FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
ALIONA GRIŠKEVIČ
GERVUOGIŲ VAISIŲ ANTOCIANINŲ SUDĖTIES TYRIMAS
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC)
METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
lekt. dr. D. Burdulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
GERVUOGIŲ VAISIŲ ANTOCIANINŲ SUDĖTIES TYRIMAS
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS (ESC)
METODU
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
lekt. dr. Deividas Burdulis Data
Recenzentas: Darbą atliko: Magistrantė Aliona Griškevič Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1 Gervuogių genties (Rubus L.) ir rūšių apibūdinimas bei panaudojimas medicinoje ... 11
1.1.1 Rubus genties apibūdinimas ... 11
1.1.2 Skirtingų gervuogių rūšių morfologinis apibūdinimas ... 11
1.1.3 Paplitimas Lietuvoje ... 13
1.1.4 Gervuogių vaisių ir lapų cheminė sudėtis ... 13
1.1.5 Gervuogių vaistinė augalinė ţaliava ir panaudojimas medicinoje ... 14
1.2 Antocianinų apibūdinimas, struktūra, biologinės savybės ir panaudojimas ... 15
1.2.1 Apibūdinimas... 15
1.2.2 Paplitimas augaliniame pasaulyje ... 15
1.2.3 Cheminės struktūros ypatumai ... 16
1.2.4 Fizikinės ir cheminės savybės ... 18
1.2.5 Farmakologinis poveikis ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1 Tyrimo objektas ... 20
2.2 Naudoti reagentai ... 21
2.3 Naudoti antocianinų standartai ... 21
2.4 Naudota aparatūra ... 21
2.5 Ekstraktų ruošimo metodika ... 22
2.6 Antocianinų tapatybės ir kiekybės nustatymo metodika ... 22
2.7 Antocianinų kiekybinis nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 23
2.8 Nuodţiūvio nustatymas gervuogių vaisiuose ... 23
2.9 Statistinis duomenų įvertinimas ... 24
3.1 Kokybinis antocianinų nustatymas R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H.
vaisiuose ... 25
3.2 Antocianinų kiekio nustatymas R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. vaisiuose ... 29
3.3 Antocianinų kiekio kitimo dinamika vaisių nokimo metu ... 30
3.4 Antocianinų kiekio nustatymas skirtingose Lietuvos vietovėse augančių gervuogių vaisiuose... ... ………32
4. IŠVADOS ... 35
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 36
SANTRAUKA
A. Griškevič magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas lekt. dr. D. Burdulis; Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas. Tikslas: ištirti natūraliose augimvietėse surinktos gervuogių vaisių vaistinės augalinės ţaliavos antocianinų kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti sudėties kitimo dinamiką vaisių nokimo metu, sudėties įvairavimą skirtingose augavietėse surinktuose mėginiuose. Uţdaviniai: nustatyti antocianinų kokybinę sudėtį gervuogių vaistinės augalinės ţaliavos ekstraktuose; nustatyti antocianinų kiekybinę sudėtį gervuogių vaistinės augalinės ţaliavos ekstraktuose; įvertinti kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą skirtingų gervuogių rūšių vaisių ėminiuose; įvertinti antocianinų kiekinės sudėties kitimo dinamiką vaisių nokimo metu; įvertinti antocianinų kiekinės sudėties įvairavimą skirtingose augavietėse surinktuose mėginiuose. Ekstrakcijai pasirinkta maceracija mechaninėje purtyklėje, kaip ekstrahentą naudojant metanolį. Kokybinė ir kiekybinė antocianinų sudėtis R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. gervuogių vaisių ėminiuose nustatyta efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodo pagalba. Bendras antocianinų kiekis R. caesius L. vaisiuose, surinktuose skirtingose Lietuvos vietovėse, nustatytas spektrofotometrijos metodu. Nustatyta, jog visose tirtose gervuogių rūšyse dominuoja du antocianinai: cianidin-3-O-gliukozidas ir cianidin-3-O-rutinozidas. Didţiausias cianidin-3-O-gliukozido ir cianidin-3-O-rutinozido kiekis nustatytas R. caesius L. vaisiuose (1,953 ± 0,452 proc. ir 0,502 ± 0,102 proc., atitinkamai), o maţiausias – R. nessensis H. vaisiuose (1,214 ± 0,225 proc. ir 0,276 ± 0,063 proc.). Nustatyta, jog didţiausias cianidin-3-O-gliukozido ir cianidi-3-O-rutinozido kiekis R. caesius L. vaisiuose yra susikaupęs ketvirtąją jų nokimo savaitę. Didţiausias O-gliukozido ir cianidin-3-O-rutinozido kiekis nustatytas Balkasodţio kaime (Alytaus r.) augančių gervuogių vaisiuose (3,234 ± 0,448 proc. ir 0,932 ± 0,203 proc., atitinkamai). Maţiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis nustatytas Nemunaityje augančiose gervuogėse (2,166 ± 0,345 proc.), o cianidin-3-O-rutinozido – Obelijoje augančių gervuogių vaisių ėminiuose (0,558 ± 0,146 proc.).
SUMMARY
A. Griškevič master's thesis / supervised by lect. dr. D. Burdulis; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. - Kaunas. Objective: to explore qualitative and quantitative composition of anthocyanins in blackberries collected from natural habitats and evaluate the dynamics of anthocyanins in blackberries collected from different habitats on their ripening time. Objectives: to determine the qualitative composition of anthocyanins in blackberry herbal raw material extracts; to determine the quantitative composition of anthocyanins in blackberry herbal raw material extracts; to assess the variation of qualitative and quantitative composition in different types of blackberry fruit samples; to evaluate the variation of quantitative composition of anthocyanins in blackberries during the fruit ripening; to evaluate the variation of quantitative composition of anthocyanin in different habitats collected samples. The maceration by mechanical shaker using methanol was selected for extraction. Qualitative and quantitative composition of anthocyanins in R.
caesius L., R. plicatus W. et N. and R. nessensis H. fruits samples was determined using high
performance liquid chromatography (HPLC). Total content of anthocyanins in R. caesius L. fruits collected in different areas of Lithuania was determined using spectroscopy. It was found that all investigated blackberry species dominated by two anthocyanins: 3-O-glucoside and cyanidin-3-O-rutinoside. The highest cyanidin-3-O-glucoside and cyanidin-3-O-rutinoside points set R. caesius L. fruits (1.953 ± 0.452 per cent. and 0.502 ± 0.102 per cent., respectively), while the lowest - R. nessensis H. fruits (1.214 ± 0.225 percent. and 0.276 ± 0.063 per cent.). It was found that the highest cyanidin-3-O-glucoside and cyanidin-3-O-rutinoside points in R. caesius L. fruits is focused their fourth week of ripening. The highest cyanidin-3-O-glucoside and cyanidin-3-O-rutinoside points set in Balkasodis village (Alytus r.) growing blackberry fruits (3.234 ± 0.448 per cent. and 0.932 ± 0.203 per cent., respectively). Minimum cyanidin-3-O-glucoside points set in Nemunaitis growing blackberries (2.166 ± 0.345 per cent.) and cyanidin-3-O-rutinoside – in Obelija growing blackberry fruit samples (0.558 ± 0.146 per cent.).
SANTRUMPOS
ACN - acetonitrilas
BMR spektroskopija – branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija
COX - ciklooksigenazė
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
KE – kapiliarinė elektroforezė
LPO – lipidų peroksidacija
MS detektorius – masių spektrometrinis detektorius
PDA – fosfodiodų matricos detektorius
ĮVADAS
Šiais laikais vis labiau populiarėja natūralūs gydymo metodai. Vienas iš tokių metodų yra fitoterapija (gr. phyton – augalas, therapeia – gydymas) – gydymas vaistiniais augalais ar jų preparatais. Fitoterapija gali būti dviejų rūšių: racionalioji (alopatinė) fitoterapija, kuri yra pagrįsta moksline medicina, ir tradicinė fitoterapija – tai liaudies medicina. Gydymas augalais yra ţinomas nuo senų laikų ir vystėsi tūkstančius metų. Augalų terapinį poveikį lemia juose esantys įvairūs cheminiai junginiai: flavonoidai, glikozidai, eteriniai aliejai, rauginės medţiagos, fermentai, vitaminai ir kt. Daţniausiai vaistinio augalo gydomąjį poveikį lemia ne viena veiklioji medţiaga, o jų kompleksas, todėl geresnis gydymo efektas yra pasiekiamas vartojant visą augalinę ţaliavą, o ne išgrynintą medţiagą. Augaliniai vaistiniai preparatai beveik nesukelia nepageidaujamo poveikio, kadangi augaluose esančios biologiškai aktyvios medţiagos sudaro kompleksus su kitais biologiškai veikliais junginiais. Būtent dėl šios prieţasties ţmonės vis daţniau renkasi fitoterapiją [1].
Gervuogė nėra plačiai vartojamas augalas fitoterapijoje. Šiam vaistiniam augalui turėtų būti skiriamas didesnis dėmesys, kadangi gervuogių vaisiuose yra daugybė sveikatai naudingų medţiagų tokių kaip antocianinai, rauginės medţiagos, flavonoidai, organinės rūgštys, vitaminai (C, E, K), provitaminas A, B grupės vitaminai ir kt. [2]. Ypatingai didelę naudą ţmogaus organizmui turi antocianinai. Šie junginiai pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis, t.y. neutralizuoja organizme laisvuosius radikalus ir apsaugo nuo lėtinių ligų. Antocianinai taip pat stiprina kraujagyslių sieneles, slopina uţdegiminius procesus ir stabilizuoja audinius, kuriuose yra kolageno, pavyzdţiui, kremzlių, sausgyslių ar raiščių [3, 4].
