MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
SANDRA KAZLAUSKAITĖ
BIOLOGIŠKAI AKTYVIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NATŪRALIOSE IR KOMERCINĖSE VYNUOGIŲ SULTYSE TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Giedrė Kasparavičienė
KAUNAS, 2014
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas dr., prof. Vitalis Briedis 2014 05 30
BIOLOGIŠKAI AKTYVIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NATŪRALIOSE IR KOMERCINĖSE VYNUOGIŲ SULTYSE TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Darbą atliko Doc. dr. Giedrė Kasparavičienė Magistrantė
Sandra Kazlauskaitė 2014 05 30 2014 05 30
Recenzentas
Prof. Sonata Trumbeckaitė 2014 05 30
KAUNAS, 2014
TURINYS
SANTRUMPOS ... 5
ĮVADAS ... 6
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 7
DARBO AKTUALUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ ... 8
1. LITERATŪROSAPŢVALGA ... 9
1.1 Tiriamojo objekto ţaliavos – vynuogių, apibūdinimas ... 9
1.1.1 Vynuogių cheminė sudėtis ... 10
1.1.2 Vynuogių veislių charakteristika ... 10
1.2 Sulčių apibūdinimas ... 12
1.2.1 Sulčių gaminimo technologija ... 12
1.2.2 Sulčių rūšių klasifikacija ... 13
1.3 Biologiškai aktyvūs junginiai vynuogėse ... 14
1.3.1 Fenolinių junginių charakteristika ... 14
1.3.2 Antocianinų charakteristika ... 15
1.4 Biologiškai aktyvių junginių įtaka antioksidaciniam aktyvumui ... 17
1.4.1 Antioksidacinio aktyvumo apibūdinimas ... 17
1.4.2 Antioksidacinė ląstelės sistema ... 18
1.5 Vynuogių sultyse esančių junginių biologinis aktyvumas ... 18
1.5.1 Oksidacinio streso maţinimas ... 18
1.5.2 Apsauga nuo širdies ir kraujagyslių sistemos ligų ... 19
1.5.3 Cholesterolio koncentraciją kraujyje maţinantis poveikis ... 19
1.5.4 Antihipertenzinis poveikis ... 19
1.5.5 Priešuţdegiminis aktyvumas ... 20
1.5.6 Antimikrobinis poveikis ... 21
1.5.7 Senėjimo procesą slopinantis ir kognityvinę funkciją gerinantis poveikis ... 21
1.5.8 Antialerginis poveikis ... 21
1.5.9 Priešvėţinis poveikis ... 22
1.5.10 Azoto oksido gamybą skatinantis ir endotelio funkciją gerinantis poveikis ... 22
1.5.11 Audinius apsaugantis poveikis po jonizuojančios spinduliuotės ... 24
2.EKSPERIMENTINĖDALIS ... 26
2.1 Tyrimo medţiagos ir aparatūra ... 26
2.2 Tyrimo objektas ... 26
2.3 Tyrimo metodai ... 27
2.3.1 Tankio nustatymas ... 27
2.3.2 pH reikšmės nustatymas ... 27
2.3.3 Sauso likučio kiekio nustatymas ... 27
2.3.4 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 27
2.3.5 Bendro antocianinų kiekio nustatymas ... 28
2.3.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalinio sujungimo metodu ... 29
2.4 Statistinė analizė ... 29
3.TYRIMOREZULTATAI ... 30
3.1 Tankio įvertinimas vynuogių sultyse ... 30
3.2 pH reikšmės įvertinimas vynuogių sultyse ... 30
3.3 Sauso likučio įvertinimas vynuogių sultyse ... 31
3.4 Bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas vynuogių sultyse ... 32
3.5 Bendro antocianinų kiekio įvertinimas vynuogių sultyse ... 33
3.6 Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas vynuogių sultyse ... 34
3.7 Antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo bendro fenolinių junginių kiekio ... 35
3.8 Antioksidacinio aktyvumo priklausomybė nuo antocianinų kiekio ... 36
3.9 Rezultatų aptarimas ... 37
4.PRAKTINĖSREKOMENDACIJOS ... 40
IŠVADOS ... 41
SANTRAUKA ... 42
SUMMARY ... 43
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44
PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ... 49
SANTRUMPOS
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas GRE - galo rūgšties ekvivalentas
SBP - sistolinis kraujo spaudimas DBP - diastolinis kraujo spaudimas DNR - deoksiribonukleorūgštis COX-1 - ciklooksigenazė-1 COX-2 - ciklooksigenazė-2
NO - azoto oksidas
eNOS - azoto oksido sintazė AA - antioksidacinis aktyvumas RDR - reaktyvios deguonies rūšys LDH - laktato dehidrogenazė UV - ultravioletinė spinduliuotė
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija
ĮVADAS
Vynuogės nuo seno buvo laikomos išskirtinėmis uogomis, nes jose gausu biologiškai aktyvių junginių. Tai leido sukurti net atskirą mokslą apie gydymą vynuogėmis — ampeloterapiją. Garsusis graikų gydytojas Hipokratas teigė, kad vynuogių sultys ir motinos pienas yra lygiaverčiai produktai savo maistingumu ir nauda ţmogaus organizmui [49].
Vynuogių ir jų produktų medicininė vertė buvo pripaţinta daugiau kaip prieš 6000 metų. Senovės Egipte iš vynuogių sulčių buvo gaminamas aliejus odos ir akių ligoms gydyti.
Uogos buvo traiškomos, gaminami eliksyrai, kurie buvo naudojami terapiniams tikslams, gydant pykinimą, vidurių uţkietėjimą, cholerą, raupus, kepenų ligas [53].
Aplinkos veiksniai, mityba, gyvenimo būdas gali skatinti lėtinio uţdegimo ir oksidacinio streso vystymąsi. Tam įtakos turi laisvieji radikalai. Jie dalyvauja mechanizmuose, sukeliančiuose daugybę ligų, tokias kaip vėţys, širdies ir kraujagyslių ligos, nervų sistemos ligos. Apsauga prieš laisvuosius radikalus gali būti sustiprinta vartojant maistinius antioksidantus. Antioksidantai sujungia laisvuosius radikalus ir saugo ląsteles nuo oksidacinio streso [27]. Vynuogėse gausu fenolinių junginių ir antocianinų, kurie pasiţymi antioksidaciniu aktyvumu [45].
Klinikinių tyrimų metu nustatyta, kad vynuogių sulčių vartojimas turi įtakos maţinant rizikos veiksnius, susijusius su širdies ir kraujagyslių ligomis, vėţiu, neurodegeneracinėmis ligomis ir su amţiumi susijusiu suvokimo silpnėjimu. Šie poveikiai taip pat daţnai siejami su antioksidaciniu aktyvumu ir flavonoidų junginių, randamų vynuogėse, funkcijomis maţinti uţdegimą [13,15,45].
Vynuogės valgomos švieţios, iš jų gaminamos sultys, todėl uogos ir iš jų pagaminti produktai, kuriuose gausu bioaktyvių medţiagų, gali turėti teigiamos įtakos sveikatai. Šio eksperimentinio tyrimo tikslas — nustatyti ir palyginti natūralių sulčių, pagamintų iš skirtingų Lietuvoje augančių vynuogių veislių (Vitis vinifera L.) uogų, ir komercinių vynuogių sulčių kokybinius ir kiekybinius rodiklius, įvertinti antioksidacinį aktyvumą. Tyrimo tikslui pasiekti yra iškeliami pagrindiniai uţdaviniai: nustatyti tankį, pH reikšmę, sauso likučio kiekį visose tirtose vynuogių sultyse; spektrofotometriškai nustatyti bendrą fenolinių junginių ir antocianinų kiekį;
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalinio sujungimo metodu įvertinti antioksidacinį aktyvumą natūraliose ir komercinėse vynuogių sultyse; įvertinti galimą kiekybinių rodiklių koreliaciją.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:
Nustatyti ir palyginti natūralių sulčių, pagamintų iš skirtingų Lietuvoje augančių vynuogių veislių (Vitis vinifera L.) uogų, ir komercinių vynuogių sulčių kokybinius ir kiekybinius rodiklius, įvertinti antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uţdaviniai:
1. Nustatyti skirtingų vynuogių veislių sulčių, pagamintų iš švieţių, šaldytų vynuogių uogų bei pasterizuotų ir komercinių vynuogių sulčių kokybinius rodiklius – tankį, pH reikšmę, sauso likučio kiekį.
