo metu (liepą). Ţaliavą sudaro natūraliai augančio ar kultivuojamo vienmečio ţolinio augalo 15- 20 cm ilgio stiebų viršūnės su lapais ir ţiedais ar butonais, stiebų dalys, vaisiai, nutrupėjusių lapų ir ţiedų mišinys. Stiebai ir jų dalys rudos ar ţalsvos spalvos, smarkiai šakoti. Lapai neblizgantys, smailiaviršūniai, linijiškai lancetiški, 10–30 mm ilgio, spirališkai susiraitę, lygiakraščiai, negausiai plaukuoti. Balti ar rausvi smulkūs ţiedai susitelkę lapų paţastyse ar atsiskyrę nuo ţaliavos. Vaisiai – tribriauniai riešutėliai – tamsiai rudi, smulkūs (apie 0,1 cm skersmens), daţniausiai nutrupėję nuo stiebų viršūnių. Gerai išdţiovinta ţaliava yra ţalios spalvos, stipraus pikantiško kvapo, aštraus skonio [27].
3 pav. Satureja hortensis L. VAŢ – dašių ţolė (Herba Satureae)
Ţaliavos ruošimas ir laikymas. Renkamos 15-20 cm ţydinčios viršūnės su ţiedais ir lapais. Antţeminė dalis, nupjauta ţydėjimo metu, dţiaunama plonu sluoksniu, dţiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, nuo saulės apsaugotoje vietoje arba specialioje dţiovykloje 30-35 oC temperatūroje.
Paruošta ţaliava pakuojama į medţiaginius arba daugiasluoksnius maišus, maţi kiekiai – į sandariai uţdarytus stiklinius indus. Laikoma sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje. Tinka vartoti 1 metus [3, 29].
Kemertelidze ir kt., 2009 atliko tyrimus, kuriais remiantis buvo sukurtas preparatas – saturinas (sausas ekstraktas ir gerai susmulkinti Satureja hortensis L. lapai santykiu 2:1 kapsulėse). Saturino pagrindinės sudedamosios medţiagos yra flavonoidai ir fenilpropanoidai, daugiausia luteolino glikozidai ir rozmarino rūgštis. Šis maisto papildas ţenkliai sumaţina gliukozės kiekį kraujyje. Saturinas gali būti naudojamas lengvo ar vidutinio sunkumo nuo insulino nepriklausomo (II tipo) cukrinio diabeto metu, atskirai ar kartu su antidiabetiniais vaistais [35].
1.5. Satureja hortensis L. farmakologinės savybės
Darţinis dašis (Satureja hortensis L.) – gydymui nuo seno naudojamas vaistinis augalas. Dėl turtingos ir įvairios cheminės sudėties vaistinė augalinė ţaliava – dašių ţolė naudojama farmacijos, maisto ir kosmetikos pramonėje, tradicinėje liaudies medicinoje, parfumerijoje [3, 7, 47].
Atliktais moksliniais eksperimentiniais tyrimais nustatytas ir įrodytas dašių preparatų antimikrobinis, antivirusinis, antigrybelinis, antiuţdegiminis, antidiarėjinis, antispazminis, atsikosėjimą gerinantis ir apetitą ţadinantis veikimas [28, 45].
Plačiausiai išnagrinėtas darţinio dašio antimikrobinis aktyvumas, kuris gali būti panaudojamas gydant įvairias infekcines ligas: stomatitą, rinosinusitą [53, 58]. Augalo preparatai taip pat perspektyvūs metabolinių sutrikimų gydyme, nes geba reguliuoti cholesterolio ir gliukozės kiekį [36, 42]. Farmakognostinėmis savybėmis remiasi liaudies medicinos rekomendacijos vartoti dašį esant virškinimo sutrikimams, apetito gerinimui, skrandţio, ţarnyno, kepenų ligoms gydyti, peršalimo metu
kaip atsikosėjimą gerinanti, šlapimo išsiskyrimą ir prakaitavimą skatinanti priemonė. Jo eterinis aliejus bei ekstraktai slopina uţdegiminius procesus, turi išreikštą antioksidantinį, antivirusinį, antigrybelinį, antidiarėjinį, antispazminį poveikį [3].
Priešuţdegiminis ir antioksidantinis poveikis. Šį poveikį apsprendţia rozmarino rūgštis ir kiti fenoliniai junginiai (karvakrolis, γ-terpinenas, p-cimenas) [4, 31, 45, 46, 53, 55]. I. Chkhikvishvili ir kt. (2013 m.) atliktame tyrime nustatyta, kad etanolinis S. hortensis L. ekstraktas (1g ţaliavos 5 ml etanolio) ir iš dalies išgryninta rozmarino rūgšties frakcija skatina interleukinų IL-2 ir IL-10 sintezę Jurkat ląstelėse (ţmogaus leukeminės T-ląstelės-limfoblastaoidai). Vandeninis S. hortensis L. ekstraktas apsaugo Jurkat ląsteles nuo oksidacinio streso sukelto vandenilio peroksidu ir beveik visiškai eliminuoja radikalus. Panašus antioksidantinis poveikis nustatytas limfocitams išskirtiems iš sveikų ţiurkių kraujo. Etanolinis ekstraktas (2,5 mg/ml) inhibuoja DNR paţeidimus, o eterinis aliejus – chromosomų paţeidimus sukeltus H2O2 [20].
Antimikrobinis poveikis. Dėl aukštos karvakrolio ir timolio koncentracijos eterinis aliejus pasiţymi plataus spektro antimikrobinėmis savybėmis prieš Gram (+) ir Gram (-) bakterijas bei kai kuriuos patogeninius grybus. Šie fenoliniai junginiai paţeidţia membranų vientisumą pakeisdami pH ir neorganinių jonų pusiausvyrą. P-cimenas neturi tokio poveikio, tačiau didina karvakrolio ir timolio antimikrobinį aktyvumą. Eterinis dašių aliejus veikia: Bacillus subtilis, Bacillus cerius, Enterococcus
fecalis, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteridis, Salmonela typhimurium, Streptococcus pyogenes, Aspergillus niger, Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Candida albicans ir Candida glabrata [11, 14, 40, 43, 45, 53, 55].
Antidiabetinis poveikis. Vandeninis ir etanolinis ekstraktai pasiţymi hipoglikeminiu poveikiu, tačiau vandeninio ekstrakto aktyvumas labiau išreikštas. Pagrindinės preparatų biologiškai veikliosios medţiagos yra flavonoidai ir fenilpropanoidai (daugiausia luteolino glikozidai ir rozmarino rūgštis) [36, 42, 45]. E. Kemetelidze ir kt. (2009 m.) atliko eksperimentą, kurio metu sveikose ţiurkėse panaudotas vandeninis ekstraktas po 3 valandų 9,5% sumaţino gliukozės kiekį. Po 7 ir 21 dienų kasdienės terapijos gliukozės kiekis sumaţėjo 18,2 % ir 20,4 %, atitinkamai. Rezultatai parodė, kad hipoglikeminis poveikis ryškesnis uţ antidiabetinio vaisto arfazetino, prolonguotas ekstrakto naudojimas patikimai stabilizuoja gliukozės kiekį kraujyje. Remiantis šiais tyrimais, sukurtas hipoglikeminis preparatas – saturinas [35].
