LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

ROBERTA LUKŠAITĖ

PRUNELLA VULGARIS L. ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAI Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Doc., Dr. Lina Raudonė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

PRUNELLA VULGARIS L. ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAI Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc., Dr. Lina Raudonė Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Roberta Lukšaitė Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) žolė ... 10

1.2. Fitocheminė sudėtis ... 11

1.3. Paprastųjų juodgalvių biologinis poveikis ... 12

1.4. Fenolinių junginių apžvalga ... 13

1.5. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas... 14

1.6. Antioksidantai, antioksidantinio poveikio nustatymas ... 16

2. TYRIMO METODIKA ... 19

2.1. Tyrimų objektas ... 19

2.2. Naudoti reagentai ... 20

2.3. Naudota aparatūra ... 20

2.4. Nuodžiūvio nustatymas, tiriamojo ekstrakto gamyba ... 21

2.5. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 21

2.6. Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas ABTS metodu ... 22

2.7. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 23

2.8. Efektyvioji skysčių chromatografija ... 24

2.9. Duomenų statistinis įvertinimas ... 24

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 25

3.2. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 28

3.4. Fenolinių junginių identifikavimas ESC metodu ... 34

3.5. Koreliacinių ryšių įvertinimas ... 39

4. IŠVADOS ... 40

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 42

SANTRAUKA

Robertos Lukšaitės magistro baigiamasis darbas. Mokslinė vadovė doc. dr. Lina Raudonė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra - Kaunas.

Pavadinimas: Prunella vulgaris L. žolės fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai.

Raktiniai žodžiai: Prunella vulgaris L., fenoliniai junginiai, Folin – Ciocalteu, FRAP, ABTS, antioksidantinis aktyvumas.

Tyrimo objektas ir metodai: Tyrimo objektas – paprastųjų juodgalvių žolė, surinkta įvairiose Lietuvos augavietėse ir vegetacijos eigoje. Fenolinių junginių kiekis įvertintas Folin – Ciocalteu spektrofotometriniu metodu, antioksidantinis aktyvumas įvertintas ABTS laisvųjų radikalų surišimo metodu bei FRAP redukcinio aktyvumo nustatymo metodu. Fenoliniai junginiai identifikuoti ir jų kiekis įvertintas ESC metodu.

Darbo tikslas: Nustatyti paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) žolės fenolinių junginių kiekinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti fenolinių junginių kiekinę sudėtį paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

2. Atlikti antiradikalinių savybių tyrimus paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose spektrofotometriniais metodais vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

3. Atlikti redukcinių savybių tyrimus paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose spektrofotometriniais metodais vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

4. Nustatyti rutino, rozmarino rūgšties ir chlorogeno rūgšties kiekinę sudėtį paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

Rezultatai: Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas Utenoje 77,15±1,39 mg/g. Didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi žaliava, rinkta Klaipėdoje 1022,17±0,98 μmol/g. Mažiausias antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas Upninkų kaime (atitinkamai 707,03±22,23 μmol/g ir 550,72±0,86 μmol/g). Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti junginiai: rutinas įvairuoja nuo 3,90±0,11 µg/g iki 8,07±0,17 µg/g, rozmarino rūgšties nustatyta nuo 29,22±0,84 µg/g iki 51,12±0,10 µg/g, chlorogeno rūgšties kiekis svyruoja nuo 0,44±0,01 µg/g iki 0,94±0,03 µg/g. Didžiausia laisvųjų radikalų surišimo geba ir redukcinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu, šio tarpsnio metu nustatytas didžiausias fenolinių junginių kiekis. Nustatyta, kad žiedai kaupia didžiausią fenolinių junginių kiekį ir pasižymi didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu.

SUMMARY

Master Thesis by Roberta Lukšaitė. Supervisor doc. dr. Lina Raudonė. Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy – Kaunas.

Title: Research of phenolic compounds and antioxidant activity of Prunella vulgaris L. herb. Key words: Prunella vulgaris L., phenolic compounds, Folin – Ciocalteu, FRAP, ABTS, antioxidant activity.

Object and methods: The object of a research – Prunella vulgaris L. herb, collected during its vegetation period and from different locations in Lithuania. Phenolic compounds were determined by the Folin - Ciocalteu spectrophotometric method, antioxidant activity was evaluated by ABTS free radical scavening method and FRAP reduction activity detection method. Phenolic compounds were identified and quantified using the ESC method.

