MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
LINA PITKAUSKAITĖ
VACCINIUM VITIS-IDAEA L. LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas prof. dr. Lina Raudonė
MEDICINOS AKADEMIJA FAMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
VACCINIUM VITIS-IDAEA L. LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Ericaceae Juss. šeima ... 12
1.2. Vaccinium L. gentis ... 12
1.3. Bruknės (Vaccinium vitis-idaea L.) morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 12
1.4. Vaistinės augalinės žaliavos ir jų fitocheminė sudėtis ... 13
1.5. Bruknės fenologinės fazės ... 15
1.6. Farmakologinis poveikis ir panaudojimas ... 15
1.7. Fenolinių junginių struktūros aktyvumo ryšys ... 17
1.8. Antioksidantai ir jų reikšmė ligų patogenezėje, antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai 20 2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tiriamasis objektas ... 23
2.2. Tiriamojo laikotarpio meteorologinės sąlygos ... 25
2.3. Naudota aparatūra ... 26
2.4. Naudoti reagentai ... 26
2.5. Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 27
2.6. Tyrimo metodai ... 27
2.6.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 27
2.6.2. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas ABTS metodu ... 28
2.6.3. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 29
2.6.4. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas ... 30
2.6.5. Proantocianidinų išskyrimas iš bruknių lapų ekstraktų ir jų kiekio nustatymas liofilizuotoje frakcijoje ... 31
2.6.6. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ESC metodu ... 32
2.7. Statistinė duomenų analizė ... 32
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas bruknių lapų ekstraktuose ... 34
3.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio kitimas vegetacijos eigoje skirtingose augavietėse ... 34
3.2.2. Fenolinių junginių kiekio kitimas skirtingose augalo veislėse ... 37
3.3. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas bruknių lapų ekstraktuose ... 37
3.3.1. Laisvųjų radikalų surišimo gebos kitimas vegetacijos eigoje skirtingose augavietėse .... 37
3.3.2. Laisvųjų radikalų surišimo gebos kitimas skirtingose veislėse ... 39
3.4. Redukcinio aktyvumo įvertinimas bruknių lapų ekstraktuose ... 40
3.4.1. Redukcinio aktyvumo kitimas vegetacijos eigoje skirtingose augavietėse ... 40
3.4.2. Redukcinio aktyvumo kitimas tarp skirtingų veislių... 42
3.5. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas bruknių lapų ekstraktuose ... 43
3.5.1. Bendro proantocianidinų kiekio kitimas vegetacijos eigoje skirtingose augavietėse ... 43
3.5.2. Bendro proantocianidinų kiekio kitimas tarp skirtingų veislių ... 44
3.6. Proantocianidinų kiekio nustatymas bruknių lapų liofilizuotoje frakcijoje. ... 45
3.7. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas bruknių veislių lapuose ESC metodu 46 3.8. Rezultatų apibendrinimas ... 48
4. IŠVADOS ... 49
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50
6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 51
SANTRAUKA
L. Pitkauskaitės magistro baigiamasis darbas „Vaccinium vitis-idaea L. lapų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai“. Mokslinis vadovas prof. dr. Lina Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. Kaunas, 2019.
Pavadinimas: Vaccinium vitis-idaea L. lapų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai.
Tyrimo tikslas: nustatyti fenolinių junginių kiekį, antioksidantinį aktyvumą ir proantocianidinų kiekį natūraliai augančių bruknių (Vaccinium vitis-idaea L.) lapų mėginiuose skirtingais vegetacijos tarpsniais ir tarp skirtingų bruknių veislių.
Uždaviniai: 1. Parinkti ekstrakcijos sąlygas bendram fenolinių junginių nustatymui ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimui. 2. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį natūraliai augančių bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų. 3. Įvertinti laisvųjų radikalų surišimo gebą ABTS metodu natūraliai augančių bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų. 4. Įvertinti redukcinį aktyvumą FRAP metodu bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų. 4. Nustatyti bendrą proantocianidinų kiekį bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų. 5. ESC metodu nustatyti fenolinių junginių kiekybinę ir kokybinę sudėtį tarp skirtingų bruknių lapų veislių ekstraktų.
Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimo objektas – natūraliai Lietuvoje augančių bruknių lapai, surinkti iš 4 skirtingų augaviečių Kalvarijos sav., Varėnos raj., Alytaus raj. ir Prienų raj., taip pat 10 bruknių veislių, 1 porūšis ir 1 varietetas, surinkti Šiaulių universiteto botanikos sode. Bendras fenolinių junginių kiekis, proantocianidinų kiekis, antioksidantinis aktyvumas įvertintas spektrofotometriniais analizės metodais. Proantocianidinų kiekis iš liofilizuotos frakcijos nustatytas gel-filtracijos chromatografijos metodu, naudojant gelio filtravimo medžiagą Sephadex LH-20. Fenolinių junginių kiekybinė ir kokybinė sudėtis įvertinta ESC metodu.
SUMMARY
The Final Master‘s Thesis of L. Pitkauskaite is The Research on Phenolic Compounds and Antioxidant Activity of Vaccinium vitis-idaea L. Supervisor prof. dr. Lina Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, The Faculty of Pharmacy, The Department of Pharmacognosy. Kaunas, 2019.
The Title: The Research on Phenolic Compounds and Antioxidant Activity of Vaccinium vitis-idaea L.
The Aim of the Research: To determine the amount of phenolic compounds, antioxidant activity as well as the amount of proanthocyanidins in samples of lingonberries’ (Vaccinium vitis-idaea L) leaves growing naturally during different periods of their vegetation and among their lower taxa.
The Objectives. 1. To choose conditions for general phenolic compounds extraction and the assessment of antioxidant activity. 2. To identify a general amount of phenolic compounds lingonberries’ (Vaccinium vitis-idaea L) leaves growing naturally during different periods of their vegetation and among their lower taxa. 3. To assess the free radical scavenging activity using ABTS method in samples of lingonberries’ leaves growing naturally during different periods of their vegetation and among their lower taxa. 4. To determine reducing antioxidant potential using FRAP method during different periods of lingonberries’ vegetation and among their lower taxa. 5. To determine a general amount of proanthocyanidins in samples of lingonberries’ leaves growing naturally during different periods of their vegetation and among their lower taxa. 6. By applying ESC method, to evaluate the quality and quantity of phenolic compounds in different extracts of lingonberry leaves’ cultivars.
The object of the research and methods: The object is lingonberries‘ leaves growing naturally in four different areas located in Kalvarija municipality, Varėna, Alytus and Prienai regions. In addition, ten lingonberries‘ cultivars, one subspiecies and one variety gathered in the Botanical Garden of Šiauliai University. The general amount of phenolic compounds, antioxidant activity as well as the amount of proanthocyanidins were evaluated by applying spectrophotometric analysis methods. The amount of proanthocyanidins in lyophilized fraction was tested using gel-filtration chromatographic method with gel filtration material Sephadex LH-20. The quality and quantity of phenolic compounds were evaluated by ESC method.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) COX-2 – ciklooksigenazė-2
CUPRAC – vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia DMAC – para-dimetilaminocinamaldehidas
DNR – deoksiribonuleorūgštis
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
FRAP – geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia PSO – pasaulio sveikatos organizacija
ĮVADAS
Remiantis Pasaulio sveikatos organizacija (PSO), pagrindinės mirties priežastys pasaulyje yra širdies ir kraujagyslių ligos, insultas, vėžys, lėtinės kvėpavimo ligos ir diabetas. Manoma, kad maždaug 80 proc. mirčių nuo širdies ir kraujagyslių ligų, insulto ir diabeto galima išvengti. Epidemiologinės studijos nustatė, kad šios ligos yra susiję su nepakankamu fiziniu aktyvumu, netinkama mityba, rūkymu ir alkoholio vartojimu. PSO duomenimis, 2,8 proc. mirčių visame pasaulyje yra susiję su nepakankamu vaisių ir daržovių vartojimu. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad vaisiuose ir daržovėse randami polifenoliniai junginiai efektyviai sumažina širdies ir kraujagyslių ligų bei vėžinių susirgimų riziką [1].
Bruknė (Vaccinium vitis-idaea L.) – natūraliai Lietuvoje augantis visžalis krūmokšnis, kurio fitocheminėje sudėtyje randami gausūs fenolinių junginių kiekiai. Fenolinių junginių kiekis bruknių lapuose siejamas su augalo farmakologinėmis savybėmis [2]. Plačiai paplitusi nuomonė, kad bruknių augalinė žaliavos pagrindinė indikacija yra šlapimo takų infekcijos. Tačiau vaistinis augalas pasižymi kur kas platesniu farmakologiniu poveikiu – moksliniais tyrimais nustatytas antioksidantinis, priešuždegiminis, antivėžinis, antibakterinis poveikiai. Siekiant išvengti lėtinių ligų ar sustabdyti jų vystymąsi ieškoma veiksmingų priemonių – gaminami augaliniai ekstraktai ar biopreparatai [3].
