LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
IGNAS POPA
LIETUVOJE KULTIVUOJAMOS PLUOŠTINĖS KANAPĖS
(CANNABIS SATIVA L.) EKSTRAKTO ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO IR KANABIDIOLIO DINAMIKOS ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Vidmantas Dirsė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
LIETUVOJE KULTIVUOJAMOS PLUOŠTINĖS KANAPĖS
(CANNABIS SATIVA L.) EKSTRAKTO ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO IR KANABIDIOLIO DINAMIKOS ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovas:
doc. dr. Vidmantas Dirsė
Darbą atliko:
Magistrantas Ignas Popa
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
1.1. Cannabis sativa L. botaninė charakteristika ... 12
1.2. Cheminė Cannabis sativa L. charakteristika ... 12
1.2.1. Cheminė kanabinoidų klasifikacija ... 13
1.2.2. Fitocheminė kanabinoidų klasifikacija ir kanabinoidų stabilumas ... 13
1.2.3. Junginiai pasiţymintys antioksidaciniu aktyvumu aptinkami Cananbis sativa L. ... 15
1.2.4. Įvairių veiksnių įtaka kanabinoidų kiekiui Cannabis sativa L. ţaliavoje ... 15
1.3. Analizės metodai taikomi kanabinoidų kiekybinėje ir kokybinėje analizėje Cannabis sativa L. augalinėje ţaliavoje ... 16
1.4. Antioksidacinio aktyvumo svarba ţmogaus organizmui bei antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 16
1.5. Kanabidiolis – farmakologinės bei fizikocheminės savybės ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo objektas ... 20
2.1.1. Cannabis sativa L. vegetacijos fazių identifikavimas ... 21
2.1.2. Pluoštinės kanapės mėginių dţiovinimas ir išdţiovintos ţaliavos kokybės vertinimas... 22
2.2. Reagentai ... 22
2.3. Aparatūra ... 23
2.4. Cannabis sativa L. ekstraktų ruošimas ... 24
2.4.1. Pluoštinių kanapių ekstraktų ruošimas ESC analizės metodui norint įvertinti kanabidiolio koncentraciją ... 24
2.5. Kanabidiolio kiekybinis ir kokybinis įvertinimas Cannabis sativa L. ekstraktuose efektyviosios
skysčių chromatografijos metodu ... 25
2.5.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos kiekybinio metodo validacija ... 26
2.6. Kanabidiolio tapatybės nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu ... 27
2.7. Cannabis sativa L. ekstraktų antioksidacinio aktyvumo kitimo nustatymas ... 28
2.8. Statistinė duomenų analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Cannabis sativa L. ţaliavos kokybinis įvertinimas ... 29
3.2. Kanabidiolio identifikavimas ekstraktuose ... 30
3.3. Kanabidiolio kiekybinis įvertinimas skirtingais vegetacijos periodais ... 32
3.3.1. Kiekybinio kanabidiolio nustatymo metodo validacijos parametrų reikšmės ... 35
3.4. Cannabis sativa L. ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 36
4. IŠVADOS ... 39
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 40
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 41
7. MAGISTRO DARBO TEMA SKELBTŲ PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 46
SANTRAUKA
Igno Popos magistro baigiamasis darbas, pavadinimas: Lietuvoje kultivuojamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) ekstrakto antioksidacinio aktyvumo ir kanabidiolio dinamikos įvertinimas/ mokslinis vadovas: doc. Dr. Vidmantas Dirsė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Darbo tikslas – įvertinti Lietuvoje kultivuojamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antţeminės dalies ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ir kanabidiolio kiekio kitimą vegetacijos metu. Darbo uţdaviniai – identifikuoti kanabidiolį Lietuvoje kultivuojamoje pluoštinėje kanapėje Cannabis sativa L., įvertinti kanabidiolio pasiskirstymą bei kiekio kitimą skirtinguose Cannabis sativa L. antţeminiuose organuose vegetacijos metu trijuose Lietuvos regionuose, nustatyti antioksidacinio aktyvumo pasiskirstymą bei kitimą skirtinguose Cannabis sativa L. antţeminiuose organuose vegetacijos metu trijuose Lietuvos regionuose. Tyrime naudoti metodai – efektyvioji skysčių chromatografija buvo naudojama kanabidiolio (CBD) identifikavimui bei kiekybinei dinamikai įvertinti tiriamojoje ţaliavoje, plonasluoksnė chromatografija – CBD identifikavimui tiriamojoje ţaliavoje, spektrofotometrinis FRAP (geleţies redukcijos antioksidacinės galios) metodas – antioksidacinio aktyvumo dinamikai Cannabis sativa L. įvertinimui.
Tyrimo rezultatai: kanabidiolis Cannabis sativa L. ţaliavoje buvo identifikuotas ESC metodu pagal sulaikymo laiką (tR = 7,62±0,061 min) ir UV spektrometrinius duomenis (λmaks1 = 206,2 nm ir
λmaks2 = 271,5 nm), bei PC metodu pagal sulaikymo faktorių (Rf = 0,53). Efektyviosios skysčių
chromatografijos metodu įvertinus kanabidiolio dinamiką skirtinguose Cannabis sativa L. organuose nustatyta, jog didţiausios CBD koncentracijos tirtuose regionuose yra ţieduose (p < 0,05), vidutinės – lapuose, maţiausios – stiebuose (p > 0,05) visos augalo vegetacijos metu. Taip pat įvertinus kanabidiolio kitimą skirtingomis vegetacijos fazėmis rinktuose mėginiuose nustatyta, jog didţiausia CBD koncentracija ţieduose ir lapuose aptinkama ţydėjimo pradţioje visuose regionuose (p < 0,05). Spektrofotometriniu būdu įvertinus antioksidacinio aktyvumo kitimą Cannabis sativa L. ţaliavoje visuose pasirinktuose regionuose buvo nustyta, jog ţieduose troloksui ekvivalentiška antioksidacinė galia (TEAC) laipsniškai maţėja augalui vystantis, lapuose TEAC maksimumas pasiekiamas ţydėjimo pabaigoje, vėlesniu vegetacijos metu stebimas TEAC maţėjimas, o stiebuose nuo vegetacijos priklausomo bei dėsningo TEAC kitimo nebuvo nustatyta. Stiebuose buvo nustatytos maţiausios TEAC reikšmės visuose regionuose (p < 0,05), o dėsningo TEAC pasiskirstymo tarp ţiedų ir lapų, stiebų lyginant skirtinguose regionuose ištirtą ţaliavą nustatyta nebuvo .
SUMMARY
Master thesis of Ignas Popa. Evaluation of cannabidiol and extracts antioxidant activity dynamics in Lithuania cultivated hemp (Cannabis sativa L.)/ scientific supervisor: doc. Dr. Vidmantas dirsė; Lithuanian university of health sciences Faculty of medicine Department of analytical and toxicological chemistry. – Kaunas.
The aim of the study is to evaluate cannabidiol and extracts antioxidant activity dynamics in aerial parts of hemp (Cannabis sativa L.) during plant vegetation. Tasks of the study were to identify cannabidiol in Lithuania cultivated hemp (Cannabis sativa L.), to evaluate cannabidiol distribution and dynamics in Cannabis sativa L aerial parts collected from three different regions in Lithuania during plant vegetation, to determine antioxidant activity distribution and dynamics in Cannabis sativa L aerial parts collected from three different regions in Lithuania during plant vegetation. Methods – high pressure liquid chromatography was used to identify cananbidiol (CBD) and quantify CBD dynamics in the raw material, thin layer chromatography was used for CBD identification, spectrophotometric FRAP method – to determine antioxidant activity dynamics in Cannabis sativa L.
The results – cannabidiol in Cannabis sativa raw material was identified by retention time (tR
= 7,62±0,061 min) and UV spectrometric data (λmax1 = 206,2 nm ir λmax2 = 271,5 nm) using HPLC and
by retention factor (Rf = 0,53) using TLC. After evaluation of cannabidiol dynamics in different
Cannabis sativa L. parts using high pressure liquid chromatography the highest CBD concentrations was determined in flowers (p < 0,05), moderate – in leaves, lowest – in stems (p > 0,05) during plant vegetation. After evaluation of cananbidiol dynamics during different vegetation phases, highest CBD concentrations in flowers and leaves was observed during beginning of flowering (p < 0,05). After spectrophotometric evaluation of antioxidant activity dynamics in Cannabis sativa L. raw material collected in selected Lithuania regions it was determined that: trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) in flowers gradually decreases during plant vegetation, in flowers TEAC reaches its peak during end of flowering and during furthers vegetation phases gradually decreases, in stems constant TEAC dynamics dependant on plant vegetation was not observed. Regular antioxidant activity distribution between plant parts (flowers, leaves, stems) was not observed. Lowest TEAC results was observed in stems collected from all selected regions (p < 0,05), but regular TEAC dynamics between flowers and leaves collected in celected regions was not observed.
PADĖKA
Dėkoju doc. Dr. Vidmantui Dirsei uţ pagalbą ir patarimus ruošiant baigiamąjį magistro darbą. Dėkoju analizinės ir toksikologinės chemijos katedros doktorantui Mindaugui Marksai uţ pagalbą dirbant analitinėje laboratorijoje. Dėkoju UAB „Agropro“ uţ tarpininkavimą bei augalinės ţaliavos ir standarto suteikimą.
SANTRUMPOS
ABTS –2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (angl. 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid))
CBD – kanabidiolis (angl. cannabidiol) CBN – kanabinolis (angl. cannabinol)
CUPRAC – Vario redukcijos antioksidantinė galia (angl. Cupric reducing antioxidant capacity)
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas (angl. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
ET – elektrono pernaša (angl. electron transfer)
FRAP – geleţies redukcinė antioksidacinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) HAT – vandenilio atomo pernaša (angl. hydrogen atom transfer)
n – imtis
PC – plonasluoksnė chromatografija R2 – regresijos koeficientas
SSN – santykinis standartinis nuokrypis
THC – tetrahidrokanabinolis (angl. tetrahydrocannabinol)
THCA – tetrahidrokanabinolinė rūgštis (angl. tetrahydrocannabinolic acid)
TRAP – antioksidanto sugaudytų radikalų suminis matas (angl. total radical trapping antioxidant parameter
ĮVADAS
Fitoterapinis augalų panaudojimas medicinoje su kiekviena diena tampa svarbesnis įvairių ligų profilaktikoje ar net jų gydyme [1].