Antispazminis ir antidiarėjinis poveikis. Darţinis dašis naudojamas liaudies medicinoje skrandţio ir virškinimo sutrikimams gydyti [45]. Hajhashemi ir kt. (2000 m.) atlikti S. hortensis L. eterinio aliejaus antispazminio aktyvumo tyrimai in vitro ţiurkės klubinei ţarnai parodė atpalaiduojantį poveikį. Eterinis aliejus inhibavo ţarnos susitraukimus, sukeltus KCl ir acetilcholino, jo efektyvumas panašus į diciklomino. Augalo eterinis aliejus (dozė – 0,1 ml/100 g) inhibuoja ricinos sukeltą diarėją
pelėms. S. hortensis L. eterinis aliejus gali turėti klinikinį pranašumą gydant virškinamojo trakto sutrikimus, tokius kaip kolitas [30].
Antihipercholestereminis poveikis. Jį apsprendţia flavonoidas epikatechinas [19, 42, 45]. D. Mchedlishvili ir kt. (2005 m.) atliko eksperimentą, kurio metu, triušių maitinamų pašaru su padidintu cholesterolio kiekiu bei flavonoidų frakcija ištirpinta distiliuotame vandenyje, tyrimai parodė ţymiai maţesnius cholesterolio kiekio serume rezultatus lyginant su kita triušių grupe, maitinamų tik cholesterolio sočiu pašaru. Šiuo tyrimu nustatyta, kad flavonoidų frakcijos cholesterolio kiekį maţinantį efektą lemia didėjanti cholesterolio koncentracija kraujo serume [42].
1.6. Satureja hortensis L. kitos panaudojimo sritys
Augalas maistinis. Darţinis dašis pasiţymi maistą dezinfekuojančiomis savybėmis. Dašis turi stiprų saldų, aštrų aromatą ir, panašų į čiobrelio, švelniai pipirinį skonį. Kulinarijoje naudojami tiek švieţi, tiek dţiovinti darţinio dašio lapai ir stiebai. Tai klasikinis prieskonis ankštinių darţovių patiekalams – pupelių, ţirnių, sriuboms, troškiniams. Taip pat tinka gaminant mėsos bei darţovių valgius, dešras, dedama į ţuvies patiekalus, marinuotus agurkus, pomidorus, nealkoholinius gėrimus [3, 37].
Augalas dekoratyvinis. Auginamas ţeldiniuose, darţeliuose, soduose, kolekcijose, būna ţemaūgių, iki 20 cm aukščio, ir aukštaūgių – iki 45 cm. Ţydi baltais arba rausvais ţiedais.
1.7. Eterinių aliejų apţvalga
Eteriniai aliejai – natūralūs, kompleksinės sudėties, maţos molekulinės masės, lakių organinių medţiagų mišiniai. Iš daugiau nei 2000 rūšių augalų išgaunami apie 3000 eterinių aliejų, iš kurių 300 yra svarbūs pramonėje [49]. Jie, kaip antriniai metabolitai, gaminami aromatinių augalų ir atlieka svarbų vaidmenį dėl savo antibakterinio, antivirusinio, antigrybelinio ir insekticidinio poveikio [39].
Klasifikacija. Eterinių aliejų komponentai terpenai, klasifikuojami pagal struktūroje esančių izopreno molekulių skaičių: 1 izopreno molekulė – pusiauterpenai, 2 – monoterpenai, 3 – seskviterpenai, 4 – diterpenai, 6 – triterpenai, 8 – tetraterpenai, 100-5000 – politerpenai. Pagal cheminę sandarą eteriniai aliejai gali būti priskiriami alifatiniams ar cikliniams, daugiausia nesotiems angliavandeniliams, alkoholiams, aldehidams, ketonams, rūgštims, esteriams ir eteriams. Eterinių aliejų cheminė sudėtis priklauso nuo augalų genetinio varieto, maistinių medţiagų pasisavinimo, trąšų
naudojimo, geografinės padėties, klimatinių sąlygų, metų laiko, streso vegetacijos metu, augalinės vaistinės ţaliavos nuėmimo, dţiovinimo ir laikymo [49].
Eteriniai aliejai pasiţymi antibakteriniu, antigrybeliniu, antivėţiniu, antimutageniniu, antidiabetiniu, antivirusiniu, antiuţdegiminiu, antispazminiu poveikiu. Taip pat veikia nervų sistemą raminančiai, stiprina imunitetą, skystina sekretą, todėl gerina atsikosėjimą, veikia diuretiškai ir choleretiškai, gerina virškinimą. Nuo seno eteriniai aliejai naudojami medicinoje įvairioms sveikatos problemoms spręsti. Susidomėjimas eterinių aliejų panaudojimo galimybėmis auga, todėl sparčiai plėtojama fitocheminė analizė siekiant identifikuoti ir charakterizuoti eterinius aliejus [49].
Eteriniai aliejai atskiriami nuo vandeninės fazės fizikiniais procesais, kurie turi maţai įtakos lakių junginių sudėčiai ir struktūrai. Naudojami eterinių aliejų ekstrakcijos metodai: distiliacija vandens garais, pagreitinta ekstrakcija tirpikliais, šalto spaudimo ekstrakcija, superkritinių skysčių ekstrakcija ir kietafazė mikroekstrakcija. Klaikinis eterinių aliejų ekstrakcijos metodas – distiliacija vandens garais [22]. Tai paprastas, nebrangus ir netoksiškas metodas, tačiau analitiniams tikslams nėra efektyvus, nes ekstrakcija ilgai trunka, reikalingi dideli augalinės ţaliavos kiekiai, dėl aukštos temperatūros vandenyje ištirpsta dalis lakių komponentų, gali įvykti cheminiai jų pokyčiai [28].
Itin perspektyvus eterinių aliejų ekstrakcijos metodas naudojamas pramoninėje ir mokslinėje analizėje yra kietafazė mikroekstrakcija. Tai greitas, nesudėtingas ir labai atrankus bandinių paruošimo metodas. Šiame darbe aprašytuose tyrimuose buvo naudojama KFME sistema, pavaizduota 4 pav., ją sudaro: kvarco strypelis padengtas sorbentu sluoksniu, stūmoklis, tuščiavidurė adata ir sistemos korpusas.
4 pav. KFME sistemos schema [8]
Eterinių aliejų cheminiam įvertinimui taikomi metodai: dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, masių spektrometrija, branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopija.
Svarbiausias metodas – dujų chromatografija, kuri gali būti naudojama derinyje su kelių tipų detektoriais. Liepsnos jonizacijos detektoriaus pagalba galima atlikti eterinių aliejų kiekybinį įvertinimą. Atominės emisijos detektorius naudojamas kartu su dujų chromatografu geba identifikuoti junginius pagal atskirus jų atomus, pvz.: anglies, vandenilio, deguonies, azoto ar halogenų. Ši sistema naudinga, kai reikia nusakyti ne tik angliavandenilinių junginių kokybę. Elektronų gaudyklės ir masių spektrometriniai detektoriai tinkami eterinių aliejų sudėties kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui. Šiuo metu plačiausiai taikomas DC-MS metodas, kadangi palyginti su kitomis sistemomis, jis yra nebrangus ir pakankamai efektyvus. Be to DC-MS analizės rezultatus galima lyginti su kompiuterine masės spektrų duomenų baze [32, 41].