Fenolinių junginių kiekybinė ir kokybinė sudėtis bei antioksidantinis aktyvumas vegetacijos metu kinta, todėl siekiant geriausio farmakologinio poveikio, svarbu nustatyti, kuriuo vegetacijos tarpsniu tikslinga rinkti vaistinę augalinę žaliavą.
Fenolinių junginių profilis bruknių žaliavose tirtas ne tik užsienio mokslininkų, bet ir lietuvių [4,5,6,7,8]. Tačiau bendro fenolinių junginių kiekio, antioksidantinio aktyvumo ir proantocianidinų kiekio tyrimų su bruknių lapais nėra daug – labiau ištirtos yra bruknių uogos. Šiame tyrime pirmą kartą nustatytas natūraliai augančių bruknių lapų fenolinių junginių kiekis ir antioksidantinis aktyvumas vegetacijos eigoje keturiose skirtingose augavietėse – Kalvarijos sav., Alytaus raj., Prienų raj. ir Varėnos raj. Taip pat Lietuvoje iki šiol nebuvo atlikti skirtingų bruknių veislių kiekybiniai ir kokybiniai fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti fenolinių junginių kiekį, antioksidantinį aktyvumą ir proantocianidinų kiekį natūraliai augančių bruknių (Vaccinium vitis-idaea L.) lapų mėginiuose skirtingais vegetacijos tarpsniais ir tarp skirtingų bruknių veislių.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti ekstrakcijos sąlygas bendram fenolinių junginių nustatymui ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimui.
2. Nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį natūraliai augančių bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų.
3. Įvertinti laisvųjų radikalų surišimo gebą ABTS metodu natūraliai augančių bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų.
4. Įvertinti redukcinį aktyvumą FRAP metodu bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų.
5. Nustatyti bendrą proantocianidinų kiekį bruknių lapų mėginiuose vegetacijos metu ir tarp skirtingų bruknių veislių ekstraktų.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Ericaceae Juss. šeima
Erikinių (Ericaceae Juss.) šeimai priklauso 103 gentys ir maždaug 3350 rūšių, plačiai paplitusių visame pasaulyje. Tai visžaliai, pusiau visžaliai, vasaržaliai krūmai, krūmokšniai ir nedideli medeliai. Dažniausiai auga grupėmis arba ištisais sąžalynais. Būdingiausia šios šeimos savybė yra tai, kad jie auga rūgščiame dirvožemyje. Daugelis Ericaceae šeimos augalų yra dekoratyviniai [9].
1.2. Vaccinium L. gentis
Genties pavadinimas Vaccinium yra kildinamas iš lotyniškų žodžių bacca (uoga) ir baccinium (uoginis krūmas), o bruknės rūšies epitetas vitis-idaea reiškia „vynmedis iš Idos kalno Kretoje“ [4]. Genčiai priskiriama apie 300-400 rūšių, paplitusių nuo arktinės iki tropikų zonos [10]. Vaccinium genties augalinės žaliavos yra gausus fenolinių junginių šaltinis. Atliktos studijos įrodė, kad mėlynių ir bruknių lapų farmakologinis poveikis yra glaudžiai susijęs su dideliu kiekiu fenolinių junginių [5].
Lietuvoje natūraliai auga 3 augalų rūšys, priklausančios Vaccinium L. genčiai – mėlynė (Vaccinium myrtillus L.), vaivoras (Vaccinium uliginosum L.) ir bruknė (Vaccinium vitis-idaea L.) [10].
1.3. Bruknės (Vaccinium vitis-idaea L.) morfologiniai požymiai ir paplitimas
spalva kinta nuo žalios iki įvairių atspalvių raudonos. Uogoje randama nuo 5 iki 50 rausvai rudų, pusmėnulio formos sėklų [4].
1 pav. Bruknė (Vaccinium vitis-idaea L.)
Bruknė randama visoje Šiaurės pusrutulio vidutinio klimato juostoje, taip pat tundroje. Lietuvoje bruknė daugiausiai paplitus rytinėje, pietrytinėje ir pietinėje dalyse. Nurodoma, kad sausuose ir apysausiuose spygliuočių miškuose, beržynuose ir aukštapelkėse bruknės auga dažniausiai. Atlikti tyrimai atskleidė, kad bruknė dažniausiai aptinkama ir geriausiai auga brukniniuose pušynuose, brukniniuose mėlyniniuose pušynuose, mėlyniniuose pušynuose, beržynuose ir tarpinio tipo pelkėse [4].
2 pav. Bruknės paplitimas pasaulyje [2]
1.4. Vaistinės augalinės žaliavos ir jų fitocheminė sudėtis
prinokimo faze, o lapuose keičiasi pagal fenologines augalo fazes. Įtakos taip pat gali turėti buveinės ekologinės bei gamtinės sąlygos, žaliavos surinkimo ir laikymo trukmė [4].
Bruknių lapų fitocheminę sudėtį tyrinėjo Bandzaitienė ir kt. Nustatyta, kad lapuose vandens kiekis per dieną svyruoja nuo 47 iki 79 proc., o arbutino ir rauginių medžiagų kiekis priklauso nuo fenologinės fazės ir atitinkamai siekia 11,5 – 12,8 proc. ir 5 – 9 proc. Taip pat randama baltymų, lipidų, nemažai mineralinių elementų – azoto, fosforo, kalio, mangano, magnio, geležies ir kt. [4]. Fenolinių junginių profilio nustatymas atsispindi Ek ir kt., 2006, Liu ir kt., 2014, Hokkanen ir kt., 2009, Bujor ir kt., 2018 mokslininkų darbuose. Bruknių lapuose didžiausią fenolinių junginių dalį sudaro arbutinas, randami mažesni kiekiai flavan-3-olių, flavonolių glikozidų, A ir B tipo proantocianidinų, hidroksicinamono rūgščių. Studijos atskleidė, kad arbutinas sudaro 31-50 proc. bendro fenolinių junginių kiekio, o jo kiekis bruknių lapuose vegetacijos eigoje kinta nuo 52,1 ± 0,1 iki 42,6 ± 0,2 mg/g. Flavan-3-oliai bruknių lapuose yra antra labiausiai paplitusi fenolinių junginių grupė. Atlikti tyrimai parodė, kad bruknių lapuose randama apie 27-42 proc. flavan-3-olių. Monomeriniai flavan-3-oliai, tokie kaip katechinas ir epikatechinas buvo aptikti visose augalo dalyse, lapuose vegetacijos eigoje kiekis kito nuo 8,78 ± 0,28 iki 15,5 ± 0,4 mg/g. Augalinėje žaliavoje taip pat nustatyta 6-14 proc. fenolinių rūgščių – cis ir trans chlorogeno rūgščių, kavos rūgšties, kumaroil kvino rūgšties, p-kumaro rūgšties, kafeoilarbutino. Iš fenolinių rūgščių aptinkami didžiausi 2-O-kafeoilarbutino kiekiai. Bruknių lapuose nustatoma maždaug 12-19 proc. flavonolių – pagrinde kvercetino ir šiek tiek mažiau kempferolio glikozidų – tai 3-O-β-galaktozidas, kvercetino-3-O-gliukozidas, kvercetino-3-O-rutinozidas (rutinas), kvercetino-3-O-β-ksilozidas, kvercetino-3-O-α-arabinozidas, kempferolio heksozidas, kvercetino-3-O-α-arabinofuranozidas (avikularinas), α-ramnozidas (kvercitrinas), kempferolio-O-pentozidas, kvercetinas, kvercetino-3-O-(4''-HMG)-α-ramnozidas, kempferolio-(HMG)-ramnozidas. Lapuose randami junginiai sutampa su skirtingų mokslininkų atliktais tyrimais. [5,6,7,8]
kiekiai hidroksicinamono rūgšties darinių, flavan-3-olių. Skirtingai nei lapų cheminėje sudėtyje, bruknių uogose papildomai aptikta benzoilgliukozės ir antocianinų – cianidino-3-O-galaktozido, cianidino-3-O-gliukozido, cianidino-3-O-arabinozido. Lyginant su bruknių lapais, uogose nustatyti mažesni flavan-3-olių, flavonolių glikozidų ir fenolinių rūgščių kiekiai – atitinkamai 30-36 proc., 7-9 proc. ir 2-3 proc. bendro fenolinių junginių kiekio. [6,8,11]
1.5. Bruknės fenologinės fazės
Bruknės fenologinių fazių laikas skirtingais metais skiriasi 1-3 savaitėmis. Analizuojant fenologinį spektrą, matoma, kad žiedinių pumpurų brinkimas prasideda kovo pabaigoje ar balandžio pradžioje (03.30 – 04.15). Tai lemia tuo metu esanti temperatūra – esant gana šiltiems orams, pumpurai pradeda brinkti anksčiau ir greičiau, tačiau balandžio mėnesį atšalus, pumpurų brinkimas gali stipriai sulėtėti. Vėliau (04.15 – 05.12) pradeda brinkti vegetatyviniai pumpurai. Žiediniai pumpurai paprastai išsprogta praėjus kelioms savaitėms po brinkimo pradžios (04.15 – 05.08). Kadangi vegetatyviniai pumpurai pradeda brinkti vėliau, todėl išsprogsta taip pat truputį vėliau nei žiediniai pumpurai (04.29 – 05.20) [4].
