Baltymų, išskirtų iš paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) ir kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) šaknų, kiekinės sudėties nustatymas vegetacijos metu Lietuvoje

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas

Baltymų, išskirtų iš paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza

glabra L.) ir kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.)

DC.) šaknų, kiekinės sudėties nustatymas vegetacijos metu

Lietuvoje

Baigiamasis magistro projektas

Simona Kairienė Projekto autorius / autorė

prof. dr. Nijolė Savickienė Vadovas/ė

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų universitetas Farmacijos fakultetas

Baltymų, išskirtų iš paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza

glabra L.) ir kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.)

DC.) šaknų, kiekinės sudėties nustatymas vegetacijos metu

Lietuvoje

Baigiamasis magistro projektas

Medicininė chemija (6281CX001)

Simona Kairienė

Projekto autorius / autorė

prof. dr. Nijolė Savickienė Vadovas / Vadovė

prof. dr. Valdas Jakštas Recenzentas / Recenzentė

Kauno technologijos universitetas Cheminės technologijos fakultetas

Lietuvos sveikatos mokslų fakultetas Farmacijos fakultetas

Simona Kairienė

Baltymų, išskirtų iš paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza

glabra L.) ir kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.)

DC.) šaknų, kiekinės sudėties nustatymas vegetacijos metu

Lietuvoje

Akademinio sąžiningumo deklaracija

Patvirtinu, kad mano, Simonos Kairienės, baigiamasis projektas tema „Baltymų, išskirtų iš paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) ir kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) šaknų, kiekinės sudėties nustatymas vegetacijos metu Lietuvoje“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.

Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.

Simona Kairienė. Baltymų, išskirtų iš paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) ir kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) šaknų, kiekinės sudėties nustatymas vegetacijos metu Lietuvoje. Magistro baigiamasis projektas / vadovė prof. dr. Nijolė Savickienė; Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų fakultetas, Farmacijos fakultetas.

Studijų kryptis ir sritis (studijų krypčių grupė): chemija, fiziniai mokslai.

Reikšminiai žodžiai: Glycyrrhiza glabra L., Desmodium canadense (L.) DC., šaknų baltymai, vegetacijos tarpsniai.

Kaunas, 2019. 45 p.

Santrauka

Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. yra daugiamečiai žoliniai augalai,

priklausantys pupinių (Fabaceae) šeimai. Abiejų augalų vaistinės žaliavos preparatai plačiai vartojami tiek ajuverdinėje medicinoje, tiek ir šiuolaikinėje medicinoje. Šių augalų ekstraktai pasižymi priešbakteriniu, priešvirusiniu, antioksidantiniu poveikiais. Remiantis mokslinės literatūros duomenimis, pupinių šeimos augalai kaupia baltymines medžiagas, tačiau jų kiekis skirtingais vegetacijos periodais dažniausiai nėra žinomas. Mūsų eksperimento tikslas - baltymų, išskirtų iš paprastųjų saldymedžių ir kanadinių jakšūnių šviežios šaknų žaliavos, surinktos skirtingais vegetacijos periodais – atžėlimo, intensyvus augimo, butonizacijos, žydėjimo ir sėklų brandos, kiekio palyginimas.

Eksperimento medžiagos ir metodai: tyrimo objektas - Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium

canadense (L.) DC. šviežia šaknų žaliava, surinkta VDU Kauno botanikos sode. Baltymų išskyrimui

iš augalinės šaknų žaliavos pasirinktas išsūdymo metodas, naudojant amonio sulfato druską ir pridedant proteazių inhibitorių - e-aminoheksano rūgštį.

Bradfordo metodu, naudojant jaučio serumo albumino standartą, nustatytas bendras baltymų kiekis išskirtose baltymų frakcijose.

Nustatytas baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, surinktos augalų septynių vegetacijos fazių metu, kiekis. Didžiausia baltymų išeiga nustatyta paprastųjų saldymedžių augalinėje žaliavoje atžėlimo ir žydėjimo pabaigos fazių metu, tuo tarpu, kanadinių jakšūnių baltymų kiekis visais vegetacijos tarpsniais buvo ženkliai mažesnis, o didžiausia baltymų išeiga nustatyta žydėjimo pradžios ir sėklų brandos tarpsniais.

Kairienė, Simona. Determination of the quantitative composition of proteins extracted from the roots of the liquorice (Glycyrrhiza glabra L.) and Canadian tick-trefoil (Desmodium canadense (L.) DC.) in Lithuania during the vegetation. Master's Final Degree Project / supervisorprof. dr. Nijolė Savickienė; Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences.

Study field and area (study field group): Chemistry, Physical Sciences.

Keywords: Glycyrrhiza glabra L., Desmodium canadense (L.) DC., root proteins, vegetation phases.

Kaunas, 2019. 45 pages.

Summary

Glycyrrhiza glabra L. and Desmodium canadense (L.) DC. – are the herbaceous perennial species of Fabaceae family. Both plants are commonly used herbs in ayurvedic medicine and in modern

medicine. Studies have shown that extracts of plants roots possess antibacterial, antioxidant, antimalarial, anti-inflammatory properties. Based on scientific literature bean family plants accumulate proteins. It was found that preparations of both plants contain a big amount of proteins, but the quantity has not been studied during vegetation phases. The aim of the experiment was to compare protein content in liquorice and Canadian tick-trefoil roots during vegetation phases – regrow, intensive growing, bud, blooming and seed maturity.

Experimental material and methods: the objective - raw root material, collected in the Botanical Garden of Vytautas Magnus University in Kaunas. Glycyrrhiza glabra L. and Desmodium canadense (L.) DC. protein fractions were obtained from liquorice and Canadian tick-trefoil roots by extraction and fractionation with ammonium sulphate and protease inhibitor - 𝜀-amino-capronic acid.

The quantity of protein was measured by the Bradford method using bovine serum albumin BSA protein standards.

Proteins of Glycyrrhiza glabra L. and Desmodium canadense (L.) DC. fresh root material was obtained in seven different vegetation phases. The biggest yield of protein was defined in liquorice root extract, while Canadian tick-trefoil root extract had a significant lower quantity of protein in all vegetation phases.

Protein quantity in fractions extracted from liquorice roots material had a tendency to decline till massive blooming phase, from that point the output started to grow. At the end of the vegetation, protein amount has become approximately stable.

Protein fractions, extracted from Canadian tick-trefoil roots, had the inclination to fluctuate. The biggest amount of protein was in seed maturity phase.

Turinys

Lentelių sąrašas ... 8

Paveikslų sąrašas ... 9

Santrumpų ir terminų sąrašas ... 10

Įvadas ... 11

1. Literatūros apžvalga ... 12

1.1. Kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) mokslinė klasifikacija ir paplitimas 12 1.1.1. Botaninė klasifikacija ... 12

1.1.2. Paplitimas ... 12

1.2. Kanadinių jakšūnių vaistinės augalinės žaliavos (šaknų) cheminė sudėtis ... 13

1.3. Kanadinės jakšūnės (lot. Desmodium canadense (L.) DC.) vaistinės augalinės žaliavos – šaknų, biologinis aktyvumas ir vartojimas ... 14

1.4. Paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) mokslinė klasifikacija ir paplitimas ... 15

1.4.1. Botaninis klasifikavimas ... 15

1.4.2. Paplitimas ... 16

1.5. Paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos (šaknų) cheminė sudėtis ... 16

1.6. Paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) vaistinės augalinės žaliavos biologinis aktyvumas ir vartojimas ... 17

1.7. Baltymų reikšmė augalams ... 18

1.7.1. Pirminių metabolitų migracija kaip apsaugos mechanizmas ... 19

1.7.2. Baltymų kaupimasis vegetacijos metu ... 19

1.7.3. Baltymų kaupimąsi lemiantys veiksniai ... 20

1.8. Fotosintezės reikšmė baltymų sintezėje ... 20

1.9. Baltymų ekstrakcijos metodai ... 21

1.9.1. Nusodinimas trichloracto rūgštimi ... 21

1.9.2. Nusodinimas kitais organiniais tirpikliais ... 22

1.9.3. Baltymų išsūdymas druskomis ... 22

1.10. Baltymų kiekinės sudėties nustatymas ... 22

1.10.1. Biureto metodas ... 22 1.10.2. Lowri metodas ... 23 1.10.3. Bradford metodas ... 23 2. Tyrimo metodika ... 24 2.1. Tyrimo objektas ... 24 2.2. Tyrimo medžiagos ... 24 2.3. Tyrimo įranga ... 25 2.4. Žaliavos paruošimas ... 25

2.5. Baltymų nusodinimas amonio sulfatu ... 25

2.6. Reagentų paruošimas ... 26

2.6.1. Jaučio serumo albumino standartų paruošimas Bradford metodo kalibracinės kreivės sudarymui: ... 26

2.6.2. Roti-Quant reagento paruošimas ... 26

2.7. Baltymų kiekinės sudėties nustatymas Bradford metodu ... 26

2.8. Proteazių inhibitoriai ... 28

3.1. Baltymų kiekio nustatymo rezultatai kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinėje

augalinėje žaliavoje skirtingais vegetacijos tarpsniais ... 29

3.1.1. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų atžėlimo fazės metu ... 29

3.1.2. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų intensyvaus augimo metu ... 30

3.1.3. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų butonizacijos metu ... 31

3.1.4. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų žydėjimo pradžioje ... 32

3.1.5. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų masinio žydėjimo metu ... 33

3.1.6. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų žydėjimo pabaigoje ... 35

3.1.7. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų sėklų brandos metu ... 36

3.2. Diskusija ... 37

Išvados ... 40

Lentelių sąrašas

1 lentelė. Desmodium canadense (L.) DC. botaninė klasifikacija ... 12 2 lentelė. Glycyrrhiza glabra L. botaninis apibūdinimas ... 16 3 lentelė. Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. žaliavų surinkimo laikas vegetacijos metu ... 24