1.8. Fenolinių junginių apţvalga
Fenoliniai junginiai yra vieni iš labiausiai gamtoje paplitusių antrinių metabolitų [18]. Augalus fenoliniai junginiai apsaugo nuo UV radiacijos, infekcijos, nepalankių klimatinių sąlygų, mechaninių paţaidų. Fenoliniai junginiai sudaro įvairią junginių klasę, kurios pagrinde yra fenolis C6H5OH [13]. Ţinoma daugiau nei 8 tūkst. fenolinių junginių [52]. Fenoliniai junginiai gali būti
klasifikuojami pagal kilmę, biologinę funkciją (savybėmis), tačiau daţniausiai jie skirstomi pagal cheminę struktūrą į 8 grupes: fenolines rūgštis, flavonoidus, kumarinus, ksantonus, stilbenus, chinonus, chromonus ir ligninus [51,52]. Svarbiausi fenolinių junginių atstovai randami augaluose yra fenolinės rūgštys ir flavonoidai. Šios junginių grupės pasiţymi antioksidantiniu, priešuţdegiminiu, antivėţiniu, hipoglikeminiu, antihipercholesterminiu poveikiais.
Fenolinės rūgštys pagal struktūros pagrindą skirstomos į hidroksibenzenkarboksirūgštis ir hidroksicinamono rūgštis. Hidroksibenzenkarboksirūgšties dariniams būdinga C6-C1 struktūra, o
skirtingi pakaitai 1,2,3 padėtyse lemia rūgščių variaciją. Šioms rūgštims priklauso galo, egalo, protokatechino, vanilino, siringo, salicilo, gentizo rūgštys. Hidroksicinamono rūgštys turi C6-C3
fragmentą, jų derivatams priskiriamos chlorogeno, kavos, ferulo, sinapo, ferulo, p-kumaro, rozmarino rūgštys [51]. Chlorogeno ir rozmarino rūgštys yra kavos rūgšties esteriai. Yra įrodyta, kad rozmarino rūgštis yra pošeimio Nepetoideae, kuriam priklauso Satureja L. genties rūšys, fitocheminis biomarkeris [48].
Flavonoidai (lot. flavus – geltonas) – didţiausia augaluose randama fenolinių junginių grupė. Flavonoidai turi maţą molekulinę masę, pasiţymi silpnomis rūgštinėmis savybėmis. Jų struktūros pagrindą sudaro du aromatiniai ţiedai A ir B sujungti heterocikliniu C ţiedu, turinčiu deguonies atomą (5 pav.).
5 pav. Bendra flavonoidų molekulinė struktūrinė formulė
Daugelio augalų spalva priklauso nuo flavonoidų, pvz.: antocianidinai lemia augalo geltoną, oranţinę, raudoną spalvas. Augaluose flavonoidai daţniausiai sutinkami glikozidų pavidalu, tačiau pasitaiko ir aglikonų bei metilintų darinių.
Flavonoidai pagal skirtingas heterociklinio C ţiedo moduliacijas skirstomi į pagrindines klases:
flavonoliai – kemferolis, kvercetinas, miricetinas, galanginas, fisetinas, kvercetino glikozidai – rutinas, hiperozidas, kvercitrinas;
flavonai – apigeninas, liuteolinas, chrizinas, diosminas;
flavanonai – naringeninas, eriodiktiolis, hesperetinas, pastarojo glikozidas – hesperidinas; flavanoliai (katechinai) – katechinas, epikatechinas, epigalokatechinas, epikatechino galatas,
epigalokatechino galatas;
izoflavonoidai – genisteinas, daidzeinas, glyciteinas, formononetinas; flavanonoliai – aromadendrinas, taksifolinas;
antocianidinai – cianidinas, pelargonidinas, delfinidinas, peonidinas, malvidinas [15, 23]. Klasikinis fenolinių junginių atskyrimo metodas yra plonasluoksnė chromatografija (PC), ankščiau buvo naudojama ir popieriaus elektroforezė bei poliamidinė sluoksnio chromatografija, tačiau šiuos metodus išstūmė pranašesni fenolių analizės būdai. Dabar fenolinių junginių kiekybiniam ir kokybiniam įvertinimui plačiausiai taikoma efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), taip pat dujų chromatografija, micelinė – elektrokinetinė chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, spektrofotometriniai metodai.
Spektrofotometrinės analizės pagalba galima kiekybiškai įvertinti fenolinius junginius, atskirti flavonoidų grupę ir įvertinti bendrą jų kiekį. Spektrofotometriniai metodai pagrįsti absorbcija ir taikoma kai yra maksimalios sugerties reikšmės, paprastų fenolių sugerties maksimumas svyruoja tarp 220 – 320 nm, tačiau absorbciją taip pat įtakoja naudojamas tirpiklis bei pH reikšmės. Toks sugerties maksimumas yra UV zonoje, kurią sugeria ne tik fenoliniai junginiai, bet ir baltymai, amino- bei nukleorūgštys. Dėl šios prieţasties fenolinių junginių nustatymui augalinėje ţaliavoje taikomi
kolorimetriniai Folin-Ciocalteu ir Folin-Denis metodai. Šie metodai pagrįsti augalinėje ţaliavoje esančių fenolių ir volframo fosforo rūgščių (Folin-Ciocalteu reagento) ar molibdeno (Folin-Denis reagento) komplekso susidarymu esant šarminei aplinkai, kurios sugerties maksimumas 760 nm [57].
Fenolinius junginius atskirti, identifikuoti ir nustatyti jų kiekį vienos operacijos metu galima ESC sujungiant su ultravioletinės spinduliuotės, masių spektrometriniu ar branduolių magnetinio rezonanso detektoriumi [13]. Daţniausiai fenoliniams junginiams įvertinti naudojamos atvirkščių fazių C18 kolonėlės, kurios ypatingai tinkamos skirtingų fenolių atskyrimui vienos analizės metu. ESC
analizė gali būti vykdoma tiek izokratinėmis, tiek gradientinėmis sąlygomis. Pastarosios sukuriamos panaudojant laipsnišką judrios fazės eliuavimą, kas leidţia atskirti skirtingos struktūros ir poliškumo junginius. Naudojamos mobiliosios sistemos: metanolio-vandens, acetonitrilo-vandens. Skiriamosios gebos pagerinimui tirpikliai parūgštinami acto, skruzdţių, fosforo ar trifluoracto rūgštimis. Fenolinių junginių detekcija ESC metodu daţniausiai atliekama apjungiant jį su UV detektoriais, kadangi ţinoma, jog fenoliai gerai absorbuoja UV zonoje [6, 57].