Jau nuo senų laikų ţmonės vartoja gervuoges liaudies medicinoje. Kaip vaistinė augalinė ţaliava yra vartojami gervuogių vaisiai bei lapai. Vaisiai, dėl juose esančių skaidulinių medţiagų, gerina virškinamojo trakto veiklą. Vartojant gervuogių vaisius organizmas yra aprūpinamas pakankamu antioksidantų kiekiu, o tai padeda apsisaugoti nuo daugelio ligų ir palaikyti normalią širdies ir kraujagyslių sistemos veiklą bei sveikus kaulus [5, 6]. Tai yra puikus vitamino C šaltinis, todėl vaisiai vartojami norint pagerinti imuninės sistemos veiklą. Gervuogių lapų arbata pasiţymi baktericidinėmis savybėmis, todėl vartojama sergant dizenterija ar virškinamojo trakto ligomis [7, 8]. Vaisių ir lapų nuovirą naudinga vartoti susirgus peršalimo ligomis, kadangi skatina prakaitavimą bei pasiţymi priešuţdegiminiu poveikiu [7, 9, 10].
Norint, kad gervuogių vaistinė ţaliava pasiţymėtų maksimaliu gydomuoju poveikiu, būtina ištirti kokiu vegetacijos laikotarpio metu ţaliavoje yra susikaupęs didţiausias kiekis veikliųjų medţiagų. Jų kiekis priklauso ne tik nuo vegetacijos tarpsnio, bet ir nuo augimo sąlygų bei augalo rūšies. Deja, tokio pobūdţio tyrimų Lietuvoje trūksta, todėl yra tikslinga išsamiau ištirti gervuogių vaisių antocianinų kokybinę ir kiekybinę sudėtį, jos įvairavimą ir kitimo dinamiką vaisių nokimo metu. Galbūt ateityje, atlikus pakankamai tyrimų, gervuogės bus kur kas daţniau vartojamos fitoterapijoje.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Tikslas: ištirti natūraliose augimvietėse surinktos gervuogių vaisių vaistinės augalinės ţaliavos antocianinų kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei įvertinti sudėties kitimo dinamiką vaisių nokimo metu, sudėties įvairavimą skirtingose augavietėse surinktuose mėginiuose.
Uţdaviniai:
1. Nustatyti antocianinų kokybinę sudėtį gervuogių vaistinės augalinės ţaliavos ekstraktuose. 2. Nustatyti antocianinų kiekybinę sudėtį gervuogių vaistinės augalinės ţaliavos ekstraktuose. 3. Įvertinti kokybinės ir kiekybinės sudėties įvairavimą skirtingų gervuogių rūšių vaisių ėminiuose. 4. Įvertinti antocianinų kiekinės sudėties kitimo dinamiką vaisių nokimo metu.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1 Gervuogių genties (Rubus L.) ir rūšių apibūdinimas bei panaudojimas
medicinoje
1.1.1 Rubus genties apibūdinimas
Rubus (lot. rubus – raudonas) gentis priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai, kurioje yra apie
450 augalų rūšių. Šiai genčiai priklauso gervuogės, avietės, katuogės ir tekšės. Daugumos šios genties augalų vaisiai yra raudonos spalvos, o gervuogių – rausvos, nokimo pradţioje, vėliau pajuoduoja.
Lietuvoje labiausiai paplitusios šios gervuogių rūšys: paprastoji gervuogė (Rubus caesius L.), stačioji gervuogė (Rubus nessensis H.), raukšlėtoji (Rubus plicatus W. et N.), bedyglė gervuogė (Rubus
fruticosus L.) rečiau sutinkama yra lazdynlapė gervuogė (Rubus coryfolius Sm.) [11]. Gervuogės
liaudyje dar gali būti vadinamos krūmuogėmis, draskėmis, krantuogėmis, gervenomis [7, 12]. Pagal botaninę klasifikaciją, gervuogės yra suskirstytos sekančiai:
Karalystė: Plantae – Augalai
Pokaralystė: Tracheobionta – Induočiai augalai Super skyrius: Spermatophyta – Sėkliniai augalai Skyrius: Magnoliophyta – Ţydintys augalai Klasė: Magnoliopsida – Dviskilčiai augalai Poklasė: Rosidae
Eilė: Rosales
Šeima: Rosaceae – Erškėtinių Gentis: Rubus L. – Gervuogė
Rūšis: caesius – paprastoji gervuogė; plicatus – raukšlėtoji gervuogė; nessensis – stačioji gervuogė; fruticosus – bedyglė gervuogė; coryfolius – lazdynlapė gervuogė. [13]
1.1.2 Skirtingų gervuogių rūšių morfologinis apibūdinimas
Paprastoji gervuogė (Rubus caesius L.) yra daugiametis vasarţalis krūmas, turintis gerai išsivysčiusį šakniastiebį ir šliauţiančius iki 3 metrų ilgio tankiai dygliuotus, apvalius, įsišaknijančius, su
melsvu apnašu stiebus. Lapai sudėtiniai, su 3-5 lapeliais, raukšlėti, iš abiejų pusių ţali, kiek plaukuoti [7, 14]. Lapeliai rombo arba kiaušinio formos, turintys nelygius stambius dantelius. Ţiedai stambūs, iki 3 cm skersmens, balti, kartais rausvi, susitelkę skėtiškose kekėse. Vaisius – beveik juodos spalvos, melsvu apnašu, sultinga, saldţiai rūgšti uoga, sudaryta iš daugelio maţų vaisių. Nuo ţiedsosčio neatsiskiria [7, 14]. Ţydi geguţės – birţelio mėnesiais, vaisiai prinoksta rugpjūčio – rugsėjo mėnesiais [7].
Raukšlėtoji gervuogė (Rubus plicatus W. et N.) - šios gervuogių rūšies krūmo stiebai yra iki 2 metrų aukščio, pliki, iš saulėtos pusės rausvi, o viršuje ryškiai briaunoti, tankiai apaugę kietais, šiek tiek lenktais dygliais. Senesni ūgliai yra išsilenkę lanku ir neryškiai vagoti. Lapai su penkiais lapeliais. Jauni lapeliai iš abiejų pusių šiek tiek plaukuoti, o seni lapai - neţymiai plaukuoti arba pliki, saulės atokaitoje daţnai raukšlėti, jų viršutinė pusė yra tamsiai ţalios spalvos. Vidurinis lapelis yra plačiai kiaušiniškas, pagrinde širdiškas arba apskritas, viršūnėje laipsniškai nusmailėjęs, apie 7-10 cm ilgio, kotuotas. Šoniniai lapeliai yra siauresni, trumpakočiai arba dygliuoti. Ţiedai gana stambūs, baltos arba rausvos spalvos, susitelkę kekėse. Vaisiai yra juodos spalvos, blizgantys. Raukšlėtoji gervuogė ţydi birţelio – rugpjūčio mėnesiais [11].
Stačiosios gervuogės (Rubus nessensis H.) krūmas siekia net 3 – 4 metrų aukštį. Jauni ūgliai yra statūs, o senesni išsilenkę lanku, briaunoti, apaugę smulkiais, tamsiai raudonais, tiesiais dygliais. Lapai susideda iš penkių lapelių (viršutiniai kartais trilapiai), blizgantys, jų viršutinė pusė yra apaugusi retais plaukeliai arba plika, o apatinė – tik visai jaunučių kiek gausiau plaukuota. Šoniniai lapeliai turi kotelius, viršutinis lapelis laipsniškai nusmailėjęs, pamate širdiškas, apie 10-12 cm ilgio ir 5 cm pločio. Ţiedai yra baltos, rečiau rausvos spalvos, iki 2,5 cm skersmens, susitelkę negausiaţiedėse trumpose kekėse. Neprinokę vaisiai yra tamsiai rusvai raudonos spalvos, o prinokę - beveik juodi, saldţiai kartaus skonio. Augalas ţydi birţelio – liepos mėnesiais, o vaisiai prinoksta rugpjūčio mėnesį [11].
Bedyglės gervuogės (Rubus fruticosus L.) stiebai uţauga iki 7 metrų ilgio ir yra ţalios, rusvos ar raudonos spalvos, gali būti neţymiai plaukuoti. Lapai yra sudaryti iš trijų ar penkių ovalių, smulkiai dantytų lapelių, kurių viršūnėlės yra tamsiai ţalios spalvos, o dalis prie kotelio – šviesiai ţalios spalvos [15]. Ţiedai yra baltos arba rausvos spalvos, nuo 2 iki 3 centimetrų skersmens, turintys penkis ţiedlapius ir susitelkę į negausias kekes trumpų šakų galuose. Prinokę vaisiai yra juodos spalvos, nuo 1 iki 3 centimetrų skersmens uogos, sudarytos iš mėsingų segmentų, kurių viduje yra sėkla. Sėklos yra nuo šviesiai iki tamsiai rudos spalvos, 2-3 milimetrų ilgio, šiek tiek trikampės, giliai ir netaisyklingai išgaubtos [16].
1.1.3 Paplitimas Lietuvoje
Paprastoji gervuogė yra paplitusi visoje Lietuvos teritorijoje. Auga drėgnuose bei šlapiuose lapuočių ir mišriuose miškuose, eţerų ir upių pakrantėse, grioviuose, krūmuose, kai kur sudaro tankius sąţalynus [7, 14,]. Didesni uogynų plotai aptinkami Joniškio rajono Ţagarės girininkijoje, Trakų rajono Kazokiškių girininkijoje, Kupiškio rajono Šimonių girininkijoje, Pakruojo rajono Pakruojo ir Ţeimelio girininkijoje, Panevėţio rajono Panevėţio girininkijoje. Šiuo metu yra naujų gervuogių veislių, kurios kultivuojamos soduose [7, 14, 10]. Dauginasi sėklomis ir įsišaknijančiais stiebais [17].