2. Nustatyti bendrą fenolinių junginių ir antocianinų kiekį visose tirtose vynuogių sultyse.
3. Įvertinti antioksidacinį aktyvumą natūraliose ir komercinėse vynuogių sultyse.
4. Įvertinti galimą kiekybinių rodiklių – fenolinių junginių, antocianinų ir antioksidacinio aktyvumo koreliaciją.
DARBO AKTUALUMAS IR PRAKTINĖ REIKŠMĖ
Vynuogių sultyse esantys biologiškai aktyvūs junginiai – antocianinai, katechinas, galo rūgštis, fenolinės rūgštys ir kiti flavonoidų grupei priklausantys ir antioksidacinėmis savybėmis pasiţymintys junginiai, stiprina organizmo apsaugines funkcijas ir stabdo lėtinių ligų vystymąsi bei progresavimą.
Mokslininkai pateikia daugybę straipsnių, publikacijų, kuriose pagrindţiami teiginiai, pateikiami svarūs argumentai, išsamūs tyrimai, įrodantys būtent vynuogių sultyse esančių junginių teigiamą poveikį ţmogaus ląstelėms, organams ir audiniams. Mokslinio straipsnio autoriai (Mahdavi et al., 2010), atlikę tyrimus, įrodė, kad biologiškai aktyvūs junginiai yra geriau absorbuojami iš sulčių negu iš augalų audinių, valgant uogas, vaisius. Teigiama, kad vaisių sulčių vartojimas atitinka rekomenduojamas vaisių porcijas.
Šio eksperimentinio tyrimo tikslas buvo nustatyti vynuogių sultyse esančius ir organizmo sistemos funkcionavimui įtaką turinčius kokybinius ir kiekybinius rodiklius, įvertinti antioksidacinį aktyvumą. Tyrimo metu buvo siekiama palyginti vynuogių sulčių, pagamintų iš skirtingų veislių vynuogių uogų, kurios buvo veikiamos skirtingo temperatūrinio reţimo, rodiklius. Darbo metu, siekiant išsamesnės analizės ir duomenų patikimumo, natūralios vynuogių sultys buvo palyginamos su komercinėmis vynuogių sultimis.
Vystantis ir tobulėjant vaistų formų kūrimo technologijoms, vynuogių sultys galėtų būti įdomiu objektu farmacinių preparatų gamybai. Dţiovinant sultis būtų galima: 1) padidinti biologiškai aktyvių medţiagų kiekį (1 kapsulė = 5 stiklinės vynuogių sulčių); 2) padidinti biologiškai aktyvių medţiagų bioprieinamumą; 3) išlaikyti biologiškai aktyvių medţiagų stabilumą. Plečiantis farmacinių preparatų rinkai, toks augaliniu pagrindu pagamintas vaistinis preparatas, kuriame sukoncentruotas didelis kiekis biologiškai aktyvių medţiagų ir, kurių terapiniai poveikiai jau įrodyti klinikiniais tyrimais, galėtų būti veiksmingas ir saugus, stiprinant biologines organizmo funkcijas.
1. LITERATŪROS APŢVALGA 1.1 Tiriamojo objekto ţaliavos – vynuogių, apibūdinimas
Tikrasis vynmedis (lot. Vitis vinifera L.) – vynmedinių (Vitaceae) šeimos augalų rūšis. Natūraliai paplitusi Vidurţemio jūros regione, vidurio Europoje, pietvakarių Azijoje [54].
Tai sumedėjusi vijoklinė liana. Ūgliai turi ūselius, kurie kabinasi uţ atramų, ir gali nusitęsti iki 25 m ir daugiau. Lapai stambūs, 3-5 skiaučių. Vaisiai – vynuogės: ţalios, tamsiai raudonos arba mėlynos sultingos uogos, susitelkusios į tankias arba retesnes kekes, prisirpsta rugpjūčio-rugsėjo mėnesiais [54,56].
Mokslinė klasifikacija [54]:
Karalystė: augalai (Plantae)
Skyrius: magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: magnolijainiai (Magnoliopsida) Šeima: vynmediniai (Vitaceae)
Gentis: vynmedis (Vitis)
Rūšis: tikrasis vynmedis (Vitis vinifera)
Svarbiausios vynmedţių rūšys [57]:
Tikrasis vynmedis (Vitis vinifera)
Gauruotasis vynmedis (Vitis labrusca)
Krantinis vynmedis (Vitis riparia)
Amūrinis vynmedis (Vitis amurensis)
Lapinis vynmedis (Vitis vulpina)
1.1.1 Vynuogių cheminė sudėtis
Vynuogės — unikalios uogos, ypatingos ne tik išskirtiniu skoniu, bet ir chemine sudėtimi. Mokslininkai vynuogėse yra nustatę apie 150 biologiškai aktyvių junginių. Vynuogėse gausu angliavandenių, cukraus (18–20 proc.), organinių rūgščių (citrinų, obuolių, vyno ir kt.), magnio, geleţies (0,5–0,6 mg proc.), kobalto, pektinų, rauginių medţiagų, provitamino A, vitaminų C, P, PP, B grupės vitaminų, nemaţai folio rūgšties, sėklose – aliejų. Ypač naudingos ir maistingos yra vynuogių sultys [53,54].
Vynuogių sultyse gausu mineralų, kuriuos vynuogių šaknys kartu su vandeniu siurbia iš ţemės ir transportuoja į vynuogių uogas. Mineralų koncentracija ir jų santykis vynuogėse labai priklauso nuo dirvoţemio. Pagrindinis elementas vynuogėse yra kalis. Jis aktyviai dalyvauja angliavandenių sintezėje ir jų transportavime iš vynuogių lapų į uogas, todėl kalio koncentracija tiesiogiai priklauso nuo cukraus kiekio vynuogėse [52]. Antras pagal gausumą elementas vynuogėse yra kalcis [50,53].
Kitas svarbus vynuogių sulčių komponentas yra rūgštys. Vynuogėse yra dvi pagrindinės rūgštys – vyno rūgštis ir obuolių rūgštis. Vyno rūgštis yra stabili ir beveik nedalyvauja fermentacijos procese. Skirtingai nuo vyno rūgšties, obuolių rūgštis aktyviai dalyvauja įvairiuose biocheminiuose procesuose, vykstančiuose tiek pačiose vynuogėse augimo metu, tiek fermentacijos metu. Nokstant vynuogėms, obuolių rūgštis virsta kitomis cheminėmis medţiagomis ir jos kiekis iki pat nuskynimo visą laiką maţėja. Vynuogių uogose obuolių rūgštis yra naudojama kaip energijos šaltinis, o galutinėje vynuogių brendimo stadijoje ji virsta gliukoze [52].
1.1.2 Vynuogių veislių charakteristika
Veislė — vieno augalo vegetatyviškai padauginti palikuonys.
Desertinių veislių vynuogės skirtos valgyti švieţias. Jos pasiţymi patrauklia kekių ir uogų išvaizda, maloniu skoniu ir aromatu, sultingu ar mėsingu minkštimu.
Vyninių veislių vynuogių paskirtis – vyno ir sulčių gamyba. Joms labai svarbi cheminė ir mechaninė derliaus sudėtis. Vyninių veislių skiriamasis bruoţas yra didelis sulčių kiekis uogose (75 – 85 proc. uogų masės) ir didelis cukringumas [56].
Šiuo metu yra populiarios trys pagrindinės vynuogių veislės: europietiškos vynuogės (Vitis vinifera), Šiaurės Amerikos vynuogės (Vitis labrusca ir Vitis rotundifolia) ir prancūziški hibridai [55].
Jau XVIII – XIX a. vynmedţiai buvo auginami Lietuvos dvaruose. Vilniaus botanikos sodo augalų ir sėklų sąrašuose vynmedţių genties augalai buvo paminėti 1782 m. Vitis vinifera L., 1821 m. Vitis labrusca L., 1824 m. Vitis vulpina L. XX amţiaus pirmoje pusėje vynmedţius introdukavo ir tyrė Kauno botanikos sode [56].