1.9. Antioksidantinis poveikis ir jo nustatymo metodai
Oksidacinio streso būklė, t.y. pernelyg didelis laisvųjų radikalų kiekis organizme, gali susidaryti suaktyvėjus jų gamybai dėl streso, jonizuojančios radiacijos poveikio, išplitusio uţdegimo, senėjimo, išsekus antioksidantiniam mechanizmui, t.y. gynybai, ir stokojant vitaminų (C, E, A) ir mikroelementų (Se, Cu, Mg, Zn), patologinių procesų ir ligų metu. Laisvieji radikalai – tai toksinai arba nestabilios molekulės, kurios paţeidţia ląsteles ir DNR. Oksidacinis stresas, aktyvių deguonies formų bei laisvųjų radikalų poveikis sukelia ląstelės metabolizmo pokyčius, susijusius su DNR bei baltymų paţeidimu, lipidų peroksidacija. Šie procesai sukelia uţdegiminius procesus, kurie gali sąlygoti įvairias patologijas, tokias kaip vėţinius susirgimus, neurodegeneracines, širdies ir kraujagyslių ligas [24].
Antioksidantai – junginiai, sulaikantys arba pristabdantys oksidacijos reakcijų plitimą ląstelėje. Pagal šaltinius antioksidantai yra skirstomi natūralius ir sintetinius. Natūraliems antioksidantams priskiriami fenoliniai junginiai (α-tokoferolis, flavonoidai, iš jų – antocianai, fenolinės rūgštys), askorbo rūgštis, karotenoidai ir kt. Plačiausiai paplitę sintetiniai antioksidantai yra alkilinti fenoliniai junginiai (pvz.: butilhidrotoluenas, propilgalatas), jie kai kuriose šalyse naudojami maisto pramonėje, tačiau susirūpinimą kelia galimas kancerogeninis poveikis. Dėl šios prieţasties didėja susidomėjimas saugiais antioksidantais iš natūralių šaltinių [26].
Antioksidantai savo struktūroje turi H-donorinę grupę, kuri prisijungia prie aktyviosios deguonies formų ir nutraukia naujų radikalų susidarymo ciklą.
Taikomi įvairūs antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai, pagrįsti skirtingais veikimo mechanizmais. Šiais metodais tiriami augaliniai antioksidantai konkuruojančios ar nekonkuruojančios reakcijos principu [6]. Antioksidantai įvairiais veikimo mechanizmais geba neutralizuoti ţalingas reaktyvias deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formas. Antioksidantai ROS/RNS radikalus ir neradikalus inaktyvuoja dviem pagrindiniais mechanizmais: vandenilio atomo perdavimo (HAT, angl. hydrogen
atom transfer) ir elektronų perdavimo (SET, angl. single electron transfer) reakcijomis. Galutinis
rezultatas vienodas (neutralizuotas prooksidantas), tačiau skiriasi reakcijos kinetika ir potencialios šalutinės reakcijos [6, 33].
Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti plačiai taikomas HAT reakcijomis pagrįstas metodas deguonies radikalų absorbcijos galia (ORAC, angl. oxygen radical absorbance capacity). DPPH radikalų surišimo įvertinimas, geleţies (FRAP), vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymas yra populiarūs elektronų perdavimu pagrįsti antioksidantinio aktyvumo tyrimo metodai. TEAC - trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. – trolox equivalent antioxidant capacity), dar kitaip vadinamas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu taip pat pagrįstas SET tipo reakcijomis [6, 21, 33].
Augalinės kilmės antioksidantų preparatai vieni perspektyviausių šių dienų farmacijos pramonėje. Pripaţįstamas jų teigiamas poveikis širdies ir kraujagyslių, nervų, endokrininei ir virškinimo sistemai. Antioksidantai slopina senėjimo procesus, neurodegeneracines ligas, uţdegimus, vėţinius susirgimus. Daugėjant ţmogaus organizmą veikiančių neigiamų išorinių ir vidinių faktorių, siekiama surasti naujų antioksidantų šaltinių ir pritaikyti juos medicinoje. Satureja hortensis L. kaupia didţiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasiţyminčias junginių grupes: fenolinius junginius ir eterinius aliejus. Tyrimais įrodytas antioksidantinis-antimikrobinis S. hortensis L. eterinio aliejaus [55] ir antioksidantinis metanolinių bei vandeninių ekstraktų poveikis leidţia teigti, kad šis vaistinis aromatinis augalas perspektyvus ateities tyrimams.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Darţinio dašio (Satureja hortensis L.) antţeminė dalis rinkta 5 skirtingų vegetacijų metu Vytauto Didţiojo universiteto Kauno Botanikos sode (koordinatės ţemėlapyje: 54.870453, 23.908354) 2014 metais.
Augalo vegetacijos fazės, surinkimo datos: 1. Intensyvus augimas 2014-06-25 2. Butonizacija 2014-07-21
3. Ţydėjimo pradţia 2014-07-24 4. Masinis ţydėjimas 2014-07-28 5. Ţydėjimo pabaiga 2014-08-20
Nupjauta antţeminė augalo dalis buvo dţiovinama paskleista plonu sluoksniu gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdţiovinta augalinė ţaliava buvo laikoma medţiaginiuose maišuose, ne aukštesnėje kaip 25oC temperatūroje, sausoje, gerai vėdinamoje
patalpoje. Tyrimams naudota orasausė ţaliava.
2.2. Naudoti reagentai
1. Acetonitrilas (99,9 %, Roth, Vokietija) 2. Acto rūgštis (99,8 %, Lachner, Čekija)
3. Aliuminio chloridas (≥98 %, bevandenis, Roth, Vokietija) 4. Bidistiliuotas vanduo (vandens gryninimo sistema Watek, JAV)
5. DPPH reagentas (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, Vokietija) 6. Folin-Ciocalteu reagentas (Merck, Vokietija)
7. Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija) 8. Metanolis (≥99,9 %, Sigma-Aldrich, Vokietija)
9. Natrio acetato trihidratas (≥99,9 %, Chempur, Lenkija) 10. Natrio karbonatas (bevandenis, Chempur, Lenkija) 11. Trifluoracto rūgštis (>99 %, Merck, Vokietija)
Medţiagos standartams:
1. Hesperetinas (≥99 %, Sigma-Aldrich, Vokietija) 2. Rutinas (≥95 %, Sigma-Aldrich, Vokietija)
3. Rozmarino rūgštis (≥95 %, Sigma-Aldrich, Vokietija) 4. Trans-p-kumaro rūgštis (≥99 %, Sigma-Aldrich, Vokietija) 5. Trans-sinapo rūgštis (≥99 %, Sigma-Aldrich, Vokietija)
2.3. Metanolinių ekstraktų ruošimo metodika
6 pav. a – nefiltruoti Satureja hortensis L. metanoliniai ekstraktai; b – Satureja hortensis L. metanolinių ekstraktų filtravimas
Ekstraktams paruošti buvo naudojamas 99,9 % metanolis, bidistiliuotas vanduo, svarstyklės „Sartorius” (Basic, Vokietija), 80 g/cm3
tankio filtravimo popierius (Reachem Slovakija s.r.o., Slovakia), orbitalinė purtyklė VWR Mini Shaker (J&M Scientific, JAV). Vaistinė augalinė ţaliava gerai susmulkinama elektriniu smulkintuvu. Ekstraktai ruošiami 0,001 g tikslumu pasveriant 0,5 g orasausės susmulkintos darţinio dašio antţeminės dalies (ţolės). Svėriniai buvo dedami į 25 ml talpos stiklinius uţsukamus buteliukus ir uţpilami 20 ml 75 % metanoliu. Ekstrakcija vykdoma ruošinius purtant orbitalinėje purtyklėje 24 valandas 190 k/min greičiu. Po ekstrakcijos, mėginiai filtruojami (6 pav.).