Augalinių vaistinių preparatų rinka pasaulyje siekia 60 milijardų JAV dolerių. Įvairių patentų, susijusių su augaliniais vaistiniai preparatais ar augalų panaudojimu medicinoje, skaičiaus augimas byloja apie fitocheminių vaistų aktualumą bei pramoninių įmonių susidomėjimą vaistiniais augalais. Apytiksliai 75 000 augalų rūšių yra naudojama tradicinėje medicinoje, tačiau tik 1 % šių augalų panaudojimo yra patvirtintas moksliniais tyrimais [2].
Cannabis sativa L. yra viena seniausiai kultivuojamų augalų rūšių. Nepriklausomai nuo chemotipo šis augalas turi didelę ekonominę vertę. Cannabis sativa L. gali būti naudojama kaip pluošto šaltinis įvairių nanopolimerų gamyboje, kuras, taip pat iš sėklų aliejaus gaminami įvairūs produktai kosmetikos bei maisto pramonei. Sėklų aliejus taip pat pasiţymi potencialiu teigiamu farmakologiniu poveikiu sergant diabetu, vėţiu, vilklige, astma, reumatoidiniu artritu, depresija bei hipertenzija [3]. Kanabinoidai, tai terpenofenolinių junginių grupė būdinga Cannabaceae šeimos augalams. Sintetiniai ar natūraliai išgauti kanabinoidai pasiţymi teigiamomis terapinėmis savybėmis vartojant juos kaip antiemetinę priemonę, apetitą skatinančią priemonę, analgetikus, išsėtinės sklerozės simptomų malšinimui, Tourett„o sindromo, epilepsijos kontrolei ar glaukomos simptomams malšinti [1]. Dėl kanabidiolio ir tetrahidrokanabinolio farmakologinio efektyvumo malšinant išsėtinės sklerozės sukeliamą spastiškumą vaistas Sativex®, kurio veikliosios medţiagos yra minėti kanabinoidai, yra leidţiamas registruotas 27 pasaulio šalyse, 12 iš jų – Europos šalys [4]. Minėtas vaistas pasiţymi reikšmingu analgeziniu poveikiu sergant reumatoidiniu artritu [5]. Taip pat 2014 metais birţelio 6 dieną Amerikos maisto ir vaistų administracija (angl. Food and drug administration – FDA) sutiko leisti atlikti klinikinius tyrimus vaistui Epidiolex®, kurio farmakologiškai aktyvi medţiaga yra kanabidiolis. Šiais klinikiniais tyrimais bus siekiama įrodyti šio vaisto efektyvumą esant sunkiai kūdikių miokloninei epilepsijai (Dravet sindromui) [6]. Šie augaliniai vaistai pasiţymi maţesniu toksiškumu nei toms pačioms indikacijoms skirti sintetiniai vaistai [4,5,6], todėl tolimesni tyrimai su Cannabis sativa L. augaline ţaliava ir jose esančiomis biologiškai aktyviomis medţiagomis yra aktualūs ir svarbūs.
Dėl Cannabis sativa L. chemotaksonominės įvairovės (1 lentelė) augalo kultivavimo kontrolė yra būtina. Lietuvoje pluoštinių kanapių (Cannabis sativa L.) kultivavimas buvo įteisintas 2014 metų sausio 1d. įsigaliojus Lietuvos Respublikos pluoštinių kanapių įstatymui Nr. XII-336. LR leidţiama auginti pluoštines kanapes, jeigu THC kiekis jose neviršija 0,2 procento. Pluoštinių kanapių auginimą priţiūri Valstybinė augalininkystės tarnyba prie Ţemės ūkio ministerijos, o THC kiekį Cannabis sativa L. augaluose tiria Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto laboratorija [7].
Atsiţvelgiant į platų Cannabis sativa L. panaudojimą bei į tai, jog Lietuvoje reglamentuojama tik THC koncentracija kanapėse, todėl aktualūs tyrimai susiję su kitų biologiškai aktyvių Cannabis sativa L. junginių įvertinimu. Remiantis atlikta literatūros apţvalga buvo pastebėta, jog yra tik keletas tyrimų susijusių su antioksidacinio aktyvumo įvertinimu Cannabis sativa L. Norint teisingai atlikti Cannabis sativa L. fitocheminių junginių analizę būtina vystyti, validuoti ir pritaikyti kuo įvairesnius analizės metodus.
Šio tyrimo objektas yra Lietuvoje UAB „Agropro“ kultivuojamos Cannabis sativa L. Finola veislės, moteriškosios lyties augalų, antţeminė dalis.
Darbo tikslas – įvertinti Lietuvoje kultivuojamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antţeminės dalies ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ir kanabidiolio kiekio kitimą vegetacijos metu.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:Įvertinti Lietuvoje kultivuojamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.) antţeminės dalies ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ir kanabidiolio kiekio kitimą vegetacijos metu.
Darbo uţdaviniai:
1. Identifikuoti kanabidiolį Lietuvoje kultivuojamoje pluoštinėje kanapėje Cananbis sativa L. 2. Įvertinti kanabidiolio pasiskirstymą bei kiekio kitimą skirtinguose Cannabis sativa L.
organuose vegetacijos metu trijuose Lietuvos regionuose.
3. Nustatyti antioksidacinio aktyvumo pasiskirstymą bei kitimą skirtinguose Cannabis sativa L. organuose vegetacijos metu trijuose Lietuvos regionuose.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Cannabis sativa L. botaninė charakteristika
Pluoštinė kanapė (Cannabis sativa L.), tai dvinamis, vienmetis augalas [8]. Auga saulėtoje ir drėgnoje aplinkoje, derlingame dirvoţemyje. Tam tikros pluoštinių kanapių veislės gali uţaugti iki 3 metrų aukščio, per 4-6 mėnesių augimo periodą [9, 10].
Vyriški augalai iš paţiūros yra aukštesni, tačiau pasiţymi maţesne lapų ir ţiedų gausa. Vyriškų augalų gyvavimo periodas yra trumpesnis, nei moteriškų Cannabis sativa L. augalų [8]. Tiriamojo objekto FINOLA® veislės vyriškos lyties Cannabis sativa L. augalai sunyksta praėjus vidutiniškai 100 dienų po pasodinimo [11].
XY chromosomas turinčiuose augaluose, ţiedynai išsidėstę kabančiomis kekėmis, kurios kartais gali būti šakotos, ţiedų skaičius kintantis. Vyriškos lyties taurelė turi 5 taurėlapius, kurie apgaubia 5 kuokelius. Tokie ţiedai pasiţymi gelsvai ţalia spalva [8, 12].
Moteriškų augalų ţiedynai pasiţymi raceminiu augimu, kaupiasi varpose, stiebų viršūnėje ir lapų paţastyse. Šios lyties augalo ţiedai daţniausiai būna ţali, kartais gali turėti roţinį ar raudoną atspalvį [8, 12].
Vaisiai balti ar ţalsvi, pavieniai, vaisių dydis apytiksliai 2-5 mm, vaisiai uţdari [12].
Šis augalas yra kilęs iš Kinijos, Centrinės Azijos šalių, tačiau dabar yra ganėtinai paplitęs vidutinio ir tropinio klimato šalyse [12].
1.2. Cheminė Cannabis sativa L. charakteristika
Cannabinaceae šeimos augalai pasiţymi išskirtinai didele įvairove kaupiamų cheminių junginių. Remiantis naujausiais tyrimais, Cannabis savo sudėtyje turi apie 483 junginius, apie 70 junginių iš visos cheminių junginių skalės sudaro kanabinoidai. Kanabinoidai – tai grupė cheminių junginių savo struktūroje turinčių 21 C atomą ir priskiriami terpenofenoliniams junginiams. Dėl sintetinių kanabinoidų (deksanabinolio, ajuleminės rūgšties ir kt.) atsiradimo ir endogeninių kanabinoidų (anandamido, 2-arachidonoilglicerolio) atradimo kanabinoidai išgauti iš Cannabis sativa L. gali būti vadinami fitokanabinoidais [10,13].
Pluoštinėse kanapėse be kanabinoidų galima rasti ir kitų biologiškai aktyvių junginių: flavonoidų glikozidų, flavonoidų, laktonų, steroidų, terpenų, cukrų, azoto turinčių junginių, glikoproteinų, rūgščių (sočiųjų ir paprastųjų) ir kt. [12,14].
Cannabis genties augalai gali būti klasifikuojami pagal dominuojančius kanabinoidus į 5 pagrindinius chemotipus: I chemotipas – narkotinės kanapės, II – vidutinio tipo kanapės, III – pluoštinės kanapės, IV – kanabigerolį kaupiančios kanapės, V – ne kanabinoidinės kanapės. Rečiausiai pasitaikantys yra IV ir V tipo fenotipai. 1 lentelėje pateiktos preliminarios kanabinoidų koncentracijos minėtuose kanapių chemotipuose [15].
1 lentelė Kanabinoidų koncentracijos skirtinguose kanapių chemotipuose. Lentelė modifikuota iš Pacifico D. Ir kt.(2006) [15]
Chemotipas THC CBD CBD:THC CBG:CBD
I (narkotinio tipo) 0,5 – 15 % 0,01 – 0,16% < 0,02 ~0,5 II (vidutinio tipo) 0,5 – 5 % 0,9 – 7,3% 0,6 – 4 ~0,1 III (pluoštinio tipo) 0,05 – 0,7% 1,0 – 13,6% > 5 ~ 0,05
IV (CBG tipo) < 0,05% < 0,5% – > 0,5
V (ne kanabinoidinio tipo) 0 0 – –
1.2.1. Cheminė kanabinoidų klasifikacija
Kanabinoidai pagal cheminę struktūrą gali būti suskirstyti į 10 pagrindinių grupių. Išskiriama 11 grupė įvairių kanabinoidų, kurie neturi vieningos struktūros, ţinoma 14 šios grupės junginių. Iš minėtų 10 grupių, būtų galima įvardinti: kanabigerolio grupę (ţinomi 7 junginiai), kanabidiolio grupė (ţinomi 7 junginiai), Δ8
-tetrahidrokanabinolio grupę (ţinomi 2 junginiai), kanabinolio grupę (ţinomi 7 junginiai), Δ9-tetrahidrokanabinolio grupę (ţinomi 9 junginiai), kanabichromeno grupę (ţinomi 5 junginiai), kanabiciklolio grupę (ţinomi 3 junginiai), kanabielsoino grupę (ţinomi 5 junginiai), kanabitriolio grupę (ţinomi 9 junginiai), kanabinodiolio grupę (ţinomi 2 junginiai). Bendros kanabinoidų grupių struktūrinės formulės pateiktos 1 priede [10].