Raukšlėtoji gervuogė yra randama pamiškėse, miškų aikštėse, pakelėse. Lietuvoje labiau paplitusi vakarinėje dalyje [11].
Stačioji gervuogė auga mišriuose miškuose, pamiškėse, miškų aikštelėse, kirtimuose, daţnai kartu su paprastąja aviete. Lietuvoje šis augalas gana daţnas visoje teritorijoje [11].
1.1.4 Gervuogių vaisių ir lapų cheminė sudėtis
Gervuogė - tai augalas, kuris kaupia įvairias sveikatai naudingas medţiagas. Vaisiuose randama 2,9 - 3,6 proc. gliukozės, 3,1 – 3,3 proc. fruktozės, 0,4 – 0,6 proc. sacharozės, iki 0,3 mg proc. karotino, 0,033 mg proc. vitamino B, 21,4 mg proc. vitaminų C ir E, 0,56 – 0,8 proc. pektininių medţiagų, 1,1 – 2,3 proc. organinių rūgščių (citrinos, obuolių, vyno salicilo), 0,13 – 0,26 proc. rauginių medţiagų [14, 9, 10, 18], skaidulinių medţiagų, flavonoidų (rutino), nikotino rūgšties, 0,495 – 0,98 proc. fenolinių junginių, antocianinų, kurių kiekis svyruoja nuo 0,065 proc. iki 0,589 proc. [19, 20, 21, 22]. Įvairių rūšių gervuogių vaisiuose daţniausiai aptinkami šie antocianinai: cianidino-3-O-gliukozidas, cianidino-3-O-arabinozidas, cianidin-3-O-rutinozidas, cianidin-3-O-galaktozidas, pelargonidin-3-O-gliukozidas, pelargonidin-3,5-di-O-gliukozidas bei kiti acilinti junginiai su malono ar oksalo rūgštimis. Vaisiuose taip pat randama makroelementų, tokių kaip magnis, geleţis, kalcis, fosforas, kalis, natris, bei mikroelementų, tokių kaip varis, cinkas, manganas, selenas [19]. Sėklose yra 10 – 12,9 proc. riebalinio aliejaus ir 0,6 proc. fitosterino [9].
Lapuose randama iki 14 proc. rauginių medţiagų, flavonoidų, organinių rūgščių (vyno, citrinų, obuolių, salicilo), fitoncidų, mineralinių ir kitų medţiagų [7, 14, 19]. Ypač didelį kiekį antioksidacinėmis savybėmis pasiţyminčių junginių turi jauni gervuogių lapeliai [23].
Lenkijoje augančių įvairių rūšių (tarp kurių yra R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R.
nessensis H.) gervuogių lapuose nustatyti 33 fenoliniai junginiai, iš kurių 15 yra flavonoliai (5
flavonai (liuteolin-3-O-gliukuronidas ir apigenin-3-O-gliukuronidas), 9 fenolinės rūgšties junginiai (tarp kurių: neochlorogeninė, chlorogeninė ir p-kumarino rūgštys), elagotaninai ir elago rūgšties dariniai (elago rūgšties pentozidas, ramnozidas, metilelago rūgšties pentozidas).
1.1.5 Gervuogių vaistinė augalinė ţaliava ir panaudojimas medicinoje
Kaip vaistinė augalinė ţaliava yra vartojami gervuogių vaisiai (Fructus) ir lapai (Folia). Lapai renkami augalui ţydint, o vaisiai – prinokę [9,10]. Surinkti lapai dţiovinami gerai vėdinamoje patalpoje, pavėsyje. Vaisiai yra paskleidţiami plonu sluoksniu ir apvytinami gryname ore, saulėje. Po to dţiovinami dţiovykloje, 50 – 60 ○C temperatūroje. Tinkamai laikomą ţaliavą galima naudoti trejus metus [7].
Ţaliavoje pajuodavusių ir apdegusių vaisių gali būti ne daugiau kaip 8 proc., su vaiskočiais – ne daugiau kaip 2 proc., susmulkėjusių augalo dalių – ne daugiau kaip 3 proc., organinių priemaišų – ne daugiau kaip 0,5 proc., mineralinių – ne daugiau kaip 0,5 proc. [9].
Gervuogių vaisių preparatai yra vartojami kaip silpnumo jausmą maţinanti, nervų sistemą raminanti, ypač klimakso neurozės metu, ţarnyno veiklą reguliuojanti priemonė. Prinokę vaisiai skatina ţarnyno peristaltiką, o neprinokę – slopina. Taip pat gervuogės yra vartojamos sergant skleroze, hipertonija, cukriniu diabetu ir angina. Švieţios uogos ir sultys vartojamos pagerinti anemijos būklei ir troškuliui malšinti karščiuojant [7, 9, 10]. Gervuogių vaisiai ir lapai skatina prakaitavimą, šlapimo išsiskyrimą, todėl yra vartojami nuo karščiavimo, šlapimo takų uţdegimo. Ilgai geriant arbatą pagerėja cukriniu diabetu sergančių ligonių medţiagų apykaita bei apetitas. Hipoglikeminis poveikis buvo pastebėtas ikiklinikinių tyrimų metu [25].
Lapų arbata pasiţymi baktericidinėmis savybėmis, todėl ją naudinga gerti sergant dizenterija arba virškinamojo trakto ligomis [7, 8]. Tyrimais įrodyta, jog guobalapių gervuogių (R. ulmifolius Schott) lapų preparatai yra veiksmingi prieš H. pylori bakteriją, kuri sukelia daugelį virškinamojo trakto ligų [26]. Gervuogių lapų nuoviras gydo skrandţio kraujavimą, diarėją. Juo skalaujama burnos ertmė esant gleivinės uţdegimui, stomatitui, gingivitui, skaudant gerklę [5, 6]. Lapų nuoviras taip pat naudojamas egzemai gydyti [7, 9, 10].
Tyrimais in vitro įrodyta, jog dėl sudėtyje esančių elagotaninų, gervuogių lapų preparatai pasiţymi antiaterogeniniu, antitromboziniu, priešuţdegiminiu ir antiangiogeniniu poveikiu bei padeda palaikyti sveikas kraujagysles [27].
Yra duomenų, jog gervuogių vaisiai pasiţymi priešvėţinėmis savybėmis. Toks poveikis yra siejamas su vaisiuose esančių antocianinų ir kitų antioksidantų gebėjimu sunaikinti laisvuosius
radikalus, kurie gali įtakoti vėţio atsiradimą. Antioksidacinėmis savybėmis pasiţymintys junginiai taip pat stiprina imuninę sistemą ir tokiu būdu maţina vėţio riziką. Ypač veiksmingai maţina stemplės, gimdos kaklelio bei krūties vėţio riziką [28].
Ikiklinikinio tyrimo metu nustatytas galimas teigiamas poveikis sergant su amţiumi susijusiomis neurodegeneracinėmis ligomis, pavyzdţiui, Alzheimerio liga (Shukitt-Hale ir kt. 2009). Tyrimo metu pastebėta, jog įtraukus gervuogių vaisius į ţiurkių mitybą, pagerėja jų koordinacija ir pusiausvyra, taip pat pagerėja darbo našumas, trumpalaikė atmintis bei paţinimo savybės [77].
1.2 Antocianinų apibūdinimas, struktūra, biologinės savybės ir panaudojimas
1.2.1 Apibūdinimas
Antocianinai (gr. „anthos― – gėlė, „kyanos― – mėlynas) – tai raudonai mėlynų pigmentų grupė, priskiriama didelei polifenolinių junginių grupei – flavonoidams, kurie yra antriniai metabolitai, sintetinami aukštesniųjų augalų. [29, 30, 31]. Tai yra diţiausia flavonoidų grupė. Antocianinai daţniausia egzistuoja glikozidų pavidale, o jų aglikonai vadinami antocianidinais. Gamtoje yra randama daugiau nei 635 antocianinai, kurie suteikia augalams mėlyną, violetinę ir purpurinę spalvas. Augalų ţiedlapių spalva priklauso nuo ląstelių sulčių pH. Kintant sulčių reakcijai nuo rūgščios iki šarminės, antocianinai keičia spalvą nuo raudonos iki mėlynos. Antocianinai rūgščioje aplinkoje yra raudonos spalvos, neutralioje – violetinės, o šarminėje – mėlynos. [32, 31, 33].
1.2.2
Paplitimas augaliniame pasaulyje
Antocianinai yra sutinkami beveik visuose gaubtasėklių šeimos augaluose. Samanose, paparčiuose ir plikasėkliuose augaluose jų kiekis yra maţesnis. Kai kuriuose sausumos augaluose, pavyzdţiui, kaktusinių (Cactaceae), balandinių (Chenopodiaceae), dyvinutinių (Nyctaginaceae) ir fitolakinių (Phytolaccaceae) šeimų, antocianinai yra pakeisti betacianais. Augalų, turinčių antocianinų, ţiedų, vaisių ir lapų spalva įvairuoja nuo gelsvai rausvos ar raudonos iki tamsiai mėlynos ar violetinės spalvos. Antocianinai yra randami augalų vaisių odelėje, vaisių minkštime, šaknyse, šakniagumbiuose, svogūnuose, lapuose, lapkočiuose bei ţieduose. Didţiausias antocianinų kiekis yra randamas uogose ir vaisiuose. Daugiausia šių junginių nustatyta vynmedinių (Vitaceae) šeimos augaluose (vynuogėse), erškėtinių (Rosaceae) šeimos augaluose (slyvose, vyšniose, braškėse, avietėse, gervuogėse), erikinių (Ericaceae) šeimos augaluose (mėlynėse, spanguolėse, šilauogėse). Pagrindiniai antocianinai, randami
avietėse ir gervuogėse, yra cianidino dariniai. Cianidin-3-O-gliukozidas sudaro apie 80 proc. suminio antocianinų kiekio gervuogėse. Šilauogių ir mėlynių uogose vyrauja delfinidino-3-O- galaktozidas ir petunidino-3-O-gilukozidas, šeivamedţio uogose - sambubiozidas ir cianidino-3-O-gliukozidas, ţemuogėse - pelargonidino glikozidai. Antocianinai taip pat yra randami ir kitų šeimų augaluose: uolaskėlinių (Saxifragaceae) – raudonuosiuose ir juoduosiuose serbentuose, kryţmaţiedţių (Cruciferae) – raudonuosiuose kopūstuose, bulvinių (Solanaceae) – baklaţanuose [34, 35, 36, 37].