2.4. Eterinio aliejaus analizė dujų chromatografijos-masių spektrometrijos metodu
Eterinio aliejaus komponentai nustatyti GCMS-QP2010 dujų chromatografu-masių spektrometru (Shimadzu, Japonija). Naudotas automatinis injektorius AOC-5000 (Shimadzu,
Japonija), kietafazės mikroekstrakcijos švirkštas su Stableflex pluošteliu, padengtu 50/30 µm DVB/PDMS sluoksniu (Supelco, JAV), elektronų jonizacijos detektorius prie 70 eV, kolonėlė RTX– 5MS (Restek, JAV), kurios ilgis 30 m, nejudančios fazės storis 0,25 µm, vidinis skersmuo 0,25 mm.
Eterinio aliejaus kietafazė mikroekstrakcija atlikta iš viršerdvės. Ekstrakcijai buvo atsverti 0,025 g masės vaistinės augalinės ţaliavos mėginiai, kurie patalpinama į stiklinį ekstrakcinį buteliuką su praduriamu kamščiu. Analizės metu kietafazės mikroekstrakcijos švirkštas praduria dangtelį ir į mėginio viršerdvę išstumiamas strypelis padengtas sorbentu. Eterinio aliejaus išsiskyrimui bandiniai laikomi 30oC temperatūroje 10 min. Įvykus absorbcijai strypelis įtraukiamas atgal į tuščiavidurę adatą. Automatinės KFME sistemos tiesiogiai sujungtos su chromatografu, pagalba sorbente uţfiksuotos analitės perkeliamos į chromatografo garintuvą, kur vykdoma terminė desorbcija 280 oC temperatūroje
1 min.
DC-MS metodo sąlygos: pradinė kolonėlės temperatūra 60oC, injektoriaus temperatūra 240
oC, jonų srauto temperatūra 260oC, sąsajos temperatūra 260o
C. Injekcija atliekama split metodu 1:10. Temperatūra keliama palaipsniui: nuo 60o
C iki 150oC 5oC/min, nuo 150oC iki 280oC 20oC/min ir palaikoma 3 min. Bendras vieno bandinio analizės laikas 30,5 min [8, 9].
2.5. Spektrofotometriniai metodai
Bendras fenolinių junginių kiekis, bendras flavonoidų kiekis, laisvųjų radikalų surišimo geba nustatyti spektrofotometru Milton Roy Spectronic 1201 (JAV). Naudotos 1 cm skersmens kvarcinės kiuvetės. Visi rezultatai buvo apskaičiuoti pagal rutino ekvivalentą.
2.5.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas naudojant kolorimetrinį Folin-Ciocalteu metodą. Duomenys įvertinti gautą absorbcijos koeficiento dydį palyginus su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 100 µl paruoštos vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto, 3000 µl 20% natrio karbonato tirpalo ir 100 µl Folin-Ciocalteu reagento. Uţkimštas mėgintuvėlis du kartus apverčiamas, kad medţiagos susimaišytų. Laikoma 30 min. kambario temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 760 nm bangos ilgio. Buvo atlikti 3 pakartojimai (n=3). Jei absorbcija didesnė nei etaloninių rutino tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai skiedţiami 75% metanoliu.
Palyginamasis tirpalas ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 100 µl 75% metanolio, 3000 µl 20% natrio karbonato tirpalo ir 100 µl Folin-Ciocalteu reagento. Sumaišoma ir po 30 min. matuojama absorbcija prie 760 nm bangos ilgio. Atlikti 3 pakartojimai (n=3).
Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami etaloninio rutino tirpalo tiriamieji ir palyginamasis tirpalai, tačiau vietoje 100 µl paruoštos VAŢ ekstrakto, pilama 5-7 ţinomų koncentracijų (0,01–1,0 mg/ml) rutino tirpalai. Pradinės koncentracijos rutino tirpalas ruošiamas 25 mg g rutino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml 75% metanolio [8].
Rutino kalibracinis grafikas pateiktas 7 paveiksle.
7 pav. Rutino kalibracinis grafikas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui
2.5.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas
Bendras flavonoidų kiekis nustatomas kolorimetriniu AlCl3 metodu. Duomenys įvertinti gautą
absorbcijos koeficiento dydį palyginus su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu.
Reagento tirpalas ruošiamas iš 60 ml metanolio (99,9%), 3 ml acto rūgšties (33%), 12 ml heksametilentetramino (5%), 9 ml aliuminio chlorido (10%) ir 60 ml bidistiliuoto vandens. Pagamintas reagentas laikomas 2oC temperatūroje. Bandinys ruošiamas į mėgintuvėlį įpilant 1920 µl paruošto reagento ir 80 µl VAŢ ekstrakto, sumaišoma du kartus apverčiant mėgintuvėlį ir laikoma 30 min. 2oC temperatūroje. Po to matuojama absorbcija prie 407 nm bangos ilgio. Buvo atlikti 3 pakartojimai (n=3). Jei absorbcija didesnė nei etaloninių rutino tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai skiedţiami 75% metanoliu.
Palyginamajam bandiniui vietoje VAŢ ekstrakto naudojama 80 µl metanolio (75 %), įpilama 1920 µl paruošto reagento, sumaišoma ir laikoma 30 min. 2oC temperatūroje. Absorbcija matuojama
prie 407 nm bangos ilgio. Atlikti 3 pakartojimai (n=3).
y = 1,303x R² = 0,996 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Absor bc ij os dy dis Rutino konc. mg/ml
Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami skirtingų koncentracijų (0,01–1,0 mg/ml) rutino tiriamieji ir palyginamasis tirpalai. Pradinės koncentracijos rutino tirpalas ruošiamas 25 mg rutino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml 75% metanolio. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5-7 skirtingų ţinomų rutino tirpalo koncentracijų [8].
Rutino kalibracinis grafikas flavonoidų kiekio nustatymui pateiktas 8 paveiksle.
8 pav. Rutino kalibracinis grafikas bendro flavonoidų kiekio nustatymui
2.5.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas
Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas fotometriniu DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil hidrato) radikalų surišimo metodu. Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti matuojama kiek stabilaus DPPH radikalo neutralizavo VAŢ ekstrakte esantys aktyvieji junginiai.