Bruknės žiedyno formavimasis tęsiasi vidutiniškai apie 20-25 dienas (nuo 05.02-05.13 iki 05.24-06.04). Gegužės pradžioje išryškėja žiedpumpuriai, pailgėja žiedyno ašis. Žiedai išsiskleidžia gegužės pabaigoje arba birželio pradžioje (05.24 – 06.04). Tada prasideda masinis žydėjimas, kuris trunka apie 10-15 dienų. Užuomazgų susidarymo pradžia sutampa su masinio žydėjimo pabaiga (06.07 – 06.22). Užuomazgos formuojasi 7-10 dienų. Uogos normalų dydį įgauna praėjus 20-25 dienoms po užuomazgų susidarymo dienos. Vasarinis bruknės žydėjimas prasideda birželio viduryje arba liepos pradžioje ir tęsiasi iki šalnų. Antrinio žydėjimo uogos pradeda nokti rugpjūčio pabaigoje ir rugsėjo mėnesį [4].
Uogų formavimasis ir nokimas apima ilgą laiko tarpą (nuo 06.07-06.20 iki 07.15-07.22), todėl uogų, susiformavusių pavasarinio ir vasarinio žydėjimo metu, derėjimas neišskiriamas į du periodus, o susidaro vienas bendras derėjimo periodas nuo liepos pabaigos iki šalnų. Tuo metu galima rasti tiek žydinčių žiedų, tiek jau prinokusių uogų [4].
Moksliniais tyrimais nustatytas bruknių vaistinės augalinės žaliavos antibakterinis [3,12,13], antivėžinis [14,15], priešuždegiminis [3,16,17], antioksidantinis poveikiai [3,18], nustatytas teigiamas poveikis šlapimo takams [3,6] ir širdies ir kraujagyslių sistemai [19].
Antibakterinis poveikis. Bruknių ekstraktuose esantys proantocianidinai, anot Mane ir kt. 2011, yra efektyvūs prieš Staphylococcus aureus bakteriją, kuri sukelia įvairias infekcijas [3]. Bruknių farmakologinį poveikį taip pat tyrė Kylli ir kt. 2011. Tyrimuose in vitro buvo nustatyta, kad bruknėse esantys proantocianidinai pasižymi stipriu antimikrobiniu poveikiu prieš Staphylococcus aureus, tačiau nėra efektyvūs prieš kitas bakterijas (Salmonella enterica, Lactobacillus rhamnosus, E. coli). Tai sutapo su ankstesnėmis studijomis, kurios parodė antibakterinį bruknių uogų poveikį prieš gram teigiamus patogenus [12]. Kiti moksliniai tyrimai atskleidė, kad bruknių uogose esantys taninai pasižymi antimikrobiniu poveikiu prieš Porphyromonas gingivalis ir Prevotella intermedia bakterijas. Dėl šios priežasties bruknių vaistinė augalinė žaliava gali būti panaudojama periodontito gydymui [13].
Antivėžinis poveikis. In vitro studijos parodė, kad bruknių uogų ekstraktai slopina vėžinių ląstelių augimą. Priklausomai nuo ekstrakto koncentracijos biologiškai aktyvios medžiagos sustabdė storosios žarnos vėžinių ląstelių (HT-29) proliferaciją. Nustatyta, kad esant 40 mg/ml bruknių ekstrakto koncentracijai buvo 30 proc. sustabdytas ląstelių augimas, o koncentracijai esant 60 mg/ml – 50 proc. [14]. Kitose in vitro studijose nustatyta, kad bruknių uogų ekstraktai nepriklausomai nuo dozės geba sukelti žmogaus leukemijos HL-60 ląstelių apoptozę. Gauti rezultatai rodo, kad bruknių uogų ekstraktai, veikdami pagal apoptozinį mechanizmą, gali sukelti vėžinių ląstelių mirtį [15].
Priešuždegiminis poveikis. Tyrimai in vivo parodė, kad esant ūmioms ir lėtinėms kvėpavimo takų infekcijoms, bruknių lapuose esantis arbutinas ir fraksinas pasižymi antiuždegiminiu ir kosulį slopinančiu poveikiais. Rezultatai atskleidė, kad tiek arbutinas, tiek fraksinas statistiškai reikšmingai pasižymėjo farmakologiniais poveikiais – nustatytas antiuždegiminio poveikio tarp fraksino ir deksametazono panašumas [16]. Kitose in vitro studijose, bruknių lapai ir uogos pasižymėjo stipriu trombocitus aktyvinančio faktoriaus ir prostaglandinų biosintezės slopinimu. Ericaceae šeimai priklausantys augalai, tarp jų ir Vaccinium vitis-idaea L. kaupia didelį kiekį fenolinių junginių, tokių kaip hidrochinonai ir jų dariniai. Bruknių lapų fitocheminėje sudėtyje aptinkamas didesnis šių darinių kiekis nei bruknių uogose. Atliktose studijose, ekstraktai, pagaminti iš bruknių lapų, pasižymėjo stipresniu poveikiu nei uogos. Būtent hidrochinonų junginiai veikia kaip gebantys slopinti prostaglandinų formavimąsi [17]. Tyrimai su gyvūnais parodė, kaip bruknės gali sumažinti uždegimo molekules, blokuoti oksidantus ir padėti organizmui atkurti svarbius antioksidantus, tokius kaip glutationas [3].
uogose. Tai lemia ne tik antibakterinį poveikį, bet ir antioksidantinį – geba slopinti lipidų oksidaciją [3]. Nustatyta, kad fenolinių junginių kiekis koreliuoja su antioksidantiniu poveikiu. Kadangi bruknėse aptinkami gausūs polifenolių kiekiai, daroma prielaida, kad vaistinis augalas geba apsaugoti ląsteles nuo laisvųjų radikalų ir oksidacinės pažaidos. Daugelis in vitro studijų patvirtina bruknių antioksidantinio poveikio efektyvumą [18].
Poveikis šlapimo takams. Bruknių uogose randama benzenkarboksirūgštis pasižymi dezinfekciniu ir antigrybeliniu poveikiu šlapimo takams [3]. Bruknių produktai kartu su fitochemiškai panašiomis Vaccinium genties uogomis naudojami kaip natūrali priemonė šlapimo takų infekcijoms gydyti [6]. Bruknės gali būti naudojamos ne tik gydant šlapimo takų infekcijas, bet profilaktiškai, siekiant išvengti tolimesnių komplikacijų [3].
Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Polifenoliniai junginiai turi teigiamą poveikį kraujo spaudimui bei širdies ir kraujagyslių ligų gydymui. Kivimaki ir kt. 2012 nustatė, kad bruknių uogose esantys polifenoliniai junginiai, pagerina kraujagyslių endotelio atsipalaidavimą ir sumažina kraujo spaudimą. Yra nustatyta, kad bruknių ir spanguolių didelės koncentracijos sultys slopina ciklooksigenazės 2 (COX-2), monocitų chemoatraktanto baltymo (MCP1) ir P-selektino išskyrimą, esant spontaniškai sukeltam aukštam kraujo spaudimui [19].
1.7. Fenolinių junginių struktūros aktyvumo ryšys
3 pav. Fenolinių junginių klasifikacija [20]
Fenoliniai junginiai yra plati aromatinių junginių grupė, kuriai priskiriama maždaug 8000 natūraliai aptinkamų junginių [6,21]. Daugiausiai fenoliniai junginiai randami vaisiuose, žolėje,
šaknyse, lapuose ir atlieka svarbią fiziologinę ir morfologinę funkciją [20]. Fenolinius junginius sintezuoja augalai jų vystymosi ir augimo metu [21]. Įprastai jie susidaro per du metabolinius kelius: per šikimato rūgšties kelią, kurio metu susidaro fenilpropanoidai arba per acto rūgšties kelią, kurio metu susidarę pagrindiniai produktai yra paprastieji fenoliai. Fenolinių junginių struktūroje yra vienas arba keli aromatiniai žiedai ir hidroksilo pakaitai [20]. Visi jie pasižymi bendrais struktūriniais ypatumais – aromatinis žiedas prisijungęs mažiausiai vieną hidroksilo pakaitą [21]. Jie aptinkami ne kaip laisvi junginiai, o kaip esteriai, metilo esteriai arba glikozidai [20].
Antioksidantinis aktyvumas yra susijęs su fenolinių junginių struktūros ypatumais. Flavonoidai ir fenolinės rūgštys yra pagrindinės fenolinių junginių grupės. Jų struktūros ir antioksidantinio aktyvumo ryšys vandeninėse ir lipofilinėse sistemose yra plačiai nagrinėjamas [22].