The aim: To determine phenolic compounds and antioxidant activity of Prunella vulgaris L. herb.

Goals of the study:

1. Determination of the total quantity of phenolic compounds from Prunella vulagris L. extracts collected from different locations in Lithuania and during its vegetation period.

2. Determination of radical scavenging of Prunella vulgaris L. extracts with spectrophotometric methods.

3. Determination of reducing activity of Prunella vulgaris L. extracts with spectrophotometric methods.

4. Determination of the total quantity of rutin, rosmarinic acid, chlorogenic acid in Prunella vulgaris L. extracts with high performance liquid chromatography.

Results: The highest total amounts of phenolic compounds were detected in Utena 77.15±1.39 mg/g. The greatest radical scavenging activity was detected in raw material, collected in Klaipėda 1022.17±0.98 µmol/g. The lowest radical scavenging and reducing activity was detected in Upninkai (respectively 707.03±22,23 µmol/g and 550.72±0.86 µmol/g). Compounds were identified with high performance liquid chromatography method: rutin ranged from 3900.60±112.58 µg/g to 8077.08±173.95 µg/g, rosmarinic acid determined from 29217.62±843.26 µg/g to 51,121.56±100.97 µg/g, chlorogenic acid content ranged from 442.70±9.53 µg/g to 937.24±33,99 µg/g. The greatest free radical scavenging and reducing activities, as well as the biggest amount of phenolic compounds, were discovered during the mass flowering period. The biggest amount of phenolic compounds and the highest antioxidant activity were found in blossoms.

SANTRUMPOS

CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (anglų k. - cupric ion reducing antioxidant capacity)

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. - ferric reducing antioxidant power) GAE – galo rūgšties ekvivalentai

HAT - vandenilio atomo perdavimo reakcija (anglų k. - hydrogen atom transfer)

ORAC – deguonies radikalų absorbcijos galia (anglų k. oxygen radical absorbance capacity) R2 – determinacijos koeficientas

ROS – reaktyvios deguonies rūšys (anglų k. - reactive oxygen species) RNS – reaktyvios azoto rūšys (anglų k. - reactive nitrogen species) SET - elektronų perdavimo reakcija (anglų k. - single electron transfer)

TEAC - trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (anglų k. - trolox equivalent antioxidant capacity) TRAP - bendras radikalų gaudyklės parametras (anglų k. - total radical trapping antioxidant parameter)

TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas

ĮVADAS

Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) - tai daugiametis augalas, priklausantis notrelinių (Lamiaceae Lindl.) šeimai [1]. Jau nuo XVII amžiaus Kinijoje, Indijoje paprastųjų juodgalvių preparatai buvo naudojami gerkles skausmui, karščiavimui mažinti, sergant kvėpavimo takų uždegimu, gerinti žaizdų gijimą. Paprastųjų juodgalvių ekstraktai pasižymi antioksidantinėmis, antivirusinėmis, antihipertenzinėmis, antialerginėmis, priešuždegiminėmis, priešvėžinėmis savybėmis. Šias augalo savybes lemia kaupiamos fenolinės rūgštys, flavonoidai, saponinai, steroidiniai junginiai, eteriniai aliejai, vitaminai B, C, K ir kt. [2,3,4].

Fenoliniai junginiai yra vieni labiausiai paplitusių junginių gamtoje, kurie pasižymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis. Antioksidantai yra apibrėžiami kaip junginiai, kurie gali atidėti, slopinti arba užkirsti kelią oksidacijai, surišant laisvuosius radikalus ir sumažinant oksidacinį stresą [2,5]. Oksidacinis stresas sukelia ląstelių ir audinių pažeidimus. Tai sąlygoja tokias ligas kaip aterosklerozė, diabetas, vėžys [2]. Fenolių, kaip natūralių papildų vartojimas gali būti naudingas organizmo homeostazei. Yra svarbu nustatyti naujus šaltinius saugių ir nebrangių natūralios kilmės antioksidantų. Dėl savo antioksidantinio poveikio augaliniai fenoliai kelia didelį susidomėjimą ieškant naujų būdų vėžiui gydyti [3,6,7].