Paveikslų sąrašas

1 pav. Benzeno rūgšties struktūra. ... 13

2 pav. Cinamono rūgšties struktūra ... 13

3 pav. Flavonoidų bazinė struktūra ... 14

4 pav. Glicirizino rūgšties struktūra ... 17

5 pav. Bradford metodo kalibracinė kreivė baltymų koncentracijos nustatymui ... 27

6 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC šviežių šaknų žaliavos, kiekis skirtingais vegetacijos periodais, mg/g(X ± SSN, n=3, p=0.005) ... 29

7 pav. Baltymų kiekis, išskirtas iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, atžėlimo fazės metu, mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,001) ... 30

8 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, kiekis intensyvaus augimo metu, išreikštas mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,02) ... 31

9 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, kiekis butonizacijos fazės metu, išreikštas mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,001) ... 32

10 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, kiekis žydėjimo pradžios metu, išreikštas mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,043) ... 33

11 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, kiekis masinio žydėjimo metu, išreikštas mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,02) ... 34

12 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, kiekis žydėjimo pabaigoje, išreikštas mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,007) ... 35

13 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežios šaknų žaliavos, kiekis sėklų brandos metu, išreikštas mg/g (X ± SSN, n=3, p=0,045) ... 36

Santrumpų ir terminų sąrašas Santrumpos:

AS – amonio sulfatas;

ATP – adenozin 5'trifosfatas; BSA – jaučio serumo albuminas; EACA ̶ 6-aminoheksano rūgštis;

ITIS ̶ taksonominės informacijos tinklo duomenų bazė; PAM ̶ paviršiaus aktyvios medžiagos;

PBS ̶ fosfatinis buferio tirpalas; pI ̶ izoelektrinis taškas;

SSP ̶ sėklų atsarginiai baltymai; VSP ̶ vegetatyviniai sėklų baltymai;

Įvadas

Augaliniai preparatai vartojami ligų profilaktikai ir gydymui, kadangi pasižymi biologiniu ir farmakologiniu aktyvumu, dažniausiai yra netoksiški, nesukelia stiprių nepageidaujamų reakcijų. Biologiškai veiklūs junginiai, sukaupti vaistinių augalų žaliavoje, yra svarbūs augalinių preparatų kokybei, tuo pačiu, ir preparatų aktyvumui. Šio tyrimo objektas – kanadinės jakšūnės (Desmodium

canadense (L.) DC.) ir paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) vaistinė augalinė žaliava –

šaknys. Desmodium canadense (L.) DC. ir Glycyrrhiza glabra L. yra pupinių (ankštinių) šeimos augalai. Fabaceae (pupinių) augalų šeima - viena labiausiai paplitusių šeimų visame pasaulyje. Daugumos šios šeimos augalų žaliava, pasižyminti biologinėmis savybėmis, plačiai pritaikoma agrokultūros srityje, kadangi gerina dirvožemio kokybę, o auginimas yra pakankamai pigus. Teigiama, jog ankštiniai augalai pasižymi priešuždegiminiu, priešvirusiniu, antioksidaciniu ir imunomoduliaciniu poveikiais, turi estrogeninių savybių, o iš augalinės žaliavos, šaknų, pagaminti preparatai vartojami karščiavimo, egzemos, meningito virškinamojo trakto sutrikimų gydymui. Pagrindinis pupinių šeimos augalų biologijos ypatumas – gebėjimas gyventi simbiozėje su atmosferos azotą fiksuojančiomis bakterijomis Rhizobium. Gumbelinių bakterijų fiksuoto azoto kiekis sudaro 70 – 100 % augalams šeimininkams reikalingo azoto. Iki 2/3 Rhizobium bakterijų pasisavinto azoto, kaip amino rūgštys ir baltymai, susikaupia augalų derliuje, likusi dalis kartu su šaknimis patenka į dirvožemį. Pupinių šeimos augalai sintetina ir kaupia daugiau baltyminių medžiagų nei kitų šeimų augalai [15]. Baltymai - iš aminorūgščių sudarytos makromolekulės, yra pirminiai augalų metabolitai, atliekantys pernašos, struktūrines, apsaugines ir kitas svarbias gyvybines funkcijas. Ankštinių šeimos augalai sukaupia nevienodą kiekį baltyminių junginių. Tam turi įtakos auginimo sąlygos bei brandos tarpsnis. Mokslinėje literatūroje nėra skelbti minėtų augalų (Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium

canadense (L.) DC.) vaistinėje žaliavoje esančių baltymų kiekio tyrimų rezultatai, todėl tai paskatino

atlikti kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos – šaknų, kiekinę baltymų analizę bei nustatyti ir palyginti baltymų koncentracijas skirtingais vegetacijos periodais. Tikėtina, kad eksperimentų rezultatai būtų naudingi, įvertinant Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium

canadense (L.) DC. vaistinės augalinės žaliavos rinkimo laikotarpį, kada augalinė žaliava sukaupia

didžiausią baltymų kiekį ir ją galima vartoti kaip baltymų šaltinį. kuriuo augalo vegetacijos laikotarpiu tikslinga rinkti paprastojo saldymedžio ir kanadinės jakšūnės vaistinę augalinę žaliavą.

Darbo tikslas:

Nustatyti Desmodium canadense (L.) DC. ir Glycyrrhiza glabra L. baltymų kiekinę sudėtį skirtingais augalų vegetacijos periodais.

Darbo uždaviniai:

1. surinkti ir paruošti tyrimams paprastųjų saldymedžių ir kanadinių jakšūnių šviežią šaknų žaliavą skirtingais vegetacijos periodais.

2. išskirti baltymų frakcijas iš šviežios šaknų žaliavos. 3. nustatyti baltymų kiekinę sudėtį gautose frakcijose. 4. atlikti tyrimo rezultatų palyginamąją analizę.

1. Literatūros apžvalga

1.1. Kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) mokslinė klasifikacija ir paplitimas

Kanadinė jakšūnė (lot. Desmodium canadense (L.) DC.), angl. Canadian tick-trefoil, showy ticktrefoil yra daugiametis, kasmet atželiantis žydintis žolinis augalas, priklausantis pupinių (Fabaceae) šeimai. Iš graikų kalbos išvertus augalo pavadinimą reiškia “grandinėlė, ilga šaka”. Kanadinė jakšūnė paplitusi Šiaurės Amerikoje (JAV ir Kanadoje), daugiausia rytinėje jos dalyje, Lietuvoje savaime neauga, tačiau kaip perspektyvus vaistinis augalas prof. V Janulio iniciatyva nuo 1994 m. introdukuojamas Kauno VDU botanikos sode [28; 49; 50].

1.1.1. Botaninė klasifikacija

Kanadinės jakšūnės botaninė klasifikacija remiasi tam tikrais giminingumo požymiais. Bendrinio taksonominės informacijos tinklo (ITIS) duomenų bazėje pateikiama tokia kanadinės jakšūnės botaninė klasifikacija (1 lentelė): [30]

1 lentelė. Desmodium canadense (L.) DC. botaninė klasifikacija

Karalystė Plantae- Augalai

Pokaralystė Viridiplantae Žalieji augalai

Antskyris Embryophyta Sėkliniai induočiai

Skyrius Tracheophyta Induočiai

Klasė Magnoliopsida Magnolijūnai

Poklasis Rosidae Ėrškėčiažiedžiai

Eilė Fabales (Leguminosales) Pupiečiai (ankštiečiai)

Šeima Fabaceae (Leguminosae) Pupiniai (ankštiniai)

Gentis Desmodium Desv. Jakšūnė

Rūšis Desmodium canadense (L.) DC. Kanadinė jakšūnė

1.1.2. Paplitimas

Desmodium canadense (L.) DC. tėvynė yra Kanada, kurioje augalas auga natūraliai. Dažniausiai

kanadinės jakšūnės aptinkamos miškuose, uolingose ir smėlingose prerijose, drėgnose ar drenuotose dirvose tiek saulėkaitoje, tiek paunksmėje, bei ežerų ir upelių pakraščiuose. Geriausias dirvožemis – smėlis, tačiau tinkamas ir priemolis, praturtintas organinėmis medžiagomis. Apskritai kanadinės jakšūnės nėra reiklios dirvožemiui, naujai pasodinti sodinukai greitai prigyja. Desmodium canadense (L.) DC. augalai šaknų gumbeliuose kaupia azotą fiksuojančias Rhizobium genties bakterijas, kurios didina azoto kiekį dirvožemyje, surišdamos laisvą atmosferos azotą, naudojamą naujų azoto druskų sintezei. Dėl šios priežasties kanadinėms jakšūnėms nereikia papildomo tręšimo [51].

Kanadoje klimatas artimas Lietuvos klimatui - žiemos šaltos, drėgnos ir vėjuotos, o vasaros karštos ir drėgnos. Visoje Kanadoje orai skiriasi priklausomai nuo regioninės padėties. Šalia Didžiųjų ežerų orai šaltesni ir žvarbesni, o vakarinėje dalyje vyrauja šiltesnis ir drėgnesnis klimatas [11; 51].

Kanadinės jakšūnės taip pat auga Jungtinėse Amerikos Valstijose. Čia jas daugiausia galima aptikti pakelėse ir pievose augančias didelėmis kolonijomis, tokiu būdu augalas apsisaugo nuo ligų ir kenkėjų [38].