Fenolinės rūgštys. Fenolinės rūgštys tai aromatiniai antriniai augalų metabolitai, plačiai paplitę augalų karalystėje [21]. Fenolinėms rūgštims priskiriama hidroksibenzenkarboksirūgštys ir hidroksicinamono rūgštys. Hidroksibenzenkarboksirūgštys yra benzenkarboksirūgšties dariniai, turintys C6-C1 struktūrą. Individualius skirtumus lemia aromatinio žiedo hidroksilo ir metoksi grupių
pakaitai. Hidroksicinamono rūgštims, kitaip vadinamomis fenilpropanoidais, būdinga C6-C3 struktūra
[23]. Tik nedidelė fenolinių rūgščių dalis aptinkama laisvų rūgščių pavidalu. Didesnė dalis per esterines jungtis sudaro junginius su celiulioze, baltymais, gliukoze [21]. Skirtingos fenolinės rūgštys skiriasi hidroksilo ir metoksilo pakaitų, prijungtų prie aromatinio žiedo, skaičiumi ir padėtimi [20].
Antioksidantinio ir radikalų surišimo aktyvumas priklauso nuo hidroksi (-OH) ir metoksi (-CH3) grupių skaičiaus ir padėties molekulėse. Pavyzdžiui, galo rūgštis su trimis hidroksilo pakaitais
turi vieną iš stipriausią radikalų surišimo aktyvumą dėl pirogalolio struktūros privalumų ir stipraus H donorinio poveikio. Junginiai be hidroksi grupių visiškai nepasižymi aktyvumu. Benzenkarboksirūgštis ir cinamono rūgštis savo struktūroje neturi nei vienos hidroksilo grupės, todėl ir nepasižymi antioksidantiniu aktyvumu [22].
4 pav. Hidroksibenzenkarboksirūgšties ir hidroksicinamono rūgšties pagrindinė struktūra [21]
benzeno žiedų (A ir B žiedas) sujungtų per heterociklinį pirano žiedą (C žiedas). Flavonoidai egzistuoja kaip aglikonai, glikozidai ir metilinti dariniai. Pagrindinė flavonoidų struktūra yra aglikonas [24]. Flavonoidus taip pat galima apibūdinti kaip augalų pigmentus, kurie gaunami sintezės būdu iš fenilalanino [25]. Aromatinis žiedas A gaunamas acetato/malonato keliu, o B žiedas gaunamas iš fenilalanino per šikimato kelią. Likusios flavonoidų poklasės – flavonoliai, flavonai, izoflavonai, flavanonai, antocianai yra gaunami prie C žiedo prijungiant įvairius pakaitus ir atliekant variacijas (alkilinimas, glikozilinimas, acilinimas ir kt.) [20]. Tuo tarpu individualūs junginiai tarp skirtingų grupių skiriasi pakaitais A ir B žieduose [24].
5 pav. Flavonoidų aglikono struktūrinis pagrindas [21]
Flavonoidų antioksidantinis aktyvumas stipriai priklauso nuo junginio cheminės struktūros [26]. Aktyvumą lemia funkcinių grupių išsidėstymas flavonoidų struktūroje. Išsidėstymas, pakaitai ir bendras hidroksi grupių skaičius daro įtaką antioksidantinio aktyvumo mechanizmams, tokiems kaip radikalų surišimo aktyvumas [24]. Yra žinoma, kad flavonoidų antioksidantinis aktyvumas susijęs su hidroksi grupių skaičiumi ir padėtimi A ir B žieduose, taip pat priklauso nuo konjugacijos apimties tarp B ir C žiedų. Remiantis ankstesnėmis išvadomis, flavonoidai, pasižymintys antioksidantinėmis savybėmis, turi atitikti tris Bors kriterijus:
1. O-dihidroksi struktūra B žiede, kuri suteikia stabilumą flavonoidų fenoksilo radikalams. 2. C2-C3 dviguba jungtis (konjugacijoje su 4-okso grupe), kuri dalyvauja radikalų
stabilizavime.
3. 3-OH ir 5-OH grupių buvimas lemia maksimalią radikalų surišimo gebą [26].
Hidroksilo pakaitai B žiede yra svarbiausi struktūriniai elementai, lemiantys ROS ir RNS surišimą. Hidroksilo grupės esančios B žiede atiduoda vandenilį ir elektroną hidroksilo, peroksilo ir peroksinitrito radikalams ir juos stabilizuoja. Gebėjimas surišti laisvuosius radikalus tiesiogiai priklauso ir nuo bendro OH grupių skaičiaus [27].
yra stipresni antioksidantai [24]. Lyginant su kitais flavonoidais, flavanoliai pasižymi ženkliai didesniu radikalus surišančiu aktyvumu. Flavanoliai turi daugiau hidroksilo grupių (nuo 5 iki 8 OH grupių), ypač įtakos turi orto padėtyje B žiede esantys pakaitai ir 3-hidroksi grupė C žiede [22]. Flavonoliai gali turėti nuo 1 iki 6 -OH grupių ir pasižymi dideliu gebėjimu surišti ABTS·+ ir DPPH· radikalus. Flavonoliai turi ne tik 3-hidroksi grupę C žiede ir 3',4'-dihidroksi grupes B žiede, bet ir dvigubąją jungtį ir ketoninę grupę 4 padėtyje C žiede, kuris yra pagrindinis struktūrinis elementas radikalų surišimo aktyvumui padidinti. Pavyzdžiui, lyginant kvercetiną ir kempferolį, pastarasis pasižymi mažesniu antiradikaliniu aktyvumu, nes turi mažesnį -OH grupių skaičių. Tuo tarpu flavonai, flavanonai ir izoflavonai nepasižymi antiradikaliniu aktyvumu, kadangi savo struktūriniame pagrinde neturi nei vienos hidroksi grupės [22].
1.8. Antioksidantai ir jų reikšmė ligų patogenezėje, antioksidantinio
aktyvumo nustatymo metodai
Antioksidantas – tai medžiaga, kuri efektyviai redukuoja prooksidantą, sudarydama netoksiškus arba mažai toksiškus junginius [28]. Kitaip antioksidantus galima apibūdinti kaip junginius, kurie mažomis koncentracijomis gali apsaugoti biomolekules nuo žalingos oksidacinės pažaidos. Teigiamas antioksidantų poveikis susijęs su sutrikimais, kuriems oksidaciniai procesai yra ypač reikšmingi, tokiems kaip aterosklerozė, koronarinė širdies liga, navikai ir senėjimo procesas [29]. Yra du pagrindiniai antioksidantų veikimo mechanizmai. Pirmasis paremtas vandenilio atomo perdavimo reakcijomis, o antrasis – elektronų perdavimo reakcijomis [28]. Antioksidantai taip pat gali paveikti biologines sistemas metalo jonų chelacijos ar genų ekspresijos reguliavimo būdais [30].
Antioksidantai gali būti klasifikuojami į fermentinius ir nefermentinius. Pagrindiniai fermentiniai antioksidantai tiesiogiai veikia ROS neutralizaciją [31]. Jie yra svarbūs apsauginei ląstelės funkcijai, todėl pirmiausiai dalyvauja antioksidantinėje apsaugoje. Pagrindiniai fermentiniai antioksidantai, saugantys ląstelę nuo per didelio ROS kiekio, yra superoksido dismutazė, katalazė, glutationas, glutationo reduktazė, glutationo peroksidazė, glutationo-S-transferazė. [30,32,33]. Visų fermentų aktyvumui yra būtini metalai – Cu, Zn, Fe, Se, Mn [32]. Nuo oksidacinio streso ląstelės yra apsaugotos su antioksidantų fermentų tinklu. Pavyzdžiui, oksidacinio fosforilinimo metu išskiriamas superoksidas, kuris pirmiausiai paverčiamas vandenilio peroksidu ir tada redukuojamas iki vandens. Toks detoksikacijos kelias yra daugelio fermentų rezultatas, superoksido dismutazės katalizuoja pirmąjį žingsnį, o tada katalazės ir peroksidazės neutralizuoja vandenilio peroksidą [30].
antioksidantai, priklausantys endogeniniams antioksidantams, yra gaunami organizmo metabolinių procesų metu. Tai gali būti glutationas, L-argininas, kofermentas Q10, melatoninas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, baltymai, jungiantys pereinamųjų metalų jonus, transferinas (Willcox ir kt. 2004) [31]. Glutationas yra gausiai augalų audiniuose aptinkamas junginys. Jis aptinkamas visuose ląstelės organoiduose: citozolyje, endoplazminiame tinkle, vakuolėje ir mitochondrijose. Glutationas suriša citotoksišką H2O2 ir veikia nefermentiškai prieš kitas reaktyvias deguonies formas – singuletinį
deguonį, superoksido radikalą ir hidroksilo radikalą. Pagrindinis glutationo antioksidantinis poveikis pasireiškia dėl gebėjimo atkurti kitą vandenyje tirpų antioksidantą – askorbo rūgštį, veikiant per askorbato-glutationo ciklą [34]. Tuo tarpu maisto antioksidantai priklauso egzogeniniams antioksidantams. Tai yra junginiai, kurių organizmas negali pasigaminti, todėl jie privalo būti gaunami su maistu – tai vitaminas E, vitaminas C, selenas, magnis, flavonoidai, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys. Maisto antioksidantai pasižymi gebėjimu detoksikuoti ROS ir užima svarbią padėtį, padėdami endogeniniams antioksidantais neutralizuoti oksidacinį stresą (Donaldson 2004). Maisto antioksidantų trūkumas yra viena iš priežasčių, kodėl sergama lėtinėmis, degeneracinėmis ligomis bei vėžiu [31]. Maisto antioksidantai, įskaitant polifenolinius juninius, vitaminus E ir C, karotenoidus, yra veiksmingos medžiagos, gebančios užkirsti kelią ligų, susijusių su oksidaciniu stresu atsiradimui. Klinikiniai tyrimai ir epidemiologinės studijos atskleidė atvirkštinę koreliaciją tarp maisto antioksidantų ir tam tikrų ligų atsiradimo (uždegimas, širdies ir kraujagyslių sistemos ligos, vėžys, Alzheimerio liga) [29]. Fenoliniai junginiai kaip antioksidantai pasižymi idealia chemine struktūra, reikalinga laisvųjų radikalų surišimo aktyvumui [34].