Paruošiamas 5,5 pH 100 mM buferinis tirpalas (1,36 g natrio acetato ištirpinama 100 ml bidistiliuoto vandens, lašinama 33% acto rūgštis, kol pasiekiamas 5,5 pH). DPPH tirpalas paruošiamas 4 mg DPPH radikalų ištirpinant 50 ml acetonitrilo, pridedant 50 ml metanolio ir 100 ml paruošto acetatinio buferio. Tada matuojama absorbcija prie 515 nm bangos ilgio ir privedama prie 0,500 naudojant buferio:acetonitrilo:metanolio (1:1,25:1,25) tirpalą. Pagamintas tirpalas laikomas tamsoje.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas iš 77 µl VAŢ ekstrakto ir 3000 µl DPPH tirpalo. Sumaišoma du kartus apverčiant mėgintuvėlį ir laikoma tamsoje 15 min. kambario temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 515 nm bangos ilgio. Nukalibravimui naudojamas 75% metanolis. Atlikti 3 pakartojimai (n=3). Jei absorbcija didesnė nei etaloninių rutino tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai skiedţiami 75% metanoliu.
y = 0,879x R² = 0,984 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Absor bc ij os dy dis Rutino konc. mg/ml
Palyginamasis tirpalas ruošiamas vietoje VAŢ ekstrakto į 3000 µl DPPH tirpalo pilant 77 µl 75% metanolio, sumaišoma ir laikoma tamsoje 15 min. kambario temperatūroje. Absorbcija matuojama prie 515 nm bangos ilgio. Buvo atlikti 3 pakartojimai (n=3).
DPPH radikalų surišimo absorbcija apskaičiuojama iš palyginamojo tirpalo absorbcijos dydţio atėmus vaistinės augalinės ţaliavos ekstrakto absorbcijos dydį.
Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami skirtingų koncentracijų (0,05–0,25 mg/ml) rutino tiriamieji ir palyginamasis tirpalai. Pradinės koncentracijos rutino tirpalas ruošiamas 25 mg rutino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml 75% metanolio. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5-7 skirtingų ţinomų rutino tirpalo koncentracijų (9 pav.). [8, 9].
9 pav. Rutino kalibracinis grafikas antioksidantiniam aktyvumui nustatyti
2.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakcijos
detekcija metodas
Fenolinių junginių identifikavimas ir jų DPPH radikalų surišimo gebos nustatymas atlikti moduline ESC sistema, sudaryta iš judrios fazės (A ir B), siurblio, autoinjektoriaus, kolonėlės (125x4,60 mm, LiChrospher 100 RP-18e, dalelių skersmuo 5 μm (Merck, Vokietija)), UV detektoriaus λ= 254 nm, DPPH reagento siurblio, DPPH reakcijos detektoriaus λ=517 nm ir duomenų registravimo sistemos.
Naudoti eliuentai: A – bidistiliuotas vanduo parūgštintas trifluoracto rūgštimi (0,05%), B – metanolis. Gradientinės sąlygos nurodytos 1 lentelėje.
y = 1,447x R² = 0,994 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 Absor bc ij os dy dis Rutino konc. mg/ml
1 lentelė. ESC gradientinės sąlygos t. min A% B% 0 99 1 4 70 30 20 57 43 30 50 50 40 1 99 45 1 99 48 99 1 58 99 1
DPPH reagento ruošimo metodika tokia pati, kaip pateikta 2.5.3. Tėkmės greitis: 0,75 ml/min, injekcija 10 µl.
Gauti duomenys įvertinti pagal identifikuotų junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtis (2 lent.), nustatyta fenolinių junginių kiekybinė sudėtis Satureja hortensis L. metanoliniuose ekstraktuose. Kalibraciniam grafikui sudaryti buvo naudoti skirtingų koncentracijų (0,015-1 mg/ml) tirpalai. Antioksidantinis aktyvumas įvertintas pagal rutino DPPH radikalų surišimo reakcijos kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį.
2 lentelė. Satureja hortensis L. identifikuotų junginių standartų kalibracinių grafikų tiesinės regresijos lygtys ir regresijos koeficientai
Junginio pavadinimas Kalibracinio grafiko
tiesinės regresijos lygtis Regresijos koeficientas R2
trans-sinapo r. y = 4344x + 67,34 R² = 0,996
trans-p-kumaro r. y = 10364x + 358,5 R² = 0,992
Hesperetinas y = 7885x + 13,77 R² = 0,998
Rutinas y = 4366x + 26,44 R² = 0,999
Rutinas (DPPH radikalų surišimo geba) y = 3568,x - 96,10 R² = 0,997
Rozmarino r. y = 4366x + 26,44 R² = 0,999
2.7. Tyrimų duomenų statistinis vertinimas
Eksperimentų duomenys buvo apdoroti „MS Exel 2003” (Microsoft, JAV) ir „Origin 8.0” (JAV) programinėmis įrangomis. Visi eksperimentai buvo kartoti 3 kartus ir išreikšti matematiniais vidurkiais ± standartinis nuokrypis (SN). Apskaičiuotas duomenų santykinis standartinis nuokrypis (SSN). Koreliacijos ryšio stiprumui nusakyti pasirinktas Pirsono koreliacijos koeficientas (r2). Šio
koeficiento reikšmė apibūdina ryšio stiprumą tarp dviejų tiriamų dydţių, kuo ši reikšmė artimesnė 1, tuo stipresnis ryšys, ir kuo artimesnė 0, tuo silpnesnis ryšys, pvz. 0,2-0,5 reikšmė yra laikoma silpna, o 0,7-1 yra laikoma stipria.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Eterinio aliejaus komponentų identifikavimas
Atlikus darţinio dašio (Satureja hortensis L.) 2014 metų ţaliavos ekstrakciją KFME metodu ir dujų chromatografijos-masių spektrometrijos analizę buvo nustatyti eterinį aliejų sudarantys komponentai (10 pav.).
Laikas (min.)
10 pav. Satureja hortensis L. antţeminės dalies chromatograma. 1-20 – identifikuoti eterinio aliejaus komponentai (pavadinimai ir sulaikymo laikai pateikti 3 lent.)
Kokybinė analizė atlikta ir eterinio aliejaus komponentai identifikuoti pagal sulaikymo indeksą ir masių spektrą. 3 lentelėje pateikti augalinėje antţeminės dalies ţaliavoje (dašių ţolėje) nustatyti eterinio aliejaus komponentai, jų sulaikymo trukmės, koncentracijų svyravimai mėginiuose bei sulaikymo indeksai.
Eteriniame aliejuje daugiausia nustatyta monociklinių monoterpenų: β-mircenas, α-felandrenas, p-cimenas, limonenas, γ-terpinenas, 4-terpineolis, α-terpineolis, timokvinonas, timolis, karvakrolis. Rasti maţesni kiekiai biciklinių monoterpenų (α-tujenas, α-pinenas, 3-karenas, trans-sabineno hidratas, borneolis) ir seksviterpenų (β-kariofilenas, β-bisabolenas). Satureja hortensis L. eteriniame aliejuje taip pat aptikti nedideli kiekiai aciklinio monoterpeno linalolio, karvakrolio darinio karvakrilacetato ir propenilfenolio estragolio.