1.2. Kanadinių jakšūnių vaistinės augalinės žaliavos (šaknų) cheminė sudėtis

Kanadinių jakšūnių vaistinė augalinė žaliava (šaknys) kaupia dviejų tipų junginius: fenolio rūgštis ir flavonoidus. Augaluose daugiausiai randamos dvi fenolio rūgščių klasės: pirmosios klasės struktūros pagrindą sudaro benzeno rūgštis (1 pav.), o antrosios – cinamono rūgštis (2 pav.). Abiejų klasių fenolinės rūgštys dažniausiai yra esterių formos arba konjuguotos. Benzeno rūgšties dariniams priklauso – 4-hidroksibenzeno, galo, vanilino ir kitos rūgštys. Cinamono rūgšties dariniai yra labai plačiai paplitę augalų sėklose, dažnai sutinkami esterių formoje kartu su chino rūgštimi arba cukrumis. Dažniausiai sutinkami cinamono rūgšties dariniai - kavos rūgštis, sinapo, ferulo ir kitos fenolinės rūgštys. Desmodium canadense (L.) DC. kaupia abiems fenolinių rūgščių klasėms priklausančius junginius (chlorogeno, kavos, vanilino, galo ir 4-hidroksicinamono rūgštis). Daugiausia nustatoma kavos ir chlorogeno rūgštys [51].

1 pav. Benzeno rūgšties struktūra. 2 pav. Cinamono rūgšties struktūra

Chlorogeno rūgštis yra polifenolinis junginys, kavos ir chino rūgšties esteris, bei tarpinis junginys lignino biosintezėje. Gamtoje rūgštis dažnai randama įvairių augalų šaknyse ir ūgliuose. Patekusi į organizmą chlorogeno rūgštis pasižymi farmakologiniu aktyvumu, suteikdama antioksidacinį, antivirusinį, kraujo spaudimą mažinantį poveikius. Kaip ir kiti polifenoliniai junginiai, chlorogeno rūgštis yra linksui sudaryti chelatus su sunkiaisiais metalais [40; 51].

Kavos rūgštis, kuri taip pat sudaro didelę dalį kanadinių jakšūnių žaliavoje esančių cheminių juginių, gaunama prijungus hidroksilo grupes prie cinamono rūgšties molekulės (3 ir 4 padėtyse) [51]. Kavos rūgštis, kaip ir chlorogeno, pasižymi plačiu farmakologinių savybių spektru. Literatūros šaltiniuose plačiausiai aprašomi kavos rūgšties antikancerogeninis ir antioksidacinis poveikiai. Organizme ši rūgštis greitai metabolizuojama į m-hidroksifenil propiono rūgštį [40]. Kavos rūgštis yra lignino biosintezės tarpinis produktas ir vienas pagrindinių medinės augalų biomasės komponentų [9]. Vanilino rūgštis yra fenolinė rūgštis, daugiausia randama vanilės ir kitų augalų ekstraktuose. Tai yra oksiduota vanilino forma ir tarpinis produktas gaminant vaniliną iš ferulino rūgšties. Vanilinė rūgštis yra kofeino rūgšties metabolizmo produktas, kuri selektyviai ir specifiškai slopina 5'-nukleotidazės aktyvumą. Dažniausiai naudojama kaip kvapioji medžiaga [48].

soformuotą struktūrą ir yra vandenyje tirpios polifenolinės molekulės. Flavonoidų molekulėje (3 pav.) yra du benzeno žiedai, tarpusavyje sujungti propaniniu fragmentu. Būtent dėl šio fragmento daugelis flavonoidų sudaro heterociklą, kuris yra pirano ar g pirono darinys. Didžioji dalis flavonoidų augaluose randami glikozidų pavidalo [51].

Pagrindiniai flavonoidai, nustatyti Desmodium canadense (L.) DC. augalinėje žaliavoje yra:

1. Viceninas - 2, pasižymintis priešmikrobiniu aktyvumu ir antiradikaliniu poveikiu. 2. Orientinas, turintis didelio potencialo antioksidantinį poveikį.

3. Homoorientinas, pasižymintis antioksidacinėmis savybėmis.

4. Viteksinas – junginys, pasižymintis priešvėžiniu, priešuždegiminiu, radioprotekcinis poveikiais.

5. Izoviteksinas ir rutinas, turintys antioksidantinį aktyvumą bei priešuždegiminį ir antikancerogeninį poveikius [49].

1.3. Kanadinės jakšūnės (lot. Desmodium canadense (L.) DC.) vaistinės augalinės žaliavos – šaknų, biologinis aktyvumas ir vartojimas

Kanadine jakšūne (Desmodium canadense (L.) DC.) plačiau susidomėta XX amžiuje, nustačius, jog vaistinė augalinė žaliava – šaknys, kaupia fenolinius junginius, kurie suteikia augalui farmakologines savybes. Kanadinių jakšūnių šaknys pasižymi stipriu priešmikrobiniu, priešuždegiminiu, priešvirusiniu, antihistamininiu poveikiais, turi imuninę sistemą stimuliuojančias savybes, gydo opas ir dermatozes [32; 61].

Pastaruoju metu vykdomi nauji kanadinių jakšūnių vaistinės augalinės žaliavos pritaikymo medicinos praktikoje - neurologinių ligų gydymui, tyrimai. Šiomis ligomis pasaulyje serga apie 1 % žmonių. Šizofrenija yra dažna psichozės forma, sukelianti asmenybės susidvejinimą, trikdanti minčių raišką ir slopinanti pažinimo funkciją. Tyrimų su pelėmis duomenimis, vartojamas etanolinis kanadinių jakšūnių ekstraktas pasižymėjo teigiamais rezultatais: pastebėtas sedatyvinis, serotoninerginis ir cholinerginis efektai, kurie įvertinti Irvino testu [3]. Taip pat tirtas kanadinių jakšūnių poveikis Alzheimerio ligai, kuri yra daugiafunkcinė neurodegeneracinė liga. Alzheimerio ligos atsiradimą skatina ląstelių oksidacinė pažaida, laisvieji radikalai [24] arba beta-amiloido kiekio padidėjimas smegenyse. Vienas iš siūlomų ligos profilaktikos būdų yra antioksidantų gausa pasižyminčių produktų vartojimas kasdieninėje mityboje. Jakšūnių vaistinė augalinė žaliava (šaknys) turi didelį antioksidantinį aktyvumą ir pasižymi amiloidinio klirenso slopinimu, todėl šio augalo šaknys intensyviai tiriamos ieškant geriausių būdų antioksidantų išskyrimui [23].

Literatūros šaltiniuose taip pat minimas reikšmingas kanadinių jakšūnių vaistinės augalinės žaliavos - šaknų, vaidmuo mažinant gliukozės kiekį kraujyje. Tyrimai atlikti su pelių patinais, kuriems dirbtinai sukeltas antro tipo cukrinis diabetas. Pelės gydytos insulino ir jakšūnių šaknų ekstrakto mišiniu. Gauti tyrimo rezultatai parodė, jog kanadinių jakšūnių ekstrakto ir insulino derinys mažino hiperglikemiją ir buvo ne mažiau veiksmingas lyginant su insulinu, švirkščiamu į peritoninę sistemą. Šis derinys buvo dvigubai naudingas: išvengta nemalonių injekcijų ir padidintas insulino veiksmingumas [20].

Naujausi moksliniai atradimai skelbia vis daugiau kanadinių jakšūnių vaistinės augalinės žaliavos – šaknų, vartojimo galimybių ne tik žmonių gydyme, bet ir žemės ūkyje. Kanadinių jakšūnių genties augalai pasižymi stipriu priešparazitiniu poveikiu, todėl smulkiuose ūkiuose šis augalas pradėtas auginti kaip tarpinis augalas, slopinantis Striga hermonthica ir Striga asiatica grūdinių kultūrų parazitų dauginimąsi alelopatiniu mechanizmu [27].

Kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) augalinė vaistinė žaliava – žolė, ir iš jos pagaminti preparatai pasižymėjo plačiu veikimo spektru. Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitete, panaudojus kanadinių jakšūnių sausąjį žolės ekstraktą, prof. V. Janulis pagamino augalinį standartizuotą vaistinį preparatą - Helepiną D. Preparatas pasižymi plačiu veikimo spektru, gydant

Herpes simplex virusǫ sukeltas dermatozes. Jo poveikis prilygsta acikloviro (“Zovirax”) preparatui,

tačiau yra 5 kartus mažiau toksiškas nei pastarasis. Taip pat nustatytas Helepino D hipoazoteminis, priešuždegiminis, antimikrobinis bei priešvirusinis poveikiai [61].

1.4. Paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) mokslinė klasifikacija ir paplitimas Paprastasis saldymedis (lot. Glycyrrhiza glabra L.) yra pupinių (Fabaceae) šeimos daugiametis žolinis augalas, paplitęs subtropinėje ir vidutinio klimato juostose, užaugantis iki 120 cm aukščio, turintis tamsius šakniastiebius, rausvai raudonos spalvos išorėje ir gelsvos spalvos viduje. Bendrinis pavadinimas Glycyrrhiza, iš graikų kalbos išvertus, reiškia ,,saldi šaknis”. Būtent, augalų šaknys yra sukaupusios didelį kiekį biologiškai aktyvių medžiagų, kurios lemia augalo priešvirusinį, antioksidacinį, antimutageninį, imunostimuliacinį bei fitoestrogeninį poveikius [46]. Paprastųjų saldymedžių šaknys ne tik plačiai vartotos medicinoje Kinijoje jau prieš 5000 metų, bet ir šiandien ši vaistinė augalinė žaliava – viena dažniausiai skiriamų vartojimui bei preparatų gamybai. Glycyrrhiza

glabra L. šaknyse kaupiasi saponinai, flavonoidai, mineralinės ir rauginės medžiagos. Dėl plataus

poveikių spektro susidomėjimas paprastųjų saldymedžių vaistine augaline žaliava kasmet didėja, atrandama vis daugiau jos pritaikymo galimybių.

1.4.1. Botaninis klasifikavimas

Paprastasis saldymedis, kaip ir kanadinė jakšūnė priklauso pupinių šeimai, todėl botaninė klasifikacija yra labai panaši (2 lentelė). Augalai skiriasi genties ir rūšies klasifikavimu [29].