Pagal vynuogių prinokimo laiką Lietuvoje veislės skirstomos [55]:
labai ankstyvos (105 – 115 dienų) – sunoksta nuo rugpjūčio vidurio;
ankstyvosios (115 – 125 dienos) – sunoksta apie rugsėjo 1-ąją;
vidutiniškai ankstyvos (125 – 135 dienos) – sunoksta iki rugsėjo vidurio;
vėlyvosios (135 – 150 dienų) – sunoksta iki rugsėjo pabaigos.
Vitis vinifera veislės [57]:
1. Iš V. vinifera occidentalis kilusios veislės jautrios šalčiui, filokserai ir miltligei, joms reikia daug šilumos (vėlai sunoksta). Tai Noir grupės (burgundiškos) veislės – jos ţydi vėlai, uogos apvalios, maţos, kekė daţniausiai tanki, uogos odelė plona, minkštimas sultingas. Ţinomiausios veislės: „Pinot Blanc―, „Pinot Noir―, „Gamay―,
„Frankenshtal―.
2. Madeleine grupės veislės – ankstyvos, uogos maţos, apvalios, kartais elipsiškos, sultingos, kekė reta. Ţinomiausios veislės: „Malinger―, „Madeleine angevine―.
3. Riesling grupės veislės – vėlyvos vyninės, baltos spalvos uogos, labai jautrios šalčiui ir ligoms, sunokimui reikia daug šilumos. Ţinomiausios veislės: „Muller Thurgau―,
„Riesling―.
4. Chasselas grupės veislės. Jų uogų minkštimas mėsingas – sultingas, kekės vidutinio dydţio, tankios. Ţinomiausios veislės: „Chasselas blank―, „Chasselas Dore―.
5. Besėklės veislės – didelės kekės, bet maţos uogos, daţnai jas reikia purkšti giberelinais, kad uţsimegztų uogos. Atsparesnės šalčiui, lyginant su anksčiau minėtomis grupėmis. Ţinomiausios įvairios „Kišmiš― veislės.
6. Aromatingos vyninės veislės, pavyzdţiui, „Traminer―.
1.2 Sulčių apibūdinimas
Sultys yra vienas iš vertingiausių vaisių, uogų ir darţovių perdirbimo produktų. Tai vaisių, uogų ar darţovių ląstelių skystoji dalis, gauta jas išspaudus mechaniniu būdu ar išgarinus garintuve vandens garais. Jose yra lengvai organizmo pasisavinamų angliavandenių, rūgščių, vitaminų, fermentų, mineralinių medţiagų. Sultys padeda ţmogaus organizmui pasisavinti riebalus, baltymus, angliavandenius, gaunamus su kitais produktais. Todėl sultys iš dalies gali pakeisti blogai išsilaikančius švieţius vaisius, darţoves, ypač uogas. Daţniau sultys spaudţiamos iš vaisių ir uogų, rečiau iš darţovių [49,50].
Sultims skirti vaisiai, uogos ir darţovės turi būti švieţi ir pakankamai subrendę, švarūs, nesugedę, nepaţeisti ligų ir kenkėjų. Nesubrendusiuose vaisiuose ir uogose yra maţiau angliavandenių, daugiau rauginių medţiagų, todėl sultys iš jų būna neskanios, aitrios. Iš perbrendusių produktų sultis sunkiau išskirti, jos lėtai skaidrėja, sunkiau filtruojasi [2,49].
1.2.1 Sulčių gaminimo technologija
Sulčių gaminimo procesas (1 pav.) [50]:
1) vaisiai, uogos ir darţovės rūšiuojami, atrenkami įpuvę;
2) plaunami;
3) ţaliava smulkinama;
4) spaudţiamos sultys.
Ţaliava sultims ne pjaustoma, o sutrinama. Smulkinant paţeidţiami ţaliavos audiniai, iš dalies suardomos ląstelių sienelės, todėl geriau išsiskiria sultys. Tačiau susmulkinta masė neturi būti per smulki, nes presuojant uţsikemša preso tinklelio tarpeliai, ir sulčių išteka maţiau.
Uogas, vaisius ir darţoves reikia smulkinti nerūdijančio plieno, mediniais ar plastmasiniais įrankiais, nes nuo sąlyčio su metalu suyra labai svarbios biologiškai aktyvios medţiagos [2,49,53].
Sušaldant ţaliavą, susidaro ledo kristalai, kurie ardo ląstelių sieneles. Be to, kristalizuojantis vandeniui, ląstelėse esančiuose syvuose didėja druskų ir rūgščių koncentracija, ląstelės ţūva, ir išsiskiria sultys.
Rauginant susmulkintą masę, angliavandeniai paverčiami etilo alkoholiu, kuris sukelia protoplazmos baltymų krešėjimą, ir ląstelės ţūva. Šis metodas taikomas tik ruošiant spirituotas sultis, nes natūraliose alkoholio neturi būti daugiau kaip 0,5 proc. [49,50].
1 pav. Sulčių (natūralių, skaidrių, kupažuotų, saldintų) gamybos technologijos schema
[http://www.asu.lt/nm/l-projektas/aug_mp_kokybe_s]
1.2.2 Sulčių rūšių klasifikacija
Saldintos sultys. Ne visos natūralios sultys turi pakankamai angliavandenių ir rūgščių.
Paprastai tik obuolių, kriaušių ir vynuogių sultis galima gerti natūralias. Kaulavaisių ir uogų sultys yra per rūgščios. Jos saldinamos cukraus sirupu ar smulkiu cukrumi. Daţniausiai cukrus beriamas į sultis be minkštimo, o cukraus sirupas pilamas į sultis su minkštimu. Daţniausiai
naudojamas 30 – 50 proc. koncentracijos cukraus sirupas. Sirupas arba cukrus supilamas į sultis, jos pakaitinamos iki 90 – 95 °C temperatūros ir išpilstomos į sterilius indus [2,50,54].
Maišytos (kupaţuotos) sultys. Norint turėti įvairesnio skonio ir vitaminingumo sulčių, jos yra maišomos. Vitaminizuoti geriausia šaltalankių ir erškėtuogių sultimis. Kupaţuotos sultys būna labai įvairios: natūralios ir su cukrumi, su minkštimu ir be minkštimo [2,50].
Sutirštintos sultys. Sutirštintomis vadinamos tokios sultys, kuriose sausųjų medţiagų koncentracija siekia 44-70 proc. Sutirštintos sultys gali būti dvejopos: ekstraktai ir koncentruotos sultys [50,58].
Koncentruotos vynuogių sultys. Tai sultys, iš kurių pašalinti karamelizacijos produktai, gaunamos nevisiškai išdţiovinus vynuogių sultis bet kuriuo leidţiamu metodu, išskyrus tiesioginį kaitinimą taip, kad refraktometro, naudojamo taikant patvirtintą metodą, vertė 20 °C temperatūroje būtų ne maţesnė kaip 50,9 proc. Koncentruotų vynuogių sulčių faktinė alkoholio koncentracija tūrio procentais gali būti ne didesnė kaip 1 tūrio proc. [2,50,53].
1.3 Biologiškai aktyvūs junginiai vynuogėse 1.3.1 Fenolinių junginių charakteristika
Fenoliniai junginiai sudaro vieną iš didţiausių fitocheminių junginių grupių ir labiausiai paplitę tarp augalų karalystės atstovų [28,35,46]. Pateikiama daugiau nei 8000 fenolinių junginių struktūrų [18,48]. Flavonoidai yra didţiausia ir labiausiai ištirta augalų fenolių grupė. Yra identifikuota virš 4000 skirtingų flavonoidų [18,30,46,47]. Šie junginiai turi bendrą struktūrą, kurią sudaro du aromatiniai ţiedai (A ir B), juos jungia trys anglies atomai, kurie sudaro deguonies heterociklą (C) (2 pav.) [34,36,46].