1.2.2. Fitocheminė kanabinoidų klasifikacija ir kanabinoidų stabilumas
Fitocheminė kanabinoidų klasifikacija atskleidţia skirtingų kanabinoidų labilumą esant tam tikroms išorės sąlygoms.
Fitocheminė kanabinoidų klasifikacija išskiria šias jų grupes: rūgštiniai kanabinoidai, neutralūs kanabinoidai ir dirbtiniai (angl. artifacts) kanabinoidai [10].
Kalbant apie fitochemines kanabinoidų grupes svarbu paminėti, kad neutralių kanabinoidų švieţioje ţaliavoje kiekis yra labai maţas. Didţiąją dalį kanabinoidų švieţioje ţaliavoje sudaro rūgštiniai kanabinoidai [10].
Rūgštiniai kanabinoidai pereina į neutralią formą prarasdami reliatyviai nestabilią karboksilo grupę. Dekarboksilinimas gali įvykti veikiant šviesai (UV spinduliuotei), karščiui ar ilgai laikant sudţiovintą ţaliavą. Dekarboksilinimo reakcija pavaizduota 1 paveikslėlyje [10].
1 pav. Dekarboksilinimo reakcija veikiant išorės veiksniams. Modifikuota iš A. Hazekamp (2009) [10]
Rūgštiniai kanabinoidai, narkotinėse kanapėse aptinkami didesnėmis koncentracijomis, tačiau jų randama ir pluoštinėse kanapėse, bet reikšmingai maţesniais kiekiais (1 lentelė). Šių rūgštinių kanabinoidų atstovai: tetrahidrokanabinolinė rūgštis (THCA), kanabidiolinė rūgštis (CBDA), kanabigerolinė rūgštis (CBGA), kanabichromeninė rūgštis (CBCA). Šios rūgštys dėl dekarboksilinimo reakcijos virsta šiais dekarboksilintais junginiais: Δ9
-tetrahidrokanabinoliu (THC), kanabidioliu (CBD), kanabigeroliu (CBG) ir kanabichromenu (CBC). Kanabinoidų perėjimas iš vienos fitocheminės grupės į kitą pavaizduotas 2 paveiksle [10].
2 pav. Kanabinoidų kitimai vykstant dekarboksilinimui ir degradacijai. I – augalo biosintezės produktai; II – dekarboksilinmo produktai; III – degradacijos produktai (dėl UV, oksidacijos,
izomerizacijos ir kitų faktorių). Schemos autorius A. Hazekamp [10]
Degradacijos produktų, vaizduojamų 1 schemoje, kiekis priklauso nuo įvairių sąlygų visais galimo ţaliavos tyrimo ar naudojimo etapais (auginimo, ţaliavos rinkimo, dţiovinimo ir laikymo, naudojimo). Itin didelis kanabinolio (CBN) kiekis ţaliavoje gali rodyti santykinai ilgą ţaliavos laikymą. CBN kiekis gali padidėti dėl THC degradacijos į CBN bei dėl THC (Δ9
į Δ8
-THC, kur izomerizacijos pusiausvyra nusistovi susidarius didesnei Δ8-THC koncentracijai. Taip pat CBN padidėja dėl THCA degradacijos iki kanabinolinės rūgšties (CBNA), kuri vėliau degraduoja iki CBN. Kanabiciklolinės rūgšties (CBLA) bei kanabiciklolio (CBL) degradaciją reikšmingai įtakoja UV spinduliuotės radiacija, kuri daro įtaka dvigubų jungčių susijungimui molekulėje [10, 13].
Kanabinoidų stabilumas ekstraktuose gali priklausyti nuo anksčiau minėtų aplinkos sąlygų (temperatūros ir šviesos) bei nuo ekstrakcijoje naudojamo ekstrahento. Pastebėta, kad kanabidiolis yra stabilus metanoliniuose, metanolio : chloroformo (9:1 v/v) tirpaluose ir ekstraktuose, tačiau nestabilus chloroformo tirpale ir augalo ekstrakte. Toks stabilumas skirtinguose tirpikliuose yra būdingas ir kitiems rūgštiniams bei neutraliems kanabinoidams [16].
1.2.3. Junginiai pasiţymintys antioksidaciniu aktyvumu aptinkami Cananbis sativa
L.
Iš anksčiau aptartų junginių grupių, kurios yra pateiktos 1.2 skyriaus pradţioje antioksidaciniu aktyvumu pasiţymi flavonoidai ir terpenai [17, 18].
Pagrindiniai flavonoidų klasės atstovai aptinkami kanapėse yra: viteksinas, izoviteksinas, apigeninas, kemferolis, kvercetinas, luteolinas, orientinas bei kanaflavinai [19]. Cannabis sativa L. randamus terpenus galima suklasifikuoti į monoterpenus ir seskviterpeus. Pagrindiniai monoterpenai aptinkami kanapėse yra: α-pinenas, β-pinenas, β-mircenas, limonenas, terpinolenas, cis-ocimenas, linalolis, o seskviterpenai: β-kariofilenas, humulenas, β-eudesmolis, kariofileno oksidas bei trans-nerolidolis [12, 20]. Terpenų atstovai ir jų koncentracijos gali reikšmingai skirtis priklausomai nuo augalo rūšies ir veislės [21].
1.2.4. Įvairių veiksnių įtaka kanabinoidų kiekiui Cannabis sativa L. ţaliavoje
Literatūroje pateikiama keletas veiksnių, kurie lemia kanabinoidų koncentracijų kitimą augalinėje ţaliavoje.
L. Hanuš ir kiti (1994) savo atliktame tyrime pastebėjo, jog kanabidiolio koncentracijų svyravimui reikšmingą įtaką turi dirvoţemiui praturtinti naudojamos trąšos. Remiantis šios studijos duomenimis kalcio citrato + kalcio dihidrofosfato bei kalcio nitrato + kalcio dihidrofosfato + kalio druskų trąšos suteikia maţesnę CBD išeigą, lyginant su kalcio nitrato + kalio druskos ir kalcio dihidrofosfato + kalio druskos trąšomis [22].
Augimvietės temperatūra gali turėti įtakos kanabinoidų koncentracijai, priklausomai nuo augalo genotipo [23]. Stebint išorės temperatūros įtaką kanabinoidų koncentracijų kitimui Cannabis sativa L. augaluose pritaikyti bendrus kitimo principus būtų sudėtinga, nes svarbu ţinoti skirtingam augalo genotipui būdingus dėsningumus.
1.3. Analizės metodai taikomi kanabinoidų kiekybinėje ir kokybinėje analizėje
Cannabis sativa L. augalinėje ţaliavoje
Daţniausiai naudojami metodai analizuojant kanabinoidus Cannabinaceae šeimos augaluose yra dujų ir skysčių chromatografija [24].
Taikant dujų chromatografiją kanabinoidų analizėje rekomenduojami detektoriai yra liepsnos jonizacijos ar masių spektrometrijos detektorius. Taikant dujų chromatografijos metodą, kartu su minėtais detektoriais, galima nustatinėti rūgštinius ir neutralius kanabinoidus, tačiau svarbu atsiţvelgti į rūgštinių kanabinoidų dekarboksilinimą, kuris gali įtakoti tam tikrų kanabinoidų koncentracijas [24].
Skysčių chromatografijos metodas tinkamas nustatinėjant rūgštinius ir neutralius kanabinoidus, tiriant bendrą jų kiekį ir pavienius junginius. Taip pat šio metodo privalumas yra tai, kad išvengiama kanabinoidų dekarboksilinimo, todėl rezultatai yra lengviau interpretuojami [12].
Kanabinoidų tapatybės nustatyme gali būti naudojama pluonasluoksnė chromatografija, efektyvioji plonasluoksnė chromatografija bei branduolio magnetinio rezonanso spektroskopija [12, 25].
Efektyvioji plonasluoksnė chromatografija gali būti taikoma ir kiekybiniame kanabinoidų nustatyme pasitelkiant densitometrijos principus [26].
Taip pat efektyviosios skysčių chromatografijos metodas gali būti taikomas kanabinoidų identifikavimui biologiniuose skysčiuose [27].
Atliekant kanabinoidų analizę dar galima naudoti imunoanalizės metodus, jonų mobilumo masių spektrometriją ar spalvines reakcijas [24].
1.4. Antioksidacinio aktyvumo svarba ţmogaus organizmui bei antioksidacinio
aktyvumo nustatymo metodai
Oksidacinis stresas – tai procesas, kurio metu sutrinka ţmogaus organizmo gebėjimas neutralizuoti perteklinį laisvųjų radikalų susidarymą. Pagrindinės dvi laisvųjų radikalų grupės yra reaktyvios deguonies ir reaktyvios azoto (angl. ROS ir RNS) rūšys. Fiziologiniai šių medţiagų kiekiai
ţmogaus organizme dalyvauja kaip antrinės signalinės molekulės dalyvaujančios homeostazės palaikyme, tačiau jų perteklius gali sukelti aplinkinių audinių paţaidą ar organų patologijas [28]. Norint išvengti oksidacinio streso ţalos organizmui reikalingos antioksidaciniu aktyvumu pasiţyminčios medţiagos.
Antioksidantai gali būti suskirstyti į dvi grupes: pirminius ir oksidacijos grandinę pertraukiančius (antrinius) antioksidantus. Pirminiai antioksidantai pasiţymi aktyvumu dar prieš radikalų susidarymo reakciją, o antriniai slopina ar sustabdo radikalų susidarymo grandinę [29].