Antioksidantai gali slopinti arba atidėti laisvųjų radikalų susidarymą, todėl jie yra pakankamai svarbūs jau minėtų ligų prevencijai. Fenoliniai junginiai, gaunami iš natūralių šaltinių, yra svarbūs dėl savo antioksidantinių savybių bei galimo vaidmens oksidacinio streso suvaldyme. Dėl didelio polifenolių kiekio augalai veikia kaip natūralūs redukuojantys agentai [35]. Studijos parodė, kad natūralūs antioksidantai yra veiksmingi ligų gydymui ir profilaktikai [36].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tiriamasis objektas
Tyrimo metu buvo tiriami natūraliai augančių bruknių lapai, surinkti iš 4 skirtingų augaviečių visomis augalo fenologinėmis fazėmis – nuo pumpurų brinkimo iki vegetacijos pabaigos. Vaistinė augalinė žaliava buvo renkama Jurgežerių kaime, Kalvarijos sav. (54.416744, 23.156419 (WGS)), Mardasavo kaime, Varėnos raj. (54.154982, 24.33017 (WGS)), Balkasodžio kaime, Alytaus raj. (54.277992, 23.975056 (WGS)) ir Prienų šile, Prienų raj. (54.608194, 23.926323 (WGS)). Lapai buvo renkami maždaug kas 2 savaites 2017 metais nuo balandžio iki spalio mėnesio (1 lentelė).
sultingos, saldžiarūgštės [39,40]. 'Rubin' (1997) – išvesta Rusijoje. Iki 15-18 cm aukščio krūmokšnis, greitai suformuojantis ištisinį sąžalyną. Uogos vidutinio stambumo, apvalios, tamsiai raudonos [39,40].
Surinkta žaliava buvo džiovinama kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje ir nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje. Išdžiovinta žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, sausoje, gerai vėdinamoje vietoje.
1 lentelė. Bruknių lapų rinkimo vietos ir datos.
Žaliavos rinkimo vieta Žaliavos rinkimo data Fenologinė fazė
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Balandžio 7 d., 2017 m. Žiedinių pumpurų brinkimas
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Balandžio 20 d., 2017 m. Vegetatyvinių pumpurų brinkimas, žiedinių pumpurų sprogimas
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Balandžio 28 d., 2017 m. Vegetatyvinių ir žiedinių pumpurų sprogimas
Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Balandžio 30 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Gegužės 13 d., 2017 m. Žiedyno formavimasis
Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Gegužės 12 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Gegužės 20 d., 2017 m. Pavasarinių ūglių augimas, pavasarinis žydėjimas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Gegužės 18 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Gegužės 19 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Gegužės 20 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Gegužės 27 d., 2017 m. Pavasarinių ūglių augimas, masinis žydėjimas
Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Gegužės 28 d., 2017 m. Prienų raj., Prienų šilas, miškas Gegužės 28 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Gegužės 28 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Birželio 3 d., 2017 m. Pavasarinių ūglių augimas, masinis žydėjimas
Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Birželio 3 d., 2017 m. Prienų raj., Prienų šilas, miškas Birželio 2 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Birželio 4 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Birželio 21 d., 2017 m. Vasarinių ūglių augimas, užuomazgų susidarymas, vasarinis žydėjimas, uogų formavimasis ir nokimas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Birželio 18 d., 2017 m.
1 lentelė. Bruknių lapų rinkimo vietos ir datos (tęsinys).
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Liepos 3 d., 2017 m. Vasarinių ūglių augimas, vasarinis žydėjimas, uogų formavimasis ir nokimas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Liepos 1 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Liepos 2 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Liepos 1 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Liepos 15 d., 2017 m. Uogų formavimasis ir nokimas
Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Liepos 15 d., 2017 m. Prienų raj., Prienų šilas, miškas Liepos 14 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Liepos 14 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Liepos 27 d., 2017 m. Derėjimo periodas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Liepos 28 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Liepos 30 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Liepos 30 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Rugpjūčio 15 d., 2017 m. Derėjimo periodas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Rugpjūčio 20 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Rugpjūčio 17 d., 2017 m Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Rugpjūčio 17 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Rugsėjo 2 d., 2017 m. Derėjimo periodas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Rugsėjo 2 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Rugsėjo 5 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Rugsėjo 5 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Rugsėjo 23 d., 2017 m. Derėjimo periodas Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Rugsėjo 22 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Rugsėjo 22 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Rugsėjo 25 d., 2017 m.
Kalvarijos sav., Jurgežerių kaimas, pamiškė Spalio 5 d., 2017 m. Vegetacijos pabaiga Varėnos raj., Mardasavo kaimas, miškas Spalio 5 d., 2017 m.
Prienų raj., Prienų šilas, miškas Spalio 6 d., 2017 m. Alytaus raj., Balkasodžio kaimas, miškas Spalio 6 d., 2017 m.
2017 metais vidutinė oro temperatūra buvo 7,6 o
C , tai buvo 0,7 oC aukščiau už standartinę klimato normą ir 0,1 oC žemiau už 2016 m. vidutinę temperatūrą. Svarbu paminėti, kad rugpjūčio 12
d., Alytuje buvo užfiksuota aukščiausia oro temperatūra (35,2 o
C). Metinis kritulių kiekis 2017 metais buvo 174 mm didesnis už standartinę klimato normą, o 116 mm buvo didesnis už 2016 m. vidutinę reikšmę. Gegužės mėnesį buvo stebimas kritulių kiekio sumažėjimas, kas galėjo turėti įtakos augalų vegetacijai. Kitus mėnesius kritulių kiekis buvo panašus į standartinę klimato normą [41].
Vertinant augalų vegetaciją, kai vidutinė oro temperatūra viršijo 5 oC, daugelyje rajonų
prasidėjo kovo 31 d., tačiau dėl vėsesnių nei įprastai balandžio orų gerokai sulėtėjo. Vegetacijos pabaiga, vidutinei oro temperatūrai nukritus žemiau kaip 5 oC, įvyko spalio 22 d., vidutiniškai šešiomis
dienomis nei įprastai. Daugelyje rajonų augalo vegetacijos laikotarpis truko vidutiniškai apie 206 dienas [41].
Aktyvi augalų vegetacija, kai vidutinė paros temperatūra ≥ 10 oC, šalyje prasidėjo gegužės 13
d. – tai įvyko vidutiniškai 2 savaitėmis vėliau nei įprastai. Rugsėjo 30 d., temperatūrai nukritus mažiau kaip 10 oC, aktyvi augalų vegetacija baigėsi [41].
2.3. Naudota aparatūra
Vaistinė augalinė žaliava sumalta elektriniu malūnėliu Retsch 200 (Retsch GmbH, Hanas, Vokietija). Susmulkinta žaliava atsverta elektroninėmis svarstyklėmis Sartorius CP64 (Sartorius AG, Getingenas, Vokietija). Žaliavos ekstrakcija atlikta ultragarso vonelėje Elmasonic P (Elma Schmidbauer GmbH, Elma, Vokietija). Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas, antioksidantinis aktyvumas ir bendras proantocianidinų kiekis įvertintas spektrofotometru (Spectronic CamSpec, Garfortas, Jungtinė Karalystė). Kokybinė ir kiekybinė fenolinių junginių analizė atlikta panaudojant chromatografą Water e2695 Alliance (Waters, Milfordas, JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Waters, Milfordas, JAV).
2.4. Naudoti reagentai
Tyrimo metu buvo naudota: 96 proc. (v/v) etanolis (Vilniaus degtinė, Vilnius, Lietuva), 99,8 proc. bevandenė acto rūgštis, 37 proc. vandenilio chlorido rūgštis, 99,9 proc. metanolis, 99,5 proc. acetonas, Folin-Ciocalteu reagentas, natrio karbonatas (Na2CO3),
heksahidratas (FeCl3 × 6H2O), natrio acetatas (CH3COONa), para-dimetilaminocinamaldehidas
(DMAC), Sephadex LH-20 gelio filtravimo medžiaga (Sigma-Aldrich, Buchs, Šveicarija); kalio persulfatas (K2S2O8) (Alfa Aesar, Karlsruhe, Vokietija). Tyrimo metu panaudoti standartai:
6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilinė rūgštis (troloksas), galo rūgšties monohidratas, etilendiaminotetraacto rūgštis (EDTA), kvercetinas, chlorogeno rūgštis, kriptochlorogeno rūgštis, ferulo rūgštis, procianidinas A2 (Sigma-Aldrich, Buchs, Šveicarija); arbutinas, (+)-katechinas, (-)-epikatechinas (Fluka, Buchs, Šveicarija); hiperozidas, astragalinas, rutinas, izoramnetino-3-O-gliukozidas, kvercitrinas (Extrasynthese, Genay, Prancūzija); procianidinas C1, avikularinas (ChromaDex, Irvine, CA, JAV). Visi naudoti reagentai ir standartai buvo analitinio švarumo.