1.2.3 Cheminės struktūros ypatumai
Antocianinų glikozidus sudaro cukrinė dalis ir aglikonas (antocianidinas), kuris daţniausiai turi prisijungusias acilines grupes. Šie junginiai yra glikozilinti flavilio katijono dariniai. Antocianinų struktūros pagrindą sudaro C6-C3-C6 struktūrinis skeletas, sudarytas iš deguonį turinčio heterociklo pirano ţiedo, sujungto su benzeno ţiedu. Prie pirano ţiedo, antroje padėtyje, yra prisijungusi fenilo grupė, kuri gali turėti skirtingų radikalų (1 pav.) [38, 39].
1 pav. Bendra antocianinų struktūra [38]
Pagrindinė antocianinų dalis yra aglikonas (flavilio katijonas), turintis dvigubas jungtis. Aglikonai daţniausiai būna penta - (3, 5, 7, 3, 4) arba heksa - (3, 5, 7, 3, 4, 5) pakaitai. Didţiąją dalį visų antocianinų sudaro šie aglikonai: pelargonidinas (Pg), peonidinas (Pn), cianidinas (Cy), malvidinas (Mv), petunidinas (Pt) ir delfinidinas (Dp) (1 lentelė) [38, 40, 41].
1 lentelė. Antocianinų aglikonai [38] Pavadinimas R1 R2 Delfinidinas OH OH Petunidinas OCH3 H Cianidinas OH H Pelargonidinas H H Peonidinas OCH3 H
Malvidinas OCH3 OCH3
Daţniausiai sutinkamas aglikonas yra cianidinas. Glikozido molekulė antocianino struktūroje visada jungiasi trečioje aglikono ţiedo padėtyje, α arba β jungtimis. Antocianinai tarpusavyje skiriasi hidroksigrupių skaičiumi, cukraus, prisijungusio prie molekulės kiekiu ir kilme, su cukraus pakaito padėtimi bei kilme ir skaičiumi alifatinių arba aromatinių rūgščių, prisijungusių prie cukraus molekulėje [36]. Pagal prisijungusių cukraus molekulių kiekį, antocianinai skirstomi į monoglikozidus, diglikozidus ir triglikozidus. Daţniausiai antocianinai būna prisijungę gliukozę, ramnozę, galaktozę, arabinozę bei ksilozę. Nedidelėje dalyje antocianinų yra nustatyta gliukurono rūgštis [36, 39, 40].
Monoglikoziduose cukraus molekulės daţniausiai jungiasi prie aglikono per C-3 padėtyje esančią -OH grupę O-glikozidine jungtimi. Diglikoziduose - dvi cukraus molekulės prisijungusios A ţiedo 3 ir 5 arba 3 ir 7 padėtyse. Tai pat galimi atvejai, kai abi cukraus molekulės yra prisijungusios A ţiedo 3. Triglikoziduose cukraus molekulės prie aglikono prisijungusios taip, kad dvi iš jų yra prie C-3 ir viena prie C-5 arba C-7. Triglikozidai taip pat gali prie C-C-3 turėti linijinį arba šakotą grandinę iš trijų cukrų, kurie gali būti prisijungę 3,4 ir 5 padėtyse. Daţniausiai diglikoziduose ir triglikoziduose yra prisijungusi rutinozė, soforozė, sambubiozė bei gliukorutinozė [38, 39, 40].
Antocianinai gali būti acilinti. Daugiau kaip 65 proc. visų antocianinų savo struktūroje turi acilines grupes. Organinės rūgštys prie antocianinų jungiasi esterinėmis jungtimis. Antocianinų molekulės taip pat gali būti prisijungusios ir fenolines bei alifatines rūgštis. Didţioji dauguma gamtoje randamų antocianinų turi monomerinę struktūrą. Kovalentinėmis jungtimis susijungę su flavanoidų molekulėmis antocianinai yra vadinami dimeriniais. Metaloantocianinai – tai sudėtingi kompleksiniai junginiai, kurių molekulėję kovalentinėmis jungtimis yra prisijungę metalų jonai (Mg, Ni, Mo, Co, Zn ir kt.). Daţnai pasitaiko ir trivalenčių geleţies bei aliuminio jonų [42, 43, 44, 45, 46].
1.2.4 Fizikinės ir cheminės savybės
Antocianinai gerai tirpsta vandenyje. Jų tirpumas tiesiogiai priklauso nuo cukraus molekulių, prisijungusių prie aglikono, skaičiaus. Taip pat tirpsta alkoholiuose, netirpūs nepoliniuose organiniuose tirpikliuose. Stiprių rūgščių tirpaluose (pH < 3) - katijoninė forma yra stabili, raudonos spalvos. Silpnų rūgščių tirpaluose (pH 4 – 6) - katijonas netenka dviejų protonų ir virsta anhidrobaze. Ši forma yra stabili, mėlynos spalvos. Antocianinų stabilumas maţėja veikiant oksidatoriais, šviesa ir karščiu. Neutralioje ir šarminėje aplinkoje antocianinai yra nestabilūs. Antocianinų tirpalai yra labai nestabilūs ir turi būti laikomi tamsoje, ţemoje temperatūroje, azoto aplinkoje. Antocianinų stabilumą vandeniniuose tirpaluose didina šie faktoriai: acilo grupių skaičius (kuo didesnis, tuo stabilesni), antocianinų jungimasis tarpusavyje, antocianinų jungimasis su flavonoidais, jungimasis ar adsorbcija su sacharoze, proteinais, pektinais ir kitomis makromolekulėmis. Antocianinų stabilumą taip pat didina didelės koncentracijos angliavandenių tirpalai [47, 48, 49].
1.2.5 Farmakologinis poveikis
Antocianinai pasiţymi dideliu biocheminiu ir farmakologiniu aktyvumu. Yra nustatyta, jog jie slopina uţdegiminius procesus, apsaugo nuo virusų ir mikrobų bei pasiţymi antioksidaciniu poveikiu [50, 51]. Šie pigmentai maţina kraujagyslių sienelių paburkimą, inaktyvuoja trombocitų susidarymą, maţina sklerozės riziką, veikia kaip antioksidantai, kurie saugo ląsteles ir jų membranas nuo laisvųjų radikalų ţalingo poveikio.
Antocianinai gali būti vartojami širdies ir kraujagyslių ligų prevencijai. Teigiamas jų poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai yra siejamas su tuo, jog antocianinai geba veikti skirtingas ląsteles, kurios dalyvauja aterosklerotinių plokštelių formavimesi. Šių plokštelių susidarymas yra viena iš pagrindinių kardiovaskulinės sistemos sutrikimų prieţasčių. Tyrimų metu nustatyta, jog antocianinai slopina monocitų chemotaksio baltymo 1 (MCP-1), kuris tiesiogiai dalyvauja aterosklerotinių plokštelių susidaryme, sintezę endotelio ląstelėse ir sumaţina galimą aterosklerozės riziką [52].
Antocianinai gali būti vartojami cukrinio diabeto profilaktikai, kadangi maţina gliukozės koncentraciją kraujyje [31, 32]. Tyrimais įrodytas antocianinų antioksidacinis ir antiproliferacinis poveikiai [53].
Yra duomenų, jog antocianinai pasiţymi priešvėţiniu poveikiu [54, 55, 56, 57, 58, 59]. Šis poveikis yra siejamas su antocianinų antioksidacinėmis savybėmis. Atliktų tyrimų rezultatai parodė, jog cianidin-3-O-gliukozidas, išskirtas iš gervuogių, apsaugo Caco-2 ląsteles nuo peroksilo radikalų
sukeliamos apoptozės [59, 60]. Taip pat yra įrodyta, jog cianidin-3-O-rutinozidas skatina peroksidų, kurie sulekia HL-60 ląstelių apoptozę, akumuliaciją [51].
Tyrėjai Bowen-Forbes, Zhang, ir Nair 2010 metais ištyrė, jog antocianinai, kurie yra randami
Rubus genties vaisiuose, pasiţymi fermentą ciklooksigenazę (COX) slopinančiu poveikiu [61].
Nustatyta, jog antocianinai, esantys R. acuminatus Sm. vaisiuose, net 71 proc. slopina COX-2. Šio tyrimo metu taip pat buvo įrodytas antocianinų gebėjimas slopinti lipidų peroksidaciją (LPO). Rezultatai parodė, jog labiausiai LPO slopina R. jamaicensis L. ir R. acuminatus Sm. vaisių ekstraktai (74 ir 71 proc., atitinkamai).
2015 metais atlikto tyrimo rezultatai parodė, jog antocianinai pasiţymi antibakteriniu poveikiu [62]. Nustatyta, jog antocianinai savo veiksmingumu prieš E. coli ir S. typhi bakterijas prilygsta antibiotikams.