2 lentelė. Glycyrrhiza glabra L. botaninis apibūdinimas

Karalystė Plantae- Augalai

Pokaralystė Viridiplantae Žalieji augalai

Antskyris Embryophyta Sėkliniai induočiai

Skyrius Tracheophyta Induočiai

Klasė Magnoliopsida Magnolijūnai

Poklasis Rosidae Ėrškėčiažiedžiai

Eilė Fabales Pupiečiai

Šeima Fabaceae Pupiniai

Gentis Glycyrrhiza L. Saldymedis

Rūšis Glycyrrhiza glabra L. Paprastasis saldymedis

1.4.2. Paplitimas

Glycyrrhiza glabra L. yra pusiau žolė, pusiau krūmas, daugiausia paplitęs Vidurio ir Vakarų Azijoje,

Viduržemio jūros regione. Dažnai kaip vaistinis augalas kultivuojamas Afrikoje - Viduržemio jūros baseine, taip pat pietų Europoje bei Indijoje. Lietuvoje savaime neauga, tačiau kaip perspektyvus augalas introdukuojamas Kauno VDU botanikos sode. Glycyrrhiza L. gentį sudaro apie 30 skirtingų rūšių, paplitusių Europos, Azijos, Amerikos ir Australijos žemynuose. Labiausiai paplitusios šios saldymedžių rūšys: G. glabra, G. uralensis, G. inflata, G. aspera ir G. eurycarpa [16].

Paprastieji saldymedžiai geriausiai auga šarminio smėlio ar molio dirvožemyje, kuriame vienodai palaikomas pakankamas drėgmės lygis, nėra akmenų ar dengiančių medžių. Ideali augimo vieta yra gausiai saulės apšviestos upelio krantinės, nuo vėjo apsaugotos dirvos [46].

1.5. Paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos (šaknų) cheminė sudėtis

Paprastųjų saldymedžių vaistinėje augalinėje žaliavoje (šaknyse) kaupiasi triterpeniniai saponinai, kurie sudaro didžiają dalį visų junginių, esančių augalo šaknyse. Jų kiekis svyruoja nuo 4 % iki 20 %, priklausomai nuo augalo rūšies, geografinės padėties ir klimato sąlygų. Pagrindinė biologiškai aktyvi medžiaga, randama požeminėje augalo dalyje, yra glicirizinas, sudarytas iš glicirizino rūgšties kalcio/kalio druskų mišinio ir dviejų gliukurono rūgšties molekulių. Būtent, glicirizino rūgštis (4 pav. ) suteikia augalui saldų skonį. Laikoma, kad ji yra 50 kartų saldesnė už cukrų. Kiti nustatyti antriniai metabolitai, kurių koncentracija šaknyse svyruoja nuo 2 % iki 6 % yra kiti triterpeniniai junginiai: glabrinas A ir B, gliciretolis, glabrolidai ir hidroksiglicirizinas [16].

Kiti biologiškai aktyvūs junginiai, randami paprastųjų saldymedžių vaistinėje augalinėje žaliavoje, yra flavonoidai ir chalkonai, suteikiantys žaliavai geltoną spalvą. Masių spektrometrijos būdu buvo identifikuota daugiau nei 300 skirtingų flavonoidinių junginių. Dažniausiai aptinkami flavonoidai yra likviritinas ir likviritigeninas. Chalkonams priskiriami izolikviritinas, izolikviritigeninas, glabrolidai ir likoflavonoliai. Tarp randamų izoflavonų identifikuoti - glabridinas, glabronas, glabrenas ir formononetinas. Glycyrrhiza glabra L. šaknyse yra ir kumarinų. Tai – junginiai, suteikiantys vaistinei augalinei žaliavai malonų kvapą: glabrokumaronas A ir B, umbeliferonas, glicinas ir kt. [16; 64].

Be minėtų biologiškai aktyvių junginių paprastųjų saldymedžių augalinėje žaliavoje buvo nustatyti pirminiai metabolitai – amino rūgštys (prolinas, argininas ir fenilalaninas), kurios įeina į baltymų sudėtį, dalyvauja anaboliniuose procesuose, o kai kuriais atvejais tarnauja kaip signalinės molekulės augaluose. Mokslinėje literatūroje minima, jog pirminių metabolitų kiekiai Glycyrrhiza glabra L. augalinėje žaliavoje (šaknyse) priklauso nuo augimviečių: ar augalai auga natūraliose augimvietėse, ar yra introdukuoti, pvz., botanikos soduose. Ištirta, kad introdukcijos metu nustatyta didesnė pirminių metabolitų koncentracija augalinėje žaliavoje, lyginant su gamtoje augančiais, tačiau kitų biologiškai aktyvių medžiagų aptikta mažiau [64].

1.6. Paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) vaistinės augalinės žaliavos biologinis aktyvumas ir vartojimas

Pirmieji rašytiniai įrodymai apie paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos vartojimą siekia senovės Egipto laikus. Nuo seno paprastųjų saldymedžių šaknys vartotos kaip vaistas nuo daugelio ligų. Dėl plataus veikimo spektro paprastųjų saldymedžių ekstraktas patenka į įvairių vaistinių preparatų sudėtį. Glycyrrhiza glabra L. preparatai dažnai vartojami virškinamojo trakto problemų šalinimui, opų, kvėpavimo takų ligų gydymui bei padidėjusio rūgštingumo mažinimui. Biologiškai aktyvus junginys – glicirizinas, pagrindinis paprastųjų saldymedžių šaknų komponentas, suteikiantis augalui imunostimuliacinį, priešvirusinį, priešgrybelinį bei priešuždegiminį poveikius [64]. Dažniausiai farmacijoje vartojamos trys paprastųjų saldymedžių augalinės žaliavos farmacinės formos: šaknų ekstraktas, šaknų milteliai ir džiovinti augalų lapai. Ekstraktas yra dažniausiai vartojama forma, gydant nervinės sistemos ligas, tokias kaip depresija bei nerimas, taip pat stimuliuoja antinksčių veiklą, normalizuodamas kortizolio kiekį kraujyje. Ekstrakte yra didelė koncentracija glicirizo rūgšties, kurios maksimali dienos dozė yra 30 mg/ml. Perdozavus gali pasireikšti tokie šalutiniai poveikiai kaip nereguliarus širdies ritmas, raumenų silpnumas ir skysčių kaupimąsis. Paprastųjų saldymedžių šaknų milteliai gali būti skirti – tiek vartojimui į vidų, pvz., opų gydymui, tiek - išoriniam vartojimui gydants dermatozes, žaizdas. Paprastųjų saldymedžių šaknų augalinės žaliavos vartojimo paros norma nustatyta - nuo 760 mg iki 15 g., priklausomai nuo paciento kūno svorio. Džiovinta augalinė žaliava dažnai vartojama arbatų paruošimui [16; 39].

Japonijoje Glycyrrhiza glabra L. - nuo seno vertinamas augalas. Vartojant paprastųjų saldymedžių šaknų ekstraktus gydomas lėtinis hepatitas, alergijos, o maisto pramonėje dažnai vartojamas kaip natūralios kilmės saldiklis [42]. Paprastųjų saldymedžių šaknyse esantys izoflavonai lemia

fitoestrogeninį poveikį, todėl gali padėti sureguliuoti estrogeno-progesterono hormonų pusiausvyrą organizme, lengvinti menopauzės simptomus, o kai kuriais atvejais slopinti krūties vėžio ląstelių augimą [25].

Mokslinėje literatūroje aprašomas glicirizino gydomasis poveikis, kuris buvo įrodytas in vivo ir in

vitro tyrimais. Vartojant gliciriziną intraveniniu būdu pastebėtas priešvirusinis, imunomoduliuojantis

ir priešnavikinis veikimas. Teigiamas poveikis pastebėtas gydant hiperlipidemiją ir hiperpigmentaciją, o išorinės glicirizino ekstrakto aplikacijos lengvino atopinio dermatito simptomus [44]. Likochalkonas A, esantis paprastųjų saldymedžių augalinėje žaliavoje yra pagrindinė medžiaga, veikianti kaip antimaliarinė priemonė. Atliktas tyrimas su pelėmis parodė, jog vartojant 1000 mg/kg geriamosios suspensijos, maliariją sukeliantys pirmuonys – plazmodijai, visiškai išnyko. Kitas biologiškai aktyvus junginys – glabridinas, lemia paprastųjų saldymedžių priešgrybelines savybes ir yra itin veiksmingas prieš Arthrinium sacchari M001 ir Chaetomium funicola M002 grybelius. Antriniai metabolitai, tokie kaip saponinai, alkaloidai ir flavonoidai, esantys Glycyrrhiza glabra L. hidrometanoliniame šaknų ekstrakte, parodė stiprų priešmikrobinį aktyvumą prieš Staphylococcus

aureus, o vandeninių ir etanolinių ekstraktų tyrimai įrodė gebėjimą slopinti Staphylococcus aureus ir Staphylococcus pyogenes mikroorganizmus. Kosmetikos pramonėje Glycyrrhiza glabra L. ekstraktas

gali būti vartojamas kaip potenciali medžiaga gaminant įvairius antiseptinius produktus [46].

Preparatus, savo sudėtyje turinčius paprastųjų saldymedžių šaknų ekstrakto, reikėtų vartoti atsargiai. Mokslinėje literatūroje rašoma, jog per ilgas vartojimas gali sukelti pseudo aldosteronizmą, pvz., periferinę edemą, hipokalemiją bei hipertenziją. Manoma, kad šie nepageidaujami poveikiai atsiranda dėl glicirizino rūgšties – pagrindinio glicirizino metabolito, slopinančio antro tipo 𝛽-hidroksisteroido dehidrogenazę, dėl kurio inkstuose sumažėja kortizono ir padidėja kortizolio kiekis. Nėštumo metu nerekomenduojama vartoti preparatų savo sudėtyje turinčių Glycyrrhiza glabra L. ekstrakto, dėl jame esančios glicirizino rūgšties, kuri gali silpninti placentos veiklą [42]. Paprastųjų saldymedžių šaknų ekstraktą pavartojus oraliai, glicirizino rūgštis yra greitai absorbuojama ir nešiklių pagalba nunešama į kepenis. Ten metabolizuojama į gliukuronidų ir sulfatų darinius, kurie vėliau rehidrolizuojami vėl į glicirizino rūgštį. Praėjus 24 h po pavartojimo glicirizinas yra vis dar aptinkamas šlapime, todėl manoma, kad junginys absorbuojamas į kraujotaką kaip nepakitusi molekulė [46].