2.5. Tiriamųjų mėginių paruošimas
Bruknių lapų augalinė žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu. Ekstraktai ruošiami tamsaus stiklo buteliukuose atsvėrus 0,25 g maltos žaliavos ir užpylus 25 ml ekstrakcijos tirpiklio (1:100). Buteliukai dedami į ultragarso vonelę 15 min, esant 37 kHz dažniui ir 80 W galiai. Gauti ekstraktai filtruojami per vatą, supilami į tamsaus stiklo buteliukus ir laikomi kambario temperatūroje nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.
2.6. Tyrimo metodai
2.6.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatomas spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu. Darbinis Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas motininį FC tirpalą praskiedus distiliuotu vandeniu 10 kartų. Tiriamasis tirpalas ruošiamas 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišant su 5 ml darbiniu Folin-Ciocalteu reagentu ir su 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalu. Gautas tirpalas gerai išmaišomas ir laikomas tamsoje 1 valandą. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj ekstrakto naudojamas ekstrahentas, t.y. 60 proc. etanolis.
6 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
GAE c ×V
m ; mg/g
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.6.2. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas ABTS metodu
Laisvųjų radikalų surišimas įvertinamas spektrofotometriniu ABTS metodu. Ruošiamas motininis 2 mM koncentracijos ABTS tirpalas – atsveriama 0,0548 g ABTS miltelių ir ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens. Į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato, mišinys sumaišomas ir laikomas tamsoje 16 valandų.
Darbinis ABTS tirpalas paruošiamas praskiedus motininį tirpalą iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo.
Tiriamieji tirpalai ruošiami imant 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir sumaišant su 20 μl tiriamojo ekstrakto. Mišinys gerai sumaišomas ir laikomas tamsoje 1 valandą. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 734 nm bangos ilgiui.
Etaloniniai trolokso tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis, tik vietoj ekstrakto pilama 6 skirtingų koncentracijų trolokso tirpalai (800 μmol/l, 600 μmol/l, 400 μmol/l, 200 μmol/l, 100 μmol/l, 50 μmol/l ). Išmatavus absorbcijos pokyčius (0,800-A), braižoma trolokso kalibracinė kreivė (7 pav.). y = 8,7141x + 0,0287 R² 0,9986 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 O ptinis t a nk is , A
7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė
Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEABTS) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
TEABTS
c ×V
m ; mg/g
c – trolokso koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.6.3. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
Redukcinis aktyvumas įvertinamas spektrofotometriniu FRAP metodu. Ruošiami reagentai: 1. 300 mM acetatinis buferis. Atsveriama 3,1 g natrio acetato, suberiama į 1000 ml matavimo
kolbą, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės (pH 3,6).
2. 10 mM TPTZ tirpalas. Į 50 ml distiliuoto vandens įpilama 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties. Gautame 40 mM druskos rūgšties tirpale tirpinami 0,1562 g TPTZ milteliai.
3. 20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas. Atsveriama 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato ir ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens.
Darbinis reagentas ruošiamas sumaišant paruoštus reagentus santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo). Tiriamasis tirpalas ruošiamas imant 3 ml darbinio FRAP reagento ir pridedant 20 μl tiriamo ekstrakto. Mišinys gerai sumaišomas ir laikomas tamsoje 1 valandą. Spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija esant 593 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj ekstrakto dedama ekstrahento, t.y. 60 proc. etanolio.
Etaloniniai trolokso tirpalai ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis, tik vietoj ekstrakto pilama 5 skirtingų koncentracijų trolokso tirpalai (8000 μmol/l, 4000 μmol/l, 2000 μmol/l, 1000 μmol/l, 500 μmol/l). Išmatavus absorbcijas, braižoma trolokso kalibracinė kreivė (8 pav.).
8 pav. Trolokso kalibracinė kreivė
Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEFRAP) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:
TEFRAP
c ×V
m ; mg/g
c – trolokso koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g)
2.6.4. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas
Bendras proantocianidinų kiekis nustatomas spektrofotometriniu metodu, panaudojant DMAC reagentą. Ruošiamas 0,1 proc. DMAC reagentas – 0,05 g 4-dimetilaminocinamaldehido miltelių ištirpinami 50 ml parūgštinto etanolio. 4 ml paruošto DMAC reagento sumaišoma su 40 μl tiriamojo ekstrakto. Mišinys gerai sumaišomas ir laikomas tamsoje 15 minučių. Spektrofotometru išmatuojama absorbcija esant 640 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj ekstrakto dedama ekstrahento, t.y. 60 proc. etanolio.
Etaloniniai epikatechino ruošiami taip pat, tik vietoj ekstrakto pilama 5 skirtingų koncentracijų epikatechino tirpalai (0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,0125 mg/ml). Išmatavu
3,s absorbcijas, braižoma epikatechino kalibracinė kreivė (9 pav.).
9 pav. Epikatechino kalibracinė kreivė
Bendras proantocianidinų kiekis išreiškiamas epikatechino ekvivalentais gramui žaliavos (CE). Apskaičiuojama pagal formulę:
CE c ×V
m ; mg/g
c – katechino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.6.5. Proantocianidinų išskyrimas iš bruknių lapų ekstraktų ir jų kiekio
nustatymas liofilizuotoje frakcijoje
Proantocianidinų kiekio nustatymas atliekamas pagal Kennedy ir kt. 2002, Hellstrom ir kt. 2007 aprašytą metodiką su nedidelėmis modifikacijomis [42,43].
Ruošiami bruknių lapų ekstraktai, naudojant skirtingus ekstrahentus. Atsveriama 40 g vaistinės augalinės žaliavos ir užpilama 250 ml 80 proc. metanoliu. Paruoštas mišinys veikiamas ultragarsu 15 minučių. Filtruojama, o nuosėdos praplaunamos 250 ml 80 proc. metanoliu. Mišinys vėl 15 minučių veikiamas ultragarsu, filtruojama. Viskas kartojama dar du kartus, kol gaunama apie 1 litras metanolinio bruknių lapų ekstrakto. Rotorinio garintuvo pagalba metanolinė frakcija išgarinama ir surenkama 200 ml vandeninio bruknių lapo ekstrakto, kuris užšaldomas. Kitas ekstraktas ruošiamas atsveriant 40 g bruknių lapų ir užpilant 250 ml 60 proc. acetono. Nuolat pamaišant mišinys paliekamas 24 h. Filtruojama, o gautas acetoninis ekstraktas garinamas su rotoriniu garintuvu. Gaunama apie 100 ml vandeninės fazės, kuri užšaldoma, siekiant palaikyti tinkamas laikymo sąlygas.
Sephadex LH-20 kolonėlė paruošiama gelio filtravimo medžiagą sefadeksą išbrinkinant 25 ml 50 proc. metanolio tirpalo. Atskirais bandymais į kolonėlę pilama skirtingais ekstrahentais gauti vandeniniai ekstraktai. Siekiant pašalinti fenolines rūgštis ir kitas priemaišas, kolonėlė praplaunama
100 ml 50 proc. metanolio iki skaidrios eliuato spalvos. Tada kolonėlė plaunama 50 ml 70 proc. acetono ir surenkama tamsiai rudos spalvos proantocianidinų frakcija. Gauta proantocianidinų frakcija liofilizuojama.
Iš bruknių lapų ekstraktų išskirta ir liofilizuota proantocianidinų frakcija ištirta kiekybiškai. Nustatant bendrą proantocianidinų kiekį bruknių lapų ekstraktuose su DMAC reagentu gali sureaguoti ir kiti fenoliniai junginiai, todėl atliekant liofilizuotos proantocianidinų frakcijos kiekybinę analizę nustatomas tikslesnis proantocianidinų kiekis. Proantocianidinų kiekio nustatymui liofilizuotoje frakcijoje ruošiamas 0,1 proc. etanolinis ekstraktas – 25 mg augalinės žaliavos užpilama 25 ml 60 proc. etanolio. Bendras proantocianidinų kiekis nustatomas analogiškai kaip 2.6.4. skyriuje aprašytoje metodikoje, tik vietoj tiriamojo ekstrakto pilama 0,1 proc. etanolinis ekstraktas.