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – paprastųjų gervuogių (Rubus caesius L.), stačiųjų gervuogių (Rubus
nessensis H.) ir raukšlėtųjų gervuogių (Rubus plicatus W. et N.) vaisiai, surinkti 2011 metais iš
botanikos instituto kolekcijų ir gamtinių cenopopuliacijų. Norint įvertinti antocianinų kiekio kitimą gervuogių vaisių nokimo metu, vaisių ėminiai buvo renkami rugpjūčio ir rugsėjo mėnesiais, kas savaitę. Siekiant įvertinti antocianinų sudėties įvairavimą, gervuogių vaisių pavyzdţiai buvo renkami keliuose Lietuvos regionuose: Obelijos k. (Alytaus r.), Mankūnų (Alytaus r.), Grūto parke (Druskininkai), Galgių (Vilniaus r.), Nemunaičio (Alytaus r.), Balkasodţio (Alytaus r.) (2 pav.). Vaisiai buvo uţšaldyti ir laikyti -18 – (-20) ºC temperatūroje iki tyrimo pradţios.
2.2 Naudoti reagentai
1. Etanolis (96 proc.) – UAB „Stumbras― (Lietuva); 2. Etanolis (50 proc.) - UAB „Stumbras― (Lietuva); 3. Metanolis - „Sigma-Aldrich‖ (Vokietija);
4. ACN - „Sigma-Aldrich‖ (Vokietija);
5. Fosforo rūgštis (4 proc.) – „Sigma-Aldrich‖ (Vokietija);
6. 0,1 proc. (v/v) HCl tirpalas metanolyje - „Sigma-Aldrich‖ (Vokietija);
2.3 Naudoti antocianinų standartai
1. 93 proc. grynumo (HPLC) kalistefinas (pelargonidin-3-O-gliukozidas) - „Sigma-Aldrich― (Buchs, Šveicarija);
2. ≥98 proc. grynumo (HPLC) keracianinas (cianidin-3-O-rutinozidas) - „Sigma-Aldrich― (Buchs, Šveicarija);
3. 95 proc. grynumo (HPLC) kuromaninas (cianidin-3-O-gliukozidas) - „Sigma-Aldrich― (Buchs, Šveicarija);
4. 95 proc. grynumo (HPLC) pelargoninas (pelargonidin-3,5-di-O-gliukozidas) - „ABCR GmbH― (Vokietija);
5. ≥97 proc. grynumo (HPLC) ideinas (cianidin-3-O-galaktozidas) - „Sigma-Aldrich― (Buchs, Šveicarija).
2.4 Naudota aparatūra
1. Waters 2690 chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV); 2. 996 PDA ir 2487 UV detektoriai (Waters, Milford, JAV) ;
3. 125x4 mm, 5 μm atvirkštinių fazių ESC kolonėlė (Lichrosher 100 RP-18e); 4. Analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE‖, Vokietija);
5. Mikropipetės („Eppendorf Research‖, JAV); 6. Matavimo kolbos;
7. Grūstuvė;
9. Membraninis, 0,22 μm porų dydţio filtras (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija); 10. Spektrofotometras (Beckman DU – 70, 4273041, „Beckman Instruments‖, JAV); 11. Mechaninė purtyklė (Laboratory shaker 358S, Lenkija).
2.5 Ekstraktų ruošimo metodika
Apie 50 g šaldytų gervuogių vaisių sutrinama grūstuvėje. Tuomet pasveriama 5 g gautos masės, pripilama 95 ml metanolio ir 30 minučių purtoma mechaninėje purtyklėje. Gautas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą į 100 ml matavimo kolbutę, filtras praplaunamas metanoliu, kuriuo matavimo kolba pripildoma iki 100 ml ţymės.
2.6 Antocianinų tapatybės ir kiekybės nustatymo metodika
Antocianinų kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatoma efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Pamatuojama 2 ml gauto ekstrakto, skiedţiama metanoliu santykiu 1:10 ir filtruojama pro membraninį, 0,22 μm porų dydţio filtrą (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Vokietija). 20 μl skiesto ekstrako yra injektuojama į atvirkštinių fazių ESC kolonėlę Lichrosher 100 RP-18e, dalelių dydis 5 μm, kolonėlės diametras 125x4 mm. Eliuentų tėkmės greitis 1ml/min. Taikytas gradientinis eliuavimas. Eliuentas A – ACN, eliuentas B – 4 proc. fosforo rūgštis (H3PO4). Eliuacijos gradiento kitimas pateiktas 3 lentelėje.
3 lentelė. Eliuacijos gradiento kitimas
Laikas ACN (A) (%) Fosforo rūgštis (B) (%)
0 min 7 93
37 min 22 78
40 min 7 93
45 min 7 93
Analizė atliekama kambario temperatūroje. Bendras analizės laikas – 45 min. Matavimams atlikti naudojamas Waters2690 skysčių chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV), sujungtas su 996 PDA ir 2487 UV detektoriais. Detekcija atliekama esant 520 nm bangos ilgiui. Antocianinų tapatybė buvo nustatyta lyginant analičių sulaikymo trukmes su standartų sulaikymo trukmėmis ir
spektrais, gautais su PDA detektoriumi. Antocianinų kiekis apskaičiuotas lyginant analičių smailių plotus su antocianinų standartų smailių plotais.
2.7 Antocianinų kiekybinis nustatymas spektrofotometriniu metodu
Nustatant antocianinų kiekybę spektrofotometriniu metodu, gervuogių vaisių ekstraktai skiedţiami 0,1 proc. (v/v) druskos rūgšties tirpalu metanolyje 50 kartų. Lyginamuoju tirpalu naudojamas 0,1 proc. (v/v) druskos rūgšties tirpalas metanolyje. Remiantis Europos farmakopėja, tirpalų absorbcija yra matuojama esant 528 nm bangos ilgiui. Procentinis antocianinų kiekis, išreikštas cianidin – 3 – gliukozido chloridu, apskaičiuojamas naudojant šią formulę:
,
kur: A – tiriamojo tirpalo absorbcija esant 528 nm bangos ilgiui, m – tiriamos medţiagos masė (g), 718 – cianidin – 3 – gliukozido chlorido absorbcija esant 528 nm bangos ilgiui [73].
2.8 Nuodţiūvio nustatymas gervuogių vaisiuose
Ţaliavos nuodţiūvis yra nustatomas augalinę ţaliavą dţiovinant iki pastovios masės ir išreiškiamas masės procentais (m/m).
Analizinei atlikti skirtas augalinės ţaliavos mėginys susmulkinamas. Iš anksto iki pastovios masės dţiovinimo spintoje išdţiovintuose ir pasvertuose biuksuose atsveriami trys augalinės ţaliavos svėriniai (± 0,001 g tikslumu). Ţaliava dţiovinama 100 – 105 ºC temperatūroje iki pastovios masės. Dţiovinimo pradţia - tai laikas, kai temperatūra dţiovinimo spintoje pasiekia 100 - 105 ºC ir nebekinta. Pirmą kartą augalinės ţaliavos mėginys sveriamas po 3 valandų. Pastovi masė yra nustatoma tuomet, kai du paskutiniai svėrimai, praėjus 30 min po dţiovinimo spintoje ir dar 30 min po vėsinimo eksikatoriuje, skiriasi ne daugiau kaip ± 0,001g. Augalinės ţaliavos nuodţiūvis (proc.) apskaičiuojamas remiantis šia formulę:
kur: m - ţaliavos masė (g) prieš dţiovinimą, m1 – ţaliavos masė (g) po dţiovinimo [74].
Galutinis rezultatas yra trijų lygiagrečių svėrimo rezultatų aritmetinis vidurkis, apskaičiuojamas dešimtųjų procento dalių tikslumu . Nuokrypis tarp vienu metu atliekamų vaistinės augalinės ţaliavos nuodţiūvio tyrimų negali būti didesnis nei ± 0,5 proc. Visi rezultatai paskaičiuoti absoliučiai sausai ţaliavai.
2.9 Statistinis duomenų įvertinimas
Gauti tyrimų rezultatai apdoroti naudojant Microsoft Excel 2010 programą. Šios programos pagalba susisteminti duomenys, apskaičiuoti vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, statistinis reikšmingumas ir nubraiţyti grafikai.
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Norint įvertinti gervuogių vaisių farmakologinį efektyvumą, būtina atlikti augalinės ţaliavos analizę bei įvertinti veikliųjų medţiagų (antocianinų) kokybinę ir kiekybinę sudėtį. Šiems tyrimams atlikti daţniausiai naudojami šie metodai: ESC, UV ir IR spektroskopija, BMR spektroskopija, masių spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija [63]. Šiuo atveju pasirinkta būtent ESC, kadangi tai yra labai tikslus ir informatyvus metodas. Nuolatinis metodo tobulinimas leidţia naudoti maţesnius augalinės ţaliavos kiekius bei uţtikrina tikslesnius rezultatus. Šio metodo pagalba galima atlikti termiškai nestabilių junginių analizę. Tai yra didelis privalumas atliekant antocianinų tyrimą, kadangi dauguma šių junginių yra nestabilūs aukštos temperatūros, deguonies ir pH poveikyje [65].
3.1 Kokybinis antocianinų nustatymas R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R.
nessensis H. vaisiuose
Antocianinų tapatybė R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. vaisiuose buvo nustatyta ESC metodo pagalba. Tyrimui atlikti buvo naudojami antocianinų standartai: pelargonidin-3-O-glikozidas (kalistefinas), cianidin-3-O-rutinozidas (keracianinas), cianidin-3-O-gliukozidas
(kuromaninas), pelargonidin-3,5-di-O-gliukozidas (pelargoninas) ir cianidin-3-O-galaktozidas (ideinas). Šių junginių chromatograma pavaizduota trečiame paveiksle:
3 pav. Antocianinų standartų chromatograma. 1 - pelargonidin-3,5-di-O-gliukozidas, 2 - cianidin-3-O-galaktozidas, 3 -cianidin-3-O-gliukozidas, 4 - cianidin-3-O-rutinozidas, 5 -
pelargonidin-3-O-glikozidas
Antocianinų tapatybė buvo nustatyta lyginant analičių sulaikymo trukmes su standartų sulaikymo trukmėmis (4 lentelė) ir junginių spektrus, gautus su PDA detektoriumi.