Remiantis šiek tiek platesne klasifikacija antioksidantai skirstomi į: fermentinius ir ne fermentinius. Fermentiniai antioksidantai skirstomi į pirminius (glutationo peroksidazė ir kt.) ir antrinius (glutationo reduktazė, gliukozės-6-fosfato dehidrogenazė). Ne fermentiniai antioksidantai skirstomi į mineralus, vitaminus, karotenoidus organinius sieros junginius, maţos molekulinės masės antioksidantus, antioksidacinius kofaktorius, polifenolius [30]. Detalesnė antioksidantų klasifikacija pateikta 3 paveikslėlyje.
Išskiriami du pagrindiniai antioksidacinio aktyvumo analizės principai: vandenilio atomo ir elektrono pernaša pagrįsta analizė. Vandenilio atomo pernaša (angl. hydrogen atom transfer - HAT) pagrįsta analizė cheminės reakcijos principu, kurioje antioksidantas dalyvauja kaip vandenilio atomo donoras (daţniausiai fenolinė –OH grupė), kuris neutralizuoja susidariusį peroksilo radikalą. Elektrono pernaša (angl. electron transfer – ET) pagrįstoje analizėje cheminė reakcija vyksta tarp oksiduojančio reagento ir antioksidantiniu aktyvumu pasiţyminčios medţiagos [31]. HAT tipo reakcijų metodų pavyzdţiai taikomi antioksidacinio aktyvumo analizėje yra deguonies radikalų absorbcijos galios (angl. oxygen radical absorbance capacity – ORAC, antioksidanto sugaudytų radikalų suminio mato (angl. total radical trapping antioxidant parameter – TRAP) ir krocino išblukinimo metodai [32].
ET tipo reakcijų metodų pavyzdţiai taikomų antioksidacinio aktyvumo analizėje gali būti DPPH radikalų surišimo metodas [33], ABTS radikalų–katijonų surišimo metodas [34], FRAP metodas [35] bei CUPRAC metodas [36]. Atliekant antioksidacinio aktyvmo įvertinimą naudojant DPPH metodą, radikalus sudarantis reagentas yra 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas, FRAP metodą – trivalentės geleţies ir 2,4,6-tripyridyl-s-triazino kompleksas, ABTS metodą - 2,2'-azino-bis (3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis), CUPRAC metodą – dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) kompleksas. Principinės minėtų ET metodų cheminės reakcijos pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Principiniais ET metodų reakcijų mechanizmai. ArOH – fenolinė hidroksilo grupė [32]
Metodo pavadinimas Reakcijos mechanizmas
DPPH radikalų surišimo
metodas DPPH• + ArOH → DPPH + ArO• + H+
FRAP metodas Fe(TPTZ)23+ + ArOH →Fe(TPTZ)22+ + ArO• + H+
ABTS radikalų–katijonų
surišimo metodas ABTS•+ + ArOH → ABTS + ArO• + H+
CUPRAC metodas nCu(Nc)22+ + Ar(OH)n → nCu(Nc)2+ + Ar(=O)n + nH+
Ţymus parametras renkantis ET metodą yra metodikoje naudojamo reagento ir antioksidaciniu aktyvumu pasiţyminčios medţiagos reakcijos laikas. Priklausomai nuo redukcinių medţiagų komplekso sudėtingumo reakcijos laikas gali kisti nuo 4 min iki 60 min ar ilgiau [37, 38]. Taip pat gautus antioksidacinio tyrimo rezultatus gali įtakoti reakcijos temperatūra, terpės pH, oksiduojančio reagento koncentracija ir kiti faktoriai [32]. Taigi norint tikslingai palyginti skirtingų mokslinių tyrimų gautus antioksidacinio aktyvumo rezultatus svarbu taikyti tas pačias analizės metodikas ir jų parametrus.
1.5. Kanabidiolis – farmakologinės bei fizikocheminės savybės
Remiantis Caterina Scuderi et. Al (2009) apibrėţimu: kanabidiolis tai pagrindinis, ne psichotropinis Cannabis sativa L. liaukinių plaukelių komponentas. Pirmą kartą kanabidiolis buvo išskirtas iš marihuanos 1930-aisiais metais, tačiau struktūra nustatyta 1963 m. Kanabidiolį galima priskirti prie neutraliųjų kanabinoidų [39].
Kanabidiolis pasiţymi labai maţu toksiškumu. Tyrime su Macaca mulatta beţdţionėmis kanabidiolio LD50 po intraveninės injekcijos siekė 212 mg/kg. Norint pasiekti toksiškumą vartojant per
os, reikia vartoti 20-50 kartų didesnę CBD koncentraciją, nei i/v atveju. CBD nepasiţymi teratogeniškumu ar mutageniškumu [40].
Neišskiriant kanabidiolio iš kitų kanabinoidų, jis kaip ir kiti, pasiţymi agonistiniu poveikiu į canabinoidinius receptorius (CB1 ir CB2), tačiau šio kanabinoido giminingumas šiems receptoriams yra
maţas, lyginant su kitais kanabinoidų atstovais [39, 41].
Kanabidiolis pasiţymi anksiolitiniu, antipsichotiniu, priešuţdegiminiu, antispazmolitiniu ir analgeziniu poveikiais [24].
CBD potencialiai gali būti naudojamas šizofrenijos simptomų gydyme bei kontrolėje dėl teigiamo antipsichozinio veikimo bei dėl retai pasireiškiančių ekstrapiramidinių sutrikimų [42]. CBD taip pat pasiţymi antineoplastiniu poveikiu bei antiproliferacinių poveikiu esant agresyvioms krūties vėţio formoms [43, 44, 45].
Kanabidiolis tirpus etanolyje, trichlormetane ir heksane, netirpus – vandenyje. Superkritinės fazės anglies diokside geriausiu tirpumu CBD pasiţymi esant 315 K temperatūrai ir 13 MPa slėgiui. CBD lydimosi temperatūra 66–67 oC, molekulinė masė 314, 16 g/mol. [24, 46]
Kanabidiolis paveiktas stiprios bazės, gali pereiti į Δ6
- kanabidiolį (4 pav.) pavyzdţiui, kanabidiolį kaitinant su kalio tert-butoksidu tolueno-heksametil-fosforo triamide. Įvykūs izomerizacijai, Δ6-CBD pasiţymi stipriu sinergistiniu poveikiu CB1 ir CB2 receptoriams – nors šis
teiginys dar nėra patvirtintas [47].
4 pav. Kanabidiolio virtimas į Δ6 – kanabidiolį. Paveikslas modifikuotas iš Mechoulam R. Ir kt. (2002) [47]
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Šio tyrimo objektas – Lietuvoje auginamos pluoštinės kanapės (Cannabis sativa L.), FINOLA veislės, moteriškos lyties augalų, antţeminė dalis. Augalinė ţaliava buvo renkama skirtinguose Lietuvos regionuose:
Anykščių rajone, Viešintų kaime;
Kupiškio rajone, Kadrėnų kaime;
Telšių rajone, Kaunatavos kaime.
Prieš renkant ţaliavą LSMU MA FF analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje buvo patvirtintas prašymas rinkti pluoštines kanapes Lietuvoje (2 priedas). FINOLA mėginiai buvo renkami keturis kartus per visą augalo vegetacijos laiką 2014 metais: Liepos 10 dieną, liepos 25 dieną, rugpjūčio 1 dieną ir rugsėjo 6 dieną. Visuose regionuose pluoštinės kanapės buvo pasėtos geguţės 26 – 27 dienomis.
Augalinė ţaliava buvo renkama pasirenkant atsitiktinį augalą, neaugantį pasodinto lauko krašte. Mėginiai analizei buvo renkami 30cm matuojant nuo viršūnės [24, 48]. Jeigu augalas pasiţymėjo maţu lapų gausumu, buvo imamas didesnis (iki 50 cm) antţeminės augalo dalies kiekis.
Mėginiai buvo surinkti ţydėjimo ir sėklų formavimosi laikotarpyje: ţydėjimo pradţioje, ţydėjimo pabaigoje, sėklų brandos pradţioje, sėklų brandos pabaigoje. Augalinės ţaliavos mėginių rinkimo regionų pasiskirstymas Lietuvoje pavaizduotas 5 paveikslėlyje.
5 pav. Pluoštinių kanapių mėginių rinkimo regionų schematinis pasiskirstymas Lietuvoje. Geltona spalva – Telšiai, raudona – Kupiškis, žalia – Anykščiai
2.1.1. Cannabis sativa L. vegetacijos fazių identifikavimas
Anksčiau minėti vegetacijos periodai buvo identifikuojami remiantis Šveicarijos federalinio technologijos instituto duomenimis [49].
Ţydėjimo pradţia ir pabaiga buvo identifikuojama pagal vyriškos lyties augalus, o sėklų brandos pradţia ir pabaiga pagal moteriškos lyties augalus. Toks identifikavimas yra tikslingas, nes moteriškuose augaluose ţydėjimo pradţios ir pabaigos nustatymas yra sudėtingesnis, lyginant su vyriškos lyties augalais, o sėklų brados eigą galima identifikuoti tik moteriškos lyties augaluose [11, 49].
Ţydėjimo pradţioje vyriškos lyties augalai pasiţymėjo pavieniais atvirais ţiedais, o ţydėjimo pabaigoje 95% ir daugiau vyriškos lyties augalų ţiedų buvo išsiskleidę.
Sėklų brandos pradţioje moteriškos lyties augalų ţieduose pradėjo atsirasti pavienės rusvos spalvos kietos sėklos, sėklų brandos pabaigoje 95% ir daugiau susiformavusių sėklų buvo kietos, tamsiai rudos spalvos (6 pav.).