2 pav. Pagrindinė flavonoidų cheminė struktūra [Pandey et al., 2009]
Fenolinių junginių yra išskiriamos dvi grupės: flavonoidai, remiantis bendra struktūra C6-C3-C6, ir ne flavonoidai. Ne flavonoidų pagrindiniai junginiai yra fenolinės rūgštys (hidroksibenzoinės rūgštys), hidroksicinamono rūgštys ir stilbenai. Hidroksibenzoinės rūgštys yra paremtos anglies atomų C6-C1 struktūra, benzeno ţiedas su vienu anglies alifatinės grandinės pakaitu. Įvairios rūgštys yra diferencijuojamos pagal pakaitus benzeno ţiede. Šio poklasio pagrindiniai junginiai: vanilino, siringo, galo rūgštys. Vynuogėse yra keletas hidroksicinamono rūgščių, kurių pagrindą sudaro anglies atomų C6-C3 struktūra (3 pav.). Šių rūgščių laisvos formos nustatytos maţais kiekiais, daugiausia esterifikuotos, ypač su tartrato rūgštimi [16,19,20].
Sudėtingesni fenoliniai junginiai yra stilbenai. Jie turi du benzeno ţiedus, sujungtus etano ar etileno grandine. Šie trans-izomeriniai junginiai, resveratrolis ar 3,5,4-trihidroksistilbenas, susidaro vyne [20,28,33].
Hidroksibenzoinės rūgštys Hidroksicinamono rūgštys
R1 R2 R3 R4
p-hidroksibenzoinė rūgštis H H OH H p-kumarino rūgštis protokatechuinė rūgštis H OH OH H kafeiko rūgštis vanilino rūgštis H OCH3 OH H ferulo rūgštis galo rūgštis H OH OH OH
siringo rūgštis H OCH3 OH OCH3 sinapiko rūgštis
3 pav. Monomerinių fenolinių junginių struktūros vynuogėse [Lorrain et al., 2013]
1.3.2 Antocianinų charakteristika
Antocianinai – tai vandenyje tirpūs pigmentai, randami daugelyje augalų audinių [14,24]. Šie junginiai suteikia raudoną, mėlyną, violetinę spalvą vynuogėms ir jų produktams
[24]. Antocianinų daugiausia kaupiasi vynuogių odelėje. Struktūriškai antocianinai yra sudaryti iš aglikono (antocianidino) ir angliavandenių molekulių, kurios gali būti prisijungusios acilo grupes. Antocianidinų pagrindą sudaro C6-C3-C6 flavonoidų struktūra. Vynuogėse labiausiai paplitę antocianidinai: pelargonidinas, cianidinas, delfinidinas, peonidinas, petunidinas ir malvidinas, kuris paprastai vyrauja raudonose vynuogėse [23].
Antocianinų junginiai vieni nuo kitų skiriasi hidroksi- ir/ar metoksi- grupių pakaitais ir angliavandenių molekulių skaičiumi, prisijungimo būdu bei padėtimi. Vynuogėse pagrindinė angliavandenių molekulė yra gliukozė. Antocianinams daugelyje augalų būdingas tik O- glikozilinimas. Tačiau naujesnėje literatūroje yra teigiama, kad egzistuoja kai kuriuose augaluose ir C-glikozilinimas [22]. Augalo V. vinifera rūšyse, gliukozė gali prisijungti prie antocianidinų per glikozidinius ryšius C3 padėtyje ir suformuoti 3-O-monogliukozidą, kadangi jiems trūksta dominuojančio alelio, įtraukiančio į digliukozidinių antocianinų gamybą. Ne augalo V. vinifera rūšyse, jungtys gali susidaryti abiejose C3 ir C5 padėtyse, susidarant 3,5-O-digliukozidų antocianinams. Vynuogėse esančių individualių antocianinų struktūros, įskaitant 3-O- monogliukozidus ir 3,5-O-digliukozidus, pavaizduotos 4 paveikslėlyje [22,23,24].
4 pav. Vynuogių sultyse esančių antocianinų struktūros [He, Mu et al., 2010]
Antocianinas R1 R2
Pelargonidin-3-O-monogliukozidas H H Cianidin-3-O-monogliukozidas OH H Delfinidin-3-O-monogliukozidas OH OH Peonidin-3-O-monogliukozidas OCH3 H Petunidin-3-O-monogliukozidas OCH3 OH Malvidin-3-O-monogliukozidas OCH3 OCH3
Antocianinas R1 R2
Pelargonidin-3,5-O-digliukozidas H H Cianidin-3,5-O-digliukozidas OH H Delfinidin-3,5-O-digliukozidas OH OH Peonidin-3,5-O-digliukozidas OCH3 H Petunidin-3,5-O-digliukozidas OCH3 OH Malvidin-3,5-O-digliukozidas OCH3 OCH3
1.4 Biologiškai aktyvių junginių įtaka antioksidaciniam aktyvumui
1.4.1 Antioksidacinio aktyvumo apibūdinimas
Antioksidacinis aktyvumas — tai medţiagos geba sustabdyti kitų junginių oksidacinės degradacijos procesus [39]. Moksliškai pagrįsti tyrimai rodo, kad maistas, turintis sudėtyje antioksidantų, yra svarbus ligų prevencijai [34]. Nustatyta, kad vaisiai ir darţovės pasiţymi apsauginėmis savybėmis prieš oksidacinio streso sukeliamas ligas, tokias kaip vėţys, širdies ligos, nutukimas, antrojo tipo cukrinis diabetas, hipertenzija, katarakta [7,26]. Vaisiuose ir darţovėse esantys antioksidantai: karotenoidai, fenoliniai junginiai, benzoinės rūgšties junginiai, flavonoidai, proantocianidinai, kumarinai, lignanai [26]. Mokslininkai nustatė, kad antioksidantų deriniai yra veiksmingesni negu pavieniai antioksidantai. Antioksidantai yra naudingi pagerinant gyvenimo kokybę, uţkertant kelią ar atitolinant degeneracinių ligų pradţią [25].
Antioksidantų yra išskiriami keli skirtingi veikimo mechanizmai: 1) oksiduojančių fermentų slopinimas, tai sumaţina reaktyviojo deguonies/reaktyviojo azoto rūšių gamybą ląstelėje; 2) sąveika su redokso signaliniais keliais, jos metu paverčiama į ląstelių antioksidacinį atsaką; 3) tiesioginė reakcija su reaktyviojo deguonies/reaktyviojo azoto rūšimis duoda maţiau toksišką/reaktyvų produktą [27].
Antioksidacinės sistemos sutrikimai taip pat nepalankios ląstelės aplinkos sąlygos sukelia nevaldomą reaktyvių deguonies rūšių (RDR) didėjimą ląstelėje. Tai lemia oksidacinį ląstelės stresą. Šiai būsenai yra būdingi tam tikri įvairių ląstelės struktūrų paţeidimai.
Biomolekulių paţeidimai, sukelti RDR, vadinami oksidaciniais paţeidimais [7]. Ţinoma daug ligų, kurių patogenezei RDR labai svarbios – tai uţdegiminės ir degeneracinės ligos, išemija/reperfuzija, aterosklerozė, katarakta, padaţnėjusių mutacijų sukeltas vėţys ir organizmo senėjimas [36]. Kenksmingi aplinkos veiksniai − ultragarsas, radiacija, sunkieji metalai ir kt. − taip pat sukelia oksidacinį stresą [7,11].
Oksidacinio streso metu daţniausiai ląstelėse padaugėja laisvų Ca2+ ir Fe3+ jonų. Todėl susidaro dar daugiau hidroksilo radikalų OH• . Tam tikra hidroksilo radikalų OH• dalis susidaro branduolyje, kur jie oksiduoja deoksiribonukleorūgštį (DNR). Normaliomis sąlygomis RDR susidarymas ląstelėje yra kompensuojamas juos naikinančių reakcijų (apsauginių sistemų veiklos). Maţi kiekiai RDR ląstelėje reikalingi tam tikroms fiziologinėms funkcijoms atlikti.
Sutrikus pusiausvyrai tarp RDR susidarymo ir šalinimo procesų (sumaţėjus antioksidantų arba padidėjus RDR susidarymui), pasireiškia oksidacinis stresas. Tokią būseną gali sukelti mineralų stoka maiste, t.y. maţesnis antioksidantų kiekis [4,11].