Šiuo metu skiriamas didelis dėmesys augalinių žaliavų tyrimams, siekiant nustatyti juose esančių fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą. Fenolinių junginių nustatymas yra svarbus norint nustatyti augalinės žaliavos cheminę sudėtį, įvertinti žaliavos kokybę [7]. Augalinių žaliavų kokybė ir jų antioksidantinis poveikis priklauso nuo augalinės žaliavos rinkimo laiko, geografinės padėties, žaliavos saugojimo sąlygų, todėl yra svarbu atlikti tyrimus norint išsiaiškinti tinkamiausias sąlygas augalinei žaliavai rinkti [3,6].

Darbo tikslas yra nustatyti fenolinių junginių kiekį paprastųjų juodgalvių žolėjė Folin – Ciocalteu metodu, įvertinti antioksidantinį aktyvumą ABTS ir FRAP metodais, efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinti fenolinių junginių kiekinę sudėtį.

Darbo naujumas. Pirmą kartą ištirta paprastųjų juodgalvių žolė, surinkta įvairiose Lietuvos augavietėse bei vegetacijos eigoje: nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis, antioksidantinis aktyvumas įvertintas ABTS laisvųjų radikalų surišimo metodu bei FRAP redukcinio aktyvumo nustatymo metodu. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinta fenolinių junginių kiekinė sudėtis.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Nustatyti paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) žolės fenolinių junginių kiekinę sudėtį ir antioksidantinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti fenolinių junginių kiekinę sudėtį paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose Folin-Ciocalteu metodu vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

2. Atlikti antiradikalinių savybių tyrimus paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose ABTS metodu vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

3. Atlikti redukcinių savybių tyrimus paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose FRAP metodu vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

4. Nustatyti rutino, rozmarino rūgšties ir chlorogeno rūgšties kiekinę sudėtį paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose efektyviosios skysčių chromatografijos metodu vegetacijos eigoje ir skirtingose Lietuvos augavietėse.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) žolė

Sistematika, nomenklatūra, morfologiniai požymiai. Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) – tai daugiametis vaistinis augalas. Paprastoji juodgalvė priklauso Prunella L. genčiai, notrelinių (Lamiaceae Lindl.) šeimai, Magnoliopsida klasei, Spermatophytina poskyriui, Tracheophyta skyriui [1]. Augalo stiebas stačias, keturbriaunis. Užauga iki 40 cm, lapai, išskyrus viršutinę porą, kotuoti, kiaušiniški arba pailgai lancetiški, dažniausiai lygiakraščiai, rečiau nežymiai dantyti, pūkuoti arba pliki. Viršutinė lapų pora glaudžiai apgaubia žiedyno pagrindą. Taurelė dvilūpė, vainikėlio apatinė lūpa dviskiltė. Vainikėlis 7-15 mm ilgio, violetinis arba melsvai violetinis, kartais baltas. Vaisiai – kiaušiniški, 1,5-2 mm ilgio ir apie 1 mm pločio, tribriauniai, blizgantys riešutėliai. Sėklos pradeda bręsti po mėnesio nuo žydėjimo pradžios [8,9,10].

1 pav. Paprastoji juodgalvė (Prunella vulgaris L.) [11]

Paplitimas. Paprastųjų juodgalvių žolė yra plačiai paplitusi Europoje, įskaitant Didžiąją Britaniją, taip pat Norvegijos pietuose ir rytuose, šiaurės Afrikoje, šiaurės Amerikoje ir vidurio Azijoje [12,13]. Lietuvoje taip pat dažna, auga miškuose, pievose, šlaituose, laukuose, soduose, vandens telkinių pakrantėse [14].

Žaliava. Paprastųjų juodgalvių žolė renkama masinio žydėjimo metu (birželio - rugsėjo mėnesį) ir džiovinama gerai vėdinamose vietose, apsaugant nuo tiesioginių saulės spindulių. Sausai laikoma žaliava tinka naudoti iki metų [8,9,12].

1.2. Fitocheminė sudėtis

Atlikti fitocheminiai tyrimai parodė, kad paprastųjų juodgalvių žolė biologiškai aktyvius junginius kaupia stiebuose, lapuose ir žieduose, tačiau didžiausia dalis nustatoma žieduose [9,13]. Vienos iš pagrindinių biologiškai aktyvių junginių grupių, lemiančių P.vulgaris biologinį aktyvumą yra triterpenoidai ir fenolinės rūgštys [9].