1.7. Baltymų biologinė reikšmė augalams

Baltymai, esantys augalų audinių ląstelėse, atlieka daug skirtingų funkcijų. Jie yra atsakingi už genetinės informacijos perdavimą, reguliuoja maisto medžiagų apykaitą augalų ląstelėse, taip pat atlieka hormoninę bei pernašos funkcijas. Membraniniai baltymai suteikia augalui apsauginę funkciją, saugodami jį nuo perkaitimo ir vandens netekimo. Literatūros šaltiniuose minima augalų imuninė sistema (angl. resistance protein), kuri yra viena iš efektyviausių augalų išgyvenimo mechanizmų, kontroliuojamų apsauginių baltymų. Sistema padeda augalams atpažinti ligos sukelėją ir įjungia apsauginius augalo mechanizmus, atpažįstančius specifiškas patogeno išskiriamas molekules, kurių neatpažįsta transmembraniniai receptoriai [59].

Augaliniai baltymai yra itin svarbūs augimui ir gyvybingumo palaikymui. Baltymų funkcijas lemia aminorūgščių išsidėstymo seka ir erdvinė struktūra. Kiekvienas baltymas turi savo unikalią amino rūgščių seką. Baltymus augalai kaupia vegetatyvinių organų audinių ląstelėse, kad vėliau galėtų sintetinti amino rūgštis, būtinas tolesniam augalo vystymuisi. Amino rūgštys sintetinamos iš pirminių elementų, tokių kaip deguonis, anglis, azotas ir vandenilis. Maisto medžiagų apykaita augaluose

priklauso nuo baltymų sintezės, kurią reguliuoja L-amino rūgštys, pasižyminčios metaboliniu aktyvumu. D-amino rūgščių formos negali dalyvauti baltymų sintezėje dėl sunkaus jų įsisavinimo [19; 65].

Augalai geba judėti reaguodami į išorinius dirgiklius. Jų judesiai yra susiję su aktyvia ląstelių veikla. Šviesos sukelti judesiai vadinami fototropizmu. Šį ir kitus tropizmus molekuliniame lygmenyje kontroliuoja baltymai. Esant nepakankamam baltymų kiekiui sulėtėja augalo augimas, sutrinka vegetatyvinių bei generatyvinių organų vystymasis, augalai tampa labiau pažeidžiami išoriniam stresui, sumažėja jų atsparumas ligoms [1].

1.7.1. Pirminių metabolitų migracija ir augalų apsaugos mechanizmas

Gamtoje augantys augalai yra dažnai atakuojami vabzdžių, kurių pagrindiniu maisto šaltiniu tampa augalų lapai ir stiebai. Dėl patiriamo abiotinio streso augalai išvystė apsaugos sistemą, kuri susijusi su pirminio metabolizmo pokyčiais, tokiais kaip fotosintezės efektyvumo slopinimas arba aktyvinimas, pakitęs augalo augimo greitis ar azoto ir anglies išteklių perskirstymas. Tiriant metabolizmo pokyčius, susijusius su vabzdžių atakomis, didžiausias dėmesys buvo skiriamas pirminių metabolitų (baltymų ir angliavandenių ) vaidmeniui apsaugos mechanizme. Amino rūgštys, yra pagrindinė azoto forma aptinkama augaluose. Jos atlieka svarbų vaidmenį augalo apsaugos mechanizme, ribojant augimui reikalingas medžiagas ir atliekant pirmtako funkciją apsauginių junginių sintezėje. Žoliaėdžių atakos dažnai sukelia aminorūgščių mobilizavimo pokyčius tarp pažeistų ir sisteminių audinių. Pirminių metabolitų judėjimas į žoliaėdžių pažeistus audinius gali būti paaiškinamas kaip substratų papildymas vietinės apsaugos stiprinimui, o atvirkščias pirminių metabolitų telkimasis požeminėje augalo dalyje gali būti suprantamas kaip resursų taupymas naujam vegetacijos laikotarpiui [5; 67].

1.7.2. Baltymų kaupimasis vegetacijos metu

Augalai skirtingais vegetacijos periodais kaupia skirtingą kiekį maistinių medžiagų, tokių kaip krakmolas, lipidai ir baltymai. Atsarginiai baltymai (angl. storage proteins) kaupiasi tiek vegetatyviniuose, tiek reprodukciniuose augalų audiniuose ir veikia kaip maistinių medžiagų rezervas. Jie skirstomi į dvi grupes: sėklų atsarginiai baltymai (SSP) ir vegetatyviniai atsarginiai baltymai, skirti augalo vegetacijai (VSP). SSP baltymai dideliais kiekiais kaupiasi augalų sėklose vėlesnėse vegetacijos stadijose, o VSP baltymai labiau linkę kauptis vegetatyviniuose audiniuose, tokiuose kaip šaknys, stiebai ir lapai [18].

Intensyvaus augimo laikotarpiais (pavasarinis atžėlimas, ataugimas po defoliacijos, vaisių vystymąsis) augalams būtina mobilizuoti endogeninius anglies ir azoto rezervinius junginius, sukauptus žiemojančiuose organuose. Žiemos metu arba po antžeminės dalies pašalinimo amino rūgštys ir tirpūs baltymai kaupiasi daugiamečiuose organuose, ir yra panaudojami intensyviam augalų ataugimui vegetacijos pradžioje. Azoto junginiai, saugomi žiemojančiose augalų dalyse, lemia svarbias fiziologines funkcijas, pavyzdžiui, azoto, kaip baltymų šaltinio saugykla vakuolėje, padeda išvengiant galimų osmosinių problemų, susijusių su azoto (kaip nitrato) kaupimusi. Tai leidžia ilgesniam laikui izoliuoti azotą, nedarant žalos ląstelių metabolizmui. Literatūroje aprašomi ankštinių augalų tyrimai, matuojant azoto junginių svyravimus, susijusius su sezoniškumu, ir jų mobilizavimą pavasario augimo metu. Analizė parodė, jog amino rūgščių ir tirpių baltymų koncentracija ankštinių augalų šaknyse žymiai padidėja rudenį ir išlieka aukšta visą žiemos laikotarpį, tuo tarpu

šakniagumbiuose esančių tirpių baltymų kiekis sumažėja pavasarį, o amino rūgščių koncentracija išlieka nepakitusi [4].

Tyrimai su VSP baltymais parodė, jog jų kaupimąsis šaknyse stipriai intensyvėja rudens-žiemos mėnesiais, o pavasario laikotarpyje atžėlimo fazės metu suaktyvėjus baltymų ir amino rūgščių mobilizacijai, bendras VSP baltymų kiekis augalų šaknyse sumažėja 60 % - 80 %, lyginant su jų pradiniu kiekiu rudens pradžioje [4].

1.7.3. Baltymų kaupimąsi lemiantys veiksniai

Baltymų kiekis augaluose kinta priklausomai nuo augalų amžiaus ir išorinių faktorių, tokių kaip fotoperiodas, temperatūra, vandens stygius ir žoliaėdžių atakos. Šviesos laikas paroje ir žema temperatūra tiesiogiai veikia augalų fiziologinius procesus, azoto kaupimąsi bei baltymų mobilizaciją. Tyrimai su ankštiniais augalais parodė, jog esant trumpam šviesos periodui ( 8 h šviesos: 16 h tamsos) VSP baltymų akumuliacija didėja. Tiriant žemos temperatūros (5 ℃ ) įtaką baltymų kiekiui, nustatytas bendras tirpių baltymų koncentracijos didėjimas, o VSP baltymų kiekio pokytis nenustatytas, todėl manoma, kad VSP baltymų koncentracija labiau priklauso nuo fotoperiodo nei nuo temperatūros [4].

Augalų amžius yra vienas svarbiausių parametrų, lemiančių anglies, azoto ir fosforo (C:N:P) junginių koncentracijų skirtumus, bei jų stechiometrinius pokyčius, turinčius reikšmės pirminių metabolitų sintezei. Literatūroje aprašyti tyrimai teigia, jog C:N:P elementų stechiometrinis santykis skirtinguose augalų audiniuose itin priklauso nuo augalų amžiaus ir vegetacijos fazės [66].

1.8. Fotosintezės reikšmė baltymų sintezėje

Fotosinteze vadinama įvairių organinių medžiagų (gliukozė, krakmolas, baltymai) sintezė augalų chloroplastuose iš neorganinių medžiagų, panaudojant atmosferoje esantį anglies dioksidą ir vandenį bei vieną iš energijos šaltinių, pvz., saulės šviesą. Jos metu šviesos energija yra paverčiama chemine energija. Fotosintezės metu organinės maisto medžiagos gaminamos lapuose, vėliau aktyviosios pernašos būdu patenka į karnienos rėtinius indus, kuriuose yra išnešiojamos po augalo organus. Organinių medžiagų judėjimas yra įmanomas abiem kryptimis, tiek iš šaknų į lapus, tiek iš lapų į šaknis. Tokiu būdu fotosintezės reakcijos metu lapuose susintetintos organinės medžiagos, tarp jų ir baltymai, yra nunešamos į augalų šaknis, ir kaip atsargos kaupiamos krakmolo pavidalu [52].