1.4.2 Antioksidacinė ląstelės sistema
Ląstelė gali apsisaugoti nuo švelnaus oksidacinio streso, didindama antioksidacinės apsaugos fermentų sintezės greitį [4,9]. Ţmogaus kūnas turi sudėtingą sistemą — natūralią fermentinę ir nefermentinę antioksidantų apsaugą, kuri neutralizuoja laisvųjų radikalų ir kitų oksidantų sukeltą ţalingąjį poveikį [34].
Endogeniniai antioksidantai yra fermentai, pvz., superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė, ir ne fermentiniai junginiai, pvz., šlapimo rūgštis, bilirubinas, albuminas, metalotioneinas. Kada endogeniniai veiksniai negali uţtikrinti grieţtos kontrolės ir visiškos organizmo apsaugos prieš reaktyvias deguonies formas, tuomet kyla egzogeninių antioksidantų poreikis. Svarbiausi egzogeniniai antioksidantai: vitaminas E, vitaminas C, β-karotenas, flavonoidai, vitaminas D, vitaminas K3, selenas. Egzogeninius antioksidantus galima gauti ir iš natūralių šaltinių (vitaminai, flavonoidai, antocianinai, mineralai), taip pat gali būti ir sintetiniai junginiai, pvz., butilhidroksianizolas, butilhidroksitoluenas, galatai [26,31].
1.5 Vynuogių sultyse esančių junginių biologinis aktyvumas
1.5.1 Oksidacinio streso maţinimas
Antocianinai yra stipriai veikiantys antioksidantai. Jie efektyviai neutralizuoja laisvuosius radikalus ir nutraukia grandininę reakciją, kuri atsakinga uţ oksidacinę paţaidą.
Kadangi pH ţmogaus kūne yra neutralus, išskyrus skrandyje, antocianinų antioksidacinis aktyvumas neutraliame pH yra ypač svarbus [10,23].
Buvo atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, kad antocianinas cianidin-3-gliukozidas pasiţymi panašiu antioksidaciniu aktyvumu kaip ir vitaminas E (α-tokoferolis) [24]. Kito tyrimo metu su ţiurkėmis, naudojant kepenų išemijos/reperfuzijos kaip oksidacinio streso modelį, nustatyta, kad cianidin-3-gliukozidas veiksmingai susilpnino kepenų ţalojimo bioţymeklių pokyčius [38].
Antocianinų apsauginis poveikis oksidacinio streso sukeltai paţaidai, įrodytas in vivo tyrimais. Buvo atlikti tyrimai su ţiurkėmis. Gyvūnai buvo dvylika savaičių maitinami vitamino E stokojančiu maistu, po to mityba papildyta išgrynintais antocianinų ekstraktais. Mityba, kurios didţiąją dalį sudarė antocianinų turintis maistas, reikšmingai pagerino plazmos antioksidacinį aktyvumą ir sumaţino hidroksiperoksidų kiekį, reikšmingai sumaţino dėl vitamino E sukelto trūkumo pasireiškusią lipidų peroksidaciją ir DNR paţaidą [24].
1.5.2 Apsauga nuo širdies ir kraujagyslių sistemos ligų
Maţo tankio plazmos lipoproteinų oksidacija skatina makrofagų baltųjų kraujo ląstelių kaupimąsi arterijų sienelėje. Oksiduoto cholesterolio plokštelių sankaupos plyšimas arterijų sienelėje sukelia aterosklerozę ir galiausiai širdies ir kraujagyslių sistemos ligas [23,38].
Maistiniai antioksidantai, ypač antocianinai, turi potencialą padidinti serumo antioksidantų efektyvumą ir tokiu būdu apsaugoti nuo maţo tankio lipoproteinų oksidacijos ir uţkirsti kelią širdies ir kraujagyslių sistemos ligoms. Ultravioletinės spinduliuotės (UV) sukeltame lipidų peroksidacijos modelyje, trys išgryninti antocianinai (pelargonidin-3- gliukozidas, cianidin-3-gliukozidas ir delfinidin-3-gliukozidas), taip pat kaip ir jų aglikonai, įrodė lipidų peroksidacijos stiprų slopinimą ir veikė kaip aktyvių deguonies radikalų neutralizavimo veiksniai [23].
Buvo atliktas tyrimas, kuris įrodė, kad reguliarus vynuogių sulčių vartojimas apsaugo ląsteles ir audinius nuo oksidacinės ţalos ir slopina trombocitų aktyvumą ir agregaciją. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad vynuogių sulčių vartojimas 7,7 ± 1,2 ml/kg/per dieną keturiolika dienų, pagerino endotelio funkcijas penkiolikai pacientų, kurie sirgo išemine širdies liga [18].
1.5.3 Cholesterolio koncentraciją kraujyje maţinantis poveikis
In vivo tyrimo metu buvo nustatyta, kad fenoliniai junginiai, ypač galo rūgštis ir monomeriniai flavan-3-oliai katechinas ir epikatechinas reikšmingai slopino kasos cholesterolio esterazę nuo koncentracijos priklausomu būdu. Kasos cholesterolio esterazė vaidina svarbų vaidmenį hidrolizuojant maiste esančius cholesterolio esterius, kurie atpalaiduoja laisvą cholesterolį į plonosios ţarnos spindį. Taigi cholesterolio esterazės slopinimas riboja cholesterolio, gaunamo su maistu, absorbciją. Junginiai taip pat jungiasi prie tulţies rūgščių ir sumaţina cholesterolio micelių tirpumą, kurios gali sukelti uţdelstą cholesterolio absorbciją [35].
1.5.4 Antihipertenzinis poveikis
Tyrimai in vivo parodė, kad vynuogių produktai pasiţymi kraujospūdį maţinančiu poveikiu. Vyrams ir moterims, sergantiems metaboliniu sindromu, kurie vartojo 150 mg ar 300 mg per dieną vynuogių sėklų ekstrakto 4 savaites, sumaţėjo sistolinis ir diastolinis kraujo spaudimas palyginus su placebu. Analogiški rezultatai buvo gauti ţmonėms, vartojusiems vynuogių sultis [21].
Buvo atliktas atsitiktinių imčių, dvigubai aklas, placebu kontroliuojamas tyrimas, kurio siekis nustatyti, ar vynuogių sultyse esantys junginiai turi įtakos maţinant padidėjusį kraujo spaudimą. Tyrime dalyvavo vyrai, kurių kraujo spaudimas: sistolinis (SBP) > 130 mmHg ir diastolinis (DBP) > 90 mmHg. Dalis tiriamųjų vartojo 5,5 ml/kg kūno svoriui vynuogių sulčių, o kitas dalis pacientų vartojo placebo sultis (sudėtis: cukrus (gliukozė, fruktozė), vyno rūgštis, obuolių rūgštis). Po 8 savaičių gydymo, buvo įvertinami gauti rezultatai (5 pav.). Sistolinis (-7,2 mmHg) ir diastolinis (-6,2 mmHg) kraujo spaudimas reikšmingai (p<0,05) sumaţėjo pacientams, vartojusiems vynuogių sultis [11,45]. Nors šis kraujo spaudimo sumaţėjimas nėra didelis, bet kaip teigiama JAV nacionalinėje aukšto kraujo spaudimo programoje, jog sumaţinus sistolinį kraujo spaudimą 5 mmHg, būtų 14 proc. išvengta mirčių nuo insulto, 9 proc. sumaţėtų mirčių nuo širdies ligų ir 7 proc. sumaţėtų bendras mirtingumas [37].