S
ignalo int
ensyvum
3 lentelė. Satureja hortensis L. antţeminės dalies eterinio aliejaus sudėtis
Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo
trukmė Koncentracija (% ± SN) Sulaikymo indeksas 1. α-tujenas 5,80 0,40 ± 0,19 905 2. α-pinenas 5,99 0,19 ± 0,07 910 3. β-mircenas 7,50 0,82 ± 0,54 949 4. α-felandrenas 7,90 0,10 ± 0,07 960 5. 3-karenas 8,25 1,46 ± 0,94 969 6. p-cimenas 8,48 1,73 ± 0,45 975 7. Limonenas 8,60 0,23 ± 0,12 978 8. γ-terpinenas 9,48 18,38 ± 12,41 1001 9. trans-sabineno hidratas 9,73 0,46 ± 0,17 1005 10. Linalolis 10,66 0,41 ± 0,13 1023 11. Borneolis 12,67 0,23 ± 0,06 1061 12. 4-terpineolis 13,00 0,22 ± 0,11 1067 13. α-terpineolis 13,38 0,20 ± 0,07 1074 14. Estragolis 13,63 0,36 ± 0,03 1078 15. Timokvinonas 15,09 0,38 ± 0,10 1105 16. Timolis 16,26 0,28 ± 0,07 1124 17. Karvakrolis 16,54 69,69 ± 13,59 1129 18. Karvakrilacetatas 18,38 0,48 ± 0,08 1159 19. β-kariofilenas 19,67 2,71 ± 0,68 1180 20. β-bisabolenas 21,71 0,80 ± 0,37 1213
Buvo nustatyta ir įvertinta skirtingomis vegetacijos fazėmis surinktos Satureja hortensis L. ţaliavos eterinio aliejaus sudėtis. Didţiausiu eterinio aliejaus kiekiu pagal bendrą smailių plotą pasiţymėjo masinio ţydėjimo (Ţ2) fazės metu rinkta ţaliava (11 pav.), bendras smailių plotas 89,12 x106. Maţiausias eterinio aliejaus kiekis nustatytas ţydėjimo pradţios (Ţ1) ir ţydėjimo pabaigos (Ţ3) metu surinktoje dašio ţaliavoje, bendras smailių plotas, atitinkamai 60,92 x106 ir 62,43x106.
11 pav. Bendras Satureja hortensis L. eterinio aliejaus komponentų smailių plotas skirtingomis vegetacijos fazėmis rinktoje ţaliavoje (SSN<6,2%, n=3). Vegetacijos fazės: A – intensyvaus
augimo, B – butonizacijos, Ţ1 – ţydėjimo pradţia, Ţ2 – masinis ţydėjimas, Ţ3 – ţydėjimo pabaiga
Kiekybinė eterinio aliejaus analizė buvo atliekama suintegruojant ir apskaičiuojant gautų chromatogramų smailių plotus. Visų penkių vegetacijos fazių DC-MS chromatogramos pateiktos 1 priede. Išanalizavus visus duomenis nustatyti 5 dominuojantys komponentai: β-mircenas, p-cimenas, γ-terpinenas, karvakrolis ir β-kariofilenas. 12 paveiksle pateikta šių komponentų kiekybinė sudėtis eteriniame aliejuje bei jos priklausomybė nuo augalo vegetacijos fazės. Vyraujantis junginys visose vegetacijos fazėse yra karvakrolis, kuris atskirose chromatogramose sudarė nuo 44,57 % iki 87,08 % visų smailių ploto (pagal smailių plotą – nuo 36,19x106
iki 55,72x106). Didţiausias jo kiekis nustatytas masinio ţydėjimo, o maţiausias – intensyvaus augimo fazės metu. Mėginiai pasiţymėjo reikšmingai dideliu γ-terpineno kiekiu, kurio smailių plotai atskiruose mėginiuose svyravo nuo 3,87x106 iki 33,70x106. Pastebimas laipsniškas šio eterinio aliejaus komponento koncentracijos maţėjimas Satureja
hortensis L. vegetacijos metu. β-mirceno smailių plotas atskiruose mėginiuose svyruoja nuo 0,16x106
iki 1,69x106, p-cimeno – nuo 0,36x106 iki 2,27x106, β-kariofileno – nuo 1,00x106 iki 4,41x106. Tikslūs pagrindinių eterinio aliejaus komponentų smailių plotai pateikti 2 priede.
77,5 71,44 60,92 89,12 62,43 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 A B Ţ1 Ţ2 Ţ3 B endr as sma ili ų plota s. x 10 6 Vegetacijos fazės
12 pav. Pagrindinių Satureja hortensis L. eterinio aliejaus komponentų dinamika skirtingomis augalo vegetacijos fazėmis (SSN≤5,8%, n=3). Vegetacijos fazės: A – intensyvaus augimo, B –
butonizacijos, Ţ1 – ţydėjimo pradţia, Ţ2 – masinis ţydėjimas, Ţ3 – ţydėjimo pabaiga
Rezvanpanah ir kt. (2011) vertindami S. hortensis L. eterinio aliejaus cheminę sudėtį taip pat gavo panašius rezultatus. Tyrimui buvo naudojami Irane kultivuojamų dašių mėginiai, eterinis aliejus išgautas hidrodistiliacijos ir hidrodistiliacijos mikrobangų pagalba metodais. DC-MS analizės metu nustatyti pagrindiniai komponentai – monoterpenai: karvakrolis, γ-terpinenas, α-terpinenas, p-cimenas ir β-mircenas [50]. Bandonienės ir kt. (2002) atlikti tyrimai taip pat patvirtina gautus rezultatus. Šiuose tyrimuose buvo analizuojama Kauno botanikos sode kultivuojamų S. hortensis L. ţaliava (ţydinti dalis), išdţiovinta dţiovinimo spintoje 30±2oC temperatūroje. Nustatyta eterinio aliejaus sudėtis ir pagrindiniai jo komponentai: karvakrolis, γ-terpinenas, α-terpinenas, timolis ir p-cimenas [4].
Tyrimai, kuriuose buvo naudojama savaime augančių Satureja hortensis L. ţaliava parodė kitokius rezultatus. Gulluce ir kt. (2003 m.) bei Hajhashemi ir kt. (2012 m.) atliktuose tyrimuose didţiausią eterinio aliejaus dalį sudarė timolis ir γ-terpinenas. Karvakrolis, p-cimenas, β-mircenas ir α-terpinenas pasiţymėjo maţesnėmis koncentracijomis [28, 31]. Skirtingus tyrimų rezultatus galėjo sąlygoti klimatiniai faktoriai, dţiovinimo ir eterinio aliejaus išgavos metodai. Baser ir kt. (2004) palyginamuosiuose tyrimuose atliktuose Turkijoje, nustatė, kad eteriniuose aliejuose išgautuose iš kultivuojamų S. hortensis L. formų vyrauja karvakrolis, tuo tarpu natūraliai augančiuose pagrindinis komponentas – timolis [16]. 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 A B Ž1 Ž2 Ž3 S maili ų plot as, x1 0 6 Vegetacijos fazės β-mircenas p-cimenas γ-terpinenas karvakrolis β-kariofilenas
3.2. Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Spektrofotometrijos metodu metanoliniuose darţinio dašio ekstraktuose analizuoti bendro fenolinių junginių, bendro flavonoidų kiekio bei antioksidantinio aktyvumo, panaudojant DPPH radikalų surišimo metodą, kitimai tarp skirtingais vegetacijos periodais rinktos ţaliavos. Duomenys įvertinti metanolinių ekstraktų absorbcijos koeficiento dydį palyginus su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos koeficientu. Antioksidantinis aktyvumas, bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu (RE) mg/g orasausės ţaliavos. Bandymai kartoti 3 kartus, nustatytas santykinis standartinis nuokrypis ir koreliacinių ryšių stiprumas.