Fotosintezės našumui didelę įtaką daro įvairūs išoriniai aplinkos veiksniai. Svarbiausi iš jų: [4] 1. šviesos trukmė ir intensyvumas

2. temperatūra

3. vandens kiekis asimiliuojančiuose organuose 4. šakninės mitybos sąlygos

5. anglies dioksido kiekis atmosferoje

Fotosintezės reakcija prasideda, esant 15-20 liuksų aplinkos apšvietimui. Jam didėjant, fotosintezės intensyvumas taip pat didėja, tačiau lėtėjančiais tempais, kol pasiekiama tam tikra riba, už kurios, didėjant apšvietimui, fotosintezės intensyvumas nekinta. Kiekvienas augalas turi jam būdingą maksimalaus apšvietimo ribą, iki kurios fotosintezės intensyvumas didėja.

Dažniausiai fotosintezė prasideda vos aukštesnėje nei 0 ℃ temperatūroje, o šiai kylant, fotosintezės intensyvumas taip pat didėja, kol pasiekiama 25 – 30 ℃ temperatūra. Toliau kylant temperatūrai, fotosintezė lėtėja.

Vandens kiekis taip pat turi įtakos organinių junginių biosintezei. Nuo vandens kiekio priklauso lapuose esančių žiotelių tarpuląsčio plotis. Kai vandens trūksta, žiotelės saugodamos vandens atsargas užsiveria, todėl sumažėja arba visiškai nutrūksta anglies dioksido dujų patekimas į asimiliacinius audinius. Geriausias fotosintezės našumas pasiekiamas, kai iki visiško ląstelių įsisotinimo trūksta 5-20 % vandens.

Kad fotosintezės našumas būtų pakankamas, lapuose turi būti atitinkamas kiekis chlorofilo, t. y., apie 0,1 - 0,2 % žalių lapų masės. Fotosintezės produktyvumą lėtina neišnešiotos organinės medžiagos augalų lapuose, šių medžiagų perteklius telkiasi chloroplastuose, o tai slopina fotosintezės aktyvumą [63].

Visų šių faktorių vaidmuo fotosintezės reakcijoje yra labai svarbus, kadangi nestabili fotosintezės sistemos veikla gali lemti pirminių metabolitų sintezės nepakankamumą ir augalo vystymosi sutrikimus. Esant mažam fotosintezės aktyvumui sulėtėja augalo augimas, už kurį atsakingas chlorofilas, vykdantis šviesos absorbciją. Pagrindiniai chlorofilo sintezės proceso metabolitai yra amino rūgštys - glicinas ir gliutamas. Šios amino rūgštys didina chlorofilo koncentraciją, taip skatindamos aktyvesnę fotosintezę. Kitos amino rūgštys reguliuoja vandens balansą augaluose, mikro ir makroelementų absorbciją. Dalis amino rūgščių yra fitohormonų pirmtakai, kurie atsakingi už augalų derliaus vystymąsi, formavimąsi, ATP gamybą ir senėjimo procesų kontrolę. Aprašytos ir baltymų foto apsauginės savybės. Baltymai, prijungiantys chlorofilą, apsaugo jį sausrų metu nuo oksidacijos [63].

1.9. Baltymų ekstrakcijos metodai

Baltymų išskyrimui augalinė žaliava nėra dėkinga dėl mažo ląstelinių baltymų kiekio, sunku suardyti ląstelių sieneles neužteršus mėginio, o antrinių metabolitų buvimas trukdo analizei. Dėl šių priežasčių nėra vieno universalaus baltymų išskyrimo metodo. Dažniausiai metodas parenkamas pagal norimo išskirti baltymo tipą arba yra taikoma kelių metodų kombinacija. Pagrindiniai naudojami metodai baltymų išskyrimui yra šie: [6]

1. Baltymų nusodinimas trichloracto rūgštimi (TCA).

2. Baltymų nusodinimas organiniais tirpikliais (metanoliu, etanoliu, acetonu). 3. Baltymų išsūdymas druskomis (dažniausiai amonio sulfato druska).

1.9.1. Nusodinimas trichloracto rūgštimi

Baltymų nusodinimo trichloracto rūgštimi metodas dažniausiai naudojamas tuomet, kada būtina sukoncentruoti praskiestus baltymų tirpalus. Jis taip pat taikomas, kai mėginiuose baltymo koncentracija yra ne mažesnė negu 5µg/ml. Panaudojant trichloracto rūgštį baltymų nusodinimui, veiksmingai slopinamas augalų audiniuose esančių proteazių aktyvumas, kurio metu inhibuojamas fermentų veikimas, sustabdant peptidinių jungčių skaidymąsi [6; 21; 37].

1.9.2. Nusodinimas kitais organiniais tirpikliais

Metodas dažniausiai taikomas sukoncentruojant labai praskiestus vandeninius baltymų tirpalus. Mechanizmai, kurie lemia baltymų agregaciją (sulipimą) vandeniniuose organinių tirpiklių tirpaluose yra labai skirtingi. Didžiausią įtaką baltymų agregacijai turi tirpalo dielektrinės konstantos sumažėjimas. Į tirpalą, kuriame yra baltymų frakcijų, pripylus organinio tirpiklio, tirpalo dielektrinė konstanta sumažėja. Kuo mažesnė tirpalo dielektrinė konstanta, tuo lengviau viena su kita sąveikauja skirtingai įkrautos molekulės, kurios sulimpa į agregatus ir nusėda. Dažniausiai baltymų nusodinimui naudojami organiniai tirpikliai yra metanolis, etanolis ir acetonas [6; 41].

1.9.3. Baltymų išsūdymas druskomis

Vienas seniausių ir iki šiol naudojamų baltymų nusodinimo metodų yra baltymų išsūdymas naudojant amonio sulfatą ((𝑁𝐻₁)₂𝑆𝑂₁). Metodas vertinamas kaip labai pigus ir efektyvus baltymų nusodinimo būdas, kadangi tuo pačiu metu baltymai yra gryninami (gauti ekstraktai yra nuo 2 iki 10 kartų labiau įsotinti reikiamu baltymu). Metodas pagrįstas sąveika tarp druskų anijonų ir teigiamai įkrautų aminorūgščių liekanų, todėl mažėja baltymo molekulės tirpumas. Druskos anijono ir aminorūgščių sąveika yra veiksmingesnė tada, kai pH < pI (izoelektrinis taškas). Gaunama druskos jonų hidratacija baltymų tirpale. Sumažėjus nesurišto vandens kiekiui tirpale, baltymo molekulės dehidratuojamos. Tirpalo paviršiuje esančios hidrofobinės sritys ima tarpusavyje sąveikauti, todėl vyksta baltymų sulipimas (agregacija) ir iškritimas į nuosėdas arba kitaip – baltymo išsūdymas. Geriausi rezultatai yra pasiekiami išsūdymą atliekant su amonio sulfato druska, dėl polivalentinio anijono su monovalentiniais katijonais. Kai tirpale yra vienoda molinė koncentracija, polivalentiniai anijonai esti veiksmingesni negu monovalentiniai, o polivalentiniai katijonai trukdo baltymų išsūdymui. Atlikus nusodinimą amonio sulfatu ir ištirpinus pasirinktame buferyje, iš tirpalo dializės būdu pašalinama druska [6; 47]. Kadangi šis metodas yra efektyvus, jis pasirinktas kaip pagrindinis būdas baltymų ekstrakcijai iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės žaliavos.

1.10. Baltymų kiekinės sudėties nustatymas

Baltymų kiekis tirpale dažniausiai nustatomas naudojant kalorimetrijos metodus. Tirpalą, kuriame yra baltymo, veikiant specifišku reagentu, susidaro spalvotas junginys, kurio šviesos sugertis nustatoma spektrofotometrijos būdu. Baltymo kiekis tiesiogiai proporcingas šviesos ryškumui. Baltymo koncentracijai analizuojamame tirpale nustatyti yra taikomi šie pagrindiniai metodai: Biureto, Lowri ir Bradford metodai [43].

1.10.1. Biureto metodas

Vienas taikomiausių metodų, naudojamų baltymams ir peptidams nustatyti, yra Biureto reakcija. Kad ši reakcija įvyktų, yra būtini keli peptidiniai ryšiai. Reakcijos pavadinimas kilęs nuo biureto reagento (𝑁𝐻2 − 𝐶𝑂 − 𝑁𝐻 − 𝐶𝑂 − 𝑁𝐻2), kuris susidaro iškaitinus šlapalo molekules aukštenėje nei 130 ℃

temperatūroje. Reaguojant vario jonams su NaOH, susidaro purpurinės spalvos kompleksinis junginys. Tirpalo spalvos ryškumas priklauso nuo baltymo kiekio tirpale. Susidariusio tirpalo spalvos intensyvumas matuojamas spektrofotometriškai, 540 nm bangos ilgyje, kai baltymo koncentracija mėginyje yra 2-10 mg ribose. Tačiau šis metodas nėra labai jautrus, dažniausiai naudojamas didelio baltymo kiekio nustatymui. Reakcijai pilnai įvykti trukdo amonio jonai, sacharozė ir natrio fosfotas, kadangi šie junginiai gali pakeisti komplekso spalvą, o detergentai ir lipidai gali drumsti tirpalus [33].

1.10.2. Lowri metodas

Baltymų koncentracijos nustatymo metodas, pagrįstas vario jonų 𝐶𝑢27 _{virtimo į 𝐶𝑢}7 _jonus.