2.6.6. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ESC metodu
ESC analizė atlikta naudojant Water e2695 Alliance sistemą su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 2998. Buvo naudojama 3 μm ACE analitinė kolonėlė (C18, 150 mm x 4,6 mm). Gradientas sudarytas iš A eliuento (0,05 proc. trifluoracto rūgštis) ir B eliuento (acetonitrilas). Naudotas gradiento kitimas: 0-5 min – 12 proc. tirpiklis B, 5-50 min – 12-30 proc. tirpiklis B, 50-51 min – 30-90 proc. tirpiklis B, 51-56 min – 90 proc. tirpiklis B, 57 min – 12 proc. tirpiklis B. Tėkmės greitis 0,5 ml/min, injekcijos tūris 10 μl. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analitės ir etaloninio mėginio sulaikymo trukmę ir UV absorbcijos spektrus.
2.7. Statistinė duomenų analizė
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų nustatymas.
Efektyvios ekstrakcijos parinkimas užtikrina tinkamą fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį. Siekiant įvertinti tinkamiausią ekstrahentą buvo atliktas bendras fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas, panaudojant įvairių koncentracijų etanolio ir vandens mišinius. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad siekiant didesnės fenolinių junginių išeigos iš bruknių lapų, ekstrakcijai naudojamas acetonas arba metanolis. Tačiau šie ekstrahentai yra toksiški, todėl norint ekstraktus panaudoti maisto ar kosmetikos pramonėje, pirmenybė teikiama įvairių koncentracijų etanolio ir vandens mišiniams [2]. Ekstrakcija atlikta ultragarso vonioje, ekstrakcijos laiko trukmė – 15 minučių. Gauti bendro fenolinių junginių kiekio rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle.
10 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) bruknių lapų ekstraktuose, naudojant skirtingos koncentracijos etanolio ir vandens mišinius; skirtingos raidės žymi statistiškai
reikšmingus skirtumus (p<0,05).
Didžiausias fenolinių junginių kiekis (p<0,05) lyginant su kitos koncentracijos etanolio ir vandens mišiniais, gautas ekstrahuojant bruknių lapų augalinę žaliavą 60 proc. etanoliu (194,34 ± 5,94 mg/g) arba 80 proc. etanoliu (182,53 ± 1,6 mg/g). Statistiškai reikšmingų pokyčių tarp šių dviejų ekstrahentų nebuvo. Ekstrahuojant vandeniu ir 96 proc. etanoliu nustatytas mažiausias fenolinių junginių kiekis (p<0,05), atitinkamai 154,04 ± 9,64 mg/g ir 143,96 ± 10,03 mg/g. Dėl šios priežasties tęsti tolimesnius bandymus su šiais ekstrahentais yra netikslinga. Rezultatų patikimumui taip pat buvo atlikti antioksidantinio aktyvumo tyrimai su skirtingos koncentracijos etanolio ir vandens mišiniais. Gauti rezultatai pavaizduoti 11 paveiksle.
11 pav. Antioksidantinis aktyvumas (mg/g), naudojant skirtingos koncentracijos etanolio ir vandens mišinius; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus (p<0,05).
Didžiausias (p<0,05) antioksidantinis aktyvumas FRAP metodu yra ekstrahentu naudojant 60 proc. etanolį (724,28 ± 33,56 mg/g) ir 80 proc. etanolį (782,76 ± 37,78 mg/g), tuo tarpu ABTS metodu – naudojant 60 proc. etanolį (1912,85 ± 115,01 mg/g) ir 70 proc. etanolį (2098,44 ± 109,75 mg/g). Abiem metodais nustatyta, kad silpniausias (p<0,05) antioksidantinis aktyvumas yra ekstrakcijai naudojant vandenį ir 96 proc. etanolį – šie rezultatai sutampa su prieš tai atliktu bendro fenolinių junginių kiekio nustatymu.
Apibendrinat gautus rezultatus galima teigti, kad bruknių lapams optimalus ekstrakcijos tirpiklis yra 60 proc. etanolis. Užtikrinant geriausią fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, tolimesniuose etapuose buvo taikomos nustatytos ekstrakcijos sąlygos – augalinė vaistinė žaliava ekstrahuojama 60 proc. etanoliu ultragarso vonioje 15 minučių.
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas bruknių lapų ekstraktuose
3.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio kitimas vegetacijos eigoje skirtingose
augavietėse
Palyginus keturias skirtingas augavietes nustatyti reikšmingi fenolinių junginių kiekio skirtumai. Fenolinių junginių kiekio kitimas vegetacijos eigoje pavaizduotas 12 paveiksle. Fenolinių junginių kiekis Jurgežerių kaime viso augalo vegetacijos metu statistiškai reikšmingai skiriasi (p<0,05). Bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 146,95 ± 2,97 mg/g (birželio 21 d.) iki 190,78 ± 4,47 mg/g (balandžio 20 d.). Nustatytas vidutinis fenolinių junginių kiekis siekia 160,25 mg/g. Didžiausias (p<0,05) šių biologiškai aktyvių junginių kiekis nustatytas balandžio 20 d rinktoje
augalinėje žaliavoje ir jis statistiškai reikšmingai skiriasi nuo kitu metu rinktų žaliavų rezultatų. Atsižvelgiant į 2017 metų klimatines sąlygas, tuo metu buvo prasidėjęs žiedinių pumpurų sprogimas ir vegetatyvinių pumpurų brinkimas. Mažiausi (p<0,05) fenolinių junginių kiekiai nustatyti birželio, liepos, rugpjūčio mėnesiais, esant žydėjimo ir bendram derėjimo periodui.
Varėnos rajone Mardasavo kaime rinktoje augalinėje žaliavoje esančių fenolinių junginių kiekis statistiškai reikšmingai skiriasi (p<0,05). Bendras fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 91,64 ± 2,48 mg/g iki 194,66 ± 2,26 mg/g, o nustatytas vidutinis fenolinių junginių kiekis siekia 155 mg/g. Didžiausias (p<0,05) fenolinių junginių kiekis nustatytas gegužės 12 dieną rinktuose bruknių lapuose, formuojantis žiedynui. Lyginant fenolinių junginių kiekį Jurgežerių kaime, Kalvarijos sav. ir Mardasavo kaime, Varėnos raj., pastaroji vietovė buvo gausesnė biologiškai aktyvių medžiagų kiekiu, tačiau didžiausias kiekis nustatytas maždaug mėnesiu vėliau nei Jurgežerių kaime. Galima daryti prielaidą, kad tai lėmė klimatinės sąlygos – Varėnos klimatas labiau kontinentinis nei kitose vietose, dažnesnės vėlyvos šalnos, dėl ko gali sulėtėti augalo vegetacija. Gegužės pabaigoje ir birželio pradžioje stebimas mažiausias (p<0,05) fenolinių junginių kiekis – maždaug 1,5 karto mažesnis nei vidutinis. Staigų fenolinių junginių sumažėjimą galėjo lemti klimatinės sąlygos - sumažėjusi oro temperetūra ar sumažėjęs kritulių kiekis. Analizuojant visą vegetacijos eigą, stebima tokia pati tendencija, kaip ir Jurgežeriuose rinktoje žaliavoje – vegetacijos pradžioje fenolinių junginių daugiausia, uogų derėjimo metu kiekis sumažėja, o vegetacijos pabaigoje kiekis tampa panašus į pradžioje buvusį.
Prienuose ir Balkasodyje augalinė vaistinė žaliava pradėta rinkti vėliau – nuo gegužės vidurio, todėl vertinti ir lyginti vegetacijos pradžioje esantį fenolinių junginių kiekį tarp skirtingų augaviečių negalima. Nustatyta, kad vidutinis fenolinių junginių kiekis Prienuose yra 121,12 mg/g, o Balkasodyje – 114,95 mg/g. Lyginant su kitose vietose rinktais bruknių lapais, šiose augavietėse bendras fenolinių junginių kiekis yra mažesnis. Didžiausias fenolinių junginių kiekis (p<0,05) Prienuose nustatytas rugsėjo 22 d., derėjimo periodui einant į pabaigą ir siekė 170,25 ± 5,93 mg/g, tuo tarpu Balkasodyje didžiausias (p<0,05) kiekis nustatytas vėliau, spalio 6 d., vegetacijos pabaigoje ir siekė 143,38 ± 3,61 mg/g. Mažiausias (p<0,05) fenolinių junginių kiekis tiek Prienuose, tiek Balkasodyje nustatytas gegužės, birželio ir liepos mėnesiais, žydėjimo, ūglių augimo ir derėjimo periodu. Atlikus statistinę analizę tarp skirtingose vietovėse rinktų bruknių lapų nustatyta vidutinė koreliacija tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo (R=0,574, p<0,05).
kitose augalo dalyse – stiebuose ir uogose [8]. Duda-Chodak ir kt. 2009 nustatė fenolinių junginių kiekį tarp penkiolikos skirtingų augalų. Metanoliniai ekstraktai lyginant su vandeniniais pasižymėjo didesne fenolinių junginių išeiga. Nustatyta, kad bruknių lapų metanoliniuose ekstraktuose fenolinių junginių kiekis siekė 199,6 mg/g – beveik dvigubai daugiau nei gudobelių žieduose, jonažolių žolėje, ąžuolų žievėje. Esktrahentu naudojant vandenį, fenolinių junginių kiekis bruknių lapų ekstraktuose sumažėjo daugiau nei du kartus – 80,7 mg/g [44].