5 pav. Sistolinio (A) kraujo spaudimo (SBP) ir diastolinio (B) kraujo spaudimo (DBP) pokyčiai prieš ir po vynuogių sulčių vartojimo. Brūkšninė linija žymi placebo sulčių rodiklius,
ištisinė linija – vynuogių sulčių [Park, Lee et al., 2009]
1.5.5 Priešuţdegiminis aktyvumas
Uţdegimas yra sudėtinis biologinis atsakas reaguojant į audinių paţeidimą. Daugelis vėţinių susirgimų atsiranda uţdegimo vietose, kadangi uţdegiminės ląstelės suteikia palankią mikroaplinką vėţiniams augliams susidaryti, todėl priešuţdegiminis gydymas turi potencialią galimybę anksti uţkirsti kelią navikų progresavimui. [42,46]. Ciklooksigenazės (COX) paverčia arachidono rūgštį į prostaglandinus, kurie skatina uţdegimą, todėl slopinamasis poveikis ciklooksigenazės fermentams yra labai svarbus [46]. Buvo atlikti tyrimai, kurie įrodė, kad cianidino aglikonas pasiţymi geresniu priešuţdegiminiu aktyvumu, nei teigiamos kontrolės
aspirinas, įvertinant ciklooksigenazės aktyvumą. Išgrynintos antocianinų frakcijos junginiai įrodė, kad pasiţymi slopinamuoju poveikiu ciklooksigenazės-1 (COX-1) ir ciklooksigenazės-2 (COX-2) fermentams. Visi uţdegimo parametrai buvo veiksmingai maţinami priklausomai nuo antocianinų dozės [45].
1.5.6 Antimikrobinis poveikis
Augaluose esantys fenoliniai junginiai pasiţymi stipriu antibakteriniu, priešgrybeliniu aktyvumu [20,28,41]. Tyrimo metu įrodyta, kad cianidin-3-gliukozidas veiksmingai slopina Gram- Escherichia coli padermę, bet neslopina normalios E. coli bakterijos ir naudingų Gram+
probiotinių bakterijų. Poveikis buvo priskirtas antocianinų gebėjimui skatinti lipopolisacharidų molekulių išsiskyrimą iš Gram- bakterijų išorinės membranos [46].
Tyrimai in vitro parodė, kad vynuogių sultys pasiţymi antivirusiniu aktyvumu.
Beţdţionių ląstelių kultūrose buvo sumaţintas uţkrečiamumo titras iki neišmatuojamo lygio per kelias minutes nuo kontakto su 25-2,000 μg/ml proantocianidinais, esančiais vynuogių sultyse.
Be to, proantocianidinai sumaţino titro lygį labiau nei spanguolių ekstraktai per tą patį tyrimą [46].
1.5.7 Senėjimo procesą slopinantis ir kognityvinę funkciją gerinantis poveikis
Tyrimo metu įrodyta, kad fenoliniai junginiai, pasiţymintys antioksidaciniu aktyvumu, gali apsaugoti audinius ir organus nuo oksidacinio paţeidimo. Šie įrodymai buvo gauti stebint ţiurkių, kurių amţius nuo 19 iki 21 mėnesio, elgesį. Sugirdţius 10 proc. vynuogių sulčių, buvo nustatytas dopamino išsiskyrimo pagerėjimas iš smegenyse esančio dryţuotojo kūno dalies [43,46] (svarbi sritis, atsakinga uţ veiksmų įvertinimą) [51] taip pat nustatyti ir paţintiniai gebėjimai Moriso vandens labirinte, o sugirdţius 50 proc. vynuogių sulčių, nustatyti veiksmų valdymo ir atlikimo gebėjimai [43,46].
1.5.8 Antialerginis poveikis
Fenoliniai junginiai gali turėti įtakos alerginio imuninio atsako vystymuisi dviejuose reikšminguose etapuose: alergijos įjautrinimo ir per naują sąlytį su alergenu. Fenoliniai junginiai gali sudaryti netirpius junginius su alergiją sukeliančiais baltymais ir paversti juos
hipoalerginiais. Fenoliniai junginiai taip pat gali tiesiogiai moduliuoti dendritinių ląstelių brendimą ir funkcijas. Per pakartotinį sąlytį, fenoliai junginai gali slopinti T ląstelių proliferaciją ir citokinų gamybą, taip pat turi įtakos antikūnų gamybai B ląstelėse [42].
1.5.9 Priešvėţinis poveikis
Fenolinių junginių poveikis ţmogaus vėţinėms ląstelėms yra skatinti navikų redukciją ir slopinti jų augimą. Šie poveikiai nustatomi įvairiose kūno vietose: burnoje, skrandyje, dvilikapirštėje ţarnoje, storojoje ţarnoje, kepenyse, plaučiuose, pieno liaukose ir odoje [30,36].
Daugelis tyrimų įrodė, kad vynuogių sulčių vartojimas gali sumaţinti riziką susirgti krūties ir storosios ţarnos vėţiu. Priešvėţinis vynuogių sulčių poveikis buvo įrodytas in vitro ir in vivo metodais. Vynuogėse esantys junginiai stabdo ląstelių ciklą ir skatina vėţinių ląstelių apoptozę taip pat stabdo kancerogenezę ir vėţinių ląstelių progresavimą [20,48].
1.5.10 Azoto oksido gamybą skatinantis ir endotelio funkciją gerinantis poveikis
Endotelio funkcija, reguliuojanti kraujagyslių homeostazę, ypač svarbi, nes nuo jos priklauso tokie apsauginiai procesai, kaip vazodilatacija, lygiųjų raumenų ląstelių augimo bei uţdegiminio atsako slopinimas. Daugelis šių procesų priklauso nuo azoto oksido (NO), galingiausio endogeninio vazodilatatoriaus poveikio [1,3]. Azoto oksidas apsaugo nuo vazokonstriktorių, susidarančių endotelyje, ir slopina maţo tankio lipoproteinų oksidaciją. NO gamybos ar aktyvumo sutrikimai sukelia endotelio disfunkciją, kuri pasireiškia susilpnėjusia nuo endotelio priklausoma vazodilatacija. Įrodyta, kad endotelio disfunkcija yra ankstyvasis aterosklerozės ţymuo ir gali būti pastebėta anksčiau nei struktūriniai kraujagyslės sienelės pokyčiai [3]. Aterosklerozės progresavimo poţymiai: didėja endotelio pralaidumas, stiprėja trombocitų agregacija, leukocitų prilipimas, didėja citokinų gamyba [1].
Epidemiologinių tyrimų metu buvo įrodyta, kad vynuogių sultys skatina nuo endotelio priklausomą vainikinių arterijų atsipalaidavimą. Šia funkcija pasiţymi būtent vynuogių sultyse esantys fenoliniai junginiai, kurie stiprina NO gamybą [6]. Vynuogių sultyse esantys junginiai sukelia NO sintazės aktyvaciją (eNOS), o jos padidėjęs aktyvumas didina NO gamybą ir gerina endotelio funkciją [5,6].
Tyrimo metu endotelio ląstelės buvo paveiktos vynuogių sultimis („Concord― veislės vynuogių sultys, CGJ) 8 val. (A) ir 24 val. (B) ir po to atlikta baltymų ekstrakcija. NO sintazės baltymo kiekis buvo nustatytas Western blot metodu ir densitometrine analize. Įvertintas β- tubulino baltymo aptikimas. Tyrimo metu buvo įrodyta, kad po vynuogių sulčių poveikio endotelio ląstelėms, NO sintazės baltymo kiekis reikšmingai padidėjo (p<0,05), lyginant su kontrolinėmis ląstelėmis (6 pav.).
6 pav. NO sintazės baltymų reguliavimas endotelio ląstelėse [Alhosin et al., 2013]
Siekiant nustatyti, kad būtent vynuogių sulčių sukelta NO sintazės aktyvacija yra susijusi su didesne NO gamyba, endotelio ląstelės NO aptikimui buvo veikiamos fluorescenciniu zondu. Fluorescencijos signalas buvo reikšmingai didesnis po 24 val., kada endotelio ląstelės buvo paveiktos vynuogių sultimis. Endotelio ląstelės taip pat buvo veikiamos NO sintazės konkurenciniu inhibitoriu, L-NA, taip buvo siekiama išvengti vynuogių sulčių stimuliuojamo poveikio. Gauti duomenys (p<0,05) patvirtina, kad vynuogių sultyse esantys junginiai (fenoliniai junginiai: galo rūgštis; antocianinai: malvidinas; proantocianidinai: katechinas; kalis) padidina NO sintazės aktyvaciją ir taip skatina NO gamybą endotelio ląstelėse (7 pav.) [5].