Reakcijos metu, pirmiausia, vyksta baltymuose esančių peptidinių jungčių reakcija su 𝐶𝑢27_jonais,

kurie vėliau virsta į 𝐶𝑢7 _{jonus ir reaguoja su Folin-Ciocalteau reagentu [31]. Jungiantis}

fosfomolibdato ir fosfovolframato reagentams su fenolinėmis amino rūgščių (tirozino ir triptofano) liekanomis, susidaro mėlynos spalvos junginys, kuris išmatuojamas spektrofotometriškai esant 650-700 nm bangos ilgiui. Spalvos intensyvumas priklauso nuo amino rūgščių kiekio tirpale. Baltymo kiekis gali būti nustatomas, kai koncentracija yra 1-1000 µg/ml ribose. Pagrindiniai šio metodo privalumai yra jo jautrumas (lyginant su Biureto reagentu) ir galimybė vykdyti baltymų koncentracijos nustatymą stipriai šarminėje terpėje. Tyrimo tikslumą mažina baltymų mėginiuose esančių priemaišų (buferio likučiai, lipidai, druskos, tioliai) buvimas, kurios lėtina spalvoto komplekso susidarymą ir greitą spalvos išnykimą po susidarymo. [33; 34; 43;].

1.10.3. Bradford metodas

Šį metodą 1976 metais atrado Marion M. Bradford. Metodas pasižymi paprastumu ir specifiškumu, todėl yra vienas populiariausių metodų iki šiol, nustatant baltymų koncentraciją mišinyje. Jis taikomas, kai baltymų nustatymo ribos yra 2-2000 μg/ml. Bradford metodas grindžiamas specifine baltymo sąveika su dažo Kumasi (angl. Coomassie) briliantiniu mėliu ir susidariusios komplekso koncentracijos matavimu spektrofotometriškai, kai bangos ilgis 595 nm. Gryno dažo katijoninė forma sugeria šviesą ties 470 nm ir 650 nm, o susijungusi su baltymo arginino ir aromatinėmis aminorūgštimis, anijoninė dažo forma sugeria šviesą ties 595 nm. Spalvotas junginys susidaro pakankamai greitai ir išlieka stabilus vieną valandą, o susidariusio komplekso ryškumas priklauso nuo baltymo sudėties. Bradford metodas, lyginant jį su Lowry metodu, pasižymi mažu jautrumu įvairiems detergentams. Dėl metodo tikslumo bei paprastumo baltymų kiekinė sudėtis tiriamuose augaluose bus matuojama šiuo būdu [12; 33].

2. Tyrimo metodika 2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – dešimtų augimo metų paprastojo saldymedžio (Glycyrrhiza glabra L.) ir penktų augimo metų kanadinės jakšūnės (Desmodium canadense (L.) DC.) vaistinė augalinė žaliava – šaknys. Tai daugiamečiai, žoliniai pupinių (Fabaceae) šeimos augalai, žydintys liepos mėnesį, o sėklas brandinantys rugsėjo mėnesį.

Kanadinių jakšūnių tėvyne laikoma šiaurės Kanada, kurioje vyrauja panašios klimato sąlygos kaip ir Lietuvoje, todėl augalai VDU botanikos sode, Vaistinių ir prieskoninių augalų kolekcijos sektoriuje introdukuoti sėkmingai, o atlikti tyrimai patvirtino, jog kanadinės jakšūnės lauko sąlygomis praeina visą vystymosi ciklą iki pilnos vaisių brandos [50]. Paprastųjų saldymedžių introdukcijos tyrimų Lietuvoje nebuvo atlikta, tačiau augalai sėkmingai auga VDU botanikos sode ir praeina visas vegetacijos fazes iki sėklų brandos, kas leidžia manyti, jog augalų introdukcija Lietuvos klimato sąlygomis yra sėkminga.

Baltymų ekstrakcijai buvo naudota paprastųjų saldymedžių ir kanadinių jakšūnių šviežia šaknų žaliava, surinkta VDU Kauno botanikos sode, Vaistinių ir prieskoninių augalų skyriaus kolekcijoje skirtingais augalų vegetacijos tarpsniais. Baltymų kiekinė sudėtis priklauso nuo augalų vegetacijos periodo, todėl požeminės dalies rinkimui pasirinkti septyni vegetacijos tarpsniai, nurodyti 3 lentelėje.

3 lentelė. Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. žaliavų surinkimo laikas vegetacijos

metu

Vegetacijos periodas Glycyrrhiza glabra L. žaliavos

surinkimo laikas

Desmodium canadense (L.) DC.

žaliavos surinkimo laikas

Atžėlimas 2018.04.10 2018.04.10 Intensyvus augimas 2018.05.16 2018.05.16 Butonizacija 2018.05.29 2018.05.29 Žydėjimo pradžia 2018.06.11 2018.06.18 Masinis žydėjimas 2018.06.14 2018.07.05 Žydėjimo pabaiga 2018.07.05 2018.07.19 Sėklų branda 2018.09.25 2018.09.25

Tyrimai atlikti 2018 m. vegetacijos laikotarpyje - gegužės-spalio mėnesiais. 2.2. Tyrimo medžiagos

1. Skystasis azotas (𝑁₂) (Gaschema, Lietuva);

2. PBS vandeninis buferio tirpalas 0,01 M, pH=7,4 (sudėtis: NaCl – 8,0 g/l; KCl – 0,2 g/l; Na2HPO4 – 1,44 g/l; KH2PO4 – 0,24 g/l) (Sigma-Aldrich, JAV);

3. Proteazių inhibitorius 6-aminoheksano rūgštis (Sigma-Aldrich®, Vokietija); 4. Amonio sulfato (AS) druska 99,0 % (𝑁𝐻1)2𝑆𝑂1 (Sigma-Aldrich, JAV);

6. Jaučio serumo albuminas (BSA) (Sigma-Aldrich®, JAV)

7. Baltymų standartas, koncentruotas tirpalas visiems baltymų tyrimams (sudėtis: 2 mg jaučio serumo albumino, 0,9 % NaCl, 0,05 % natrio azido) (Sigma-Aldrich, JAV);

8. Distiliuotas vanduo (LSMU, FF, Lietuva); 2.3. Tyrimo įranga

1. Svarstyklės Scaltec SBC 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija);

2. Analitinės svarstyklės CPA225D-0CE (1 mg-220 g) (Sartorius, Goettingen, Vokietija); 3. Vortex maišyklė IKA (Vokietija);

4. Šaldoma preparatyvinė centrifuga (Heraeus BIOFUGE STRATOS, Vokietija); 5. Automatiniai dozatoriai - pipetės (Ependorf, JAV);

6. Magnetinė maišyklė IKA RCT basic (Vokietija);

7. Spektrofotometras SPECTRONIC CAMSPEC M550 UV/VIS (UK); 8. Smulkintuvas M20 Universal Mill (Vokietija);

9. Ultra švaraus valdens aparatas GFL 2008 (Vokietija);

10. Smulki laboratorinė įranga: grūstuvas, mėgintuvėliai, kolbos, vienkartinės pipetės, pirštinės; 2.4. Žaliavos paruošimas

Šviežiai surinkta vaistinė augalinė žaliava – šaknys, iš karto po surinkimo buvo nuplautos šaltu tekančiu vandeniu ir užšaldytos žemoje (-34 ℃) temperatūroje. Ruošiant žaliavą baltymų išskyrimui, šaknys buvo apdorotos skystu azotu ir homogenizuotos smulkintuvu iki miltelių pavidalo masės. Pilnam žaliavos paruošimui likusios nesusmulkintos žaliavos dalys dar kartą apdorotos skystu azotu ir susmulkintos porcelianinėje grūstuvėje. Susmulkinta šaknų masė pasverta ir paruošta tolimesniam baltymų ekstrakcijos etapui.

2.5. Baltymų nusodinimas amonio sulfatu

Bendram baltymų kiekio augalinėje šaknų žaliavoje nusodinimui pasirinktas baltymų išsūdymas amonio sulfato druska metodas.

5 g smulkintos šaknų žaliava užpilta 1:10 (v/v) 0,01 M fosfatinio buferio tirpalu (PBS), kurio pH 7,2, pridedant proteazių inhibitorių. Gauto mišinio baltymų ekstrakcija vykdyta 4 ℃ temperatūroje nuolat maišant 2 valandas.

0,01 M fosfatinio buferio tirpalo (pH 7,2) sudėtis: Na2HPO4 (bevandenis) - 10.9 g, NaH2PO4

(bevandenis) - 3.2 g, NaCl - 90 g, praskiedžiant grynu distiliuotu vandeniu iki 1 litro tūrio.

Kaip proteazių inhibitorius naudota 0,66 mg/ml 6-aminoheksano rūgštis (EACA), kuri pagerino membraninių baltymų tirpumą.

Po ekstrakcijos gautas baltymų ekstraktas perfiltruojamas ir centrifuguojamas 8500 aps./min. greičiu 20 minučių, centrifugavimo metu palaikant 4-5 ℃ temperatūrą. Vėliau nuosėdos pašalinatos, o gautas supernatantas naudotas tolimesniam baltymų nusodinimo etapui.

Baltymų išsūdymui iš gauto ekstrakto naudota AS druska, išsūdymą vykdant 16 valandų 4 ℃ temperatūroje nuolat maišant. Supernatanto prisotinimo laipsnis amonio sulfatu pasirinktas 80-100 %, tokiu atveju 100 ml baltymų ekstrakto reikės 70,7 g amonio sulfato druskos. Gautas mišinys

magnetinės maišyklės pagalba maišytas 10-15 min geresniam druskos tirpumui ir įdėtas į šaltą patalpą 16 valandų baltymų išsodinimui. Praėjus numatytam laikui tirpalas su išsodintais baltymais centrifuguotas 8500 aps./min. greičiu 20 minučių, centrifugavimo metu palaikant 4-5 ℃ temperatūrą. Supernatantas nupiltas, o gautos baltymų nuosėdos suspenduotos nedideliame tūryje fosfatinio buferio tirpalo ir laikyta 4 ℃ temperatūroje iki baltymų kiekinės analizės matavimo.