Apibendrinant galima teigti, kad Jurgežeriuose (Kalvarijos sav.) rinktuose bruknių lapuose fenolinių junginių kiekis yra didžiausias, o Balkasodyje (Alytaus raj.) mažiausias. Taip pat rezultatai patvirtina hipotezę, kad fenolinių junginių kiekis priklauso nuo augalo vegetacijos ir didžiausias jų kiekis būna vegetacijos pradžioje ir pabaigoje, o uogų derėjimo metu biologiškai aktyvių medžiagų bruknių lapuose sumažėja.
12 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) skirtingose augavietėse augalo vegetacijos fazėmis. 0 50 100 150 200 250 04.07 04.20 04.28-30 05.12-13 05.18-20 05.27-28 06.02-04 06.18-21 K o ncent ra cij a , m g /g
Jurgežeriai Mardasavas Prienai Balkasodis
Vegetacijos pradžia, pumpurų brinkimas ir sprogimas
Žiedyno formavimąsis, žydėjimo periodas 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 07.01-03 07.14-15 07.27-30 08.15-20 09.02-05 09.22-25 10.05-06 K o ncent ra cij a , m g /g
Jurgežeriai Mardasavas Prienai Balkasodis
Uogų formavimosi
periodas Bendras derėjimo periodas
12 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) skirtingose augavietėse augalo vegetacijos fazėmis (tęsinys).
3.2.2. Fenolinių junginių kiekio kitimas skirtingose augalo veislėse
Bendras fenolinių junginių kiekis tarp dvylikos skirtingų bruknių veislių lapų pavaizduotas 13 paveiksle. Nustatyta, kad fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 72,43 ± 2,28 mg/g ('Erntedank') iki 183,69 ± 1,34 mg/g ('Rubin'). Apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekio vidurkis, kuris siekia 128,1 mg/g. Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad didžiausias (p<0,05) fenolinių junginių kiekis yra 'Rubin' ir 'Kostromskaja rozovaja' bruknių lapų ekstraktuose. Mažiausias fenolinių junginių kiekis (p<0,05) nustatytas 'Erntedank' veislės bruknių lapuose – beveik 2 kartus mažiau nei vidutinis fenolinių junginių kiekis ir 2,5 karto mažiau nei didžiausias fenolinių junginių kiekis. Atlikus statistinę analizę nustatyta stipri koreliacija tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir redukcinio aktyvumo skirtingose bruknių veislėse (R 0,818, p<0,05).
13 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) bruknių veislėse; skirtingos raidės žymi statistiškai reikšmingus skirtumus (p<0,05).
3.3. Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas bruknių lapų ekstraktuose
3.3.1. Laisvųjų radikalų surišimo gebos kitimas vegetacijos eigoje skirtingose
augavietėse
Palyginus laisvųjų radikalų surišimo gebą tarp keturių augaviečių pastebimi statistiškai reikšmingi pokyčiai. Laisvųjų radikalų surišimo gebos kitimas vegetacijos eigoje pavaizduotas 14
paveiksle. Vertinant laisvųjų radikalų surišimą Jurgežerių kaime rinktuose bruknių lapuose, nustatyta, kad didžiausias (p<0,05) antioksidantinis aktyvumas nustatytas rugpjūčio 15 d. rinktoje žaliavoje, bendro derėjimo periodu, uogų nokimo metu. Stiprus antioksidantinis aktyvumas nustatytas ir vegetacijos pradžioje, balandžio mėnesį, žiedinių pumpurų brinkimo metu. Laisvųjų radikalų surišimo geba bruknių lapų ekstraktuose svyruoja nuo 1853,85 ± 110,68 mg/g iki 4836,39 ± 156,01 mg/g. Nustatyta, kad vidutinis antioksidantinis aktyvumas yra 3130,98 mg/g. Ūglių augimo metu, formuojantis žiedynui ir bendro derėjimo pradžioje laisvųjų radikalų surišimas yra panašus į vidutinį ir tarpusavyje statistiškai reikšmingai nesiskiria. Silpniausias (p<0,05) antioksidantinis aktyvumas nustatytas rugsėjo 2 d. rinktoje žaliavoje (derėjimo periodo pabaigoje) – maždaug 1,5 karto mažiau nei vidutinė ir 2,5 karto mažiau nei didžiausia laivųjų radikalų surišimo geba.
Vertinant laisvųjų radikalų surišimą Mardasavo kaime, Varėnos rajone rinktuose bruknių lapuose nustatyti statistiškai reikšmingi pokyčiai. Vidutinis laisvųjų radikalų surišimas siekia 2542,13 mg/g, o svyruoja nuo 1657,22 ± 107,17 iki 3409,15 ± 146,79 mg/g. Didžiausias (p<0,05) antioksidantinis aktyvumas nustatytas derėjimo periodo pabaigoje, rugpjūčio viduryje ir rugsėjo pradžioje. Vegetacijos pradžioje, sprogstant vegetatyviniams ir žiediniams pumpurams laisvųjų radikalų surišimas siekia vidutinę reikšmę. Gegužės ir birželio mėnesiais, masinio žydėjimo metu nustatyta mažiausias (p<0,05) laisvųjų radikalų surišimo geba. Lyginant su Jurgežeriuose rinkta žaliava, Varėnoje rinkti bruknių lapai pasižymėjo silpnesniu antioksidantiniu aktyvumu. Skirtumas tarp dviejų augaviečių yra tai, kad Jurgežeriuose rinktuose bruknių lapuose mažiausias antioksidantinis aktyvumas nustatymas vegetacijai einant į pabaigą, rugsėjo mėnesį, o Varėnoje rinktoje žaliavoje atvirkščiai – vasaros pradžioje. Vis dėlto abiejose augavietėse stipriausias laisvųjų radikalų surišimas nustatytas tokiu pačiu metu, bendro derėjimo periodu, rugpjūčio mėnesį.
Prienuose ir Balkasodyje bruknių augalinė žaliava pradėta rinkti vėliau, todėl vertinti skirtumus tarp keturių skirtingų augaviečių vegetacijos pradžioje negalima. Vidutinė laisvųjų radikalų surišimo geba Prienuose rinktoje žaliavoje yra 1867,21 mg/g. Vertinant antioksidantinį aktyvumą augalo vegetacijos metu, pastebima, kad birželio 18 d. antioksidantinis aktyvumas yra didžiausias (p<0,05) ir siekia 2558,17 ± 157,92 mg/g. Silpniausias (p<0,05) laisvųjų radikalų surišimas Prienuose rinktoje žaliavoje nustatytas liepos mėnesį, derėjimo periodu ir spalį, vegetacijai einant į pabaigą. Tuo tarpu Balkasodyje rinktuose bruknių lapuose antioksidantinis aktyvumas ženkliai skiriasi. Didžiausias (p<0,05) laisvųjų radikalų surišimas nustatytas gegužės 20 d., pavasarinio žydėjimo metu. Nustatyta, kad silpniausias antioksidantis aktyvumas nustatytas birželio – spalio mėnesiais, statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių mėnesių nebuvo.
žolės ir gudobelių žiedų antioksidantinis aktyvumas buvo du kartus mažesnis lyginant su bruknių lapais. Ekstrahentu naudojant vandenį, antioksidantinis aktyvumas sumažėjo, tačiau bruknių lapuose vis tiek išliko didžiausias (1136,2 mg/g) [44].
14 pav. Laisvųjų radikalų surišimo geba (mg/g) skirtingose augavietėse augalo vegetacijos metu.
14 pav. Laisvųjų radikalų surišimo geba (mg/g) skirtingose augavietėse augalo vegetacijos metu (tęsinys).
3.3.2. Laisvųjų radikalų surišimo gebos kitimas skirtingose veislėse
Laisvųjų radikalų surišimo gebos rezultatai pavaizduoti 15 paveiksle. Nustatyta, kad antioksidantinis aktyvumas bruknių veislių ekstraktuose svyruoja nuo 620,49 ± 109,59 mg/g ('Vaccinium vitis-idaea subsp. minus') iki 2179,71 ± 154,88 mg/g ('Erntesegen'). Įvertinus laisvųjų radikalų surišimo gebą, nustatytas dvylikos veislių vidurkis – jis siekia 1188,04 mg/g. Analizuojant
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 04.07 04.20 04.28-30 05.12-13 05.18-20 05.27-28 06.02-04 06.18-21 L as iv ųjų ra dik alų suriš im o geba , m g /g
Jurgežeriai Mardasavas Prienai Balkasodis
Vegetacijos pradžia, pumpurų brinkimas ir sprogimas
Žiedyno formavimąsis, žydėjimo periodas 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 07.01-03 07.14-15 07.27-30 08.15-20 09.02-05 09.22-25 10.05-06 L ais vųjų ra dik alų suriš im o geba , m g /g
Jurgežeriai Mardasavas Prienai Balkasodis
Uogų formavimosi
periodas Bendras derėjimo periodas