7 pav. NO gamyba endotelio ląstelėse, paveikus vynuogių sultimis [Alhosin et al., 2013]
1.5.11 Audinius apsaugantis poveikis po jonizuojančios spinduliuotės
Dėl jonizuojančios spinduliuotės ir biologinės sistemos sąveikos, pasireiškia patofiziologiniai reiškiniai. Ląstelės yra skirtingai jautrios jonizuojančiajai spinduliuotei, todėl atsiţvelgiant į tai, pagal lokalizaciją yra skiriami trys ūminiai radiacijos sindromai: kraujotakos sistemos, virškinamojo trakto ir neurokraujagyslinės sistemos [8,40,44]. Radiacijos poveikiui yra ypač jautri širdis. Atlikti tyrimai parodė, kad jonizuojančios spinduliuotės poveikis širdies audiniui gali sukelti širdies vainikinių kraujagyslių ir voţtuvų patologijas, stazinį širdies nepakankamumą ir staigią mirtį [8,44]. Įrodyta, kad kraujo serumo biocheminės analizės būdu, galima nustatyti laktato dehidrogenazės (LDH) aktyvumą. Tai yra patikimas būdas įvertinti radiacijos ţalą specifiniams organams, tokiems kaip širdis. Nustatyta, kad LDH koncentracija kraujo serume yra širdies audinio, paveikto radiacija, ţalos ţymeklis, ir tokio fermento kiekio išmatavimas yra alternatyvus būdas kiekybiškai įvertinti jonizuojančios spinduliuotės padarinių riziką [8].
Atlikto tyrimo metu su ţiurkėmis nustatyta, kad LDH kiekis buvo statistiškai reikšmingas (p<0,05), palyginus tarp jonizuojančia spinduliuote paveiktų gyvūnų, kurie maitinosi vynuogių sultimis (SI), ir jonizuojančia spinduliuote paveiktų ir maitinamų placebo sultimis (PI). Kontrolinių grupių, t.y. jonizuojančia spinduliuote nepaveikti gyvūnai, kurie maitinosi vynuogių sultimis (SNI) ir gyvūnai, nepaveikti jonizuojančia spinduliuote, bet maitinosi placebo sultimis (PNI), reikšmės išliko maţai pakitusios ir statistiškai nereikšmingos (p>0,05) (8 pav.). Šie poveikiai yra siejami su vynuogių sultyse esančiais biologiškai aktyviais junginiais: fenoliais, flavonoidais, taninais, galo rūgštimi, elago rūgštimi, kvercetinu, katechinu [8].
8 pav. Kraujo serumo laktato dehidrogenazės (LDH) kiekis visose tirtose gyvūnų grupėse 24, 48, 72, 96 val. po radiacijos. a ir b reikšmės yra statistiškai reikšmingos (p<0,05) tarp šių
grupių.
[Borba de Freitas et al., 2013]
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS 2.1 Tyrimo medţiagos ir aparatūra
1. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalas. Chromatografinio grynumo > 99 proc.
(Sigma-Aldrich, Vokietija).
2. Etanolis 96,3 proc. V/V (Stumbras, Lietuva).
3. Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Sigma, Šveicarija).
4. Galo rūgšties tirpalas (Sigma, Šveicarija).
5. Natrio karbonatas, grynas > 99,5 proc. (Merck, Vokietija).
6. Buferinis tirpalas pH 1,0 (LSMU laboratorija).
7. Buferinis tirpalas pH 4,5 (LSMU laboratorija).
8. Išgrynintasis vanduo (LSMU laboratorija).
9. UV-VIS spektrofotometras Agilent 8453 (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, JAV).
10. Drėgnomatis KERN MLS 50-3 (Kern, Vokietija).
11. pH-metras HD 2105.1 (Delta OHM, Italija).
12. Areometras.
2.2 Tyrimo objektas
Eksperimentinio tyrimo objektais pasirinktos Lietuvoje augančios trys skirtingos vėlyvosios vynuogių veislės: „Frankenshtal― mėlynųjų vynuogių veislė, „Relance seedles―
raudonųjų vynuogių veislė, „Kristal― ţaliųjų vynuogių veislė. Vynuogės skintos 2013 m. rugsėjo pabaigoje, Panevėţio rajone. Vynuogių veislių pasirinkimo pagrindimas: skirtinga vynuogių uogų spalva, vienodas sunokimo laikas, ta pati augavietė. Šios vynuogės naudojamos kaip ţaliava sulčių gamybai.
Tirtos vynuogių sultys:
1. Iš švieţiai nuskintų skirtingų veislių vynuogių uogų pagamintos sultys.
2. Iš uţšaldytų vynuogių uogų ir jas atšildţius kambario temperatūroje, pagamintos sultys.
Dalis švieţiai nuskintų vynuogių uogų buvo uţšaldytos (-12 ± 1°C temperatūroje) ir 6 mėn. šaltai laikytos.
3. Pasterizuotos skirtingų veislių vynuogių uogų sultys. Iš kitos dalies švieţiai surinktų vynuogių uogų buvo spaudţiamos sultys, kurios nedelsiant buvo pasterizuojamos. Sultys
pirmiausia įkaitinamos iki 98° C temperatūros ir po to 30 sekundţių sparčiai atvėsinamos.
Palyginimui pasirinktos komercinės vynuogių sultys: „Elmenhorster― mėlynųjų vynuogių nektaras, „Hollinger― raudonųjų vynuogių nektaras, „Bio Macatela― ţaliųjų vynuogių nektaras. Šios vynuogių sultys pasirinktos, kadangi šiose sultyse yra didelis kiekis natūraliai vaisiuose esančio cukraus bei dėl aukštos procentinės grynų vynuogių sulčių sudėties.
2.3 Tyrimo metodai
2.3.1 Tankio nustatymas
Tankis, kaip vienas iš kokybinių rodiklių, buvo nustatytas ir įvertintas visose tirtose vynuogių sultyse. Matavimai atlikti naudojant areometrą. Bandymas kartotas 3 kartus, rezultatai pateikti apskaičiavus imties aritmetinį vidurkį. Vynuogių sulčių tankis išreikštas g/cm3.
2.3.2 pH reikšmės nustatymas
Visose tirtose vynuogių sultyse pH reikšmės rodiklis nustatytas pH-metru HD 2105.1.
Bandymas kartotas 3 kartus, rezultatai pateikti apskaičiavus imties aritmetinį vidurkį.
2.3.3 Sauso likučio kiekio nustatymas
Visose tirtose vynuogių sultyse sauso likučio kiekis nustatytas veikiant sultis drėgnomačiu KERN MLS 50-3. Tyrimui imta po 1 ml kiekvienų tirtų vynuogių sulčių.
Eksperimentinis tyrimas kartotas 3 kartus, rezultatai pateikti apskaičiavus imties aritmetinį vidurkį. Vynuogių sulčių sauso likučio kiekis išreikštas proc.
2.3.4 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas UV-VIS spektrofotometru Agilent 8453, naudojant standartinį Folin-Ciocalteu reagentą pagal etaloninį galo rūgšties tirpalą [18].
Atliekama spalvinė reakcija. Folin-Ciocalteu reagentas skiedţiamas distiliuotu vandeniu (1:10). 0,5 ml tiriamųjų vynuogių sulčių buvo praskiestos distiliuotu vandeniu 10 kartų. 2,5 ml reagento sumaišoma su tiriamosiomis vynuogių sultimis. Vėliau įpilama 2 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo, suplakame. Po 30 min. UV-VIS spektrofotometru matuojamas tirpalo optinis tankis esant 765 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas distiliuotas vanduo. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas mg/ml galo rūgšties ekvivalentais (GRE).
Kiekvieno bandinio tirta po tris pakartotinius mėginius.
2.3.5 Bendro antocianinų kiekio nustatymas
Antocianinų kiekis visose tirtose vynuogių sultyse nustatytas pH diferenciniu metodu.
Absorbcija matuota UV-VIS spektrofotometru Agilent 8453. Tiriamosios vynuogių sultys buvo skiedţiamos pH 1,0 buferiniu tirpalu iki absorbcija esant 520 nm bangos ilgiui bus intervale 0,4 – 0,6. Išmatuojama tiriamųjų tirpalų absorbcija 520 nm ir 700 nm bangos ilgiuose. Tokia pati procedūra kartojama ir matavimai atliekami vynuogių sultis praskiedus pH 4,5 buferiniu tirpalu.