2.6. Reagentų paruošimas

2.6.1. Jaučio serumo albumino standartų paruošimas Bradford metodo kalibracinės kreivės sudarymui:

Norint pamatuoti baltymų koncentraciją augalinėje žaliavoje Bradford metodu, sudaryta kalibracinė kreivė (5 pav.) ir pasigaminti jaučio serumo albumino (BSA) standartai. Pasirinktos šios jaučio serumo albumino koncentracijos: 0,125, 0,25, 0,5 ir 1,0 mg/ml. Pramoniniu būdu pagaminti jaučio serumo albumino standartai skiedžiami ultrašvariu vandeniu. Pagaminti standartai saugoti 2 ml talpos mėgintuvėliuose -20 ℃ temperatūroje.

2.6.2. Roti-Quant reagento paruošimas

Roti-Quant reagento, reikalingo Bradford tyrimui, paruošimas: 250 µl Coomasie briliantinio mėlynojo dažo Roti®-Quant praskiesta 1000 µl distiliuotu vandeniu. Pagamintas didesnis reagento kiekis negu reikalingas vienam matavimui, tačiau tirpalą laikant 4 ± 1 ℃ temperatūroje jis tinkamas naudoti kelias savaites.

2.7. Baltymų kiekinės sudėties nustatymas Bradford metodu

Bradford metodas 1976 metais buvo atrastas amerikiečių mokslininko, kuris pirmasis išrado ir užpatentavo greitą baltymų nustatymo metodą tirpale. Metodas remiasi baltymo ir Coomasie G-250 dažo sąveika rūgščioje aplinkoje. Coomasie G-250 briliantinis mėlynasis dažas, kaip kalorimetrinis dažiklis naudojamas bendram baltymų kiekio nustatymui ir kiekiniam įvertinimui. Coomasie G-250 dažo ligandų skaičius, prisijungęs prie kiekvienos baltymo molekulės, yra proporcingas teigiamam baltymo krūviui. Spalvos susidarymas tarp dažo ir baltymo molekulių yra susijęs su tam tikrų amino rūgščių (arginino, lizino, histidino) buvimu baltymo struktūroje. Van der Valso jėgos ir hidrofobinės sąveikos taip pat daro įtaką dažo prisijungimui prie baltymo molekulių [62].

Rūgščioje reagento aplinkoje baltymai jungiasi su Coomasie G-250 dažikliu, o tai lemia spektrinį poslinkį nuo raudonos/rudos dažų spalvos formos (absorbcijos maksimumas, esant 465 nm šviesos bangos ilgiui) iki mėlynos dažų spalvos formos (absorbcijos maksimumas, esant 610 nm šviesos bangos ilgiui). Skirtumas tarp dviejų skirtingos spalvos dažo formų yra didžiausias esant 595 nm šviesos bangos ilgiui. Spalvos intensyvumas taip pat gali būti išmatuotas tarp 575 nm ir 615 nm šviesos bangos ilgių, tačiau ribiniuose taškuose (575 nm ir 615 nm) išmatuotas spalvos intensyvumas bus mažesnis apie 10 %, palyginti su spalvos intensyvumu gautu matuojant prie 595 nm šviesos bangos ilgio [62].

Laivosios amino rūgštys ir mažos molekulinės masės baltymai nesudaro spalvoto komplekso su

Coomasie dažų reagentais. Peptido ar baltymo masė turi būti ne mažesnė nei 3000 daltonų, kad

susidarytų spalvotas kompleksas, todėl šis tyrimas yra tinkamas tik didelės molekulinės masės baltymų kiekio nustatymui. Naudojant Bradford kiekinio baltymų tyrimo metodą galima išmatuoti baltymų kiekį nuo1 iki 20 𝜇𝑔 diapazone. Tai itin jautrus baltymų kiekinio nustatymo metodas.

Baltymo mėginiuose esančios druskos, metalų kompleksai ar tioliai nedaro įtakos tyrimo rezultatams [62].

Pirmiausia norint išmatuoti baltymų koncentraciją analizuojamame tirpale, sudaryta kalibracinė kreivė. Tuo tikslu pasirinkti skirtingų koncentracijų standartai bei neigiamos kontrolės tirpalas – PBS buferis (pH 7,4). Kiekvieno standarto ir neigiamos kontrolės tirpalo imta po 40 𝜇𝑙 ir įpilta po 2 ml paruošto naudojimui Roti-Quant reagento. Mišinys sumaišytas Vortex maišykle ir paliktas 5 min 20-22 ℃) tam, kad dažo molekulės prisijungtų prie baltymo struktūros. Absorbcija matuota esant 595 nm šviesos bangos ilgiui.

Naudojant skirtingų koncentracijų jaučio serumo albumino tirpalus, sudaryta kalibracinė kreivė ir gauta tiesinė regresijos lygtis. Sudarytas grafikas naudotas tolimesniems skaičiavimams, nustatant baltymo kiekį, pavaizduotas 5 paveiksle.

Atitinkamai išmatuota tiriamų tirpalų absorbcija, sumaišius kiekvieno mėginio po 40 𝜇𝑙 ir 2 ml paruošto Roti-Quant reagento. Mišinys inkubuotas 5 min., vėliau spektrofotometru išmatuota tirpalų absorbcija prie 595 nm šviesos bangos ilgio. Turimą mišinį galima naudoti ne ilgiau nei vieną valandą, kadangi susidaręs kompleksas praėjus numatytam laikui tampa nestabilus, gaunamos netikslios absorbcijos reikšmės.

Baltymo išeiga žaliavoje (mg/g) paskaičiuota pagal 1 formulę:

𝜂 =

D_Ž (1 formulė) čia:

𝜂 ̶ baltymų išeiga žaliavoje (mg/g); c ̶ baltymų koncentracija tirpale (mg/ml);

𝑉GHGI – suspenduotų baltymų tūris (ml);

𝑚_ž ̶ žaliavos masė (g);

Pagrindinis Bradford metodo trūkumas yra jo nesuderinamumas su baltymų komplekse esančiomis paviršiaus aktyviomis medžiagomis (PAM), kurios naudojamos tirpinant membraninius baltymus. Net maža PAM koncentracija sukelia reagento iškritimą į nuosėdas ir trukdo dažui prisijungti prie baltymo šoninės grandinės. Kadangi Coomasie reagentas yra rūgštinės prigimties, šiuo metodu negalima išmatuoti blogai rūgščioje terpėje tirpstančių baltymų kiekio. Taip pat jeigu baltymas turi nepakankamą aromatinių radikalų skaičių, dažas negalės veiksmingai prisijungti prie baltymo ir sudaryti komplekso [62].

2.8. Proteazių inhibitoriai

Kokybiškesniam baltymų išskyrimui iš augalinės žaliavos yra naudojami proteazių inhibitoriai, kurie slopina fermentų veikimą, taip stabdydami peptidinių jungčių skaidymą. Atliekant ląstelės sienelės suardymą padidėja proteolitinių fermentų išsiskyrimas, kuris gali mažinti bendrą tyrime išskiriamų baltymų kiekį. Siekiant kontroliuoti šią nepageidaujamą reakciją – proteolizę, rekomenduojama pridėti proteazių inhibitorių į ląstelių suspensiją. Kadangi daugelis šių junginių nėra labai stabilūs vandeniniuose tirpaluose, svarbu, kad prieš pat naudojimą jie būtų ištirpinti buferiniame tirpale [45]. Šiame tyrime buvo panaudota 6-aminoheksano rūgštis (EACA), kuri veikia kaip priedas, gerinantis membraninių baltymų tirpumą ir slopinantis proteolizę [54].

EACA yra lizino analogas [2]. Ji slopina chimotripsiną, VIIa faktorių, lizino karboksipeptidazę ir plazminą. EACA tirpumas vandenyje siekia 25 mg/ml, veikimo spektras - 5 mg/ml [56].

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, surinktos skirtingais vegetacijos tarpsniais, baltymų kiekio nustatymo rezultatai

Remiantis literatūros duomenimis, pupinių šeimos augalai kaupia didelį kiekį baltyminių junginių [15]. Siekiant palyginti abiejų augalų baltymų kiekinę sudėtį vegetacijos ciklo metu, buvo atliktas baltymų kiekio nustatymas Bradford metodu, kurio rezultatai pavaizduoti 6 paveiksle.

6 pav. parodyta, jog abiejų vaistinių augalinių žaliavų baltymų kiekis vegetacijos metu kito priklausomai nuo vystymosi fazės. Didžiausias baltymų kiekis sukauptas ankstyvą pavasarį atžėlimo fazės metu ir vegetacijos pabaigoje - augalui brandinant sėklas. Žydėjimo metu (žydėjimo pradžioje, masinio žydėjimo ir žydėjimo pabaigoje) baltymų kiekis taip pat buvo skirtingas.

3.1.1. Baltymų, išskirtų iš kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių vaistinės augalinės žaliavos, kiekinės analizės rezultatai augalų atžėlimo fazės metu

Prasidėjus vegetacijai, šviežia šaknų žaliava buvo surinkta balandžio mėnesio pirmoje dekadoje. Tirtų augalų vegetacijos pradžia sutapo, todėl žaliavos iškastos tuo pačiu metu. Baltymų kiekinė sudėtis, nustatyta kanadinių jakšūnių ir paprastųjų saldymedžių šviežioje šaknų žaliavoje atžėlimo fazės metu, pavaizduota 7 pav.

6 pav. Baltymų, išskirtų iš Glycyrrhiza glabra L. ir Desmodium canadense (L.) DC. šviežių šaknų žaliavos,

kiekis skirtingais vegetacijos periodais, mg/g (XL ± SSN, n=3, p=0.005)

9.797 6.628 4.593 3.803 5.162 7.578 7.137 2.768 0.931 0.256 4.288 1.225 0.514 6.696 Atžėlimas Intensyvus

augimas Butonizacija Žydėjimopradžia žydėjimasMasinis Žydėjimopabaiga Sėklų branda

Ba lty m ų ki ek is ž al ia vo je , m g/ g

Baltymų kiekis vegetacijos ciklo metu