6pav. Subrendusių sėklų išvaizda sėklų brandos pabaigoje Cannabis sativa L. augale
Taip pat Cannabis sativa L. vegetacijos metu buvo pastebėta vyriškosios lyties augalų morfologinė degradacija. Ţydėjimo metu buvo stebimas ţiedų išsiskleidimo didėjimas, sėklų brandos pradţioje – lapų bei ţiedų spalvos pokytis iš ţalios į gelsvą, o sėklų brandos pabaigoje – visiškas ţiedų ir lapų sunykimas. Šį vyriškosios lyties augalų pokyti tarp ţydėjimo pabaigos ir sėklų brandos pradţios galima įvertinti 7 pav. A ir B dalyse.
7pav. Vyriškosios lyties augalų pokytis vegetacijos metu. A – žydėjimo pabaigos fazė, B- sėklų brandos pradžios fazė
2.1.2. Pluoštinės kanapės mėginių dţiovinimas ir išdţiovintos ţaliavos kokybės
vertinimas
Surinkta augalinė ţaliava buvo dţiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, kambario temperatūroje, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių, paskleidţiant augalinės ţaliavos mėginius plonu sluoksniu. Išdţiovinta augalinė ţaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25 0C temperatūroje, sausoje, gerai vėdinamoje vietoje.
Sudţiovintos ţaliavos kokybė buvo vertinama vizualiai ir pagal drėgmės kiekį. Tyrimams buvo naudojama ţaliava, kurios drėgmės kiekis neviršijo 15%. Rekomenduojama drėgmės riba nustatyta ElSohly M. ir kt. (2013) monografijoje [12].
2.2. Reagentai
Visiems atliktiems tyrimams buvo naudojami šie reagentai:
Acetonitrilas (≥99,9%, Sigma-Aldrich, Izraelis).
Metanolis (≥99,8% Sigma-Aldrich, Izraelis).
Trichlormetanas (≥99% Sigma-Aldrich, Missouri, JAV),
4-hidroksi-3-metoksibenzaldehidas (≥99% Sigma-Aldrich, Missouri, JAV),
Koncentruota druskos rūgštis (≥ 95%, Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija),
37% druskos rūgštis (≥37%, Sigma-Aldrich, Missouri, JAV)
Natrio acetatas (Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija),
Ledinė acto rūgštis (≥99% Sigma-Aldrich, Missouri, JAV),
Geleţies (III) chlorido heksahidratas (≥99% Sigma-Aldrich, Missouri, JAV),
2,4,6-tripyridyl-s-triazinas (98 %, Alfa aesar, Vokietija),
Fast blue salt B (95 %, Sigma-Aldrich,Steinheim, Vokietija),
Trolox (≥98% HPLC grade, Sigma-Aldrich, Steinheim, Vokietija),
Kanabidiolis (99,8% THC Pharm, Germany).
2.3. Aparatūra
Kanabidiolio atskyrimui augalo ekstrakte efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo naudojamas Waters 2695 atskyrimo modulis (Milford, JAV) bei ACE C18 kolonėlė, kurios ilgis 250mm, vidinis diametras 4,6mm, sorbento dalelių dydis 5 µm. Analitės detekcija buvo vykdoma naudojant fotodiodų matricos detektorių Waters 996 (Milford, JAV).
Bendrojo antioksidacinio aktyvumo nustatyme buvo naudojamas UV–regimojo spektro dvigubo spindulio spektrofotometras HALO DB-20 UV – vis Dynamica GmbH (Šveicarija). Darbinio tirpalo temperatūrai palaikyti naudota termostatinė vonelė Heidolf (Vokietija).
Ekstrakcijai, norint nustatyti kanabidiolio koncentraciją mėginyje, buvo naudojama ultragarso vonelėBioSonic UC100 (Ohio, JAV);
Ekstrakcijai, norint nustatyti bendrą ekstraktuose esančių biologinių junginių antioksidacinį aktyvumą, buvo naudojamas horinzontalus purtytuvas ELPAN laboratory shaker type 358 S (Lenkija).
Kokybinei kanabidiolio analizei plonasluoksnės chromatografijos metodu buvo naudojama chromatografavimo kamera CAMAG Twin Trough Chamber 20x20 cm (Muttenz, Šveicarija); chromatografinės plokštelės ALUGRAM SIL G/UV padengtos 0,20 mm silikagelio sluoksniu, kurio porų dydis buvo 60 Å, o sorbentas prisotintas fluorescencuojančiu indikatoriumi, kuris fluorescuoja jį paveikus 254 nm ultravioletinių spindulių šviesa. Analizuojami ekstraktai ant plokštelės buvo uţnešami naudojant pusiau automatinį mėginių uţnėšėją CAMAG Linomat 5 (Muttenz, Šveicarija). Gauti chromatografinės plokštelės duomenys buvo analizuojami naudojant vizualizavimo prietaisą CAMAG TLC Visualizer (Muttenz, Šveicarija) ir programinę įrangą VisionCATS v2.0.
Išdţiovintoje ţaliavoje drėgmės kiekis buvo įvertintas naudojant DBS (KERN) v1.0 moisture analyser (Balingen, Vokietija) prietaisą.
Vandens gamybai buvo naudojama MILIPORE (Darmstadt, Vokietija) vandens gryninimo sistemą
Medţiagų pasvėrimui buvo naudojamos Shimadzu AUW120D (Duisburg, Vokietija) svarstyklės. Ţaliavos malimui buvo naudojamas D-47906 Clatronic (Kempen, Vokietija) laboratorinis malūnėlis.
2.4. Cannabis sativa L. ekstraktų ruošimas
Remiantis literatūros apţvalga buvo pasirinkti du ekstrakcijos būdai norint įvertinti skirtingus ţaliavoje esančių biologiškai aktyvių medţiagų parametrus.
Ţaliava abiems ekstrakcijos metodams buvo ruošiama vienodai. Kiekvienas augalo organas buvo nuskinamas nuo išdţiovinto augalo: ţiedai vėlesnėse vegetacijos fazėse buvo analizuojami su sėklomis, lapai be lapkočių. Nuskinti lapai ar ţiedai buvo malami ~ 5 minutes. Stiebai prieš malant smulkintuvėje buvo sukarpomi ţirklėmis į ~ 0,5-1 cm ilgio dalis, norint pagerinti malimo našumą. Sukarpyti stiebai buvo malami ~7-8 minutes. Malimo laikas buvo įvertintas empiriškai lyginant skirtingu laiku sumaltą ţaliavą. Smulkinant ţaliavą nurodytą laiką buvo gaunami miltelių konsistencijos mėginiai, kuriuose nebuvo matyti didelių, heterodispersinių dalelių.
2.4.1. Pluoštinių kanapių ekstraktų ruošimas ESC analizės metodui norint įvertinti
kanabidiolio koncentraciją
Ekstrakcija buvo atliekama remiantis ElSohly M. ir kt. (2013) monografija [12].
Prieš ekstrakciją buvo paruošiamas ekstrahentas sumaišant 9 dalis metanolio ir 1 dalį trichlormetano. Ant aliuminio folijos buvo atsveriama 200 mg susmulkintos ţaliavos, kuri buvo suberiama į 10ml tūrinę kolbutę, po to paruoštas ekstrahentas uţpilamas iki ţymos. Kolbutė buvo uţkemšama plastikiniu kamščiu ir dedama į ultragarso vonią 30 minučių. Gautas ekstraktas buvo filtruojamas pro Albet 400 (Dublinas, Airija) filtravimo popierių (porų dydis 38-43 µm) į tamsaus stiklo buteliuką. Nufiltruotas ekstraktas buvo filtruojamas pro 0,45 µm filtrą į chromatografijai skirtus buteliukus. Ekstrakcija buvo atliekama po 3 kartus naudojant skirtingus, vienodos masės, ţaliavos svėrinius.
2.4.2. Pluoštinių kanapių ekstraktų ruošimas bendro antioksidacinio aktyvumo
nustatymu
Skirtingos ekstrakcijos pasirinkimą antioksidacinio aktyvumo įvertinimui ţaliavoje lėmė Mkpenie et al. 2012 tyrimo rezultatai, kuriuos įvertinus, buvo galima padaryti prielaidą, jog didţiausia antioksidaciniu aktyvumu pasiţyminčių medţiagų koncentracija pasiekiama ekstrakciją vykdant 18 valandų metanolyje [50].
Ekstrakcija buvo vykdoma maceracijos būdu. Į 100 ml plokščiadugnę kolbą buvo atsveriama 1 g susmulkintos augalinės ţaliavos. Po to ant augalinės ţaliavos buvo uţpilama 10ml metanolio, kolbutė uţdengiama glazūruotu kamščiu ir paliekama 18 valandų ant horizontalaus purtytuvo (angl.
horizontal shaker). Gautas ekstraktas buvo nufiltruojamas pro Albet 400 (Dublinas, Airija) filtravimo
popierių į tamsaus stiklo buteliuką. Buteliukas buvo laikomas šaldytuve iki ekstrakcijos dienos.
2.5. Kanabidiolio kiekybinis ir kokybinis įvertinimas Cannabis sativa L.
ekstraktuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Kanabidiolio kiekybinis ir kokybinis įvertinimas ekstraktuose buvo vykdomas efektyviosios skysčių chromatografijos būdu. Chromatografavimo sąlygos buvo pasirinktos remiantis UNODC (2009)rekomendacijomis [24]. ESC analizės parametrai pateikti 3 lentelėje.
3 lentelė. Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės parametrų reikšmės
Parametras Reikšmė
Eliuentai A-acetonitrilas, B – vanduo
Eliuentų santykis A-80%, B-20%
Eliucijos rėţimas Izokratinis
Tėkmės greitis 1 ml/min
Injekcijos tūris 10 µL
Kolonėlės temperatūra 300C
CBD koncentracija buvo apskaičiuojama remiantis gradavimo grafiku. Gradavimo grafikas buvo sudarytas iš pagaminto kanabidiolio standartinio metanolinio tirpalo. Kalibracinės kreivės tiesiškumo ribos 0,391µg/ml – 0,1 mg/ml. Gautos kalibracinės kreivės funkcija: y = 8,32*107 x-2,92*104, y – chromatografinės smailės plotas, x- kanabidiolio koncentracija išreikšta mg/ml.
Kanabidiolio standartinių tirpalų koncentracijų priklausomybė nuo chromatografinių smailių plotų pavaizduota 8 pav.