Palyginamieji tirpalai yra atitinkamai pH 1,0 ir pH 4,5 buferiniai tirpalai [18].
Diferencinė absorbcija apskaičiuota pagal formulę:
A = (A520 nm pH 1,0 – A700 nm pH 1,0) – (A520 nm pH 4,5 – A700 nm pH 4,5);
kur: A520 nm pH 1,0 – absorbcijos maksimumas esant 520 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH = 1,0;
A700 nm pH 1,0 – absorbcijos maksimumas esant 700 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH = 1,0;
A520 nm pH 4,5 – absorbcijos maksimumas esant 520 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH = 4,5;
A700 nm pH 4,5 – absorbcijos maksimumas esant 700 nm bangos ilgiui, kai tirpalo pH = 4,5.
Antocianinų koncentracija vynuogių sultyse apskaičiuota pagal formulę:
C(mg/l) = A×Mr×103×praskiedimo faktorius/ԑL;
kur: A – diferencinė absorbcija;
Mr – molekulinė masė;
ԑ – molinė absorbcija;
L – kiuvetės storis (cm).
Skaičiavimams naudota antocianino malvidin-3-gliukozido molinė absorbcija 28, malvidin-3-gliukozido molekulinė masė – 493,5. Koncentracija apskaičiuota įvertinus praskiedimo faktorių.
Kiekvieno bandinio tirta po tris pakartotinius mėginius.
2.3.6 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalinio sujungimo metodu
Antioksidacinis aktyvumas įvertinamas matuojant, kiek procentų stabilaus DPPH radikalo neutralizuoja vynuogių sulčių sudėtyje esantys ir antioksidaciniu aktyvumu pasiţymintys junginiai [17].
2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo molekulė (α,α-difenil-β-pikrilhidrazil; DPPH) yra apibūdinama kaip stabilus laisvas radikalas, remiantis delokalizacija nesuporuoto elektrono per molekulę kaip visumą. Taigi molekulė nėra dimeras, kaip būtų su dauguma kitų laisvųjų radikalų. Elektrono delokalizavimas taip pat suteikia ryškiai violetinę spalvą, pagal absorbcijos juostą etanolio tirpale maţdaug prie 515 nm bangos ilgio. Kada DPPH tirpalas yra sumaišomas su antioksidantu, kuris gali atiduoti vandenilio atomą ir taip inaktyvinti laisvuosius radikalus, nyksta violetinė spalva [34].
Į 2,9 ml 0,1 mM koncentracijos etanolinį DPPH radikalo tirpalą įlašinama 100 µl vynuogių sulčių. Reakcijos mišinys supurtomas ir paliekamas kambario temperatūroje tamsoje 30 min. UV-VIS spektrofotometru Agilent 8453 išmatuojamas mėginių absorbcijos sumaţėjimas esant 515 nm bangos ilgiui pasiekus pusiausvyrą. Palyginamasis tirpalas etanolis 96 proc.
Tirpalų aktyvumas apskaičiuojamas inaktyvuoto DPPH kiekio procentais:
AA = (A0 – At)/A0 × 100 proc.;
kur: AA – antioksidacinis aktyvumas %;
A0 – gryno DPPH absorbcija;
At – tiriamojo tirpalo absorbcija po 30 min.
Kiekvieno bandinio tirta po tris pakartotinius mėginius.
2.4 Statistinė analizė
Statistinė tyrimo analizė atlikta naudojant SPSS Statistics 20,0 paketą. Kokybinių ir kiekybinių rodiklių vidurkiai pateikti kartu su standartiniu nuokrypiu, statistiškai palyginti neparametriniu metodu, taikant Kruskal-Walis testą. Koreliacijai tarp kintamųjų įvertinti taikyti Spirmeno ranginės koreliacijos koeficientai. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingai priklausomi, kai p<0,05.
3. TYRIMO REZULTATAI 3.1 Tankio įvertinimas vynuogių sultyse
Kiekvienoje tirtoje vynuogių sulčių grupėje buvo nustatytas tankis. Rezultatai pateikiami 9 paveikslėlyje.
9 pav. Tankio įvertinimas tirtose vynuogių sultyse
Tankis yra didţiausias pasterizuotose ţalių vynuogių sultyse 1,081±0,001 g/cm3. Maţiausia tankio reikšmė nustatyta komercinėse raudonų vynuogių sultyse 1,04±0,006 g/cm3. Tyrimo metu nustatyta, kad vienodą tankį turi raudonos vynuogių sultys, pagamintos iš švieţių vymuogių uogų ir mėlynos vynuogių sultys, pagamintos iš šaldytų uogų 1,061±0,001. Vienodas tankis nustatytas ir tiriant ţalias vynuogių sultis, pagamintas iš švieţių vynuogių uogų bei tiriant komercines ţalių vynuogių sultis 1,071±0,001.
3.2 pH reikšmės įvertinimas vynuogių sultyse
Vertinant pH reikšmes kiekvienoje tirtoje vynuogių sulčių grupėje, reikšmingo skirtumo nepastebėta. Visas tirtas sultis galima įvardinti kaip silpnai rūgščias. Rezultatai pateikiami 10 paveikslėlyje.
Vynuogių sulčių tankio palyginimas
1 1.01 1.02 1.03 1.04 1.05 1.06 1.07 1.08 1.09 1.1
Iš šviežių uogų Iš šaldytų uogų Pasterizuotos Komercinės
Vynuogių sulčių tipas
Tankis, g/cm3
Mėlynos Raudonos Žalios
10 pav. pH reikšmės įvertinimas tirtose vynuogių sultyse
Aukščiausią pH reikšmę turi ir maţiau rūgščios yra komercinės mėlynų vynuogių sultys 3,9±0,06. Ţemiausią pH reikšmę turi pasterizuotos raudonų vynuogių sultys 3,1±0,06. Raudonų vynuogių sultys, pagamintos iš šaldytų vynuogių uogų ir pasterizuotos mėlynų vynuogių sultys turi vienodą pH reikšmę 3,2±0,06. Tyrimo metu nustatyta, kad vienodą pH reikšmę 3,5±0,06 turi ir raudonų vynuogių sultys, pagamintos iš švieţių vynuogių uogų, pasterizuotos ţalių vynuogių sultys bei komercinės raudonų vynuogių sultys. Vienoda pH reikšmė taip pat nustatyta ir ţaliose vynuogių sultyse, pagamintose iš švieţių vynuogių uogų 3,7±0,06 ir komercinėse ţalių vynuogių sultyse 3,7±0,1.
3.3 Sauso likučio įvertinimas vynuogių sultyse
Atliekant tyrimą, buvo svarbu įvertinti sauso likučio pokyčius vynuogių sultyse.
Rezultatai pateikiami 11 paveikslėlyje.
Vynuogių sulčių pH palyginimas
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Iš šviežių uogų Iš šaldytų uogų Pasterizuotos Komercinės
Vynuogių sulčių tipas
pH Mėlynos
Raudonos Žalios
11 pav. Sauso likučio įvertinimas tirtose vynuogių sultyse
Atlikto tyrimo metu nustatyta, kad komercinės raudonų vynuogių sultys turi didesnį sauso likučio kiekį 23,33±1,12 proc., tačiau labai maţai skiriasi nuo pasterizuotų mėlynų 22,33±3,14 proc. ir ţalių vynuogių sulčių 22,67±0,47 proc. Maţiausias sauso likučio kiekis nustatytas ţaliose vynuogių sultyse, pagamintose iš švieţių vynuogių uogų 12,43±0,29 proc.
3.4 Bendro fenolinių junginių kiekio įvertinimas vynuogių sultyse
Vienas iš pagrindinių sultyse esančių kiekybinių rodiklių, lemiančių platų vynuogių sulčių farmakologinį poveikį, tyrimo metu buvo įvertintas kiekvienoje tirtoje vynuogių sulčių grupėje. Rezultatai pateikti 12 paveikslėlyje.
Sauso likučio vynuogių sultyse palyginimas
0 5 10 15 20 25 30
Iš šviežių uogų Iš šaldytų uogų Pasterizuotos Komercinės
Vynuogių sulčių tipas
Sausas likutis, proc.
Mėlynos Raudonos Žalios