4 lentelė. Antocianinų standartų sulaikymo trukmės
Antocianinų standarto pavadinimas Sulaikymo trukmė
Pelargonidin-3,5-di-O-gliukozidas 17.58
Cianidin-3-O-galaktozidas 18.12
Cianidin-3-O-gliukozidas 19.78
Cianidin-3-O-rutinozidas 21.59
Pelargonidin-3-O-glikozidas 22.45
R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. vaisių ekstraktų chromatogramos
4 pav. R. caesius L. vaisių ekstrakto chromatograma. 1 - gliukozidas, 2 - cianidin-3-O-rutinozidas
5 pav. R. plicatus W. et N. vaisių ekstrakto chromatograma. 1 - cianidin-3-O-gliukozidas, 2 - cianidin-3-O-rutinozidas
6 pav. R. nessensis H. vaisių ekstrakto chromatograma. 1 - O-gliukozidas, 2 - cianidin-3-O-rutinozidas
Iš gautų chromatogramų nustatyta, jog visose tirtose gervuogių rūšyse dominuoja du antocianinai: cianidin-3-O-gliukozidas bei cianidin-3-O-rutinozidas (dvi pirmosios smailės).
Panašus tyrimas buvo atliktas 2006 metais, kurio metu buvo tiriama juodųjų aviečių (Rubus
occidentalis L.) antocianinų tapatybė [64]. ESC metodo pagalba R. occidentalis L. vaisiuose nustatyti
penki antocianinai: gliukozidas (kuromaninas), sambubiozidas, cianidin-3-ksilozilrutinozidas, cianidin-3-rutinozidas (keracianinas) ir pelargonidin-3-rutinozidas.
Palyginus abiejų tyrimų rezultatus, galima daryti išvadą, jog R. occidentalis L. rūšies vaisiuose antocianinų įvairovė yra didesnė negu R. caesius L., R. nessensis H. ir R. plicatus W. et N. Iš atliktų tyrimų duomenų taip pat matyti, jog visų rūšių vaisiuose dominuojantys antocianinai yra cianidino dariniai. Būtent šie junginiai suteikia vaisiams violetinę spalvą [66].
Dar vienas tyrimas buvo atliktas 2004 metais, kurio metu ESC metodu buvo nustatyti antocianinai, esantys R. alleghaniensis Porter ex L. H. Bailey vaisiuose [67]. Šios rūšies gervuogėse identifikuoti šie antocianinai: cianidin-3-gliukozidas, cianidin-3-rutinozidas, cianidin-3-ksilozidas, cianidin-3-malonilgliukozidas, cianidin-3-dioksalilgliukozidas.
Lenkų mokslininkai 2009 metais ištyrė laukinių gervuogių (R. adenotrichus Schltdl. ir R.
glaucus Benth.) vaisiuose esančių antocianinų sudėtį [68]. Tyrimo metu nustatyta, jog pagrindinis
antocianinas vyraujantis šių gervuogių vaisiuose yra cianidin-3-O-gliukozidas. Tirtuose vaisiuose taip pat nustatyti šie antocianinai: cianidin-3-ksilozidas, malvidin-3-gliukozidas, malvidin-3-ksilozilgliukozidas.
Atsiţvelgiant į atliktų tyrimų rezultatus, galima teigti, jog pagrindiniai antocianinai, randami įvairių rūšių gervuogių vaisiuose, yra cianidin-3-gliukozidas ir cianidin-3-rutinozidas. Taip pat randami ksilozės ir cianidino dariniai bei acilinti malono rūgšties ir cianidino junginiai [69].
3.2 Antocianinų kiekio nustatymas R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R.
nessensis H. vaisiuose
Šiam tyrimui atlikti R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. gervuogių vaisiai buvo surinkti iš botanikos instituto kolekcijų Vilniuje. Visų rūšių vaisiai buvo renkami tuo pačiu metu, kiekvieną savaitę nuo jų derėjimo pradţios. Gervuogių ekstraktai buvo ruošiami tomis pačiomis sąlygomis ir tiriami ESC metodu, nustatant kiekybinę antocianinų sudėtį. Paskaičiuoti kiekvienos gervuogių rūšies mėginių rezultatų vidurkiai. Gauti rezultatai vaizduojami septintame paveiksle:
7 pav. Antocianinų kiekinė sudėtis skirtingų rūšių gervuogių vaisiuose
Iš gautų rezultatų matyti, jog R. caesius L. rūšies vaisiai yra ţymiai turtingesni tiek cianidin-3-O-gliukozido, tiek cianidin-3-O-rutinozido kiekiu negu R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. Bendras vidutinis cianidin-3-O-gliukozido ir cianidin-3-O-rutinozido kiekis R. caesius L. vaisiuose siekia 2,455
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500
R. caesius L. R. plicatus W. et N. R. nessensis H.
A n to ci an in ų k ie ki s (p ro c. ) Gervuogių rūšis Cianidin-3-O-gliukozidas Cianidin-3-O-rutinozidas
± 0,767 proc. (sausos ţaliavos masės), R. plicatus W. et N. – 1,586 ± 0,322 proc., R. nessensis H. – 1,49 ± 0,321 proc. Tyrimo metu gauti duomenys galėtų būti naudojami kaip cheminiai ţymenys norint nustatyti gervuogių rūšį.
Panašaus pobūdţio tyrimas buvo atliktas 2010 metais, kurio metu buvo nustatytas antocianinų kiekis, esantis R. jamaicensis L. (Jamaikos gervuogė), R. rosifolius Sm. (raudonoji avietė), R. racemosus Roxb. (juodoji avietė), R. acuminatus Sm. (juodoji avietė) ir R. idaeus L. (avietė) vaisiuose [70]. Tyrimo rezultatai parodė, jog didţiausias suminis antocianinų kiekis yra randamas R. acuminatus Sm. rūšies uogose, o maţiausias – R. rosifolius Sm. uogose.
Abu atlikti tyrimai papildo vienas kitą, kadangi buvo atliekami su tos pačios genties atstovais ir naudojant tą patį metodą. Palyginus abiejų tyrimų rezultatus, akivaizdu, jog R. jamaicensis L., R.
racemosus Roxb. ir R. acuminatus Sm. vaisiuose esantis cianidin-3-gliukozido kiekis yra panašus į R.
caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. vaisių kaupiamą cianidin-3-gliukozido kiekį. Iš gautų
rezultatų taip pat matyti, jog cianidin-3-rutinozido kiekis, esantis juodųjų aviečių vaisiuose yra artimas cianidin-3-rutinozido kiekiui, kuris randamas tirtose gervuogių rūšyse.
Remiantis abiejų tyrimų metu gautais duomenimis galima daryti išvadą, jog gervuogėse ir juodosiose avietėse esantis antocianinų kiekis yra ţenkliai didesnis negu avietėse.
3.3 Antocianinų kiekio kitimo dinamika vaisių nokimo metu
Norint įvertinti antocianinų kiekio kitimo dinamiką vaisių nokimo metu, R. caesius L. rūšies gervuogių ėminiai buvo surinkti Obelijos k. (Alytaus r.). Vaisiai buvo renkami toje pačioje augavietėje, kiekvieną savaitę, nuo rugpjūčio mėnesio pradţios iki rugsėjo vidurio. Visų surinktų ėminių ekstraktai buvo ruošiami taikant tą pačią metodiką. Kiekvienas bandinys buvo tiriamas efektyviosios ESC metodu, nustatant kiekybinę antocianinų sudėtį. Gauti rezultatai yra vaizduojami aštuntame paveiksle:
8 pav. Antocianinų kiekio kitimo dinamika gervuogių vaisių nokimo metu
Rezultatai rodo, jog nokstant gervuogių vaisiams, tiek O-gliukozido, tiek cianidin-3-O-rutinozido kiekis palaipsniui didėja. Iš gautų rezultatų aiškiai matyti, jog didţiausias antocianinų kiekis gervuogėse buvo ketvirtąją ėminių rinkimo savaitę, vėliau jų kiekis ėmė maţėti. Nokimo pradţioje R. caesius L. vaisiuose esantis cianidin-3-O-gliukozido kiekis siekė 3,456 ± 0,608 proc. Šis kiekis statistiškai reikšmingai (p < 0,05) padidėjo iki 3,923 ± 0,639 proc. ketvirtąją rinkimo savaitę. Tuo tarpu cianidin-3-O-rutinozido kiekis nokimo pradţioje siekė 0,889 ± 0,191 proc., o ketvirtąją ėminių rinkimo savaitę – 1,350 ± 0,251 proc. (p < 0,05). Bendras gliukozido ir cianidin-3-O-rutinozido kiekis nuo vaisių nokimo pradţios iki ketvirtosios rinkimo savaitės padidėjo 17,6 proc.
Panašus tyrimas buvo atliktas 2009 metais. Jo metu buvo tiriamas antocianinų kiekio kitimas skirtinguose tropinių gervuogių (Rubus adenotrichus Schltdl.), augančių Kosta Rikoje, brendimo etapuose [71]. Antocianinų kiekis buvo vertinamas ESC metodu, trijų brendimo etapų, priklausančių nuo vaisių spalvos, metu: 1 etapas – uogos šviesiai raudonos spalvos, 2 etapas – violetinės spalvos, 3 etapas – tamsiai melsvai violetinės spalvos. Rezultatai parodė, jog antocianinų kiekis vaisiuose didėja jiems nokstant. O didţiausias antocianinų kiekis buvo nustatytas trečiojo brendimo etapo metu, kai vaisių spalva yra intensyviausia.