8 pav. Kanabidiolio kalibracinė kreivė
Kanabidiolio tapatybė buvo įvertinta pagal sulaikymo laiką kolonėlėje ir gautus spektrinius duomenis. Minėti parametrai buvo lyginami su CBD standartinių mėginių duomenimis.
2.5.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos kiekybinio metodo validacija
ESC metodo validacija buvo atlikta pagal pasirinktus validacijos parametrus: glaudumą (preciziškumą), aptikimo ribą, nustatymo ribą, tiesiškumą bei specifiškumą.
Specifiškumas buvo vertinamas lyginant standartinio CBD tirpalo ir ekstrakte esančio CBD sulaikymo laikus bei spektrinius duomenis.
Metodikos preciziškumas buvo įvertintas atliekant pakartojamumo bei atkuriamumo tyrimus. Pakartojamumas buvo vertinamas atlikus šešias mėginio injekcijas tą pačią dieną (angl. intra-day), o atkuriamumas – po penkias injekcijas tris skirtingas dienas (angl. inter-day). Glaudumas buvo vertinamas pagal vidutinį sulaikymo laiką ir vidutinį smailės ploto santykinį standartinį nuokrypį. SSN buvo išreiškiamas procentais apskaičiavus standartinio nuokrypio ir vidutinio smailės ploto (ar vidutinio sulaikymo laiko) santykį.
Aptikimo (angl. limit of detection – LOD) bei nustatymo ribos (angl. limit of quantitation – LOQ) buvo apskaičiuojamos panaudojant S/N santykį. S/N santykis buvo surandamas lyginant CBD smailės aukštį su bazinės chromatogramos linijos triukšmu. Identifikavimo riba buvo nustatoma tada, kada analitės ir triukšmo smailių aukštis sutiko santykiu 3:1, o kiekybinio nustatymo riba, kai S/N = 10:1 [51].
Tiesiškumas buvo nustatomas vertinant kalibracinės kreivės determinacijos koeficientą R2
2.6. Kanabidiolio tapatybės nustatymas plonasluoksnės chromatografijos metodu
Kanabidiolio tapatybės įvertinimas buvo vykdomas remiantis ElSohly M. ir kt. (2013) [12] bei UNODC (2009) [24] rekomendacijomis.
Kanabidiolio tapatybės nustatyme PC metodu buvo naudojamas ţydėjimo pradţioje Kupiškyje rinktos ţaliavos ţiedų ekstraktas (ekstrakcijos sąlygos buvo naudojamos kaip ESC analizei), o kaip lyginamasis ţymuo chromatogramoje buvo naudojamas metanolinis 1 mg/ml kanabidiolio tirpalas.
Analizės atlikimas buvo vykdomas uţnešant ekstrakto bei kanabidiolio standarto tirpalus ant chromatografinės plokštelės naudojant CAMAG linomat 5 pusiau automatinį mėginių uţnešėją. Pradţios linija buvo 20 mm nuo chromatografavimo plokštelės apačios, tarpai tarp mėginių uţdėjimo juostų – 28 mm, mėginio atstumas nuo chromatografinės plokštelės krašto – 30 mm, finišo linija – 10 cm nuo starto linijos.
Mobilios fazės sudėtis PC analizėje buvo metanolis : vanduo santykiu 75:25 (v/v), bei 0,1% koncentruota acto rūgštis. Tirpiklių sistema buvo supilama į CAMAG chromatografavimo kamerą, kuri uţdengiama ir paliekama prisisotinti tirpiklio sistemos garais. Į prisotintą chromatografavimo kamerą buvo dedama chromatografinė plokštelė su uţneštais standarto ir ekstrakto mėginiais ir laukiama, kol tirpiklių sistema uţkils iki pabaigos linijos. Po to chromatografinė plokštelė buvo dţiovinama kambario temperatūroje traukos spintoje.
Atliktas chromatografinės plokštelės ryškinimo optimizavimas lyginant Fast blue salt B ir Duquenois Levin reagentus. Ryškinant su Fast blue salt B CBD nusidaţo oranţinė spalva [24].
Fast blue salt B reagentas buvo ruošiamas tirpinant 50mg šios diazonio druskos 20 ml 0,1N NaOH [24]. Duquenois Levin„o reagentas gaminamas 0,2 g vanilino ištirpinant 10 mL etanolio, poto sumaišant su 0,25 ml acetaldehido [52].
Vykdant ryškinimą chromatografinės plokštelės buvo apipurškiamos ryškinimo reagentu. Atliekant ryškinimą Duquienois Levin„o testu, chromatografinė plokštelė po reagento aplikacijos ir išdţiovinimo, buvo apipurškiama koncentruota druskos rūgštimi. Sąveikaujant šiam reagentui su CBD gaunama purpurinė spalva [52].
Kanabidiolio tapatybė patvirtinama aptikus purpurinės ar organţinės spalvos dėmes, kurių Rf
2.7. Cannabis sativa L. ekstraktų antioksidacinio aktyvumo kitimo nustatymas
FINOLA veislės metanolinių ekstraktų antioksidacinė geba buvo vertinama taikant geleţies redukcijos antioksidacinės galios (FRAP) metodą remiantis Srivastava N. ir kiti (2012) [53] metodika.
FRAP reagento gamyba: A, B, C regentai sumaišomi 10:1:1 santykiu, o gautas tirpalas laikomas tamsaus stiklo butelyje. Prieš analizę paruoštas FRAP darbinis tirpalas buvo pašildomas iki 37 0C.
A reagento gamyba: 3,1g natrio acetato suberiama į 1000 mL tūrinę kolbą ir tirpinama 16 mL ledinėje acto rūgštyje, poto distiliuotu vandeniu iki ţymės. Gauto tirpalo pH turi būti 3,6.
B reagento gamyba: pradţioje pasigaminama 40 mM druskos rūgštis, 0,1695 mL koncentruotos druskos rūgšties sumaišant su 50 mL distiliuoto vandens. Gauta praskiesta rūgštimi uţpilami 0,1562g 2,4,6-tripyridyl-s-triazino milteliai ir tirpinami ultragarso vonelėje. Gaunamas 10 mM 2,4,6-tripyridyl-s-triazino tirpalas druskos rūgštyje.
C regento gamyba: 0,2703 geleţies (III) chlorido heksahidrato ištirpinama 50ml distiliuoto vandens ir gaunamas 20 mM geleţies (III) chlorido tirpalas.
Analizės atlikimas: 2 ml švieţiai paruošto FRAP reagento buvo sumaišomi su 100 µL ekstrakto. Po 30 minučių buvo matuojama tirpalo šviesos absorbcija spektrofotometru ties 593 nm bangos ilgiu. Vieno mėginio matavimai buvo atliekami po 3 kartus.
Gauti rezultatai buvo vertinami pagal trolokso kalibracinę kreivę. Kalibracinės kreivės teisiškumas buvo išlaikomas 0,0015 – 0,048 mg/ml koncentracijų ribose. Kalibracinė kreivė pateikta 9 pav. Standartiniai kalibracinės kreivės parametrai: A1 = 0,0211, A0 = (-0,0030), R2 = 0,9972.
Tiriamajame ekstrakte esanti koncentracija ekvivalentiška troloksui buvo skaičiuojama pagal formulę: Konc. = A1 * Mėginio absorbcija + A0 ir panaudojant UV detective plus v2.1 programinę įrangą
pritaikytą naudotam spektrofotometrui.
2.8. Statistinė duomenų analizė
Eksperimentiniai duomenys buvo apdorojami naudojant statistinius duomenų analizės paketus Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV) ir SPSS v17.0.0 (SPSS Inc, JAV). Visi kiekybinio nustatymo eksperimentai kartoti tris kartus, o rezultatai išreikšti vidurkiais ± standartine išraiška. Statistinis reikšmingumas tarp gautų duomenų buvo nustatytas naudojant Turkey HSD testą. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α = 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Cannabis sativa L. ţaliavos kokybinis įvertinimas
Ištyrus drėgmės kiekį sudţiovintos ţaliavos mėginiuose buvo nustatyta, jog drėgmė neviršija 15% ţaliavos masės, šią maksimalią leidţiamą drėgmės kiekio reikšmę reglamentuoja M. ElSholy ir kt (2013) [12]. 4 Lentelėje pateikti drėgmės matavimo išdţiovintoje ir susmulkintoje ţaliavoje duomenys. Po organoleptinio įvertinimo, sudţiovintos ţaliavos ţiedai ir lapai buvo tamsiai ţalios spalvos, savito kvapo, sėklos – rudos, stiebai šviesiai rudi. Ant sudţiovintos ţaliavos nebuvo nustatyta jokio puvimo proceso ar pelėsinio uţteršimo. Taigi remiantis šiais duomenimis buvo padaryta išvada, kad surinkta ir išdţiovinta ţaliava yra tinkama analizei.
4 lentelė. Sudžiovintos ir susmulkintos augalinės žaliavos drėgmės kiekis išreikštas procentais
Regionas Telšiai Anykščiai Kupiškis
Augalo organas Vegetacijos periodas Ţieda i S ti eba i La pa i Ţieda i S ti eba i La pa i Ţieda i S ti eba i La p ai Ţydėjimo pradţia 6,29% 6,29% 7,58% 6,73% 6,51% 8,04% 6,49% 6,27% 7,30% Ţydėjimo pabaiga 6,38% 6,16% 7,07% 6,47% 5,79% 7,07% 6,11% 5,48% 7,01% Sėklų brandos pradţia 6,39% 5,68% 7,34% 7,27% 5,45% 7,34% 6,48% 5,97% 8,18% Sėklų brandos pabaiga 7,96% 5,19% 9,53% 8,86% 7,46% 10,40% 6,58% 5,68% 9,02%
3.2. Kanabidiolio identifikavimas ekstraktuose
Kanabidiolis FINOLA veislės kanapėse buvo identifikuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu pagal sulaikymo laiką ir spektrinius duomenis, plonasluoksnės chromatografijos metodu pagal sulaikymo faktorių, gautas reikšmės lyginant su standartinio CBD tirpalo duomenimis. Kanabidiolio ekstrakto UV spektras pateiktas 10 paveikslėlyje.