13 pav. Bendro flavonoidų, bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo kitimas Satureja hortensis L. metanoliniuose ekstraktuose vegetacijos metu (SSN<5,3%, n=3)
13 paveiksle pateikti spektrofotometrinės analizės rezultatai. Didţiausiu fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiu pasiţymėjo S. hortensis L. ekstraktai paruošti iš butonizacijos metu rinktos ţaliavos, atitinkamai 46,01 RE mg/g ir 12,81 RE mg/g. Maţiausi šių biologiškai veikliųjų medţiagų kiekiai aptikti masinio ţydėjimo fazės metu: fenolinių junginių nustatyta 36,72 RE mg/g, flavonoidų – 9,74 RE mg/g. 0 10 20 30 40 50 60 Intensyvus augimas (A) Butonizacija (B) Ţydėjimo pradţia (Ţ1) Masinis ţydėjimas (Ţ2) Ţydėjimo pabaiga (Ţ3) Kie kis R Emg /g Vegetacijos fazės
Įvertintas metanolinių S. hortensis ekstraktų antioksidantinis aktyvumas taikant DPPH radikalų surišimo metodą (13 pav.). Gauti duomenys įvertinti pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 1,447x; R² = 0,994.
Didţiausi aktyvumu pasiţymėjo mėginiai paruošti iš butonizacijos metu rinktos ţaliavos (47,49 RE mg/g), o maţiausiu – masinio ţydėjimo ir ţydėjimo pabaigos bandiniuose (36,93 RE mg/g ir 36,99 RE mg/g). Gauti rezultatai yra statistiškai priklausomi vienas nuo kito. Nustatyta stipri koreliacija tarp antiradikalinio aktyvumo ir bendro fenolių kiekio (r2 = 0,798) bei tarp antiradikalinio aktyvumo ir bendro flavonoidų kiekio (r2
= 0,894).
Nustatyti koreliacijos koeficientai leidţia teigti, jog antiradikalinis aktyvumas yra tiesiogiai priklausomas nuo šių biologiškai aktyviųjų junginių koncentracijos, t. y. didėjant tiek bendram fenolinių junginių kiekiui, tiek bendram flavonoidų kiekiui antioksidantinis aktyvumas taip pat didėja.
L. Gontaru ir kt. (2009 m.) atliktuose tyrimuose koreliacija tarp spektrofotometriškai nustatyto antiradikalinio aktyvumo ir biologiškai aktyvių junginių nepastebėta. Tiek bendram fenolinių junginių kiekiui, tiek bendram flavonoidų kiekiui nustatyti buvo naudotos tos pačios metodikos kaip šiame darbe. Tačiau Satureja hortensis L. ţaliavos ekstrakcija buvo atliekama Soksleto ir superkritinių skysčių ekstrakcijos būdais, o rezultatai išreikšti pirogalolio ekvivalentu. Tai galėjo sąlygoti L. Gontaru ir kt. bei šiame darbe aprašytų tyrimų skirtumus [26].
3.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai
Satureja hortensis L. vaistinės augalinės ţaliavos metanolinių ekstraktų fenolinių junginių
kokybinis ir kiekybinis įvertinimas bei antioksidantinis aktyvumas buvo nustatytas pasitelkiant ESC su pokolonėline DPPH reakcijos detekcija metodą. Metodo sąlygos pateiktos 2.6 skyriuje. Fenolinių junginių identifikavimas pagrįstas etalono sulaikymo laiko atitikimu su analitės sulaikymo laiku. Siekiant kokybiškai įvertinti flavonoidus ir fenolines rūgštis darţinio dašio ekstraktuose buvo taikomi išorinio standarto metodai. Fenolinių junginių standartai buvo analizuojami tomis pačiomis sąlygomis kaip ir VAŢ ekstraktai.
Atlikus efektyviosios skysčių chromatografijos analizę S. hortensis L. ekstraktuose buvo identifikuoti 5 fenoliniai junginiai. Identifikuotos fenolinės rūgštys: trans-sinapo r., trans-p-kumaro r., rozmarino r. bei flavonoidai – hesperetinas ir rutinas, junginių sulaikymo laikai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. Identifikuotų fenolinių junginių sulaikymo laikai UV chromatogramoje
Junginio pavadinimas Išorinio standarto sulaikymo
laikas ± SSN (min)
Junginio sulaikymo laikas ± SSN (min) S. hortensis L. ekstrakte
trans-sinapo r. 19,27 ± 0,08 19,36 ± 0,13
trans-p-kumaro r. 23,12 ± 0,17 23,18 ± 0,14
Hesperetinas 23,51 ± 0,10 23,68 ± 0,03
Rutinas 24,48 ± 0,02 24,53 ± 0,04
Rozmarino r. 25,56 ± 0,13 25,64 ± 0,05
Nustačius pagrindinius Satureja hortensis L. metanolinių ekstraktų fenolinius junginius buvo sudaryti šių medţiagų etaloninių tirpalų kalibraciniai grafikai ir tiesinės regresijos lygtys, kurios pateiktos anksčiau 2.6 skyriuje 3 lentelėje. Pagal tiesinės regresijos lygtis kiekybiškai įvertinta VAŢ ekstraktų sudėtis skirtingais vegetacijos periodais (14 pav.).
14 pav. Satureja hortensis L. ţolėje identifikuotų fenolinių junginių kitimas vegetacijos metu (SSN≤8,5%, n=3)
14 paveiksle matyti, kad Satureja hortensis L. ţaliavoje dominuoja rutinas ir rozmarino rūgštis. Rozmarino r. maţiausias kiekis aptinkamas intensyvaus augimo metu (3,79 mg/g), o didţiausias – masinio ţydėjimo fazės metu (7,79 mg/g). Tik butonizacijos fazės metu rozmarino r. kiekis orasausėje ţaliavoje viršija rutino kiekį (1,25 karto). Visose kitose fazėse nustatytos didesnės rutino koncentracijos. Rutino kiekiai svyruoja nuo 3,84 mg/g iki 8,16 mg/g orasausės ţaliavos, be to pastebimas nuoseklus junginio didėjimas nuo intensyvaus augimo iki masinio ţydėjimo fazės. Trans-sinapo r., p-kumaro r. ir hesperetinas pasiţymėjo ţenkliai maţesniais kiekiais. Daugiausiai
trans-0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 A B Ţ1 Ţ2 Ţ3 Kie kis mg /g Vegetacijos fazės trans-sinapo r. trans-p-kumaro r. Hesperetinas Rutinas Rozmarino r.