Kito tyrimo metu, mokslininkai Siriwoharn, Wrolstad, Finn ir Pereira nustatė, jog bendras antocianinų kiekis gervuogių vaisiuose nuo jų nokimo pradţios iki techninės brandos padidėjo nuo 0,075
0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000 4.500 08 06 08 15 08 23 08 30 09 10 A n to ci an in ų k ie ki s (%) Rinkimo data Cianidin-3-O-gliukozidas Cianidin-3-O-rutinozidas
± 0,011 proc. iki 0,317 ± 0,035 proc. (Marion atmaina) ir nuo 0,070 ± 0,011 proc. iki 0,164 ± 0,012 proc. (Evergreen atmaina) [72]. Rezultatai paskaičiuoti švieţiai ţaliavai.
Remiantis atliktų tyrimų rezultatais, galima daryti bendrą išvadą, jog nokstant gervuogių vaisiams, antocianinų kiekis juose didėja, kadangi intensyvėja vaisių spalva. Vertingiausia gervuogių vaisių augalinė ţaliava yra surinkta ketvirtąją vaisių nokimo savaitę, kadangi tuo metu vaisiai yra sukaupę didţiausią antocianinų kiekį. Vėliau antocianinų kiekis gervuogių vaisiuose maţėja. Tam įtakos gali turėti nepalankios meteorologinės sąlygos (pvz., gausūs krituliai), kurios skatina antocianinų skilimą, kadangi vaisiuose prasideda rūgimo procesas [75].
3.4 Antocianinų kiekio nustatymas skirtingose Lietuvos vietovėse augančių
gervuogių vaisiuose
Šis tyrimas buvo atliktas su R. caesius L. ir R. nessensis H. rūšių gervuogių vaisiais, kurie buvo surinkti iš kelių skirtingų Lietuvos regionų. Antocianinų kiekis mėginiuose buvo nustatytas ESC ir spektrofotometrinio metodų pagalba. ESC metodu buvo nustatyti O-gliukozido ir cianidin-3-O-rutinozido kiekiai, esantys R. caesius L. vaisiuose, o taikant spektrofotometrijos metodą – bendras antocianinų kiekis, esantys R. caesius L. ir R. nessensis H. vaisiuose. Rezultatai, gauti ESC metodo pagalba, vaizduojami devintame paveiksle:
9 pav. Antocianinų kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos vietovėse surinktuose gervuogių vaisių ėminiuose 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000
Obelija Mankūnai Nemunaitis Balkasodis
A n to ci an in ų k ie ki s (p ro c. ) Rinkimo vieta Cianidin-3-O-gliukozidas Cianidin-3-O-rutinozidas
Didţiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis nustatytas gervuogėse, surinktose Balkasodţio kaime, Alytaus rajone (3,234 ± 0,448 proc.). Toliau atitinkami seka Obelija (2,994 ± 0,489 proc.), Mankūnai (2,788 ± 0,359 proc.), o maţiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis nustatytas Nemunaityje augančiose gervuogėse (2,166 ± 0,345 proc.). Didţiausias cianidin-3-O-rutinozido kiekis nustatytas gervuogėse, augančiose Balkasodyje (0,932 ± 0,203 proc.), toliau seka Mankūnai (0,768 ± 0,198 proc.), Nemunaitis (0,642 ± 0,176 proc.) ir Obelija (0,558 ± 0,146 proc.).
Bendras šių antocianinų kiekis gervuogių vaisiuose, nustatytas ESC metodu, svyruoja nuo 2,809 ± 0,474 proc. iki 4,166 ± 0,555 proc.
Rezultatai, gauti spektrofotometriniu metodu, vaizduojami dešimtame paveiksle:
10 pav. Bendro antocianinų kiekio įvairavimas skirtingose Lietuvos vietovėse surinktuose gervuogių vaisių ėminiuose
Iš gautų rezultatų matyti, jog bendras antocianinų kiekis R. caesius L. vaisiuose vidutiniškai svyruoja nuo 2,258 ± 0,452 proc. iki 3,867 ± 0,493proc., o R. nessensis H. vaisiuose – nuo 3,081 ± 0,540 proc. iki 3,768 ± 0,589 proc. Didţiausias antocianinų kiekis nustatytas Balkasodyje augančiose R.
caesius L. rūšies gervuogėse (3,867 ± 0,493 proc.), o maţiausias – Nemunaityje (2,258 ± 0,452 proc.).
Panašaus pobūdţio tyrimas buvo atliktas 2005 metais, kurio metu buvo tiriamas antocianinų kiekis gervuogių vaisiuose, augančiose skirtinguose Meksikos ir Jungtinių valstijų regionuose [76]. Vaisių ėminiai buvo renkami pavasarį ir rudenį. Tyrimo metu nustatyta, jog antocianinų kiekis
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 Obelija Mankūnai Nemunaitis Balkasodis Grūtas Galgiai
Bendras antocianinų kiekis mėginyje (proc.)
G erv u o gi ų va is ių ė m in ių ri n ki m o vi et a R. nessensis R. caesius
gervuogėse labiau priklauso nuo augimo sezono ir augalo genotipo negu nuo augimo regiono. Antocianinų kiekis skirtinguose regionuose surinktuose gervuogių ėminiuose skyrėsi neţymiai.
Sugretinus atliktų tyrimų rezultatus, galima daryti išvadą, jog geografiniai rodikliai gali turėti įtakos antocianinų kiekiui gervuogių vaisiuose, tačiau daug labiau antocianinų kiekį įtakoja augalo genetiniai faktoriai.
4. IŠVADOS
1. Atlikus R. caesius L., R. plicatus W. et N. ir R. nessensis H. vaisių kokybinę analizę ESC metodu, nustatyta, jog visų trijų gervuogių rūšių vaisiuose dominuoja du pagrindiniai antocianinai: cianidin-3-O-gliukozidas (kuromaninas) ir cianidin-3-O-rutinozidas (keracianinas).
2. Ištyrus skirtingų gervuogių rūšių kiekybinę sudėtį, paaiškėjo, jog didţiausias antocianinų kiekis yra
R. caesius L. vaisiuose. Cianidin-3-O-gliukozido kiekis šiuose vaisiuose siekia 1,953 ± 0,452 proc.,
o cianidin-3-O-rutinozido – 0,502 ± 0,102 proc. Maţiausias antocianinų kiekis nustatytas R.
nessensis H. vaisiuose, kuriuose yra 1,214 ± 0,225 proc. cianidin-3-O-gliukozido ir 0,276± 0,063
proc. cianidin-3-O-rutinozido.
3. Įvertinus antocianinų kiekio kitimo dinamiką gervuogių vaisių nokimo metu, nustatyta, jog nokstant vaisiams, antocianinų kiekis juose ţenkliai didėja (p<0,05). Didţiausias antocianinų kiekis gervuogių vaisiuose nustatytas ketvirtąją rinkimo savaitę. Cianidin-3-O-gliukozido kiekis juose siekia 3,923 ± 0,639 proc., o cianidin-3-O-rutinozido - 1,350 ± 0,251 proc. Nuo vaisių nokimo pradţios iki ketvirtosios ėminių rinkimo savaitės antocianinų kiekis gervuogių vaisiuose iš viso padidėjo 17,6 proc. Vėliau antocianinų kiekis ėmė maţėti.
4. Nustatyta, jog R. caesius L. gervuogių rūšies vaisiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos augaviečių, cianidin-3-O-gliukozido kiekis svyruoja nuo 2,166 ± 0,345 proc. iki 3,234 ± 0,448 proc. Tuo tarpu cianidin-3-O-rutinozido kiekis – nuo 0,558 ± 0,146 proc. iki 0,932 ± 0,203 proc. Didţiausias cianidin-3-O-gliukozido ir cianidin-3-O-rutinozido kiekis nustatytas Balkasodţio kaime (Alytaus r.) augančių gervuogių vaisiuose (3,234 ± 0,448 proc. ir 0,932 ± 0,203 proc. atitinkamai). Maţiausias cianidin-3-O-gliukozido kiekis nustatytas Nemunaityje augančiose gervuogėse (2,166 ± 0,345 proc.), o cianidin-3-O-rutinozido – Obelijoje augančių gervuogių vaisių ėminiuose (0,558 ± 0,146 proc.).
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktų tyrimų duomenimis, kaip vaistinę augalinę ţaliavą rekomenduojama vartoti
R. caesius L. vaisius, surinktus ketvirtąją jų nokimo savaitę, kadangi juose nustatytas didţiausias
antocianinų kiekis.
Norint įvertinti antocianinų kiekio gervuogių vaisiuose priklausomybę nuo augalo augimo vietos tikslinga atlikti išsamesnius tyrimus.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Bone K, Mills S. Principles and Practice of Phytotherapy. Modern Herbal Medicine. 2nd ed. Edinburgh; 2013. P. 17-18.
2. Boivin D, Blanchette M, Barrette S, Moghrabi A, Beliveau R. Inhibition of cancer cell proliferation and suppression of TNF-induced activation of NFkB by edible berry juice. Anticancer Research 2007;27:937–948.
3. Pantelidis GE, Vasilakakis M, Manganaris GA, Diamantidis Gr. Antioxidant capacity, phenol, anthocyanin, and ascorbic acid contents in raspberries, blackberries, red currants, gooseberries and Cornelian cherries. Food Chemistry 2007;102:777–783.
4. Tulio Jr AZ, Reese RN, Wyzgoski FJ, Rinaldi PL, Fu R, Scheerens JC, Miller AR. Cyanidin 3-rutinoside and cyanidin 3-xylosyl3-rutinoside as primary phenolic antioxidants in black raspberry. Journal of Agriculture and Food Chemistry 2008;56:1880–1888.
5. Cloverleaf Farm, Inc; c2014. [Ţiūrėta 2015 04 11]. cloverleaffarmherbs.com [Internet] Available from: http://www.cloverleaffarmherbs.com/blackberry/#sthash. 0×JqXObG.dpbs
6. Seeram NP. Berry fruits: Compositional elements, biochemical activities and the impact of their intake on human health, performance, and disease. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2008;56:627–629.