10 pav. Kanabidiolio UV spektras. A – šiame tyrime nustatytas CBD UV spektras, B – A. Hazekamp ir kt. (2005) gautas CBD UV spektras [54]
Kaip matyti 89 pav. A kanabidiolio UV absorbcijos spektre išryškėja du absorbcijos maksimumai: pirmasis λmax1 = 206,2 nm, antrasis λmax2 = 271,5 nm. Gautas 10 pav. A UV spektras bei
absorbcijos maksimumai sutampa su standartinio CBD tirpalo duomenimis. Tapatus CBD UV spektro vaizdas atsispindi A. Hazekamp ir kt. (2005) gautame spektre 10 pav. B [54].
11 paveiksle pateikta Cannabis sativa L. ekstrakto ir CBD standartinio tirpalo efektyviosios skysčių chromatografijos rezultatai kanabidiolio tapatumui nustatyti.
11 pav. A – žydėjimo pradžioje, Telšių raj. rinktos žaliavos žiedų ekstrakto chromatograma; B – CBD standartinio tirpalo chromatograma
Kaip matyti 11pav. Ekstrakte esančio kanabidiolio sulaikymo laikas yra 7,64 min., o kanabidiolio esančio standartiniame tirpale – 7,65 min.
Atliekant kanabidiolio tapatybės nustatymą Cannabis sativa L. ekstraktuose PC metodu buvo naudoti du skirtingi ryškinimo reagentai (išsamiau 3.4.3 skyriuje). Ryškinimui naudojant Duquenois Levin„o reagentą ne visada pavykdavo išryškinti PC chromatografinę plokštelę, dėl šios buvo pasirinktas Fast Blue salt B reagentas.
Plonasluoksnės chromatografijos metodu kanabidiolio identifikavimas ekstrakte buvo vykdomas lyginant standartinio CBD tirpalo Rf reikšmę su artimiausia ekstrakto gauta Rf reikšme. 12
pav. pateikta kanabidiolio tapatybę patvirtinanti chromatograma. Gauta ekstraktų Rf reikšmė buvo
0,53±0,0058, o standarto Rf reikšmė – 0,53. Remiantis gautais rezultatais galima teigti, jog
kanabidiolis buvo identifikuotas.
Pateiktoje chromatogramoje matomas chromatografinių juostų pakrypimas ar juostų išplitimas. Tokį juostų nevientisumą galima paaiškinti per dideliu uţpurkštu ryškinamojo reagento kiekiu dėl kurio įvyko difuzija ant chromatografinės plokštelės.
Nustatant pasirinkto ryškinimo reagento (Fast Blue salt B) jautrumą kanabidioliui buvo tiriami skirtingi standartinio CBD tirpalo, kurio koncentracija 1 mg/ml, tūriai: 2,5 µL, 5 µL, 1,5 µL, 1 µL, 0,75 µL, 0,5 µL bei 0,25 µL. Tyrimo metu nustatyta, jog uţnešus 0,5 µL tirpalo ant chromatografinės plokštelės CBD identifikavimas negalimas, dėl neatsirandančios oranţinės spalvos srities chromatogramoje.
12 pav. Plonasluoknės chromatografijos chromatograma regimojoje šviesoje
3.3. Kanabidiolio kiekybinis įvertinimas skirtingais vegetacijos periodais
Atliekant kiekybinę kanabidiolio analizę Cannabis sativa L. ţaliavoje buvo nustatinėjami pastarojo kanabinoido pokyčiai skirtingais augalo vegetacijos periodais trijose Lietuvos pluoštinių kanapių augimvietėse. CBD kitimas skirtingais vegetacijos periodais buvo stebimas ir skirtinguose augalo organuose t.y. ţieduose, lapuose ir stiebuose.
Įvertinus kanabidiolio kitimą ţieduose skirtingais vegetacijos periodais Kupiškio raj. Kadrėnų kaime rinktoje ţaliavoje nustatytas tiriamosios medţiagos maţėjimas nuo ţydėjimo pradţios iki pabaigos (13 pav.). Statistiškai reikšminga didţiausia CBD koncentracija buvo nustatyta ţydėjimo pradţioje 2,985±0,223 mg/g (p < 0,05) ţieduose. Ţydėjimo pabaigoje (1,653±0,074 mg/g) ir sėklų brandos pradţioje (1,571±0,062 mg/g) statistiškai reikšmingas CBD kiekio skirtumas nenustatytas (p = 0,841). Reikšmingai maţiausia tiriamosios medţiagos koncentracija minėtame rajone rinktos ţaliavos ţieduose buvo nustatyta sėklų brandos pabaigoje 0,759±0,0006 mg/g (p < 0,05).
13 pav. Kanabidiolio kiekio kitimas Cannabis sativa L. žieduose skirtingais vegetacijos periodais Kadrėnų kaime, Kupiškio rajone rinktoje žaliavoje (SSN ≤ 7,46 %, n=3)
Nustačius CBD koncentracijos variacijas ţieduose skirtingose vegetacijos fazėse Anykščių raj. rinktoje ţaliavoje galima teigti, jog statistiškai reikšminga didţiausia nustatyta kanabidiolio koncentracija šiame rajone rinktuose ţieduose yra ţydėjimo pradţioje – 2,345±0,1599 mg/g (p < 0,05). Vėlesniuose vegetacijos perioduose stebimas CBD koncentracijos maţėjimas: ţydėjimo pabaigoje CBD konc. – 1,267±0,112 mg/g, sėklų brandos pradţioje – 0,680±0,016 (p < 0,05). Sėklų brandos pabaigoje nustatytas reikšmingas (p < 0,05) CBD koncentracijos padidėjimas – 1,909±0,007. 14 pav. pavaizduota kanabidiolio dinamika ţieduose Anykščių raj. rinktoje ţaliavoje.
14 pav. Kanabidioio koncentracijos kitimas žieduose, rinktuose Anykščių raj. Viešintų kaime (SSN ≤ 8,84%, n =3)
Didţiausias statistiškai reikšmingas kanabidiolio kiekis Telšių raj. rinktos ţaliavos ţieduose taip pat nustatytas ţydėjimo pradţioje - 2,416±0,063 mg/g (p < 0,05). Vėlesniuose vegetacijos perioduose nustatytas CBD koncentracijos svyravimas: ţydėjimo pabaigoje nustatyta CBD koncentracija – 1,415±0,010 mg/g, sėklų brandos pradţioje 2,186±0,060 mg/g, sėklų brandos pabaigoje 1,388±0,102 mg/g (p = 0,959). Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp ţydėjimo pabaigoje ir sėklų brandos pabaigoje nustatytų CBD kiekių nebuvo nustatytas. CBD dinamika Telšių raj. rinktos ţaliavos ţieduose pateikta 15 pav.
15 pav. Kanabidiolio koncentracijos kitimas Telšių rajone, Kaunatavos kaime rinktuose žieduose (SSN ≤ 7,31%, n=3)
Tiriant kanabidiolio kitimą Cannabis sativa L. ţieduose, lapuose ir stiebuose, Kupiškio bei Telšių raj. rinktoje ţaliavoje, buvo nustatyti statistiškai reikšmingi (p < 0,05) skirtumai šiuose regionuose tarp išvardintų augalo audinių viso augalo vegetacijos metu (16 pav.). Anykščių regione tokio CBD kiekio pasiskirstymo tarp augalo dalių nustatyti nepavyko (16 pav.), nes ţydėjimo pabaigoje aptinkamos CBD koncentracijos stiebuose ir lapuose statistiškai reikšmingai nesiskiria (p = 0,173). Reikšmingai didţiausias CBD kiekis visais tirtais vegetacijos periodais pasirinktuose regionuose yra ţieduose (p < 0,05), vidutinės CBD koncentracijos nustatytos – lapuose (Kupiškyje ir Telšiuose p < 0,05), maţiausios – stiebuose (Kupiškyje ir Telšiuose p <0,05).
Lapuose didţiausia nustatyta kanabidiolio koncentracija buvo Kupiškio raj. rinktoje ţaliavoje, ţydėjimo pradţioje – 1,034±0,090 mg/g, maţiausia aptikta CBD koncentracija lapuose buvo Anykščių raj. rinktoje ţaliavoje, ţydėjimo pabaigoje – 0,139±0,004 mg/g. Stiebuose didţiausia aptikta kanabidiolio koncentracija buvo nustatyta Telšių raj. ţydėjimo pabaigoje 0,135±0,00078 mg/g, maţiausia aptikta kanabidiolio koncentracija stiebuose buvo Kupiškio raj. rinktoje ţaliavoje, sėklų brandos pabaigoje 0,0245±0,00001 mg/g.
Lyginant kanabidiolio koncentracijos kitimą tarp skirtinguose regionuose rinktos ţaliavos buvo nustatyta, jog ţydėjimo pradţioje Kupiškio raj. rinktuose ţieduose CBD koncentracija yra didţiausia, kai p < 0,05. Anykščių ir Telšių regionuose rinktoje ţaliavoje didţiausios CBD koncentracijos nustatytos taip pat ţydėjimo pradţioje, tačiau tarp šiuose regionuose nustatyto CBD kiekio ţieduose reikšmingo skirtumo nenustatyta (p = 0,858).
16pav. Kanabidiolio pasiskirstymas Cannabis sativa L. audiniuose skirtingais augalo vegetacijos periodais (SSN≤8,84%, n=3)
3.3.1. Kiekybinio kanabidiolio nustatymo metodo validacijos parametrų reikšmės
Kaip minėta anksčiau, buvo atlikta ESC kiekybinio CBD nustatymo metodikos validacija. Įvertinus specifiškumą sulaikymo laikai (11 pav. A ir B), bei spektriniai CBD duomenys sutapo (10 pav. A).