7. Sasnauskas V. Miško vaistiniai augalai. Vilnius; 2006. p. 123-128.
8. Hager TJ, Howard LR, Liyanage R, Lay JO, Prior RL. Ellagitannin composition of blackberry as determined by HPLC-ESI-MS and MALDI-TOF-MS. J. Agric. Food Chem. 2008;56:661–669. 9. Kaume L, Howard LR, Devareddy L. The Blackberry Fruit: A Review on Its Composition and
Chemistry, Metabolism and Bioavailability, and Health Benefits. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2012;60:5716–5727.
10. Internetinė prieiga:
https://books.google.lt/books?id=M8AQUwNr5u8C&pg=PA218&dq=rubus+caesius&hl=lt&sa=X& ei=Pg-xVK_hKMKvU_SGgeAN&ved=0CEoQ6AEwBg#v=onepage&q=rubus%20caesius&f=false. 11. Lietuvos TSR flora IV. Rubus pogentė. Vilnius; 1971. p. 112-7.
12. Kaunienė V, Kaunas E. Vaistingieji augalai. Kaunas; 1991. p. 129-131. 13. Vasiliauskas J. Gamtos vaistinė. Vilnius; 2011. p. 208-210.
14. Vasiliauskas J. Augalai ir sveikata. Vilnius; 1991. p. 211-213.
15. Clarence Valley Council, Inc; 2014. [Ţiūrėta 2015 03 14]. clarence.nsw.gov.au [Internet] Available from: http://www.clarence.nsw.gov.au/content/uploads/Blackberry.pdf .
16. Parsons WT. Noxious Weeds of Australia. 2nd ed. Collingwood: CSIRO Publishing; 2001. Noxious weed legislation in Australia-Family Rosaceae; p. 578. Prieiga per internetą:
< http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=RUC>.
17. Live and Feel, Inc; c2014. [Ţiūrėta 2015 04 10]. liveandfeel.com [Internet] Available from:http://www.liveandfeel.com/vegetables/blackberry.htm.
18. Pazmiño-Durán AE, Giusti MM, Wrolstad RE, Glória BA. Anthocyanins from oxalis triangularis as potential food colorants. Food Chemistry 2001;75(2):211–216.
19. Internetinė prieiga:
https://books.google.lt/books?id=c4KuB3iGmbwC&pg=PA562&dq=rubus+caesius+anthocyanins&
hl=lt&sa=X&ei=cT-xVI2nIomsU5iKhPAN&ved=0CCwQ6AEwAg#v=onepage&q=rubus%20caesius%20anthocyanins &f=false.
20. Sellappan S, Akoh CC, Krewer G. Phenolic compounds and antioxidant capacity of Georgia-grown blueberries and blackberries. J Agric Food Chem. 2002;50:2432–8.
21. Nast C. Nutrition facts for raw blackberries. 2012; [Internet] Nutritiondata.com.
22. Maţeikių krašto gamta. Sud.: V. Malinauskas, J. Augustauskas, A. Mikuta. - V., 2000. - 128 p. - p. 116.
23. Martini S, Addario CD, Colacevich A, Focardis, et al. Antimicrobial activity against Helicobacter
pylori strains and antioxidant properties of blackberry leaves (Rubus ulmifolius) and isolated
compounds. Int J Antimicrob Ag. 2009;34:50–9.
24. Oszmiański J, Wojdyło A, Nowicka P, Teleszko M, Cebulak T, Wolanin M. Determination of Phenolic Compounds and Antioxidant Activity in Leaves from Wild Rubus L. Species. Molecules 2015;20:4951-4966.
25. altnature.com [Internet]. Blackberry Herbal Use and Medicinal Properties. [Ţiūrėta 2015 04 10]. Available from: http://www.altnature.com/gallery/Blackberry.htm.
26. Martini S, D‘Addario C, Colacevich A, Focardi S, Borghini F, Santucci A, Figura N, Rossi C. Antimicrobial activity against Helicobacter pylori strains and antioxidant properties of blackberry leaves (Rubus ulmifolius) and isolated compounds. Int. J. Antimicrob. Agents 2009;34:50–59.
27. Larrosa M, García-Conesa MT, Espín JC, Tomás-Barberán FA. Ellagitannins, ellagic acid and vascular health. Mol. Asp. Med. 2010; 31:513–539.
28. Wang SY, Lin HS. Antioxidant activity in fruits and leaves of blackberry, raspberry, and strawberry varies with cultivar and developmental stage. J Agric Food Chem. 2000;48:140–6.
29. Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF, Brouillard R. Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochemistry 2003;64:923–933.
30. Andersen ØM, Jordheim M. Anthocyanins—food applications. Presented at Proc. 5th Int. Congr. Pigments Foods: For Quality and Health, 2008; Helsinki, Finl.
31. He J, Giusti MM. High-purity isolation of anthocyanins mixtures from fruits and vegetables— A novel solid-phase extraction method using mixed mode cation-exchange chromatography. J. Chromatogr. A 2011;1218:7914–7922.
32. Delgado-Vargas F, Paredes-Lopez O. Anthocyanins and betalains. In Natural Colorants for Food and Nutraceutical Uses, eds. F Delgado-Vargas, O Paredes-Lopez, 2003. p. 167–219. Boca Raton, FL: CRC Press.
33. Shahidi F, Naczk M. Contribution of phenolic compounds to flavor and color characteristics of foods. In Phenolics in Food and Nutraceuticals, eds. F Shahidi,MNaczk, 2004. p. 443–61. Boca Raton, FL: CRC Press.
34. Eder R. Pigments. In Food Analysis by HPLC, ed. LML Nollet, Monticello, NY: Marcel Dekker; 2000. p.845–80.
35. Kong JM, Chia LS, Goh NK, Chia TF, Brouillard R. Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochemistry 2003;64:923–33.
36. Wu X, Beecher GR, Holden JM, Haytowitz DB, Gebhardt SE, Prior RL. Concentrations of anthocyanins in common foods in the United States and estimation of normal consumption. J. Agric. Food Chem. 2006;54:4069–75.
37. Hou DX, Kai K, Li JJ, Lin S, Terahara N, Wakamatsu M, Fujii M, Young MR, Colburn N. Anthocyanidins inhibit activator protein 1 activity and cell transformation: structure-activity relationship and molecular mechanisms. Carcinogenesis. 2004;25:29–36.
38. Amr A, Al-Tamimi E. Stability of the crude extracts of Ranunculus asiaticus anthocyanins and their use as food colourants. International Journal of Food Science and Technology 2007;42:985–991. 39. Sakata K, Saito N, Honda T. Ab initio study of molecular structures and excited states in
anthocyanidins. Tetrahedron 2006;62(15):3721–3731.
40. Castañeda-Ovando A, Ma. de Lourdes Pacheco-Hernández, Ma. Elena Páez-Hernández, José A. Rodríguez, Carlos Andrés Galán-Vidal. Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chemistry 2009;113:859–871.
41. Kazlauskienė D, Ivanauskas L, Marksienė R. Chromatografiniai analizės metodai. Kaunas; 2008. p. 6-10.
42. Brownmiller C, Howard LR, Prior R L. Processing and storage effects on monomeric anthocyanins, percent polymeric colour, and antioxidant capacity of processed blueberry products. Journal of Food Science 2008;5(73).
43. Aurelio DL, Edgardo RG, Navarro-Galindo S. Thermal kinetic degradation of anthocyanins in a roselle (Hibiscus sabdariffa L. cv. ‗Criollo‘) infusion. International Journal of Food Science and Technology 2008;43:322-325.
44. Rein M. Copigmentation reactions and color stability of berry anthocyanins. Helsinki: University of Helsinki. 2005. p. 10–14.
45. Yoshida K, Kitahara S, Ito D, Kondo T. Ferric ions involved in the flower color development of the Himalayan blue poppy, Meconopsis grandis. Phytochemistry 2006;67(10): 992–998.
46. Record IR, Dreosti IE, McInerney JK. Changes in plasma antioxidant status following consumption of diets high or low in fruit and vegetables or following dietary supplementation with an antioxidant mixture. British Journal of Nutrition 2001;85(4):459–464.
47. Ito F, Tanaka N, Katsuki A, Fujii T. Why do flavylium salts show so various colors in solution?: Effect of concentration and water on the flavylium‘s color changes. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 2002;150(1–3):153–157.
48. Fleschhut J, Kratzer F, Rechkemmer G, Kulling SE. Stability and biotransformation of various dietary anthocyanins in vitro. European Journal of Nutrition 2006;45(1):7–18.
49. Moncada MC, Moura S, Melo M J, Roque A, Lodeiro C, Pina F. Complexation of aluminum(III) by anthocyanins and synthetic flavylium salts: A source for blue and purple color. Inorganica Chimica Acta 2003;356:51–61.
50. Lafay S, Gil-Izquierdo A. Bioavailability of phenolic compounds. Phytochem. Rev. 2008;7:301– 311.
51. Feng R, Ni HM, Wang SY, Tourkova IL, Shurin MR, Harada H, Yin XM. Cyanidin-3-rutinoside, a natural polyphenol antioxidant, selectively kills leukemic cells by induction of oxidative stress. J. Biol. Chem. 2007;282:13468–13476.
52. Garcia-Alonso M, Rimbach G, Rivas-Gonzalo J. Antioxidant and cellular activities of anthocyanins and their corresponding vitisins A––studies in platelets, monocytes, and human endothelial cells. Journal of the Science of Food and Agriculture 2004;52:3378-84.
53. Diaconeasa Z, Leopold L, Rugină D, Ayvaz H, Socaciu C. Antiproliferative and Antioxidant Properties of Anthocyanin Rich Extracts from Blueberry and Blackcurrant Juice. Int. J. Mol. Sci. 2015;16:2352-2365.