Vertinant metodikos pakartojamumą (angl. intra-day) gautas smailių ploto variacijos koeficientas buvo 0,47%, o sulaikymo laiko nustatytas SSN = 0,11%. Stebint atkuriamumo (angl. inter-day) duomenis smailių ploto variacijos koeficientas buvo 0,56%, sulaikmo laiko – 0,8%. Toks duomenų preciziškumas (glaudumas) yra priimtinas, todėl pagal pasirinktą metodiką galima atlikti kanabidiolio kiekybinę analizę. Vykdant metodo validaciją nustatyta analitės aptikimo riba (LoD) = 0,286 µg/ml, bei kiekybinio nustatymo riba (LoQ) = 0,954 µg/ml. Apskaičiuotas CBD kalibracinės kreivės determinacijos koeficientas R2
=0,9997, tai patvirtina metodo tiesiškumą. Taip pat buvo nustatytos teisiškumo ribos: 0,391 µg/ml - 0,1 mg/ml.
3.4. Cannabis sativa L. ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas
Vertinant FINOLA veislės pluoštinių kanapių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo kitimą ţieduose, buvo pastebėta, jog maţiausiu antioksidaciniu aktyvumu ţiedai pasiţymi sėklų brandos pabaigoje (17 pav.).
17pav. Antioksidacinio aktyvumo kitimas Cannabis Sativa L. žieduose (SSN ≤ 3,14%, n=3)
Antoksidacinis aktyvumas sėklų brandos pabaigoje ţieduose Telšių raj. rinktoje ţaliavoje yra 0,1478±0,0047 TE mg/g, Kupiškio raj. – 0,1443±0,0054 TE mg/g, Anykščių raj.- 0,1433±0,0019 TE mg/g. Kaip matyti 17 pav. Kupiškio ir Anykščių rajonuose antioksidacinė geba augalo ţieduose maţėjo nuo ţydėjimo pradţios iki sėklų brandos pabaigos, o Telšių rajone rinktoje ţaliavoje stebimas antioksidacinės gebos padidėjimas ţydėjimo pabaigoje, kai nustatytos reikšmės ţydėjimo pradţioje buvo 0,3491±0,0057 TE mg/g, o ţydėjimo pabaigoje 0,359±0,0107 TE mg/g, tačiau šis pokytis yra statistiškai nereikšmingas (p = 0,235). Vėlesnėse vegetacijos fazėse išlaikomas bendras TEAC kitimo dėsningumas, lyginant visus regionus.
Vertinant ţieduose esančių fitocheminių junginių antioksidacinę gebą skirtinguose regionuose tuo pačiu vegetacijos metu bei atsiţvelgiant į statistinį reikšmingumą (p < 0,05) buvo nustatyta, jog ţydėjimo pradţioje didţiausias antioksidacinis aktyvumas yra Anykščių raj. rinktuose ţieduose (0,3843±0,0144 TE mg/g), ţydėjimo pabaigoje – Telšių raj. (0,3594±0,0107 TE mg/g), vėlesnėse vegetacijos fazėse reikšmingų skirtumų tarp regionų nenustatyta. Palyginus šias dvi didţiausias reikšmes, buvo nustatyta, jog didţiausias antioksidaciniu aktyvumu ţieduose pasiţymi Anykščių raj. rinkta ţaliava, ţydėjimo pradţioje (p = 0,05).
18pav. Antioksidacinio aktyvumo kitimas Cannabis Sativa L. lapuose (SSN ≤ 4,65%, n=3)
Įvertintus antioksidacinį aktyvumą lapuose skirtingais vegetacijos periodais buvo nustatyta, jog maţiausiu antioksidaciniu aktyvumu visuose trijuose regionuose lapai, pasiţymi sėklų brandos pabaigoje (18 pav.). Sėklų brandos pabaigoje Telšių raj. rinktuose lapuose buvo nustatytas 0,1127±0,0048 TE mg/g antioksidacinis aktyvumas, Kupiškio raj. – 0,2247±0,0065 TE mg/g, o Anykščių raj. – 0,1934±0,0090 TE mg/g. Telšių, Anykščių ir Kupiškio rajonuose rinktoje ţaliavoje stebimas antioksidacinio aktyvumo didėjimas nuo ţydėjimo pradţios iki pabaigos: nuo 0,2267±0,0031 TE mg/g iki 0,3461±0,0144 TE mg/g Telšių raj., Anykščių raj. nuo 0,2702±0,0070 TE mg/g iki 0,3679±0,0113 TE mg/g, Kupiškio raj. nuo 0,3712±0,0033 iki 0,3784±0,0008 TE mg/g. Ţydėjimo pabaigoje aptiktos antioksidacinio aktyvumo reikšmės lapuose yra didţiausios visuose trijuose regionuose (p < 0,05). Reikšmingas skirtumas tarp regionų ţydėjimo pabaigoje nenustatytas (p > 0,05). Vėlesnėse vegetacijos fazėse nustatytas antioksidacinio aktyvumo maţėjimas.
Lyginant antioksidacinį aktyvumą iš skirtingų regionų surinktų lapų tuo pačiu vegetacijos metu buvo pastebėta, jog gauti rezultatai reikšmingai skiriasi ţydėjimo pradţioje, sėklų brandos pradţioje bei sėklų brandos pabaigoje (p < 0,05). Statistiškai reikšmingas skirtumas ţydėjimo pabaigoje tarp skirtinguose regionuose surinktų lapų nenustatytas.
Nustačius antioksidacinio aktyvumo kitimą Cannabis sativa L. stiebuose buvo pastebėta, jog maţiausiu antoksidaciniu aktyvumu pasiţymi ţaliava surinkta ţydėjimo pradţioje (19 pav.). Ţydėjimo pradţioje Telšių raj. rinkta ţaliava pasiţymėjo 0,0356±0,0015 TE mg/g antioksidacine geba, Kupiškio raj. – 0,0570±0,0001 TE mg/g, Anykščių raj. – 0,0614±0,0002 TE mg/g. Didţiausias antioksidacinis aktyvumas stiebuose buvo uţfiksuotas Anykščių rajone rinktoje ţaliavoje, sėklų brandos pradţioje – 0,1066±0,005TE mg/g. Telšių raj. didţiausias uţfiksuotas antioksidacinis aktyvumas stiebuose yra 0,0752±0,0003 TE mg/g, Kupiškio raj. – 0,0754±0,0004 TE mg/g.
Lyginant antioksidacinį aktyvumą iš skirtingų regionų surinktų stiebų tuo pačiu vegetacijos metu buvo pastebėta, jog statistiškai reikšmingai didţiausias antioksidacinio aktyvumo kiekis yra Anykščių raj. surinktoje ţaliavoje ţydėjimo pradţioje, sėklų brandos pradţioje ir sėklų brandos pabaigoje (p > 0,05). Ţydėjimo pabaigoje reikšmingas skirtumas tarp skirtingų regionų nestebimas.
Įvertinus atioksidacinį aktyvumą visuose augalo organuose kiekviename regione buvo nustatyta, jog visose fiksuotose vegetacijos fazėse maţiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymėjo stiebai (p < 0,05). Kupiškio raj. rinktoje ţaliavoje visais vegetacijos periodais didţiausias antoksidacinis aktyvumas išlieka lapuose (p < 0,05). Anykščių raj. rinktoje ţaliavoje ţydėjimo pradţioje didţiausias antioksidacinis aktyvumas ţieduose (p < 0,05), o vėlesniuose vegetacijos perioduose – lapuose (p < 0,05). Telšių raj. rinktoje ţaliavoje ţydėjimo pradţioje ir sėklų brandos pabaigoje didţiausia antioksidacine geba pasiţymi ţiedai, kai p < 0,05, tačiau ţydėjimo pabaigoje ir sėklų brandos pradţioje statistiškai reikšmingas skirtumas tarp lapų ir ţiedų nenustatytas (p > 0,05).
19pav. Antioksidacinio aktyvumo kitimas Cannabis Sativa L. stiebuose (SSN ≤ 4,69%, n=3)
N. Srivastava ir kt. (2012) [53] atlikę Cannabis sativa L. antioksidacinio aktyvumo nustatymą FRAP metodu nustatė, jog didţiausias antioksidacinis aktyvumas yra ţieduose (74,8±1,93 µM Fe++
g-1), vidutinis lapuose (34,0±0,02 µM Fe++g-1), o maţiausias stiebuose (14,5±0,35 µM Fe++g-1) [53]. Šių duomenų palyginimas yra sudėtingas, nes N. Srivastava ir kt. (2012) [53] nenurodo augalo vegetacijos periodo, kuriuo buvo rinkta augalinė ţaliava, o ekstraktų gamyboje naudojama vanduo ir švieţia augalinė ţaliava. Neatsiţvelgiant į šiuos skirtumus, antioksidacinio aktvumo pasiskirstymas tarp augalo dalių atitinka Anykščių rajone rinktos ţaliavos rezultatus ţydėjimo pradţioje.
4. IŠVADOS
1. Kanabidiolis Cannabis sativa L. ţaliavoje buvo identifikuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu pagal sulaikymo laiką ir UV spektrą, bei plonasluoksnės chromatografijos metodu pagal sulaikymo faktorių.
2. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinus kanabidiolio dinamiką skirtinguose Cannabis sativa L. organuose nustatyta, jog didţiausia CBD koncentracija tirtuose regionuose yra ţieduose (p < 0,05), vidutinė – lapuose, maţiausia – stiebuose (p > 0,05) visos augalo vegetacijos metu. Taip pat įvertinus kanabidiolio kitimą skirtingomis vegetacijos fazėmis rinktuose mėginiuose nustatyta, jog didţiausia CBD koncentracija ţieduose ir lapuose aptinkama ţydėjimo pradţioje visuose regionuose (p < 0,05).
3. Spektrofotometriniu būdu įvertinus antioksidacinio aktyvumo kitimą Cannabis sativa L. ţaliavoje visuose pasirinktuose regionuose buvo nustyta, jog ţieduose TEAC laipsniškai maţėja augalui vystantis, lapuose TEAC maksimumas pasiekiamas ţydėjimo pabaigoje, vėlesniu vegetacijos metu stebimas TEAC maţėjimas, o stiebuose nuo vegetacijos priklausomo bei dėsningo TEAC kitimo nebuvo nustatyta. Stiebuose buvo nustatytos maţiausios TEAC reikšmės visuose regionuose (p < 0,05), o dėsningo pasiskirstymo tarp ţiedų ir lapų, lyginant skirtinguose regionuose ištirtą ţaliavą, nustatyta nebuvo.