Triterpenoidai. Pagrindiniai paprastųjų juodgalvių žolėje kaupiami triterpenoidai yra oleanolo ir ursolo rūgštys. Taip pat nustatyta betulino rūgštis, uvaolis, β-amirinas. Augaluose triterpenoidai dažnai kaupiami glikozidų (saponinų) forma. Saponinai sudaryti iš hidrofobinio triterpenoido anglikono ir vienos ar kelių hidrofilinių cukraus liekanų [13,14]. Triterpenoidai pasižymi antimikrobiniu aktyvumu [9,15].

Organinės rūgštys. P. vulgaris žolėje kaupiamas organines rūgštis galima išskirti į fenolines ir ilgos grandinės riebalų rūgštis. Kaupiamos fenolinės rūgštys yra cis- ir trans- izomerų kavos rūgštys, rozmarino, chlorogeno rūgštys, p-kumaro, ferulo, protokatecho, elago rūgštys [3,16,17]. Rozmarino rūgštis yra vienas pagrindinių junginių paprastųjų juodgalvių žolėje [18]. 2013 m. Cui , Hou ir Jing analizavo paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktus dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodu ir nustatė riebalų rūgštis, iš kurių didžiausi kiekiai aptikti linoleno rūgšties. Taip pat nustatyta palmitino, oleino, arachidono rūgštys, heksatriakontanas [13].

Flavonoidai. Paprastųjų juodgalvių žolėje gausu flavonoidų, kurie pasižymi antioksidantiniu poveikiu. Paprastųjų juodgalvių žolėje aptinkami flavonoliai (kvercetinas ir jo glikozidai, rutinas, kempferolis ir jo glikozidas), flavonai (luteolinas, vogoninas), flavonolis (hesperidinas), antocianinas (cianidinas) [2,3,9,13].

Steroidiniai junginiai. Steroidiniai junginiai augaluose reguliuoja ląstelių augimą ir dalijimąsi ir yra aktyvūs per visą augalo gyvavimo ciklą [9,19]. P. vulgaris žolėje nustatyta α-spinasterolis, α-spinasterol-3-O-β-D-gliukozidas, β-sitosterolis, stigmasterolis, daukosterolis [13].

Eteriniai aliejai. Naudojant dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodą paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose nustatyta 30 eterinio aliejaus komponentų, iš kurių didžiausi kiekiai randami kamparo, germakreno D, α-pineno, β-elemeno ir β-kariofileno [13,20].

Kumarinai. Paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose aptinkami kumarinų dariniai (umbeliferonas, skopoletinas) [13]. Umbeliferonas pasižymi priešuždegiminiu poveikiu. Atlikti tyrimai įrodė, kad umbeliferonas apsaugo kepenis nuo alkoholio sukelto pažeidimo aktyvindamas antioksidantinę sistemą [21]. Skopoletinas pasižymi priešuždegiminiu, antioksidantiniu, priešvėžiniu aktyvumu [22].

Vitaminai. Nustatyta, kad P. vulgaris žolė kaupia vitaminą B1, vitaminą C ir vitaminą K [13]. Augalinės kilmės vitaminai yra naudingi žmogaus organizmui, jie dalyvauja metabolizme ir veikia kaip fermentiniai kofaktoriai [23].

1.3. Paprastųjų juodgalvių biologinis poveikis

Kinijoje paprastoji juodgalvė yra pripažinta kaip tradicinis vaistinis augalas. Jos vandeniniai ekstraktai, pagaminti iš sudžiovintų žiedų, buvo naudojami gydyti galvos skausmą, galvos svaigimą, hipertenziją, spengimą ausyse, sausą kosulį, dermatitą, alergines ligas. XVII amžiuje Europoje tai buvo populiari priemonė gydyti gerklės skausmą, karščiavimą, akių ligas, paspartinti žaizdų gijimą [4,17]. Šiuolaikiniais farmakologiniais tyrimais įrodyta, kad paprastųjų juodgalvių žolė dėl sudėtyje esančių aktyvių junginių pasižymi antivirusiniu, imunomuduliaciniu, antidiabetiniu, antioksidantiniu, priešuždegiminiu, antihipertenziniu, priešvėžiniu poveikiu [11].

Antivirusinis poveikis. Atlikti tyrimai parodė, kad paprastųjų juodgalvių ekstraktuose esantys polisacharidai yra naudingi gydant ŽIV ir Herpes virusus. Nustatyta, kad sulfatinis polisacharidas prunelinas slopina ŽIV-1 replikaciją. Be to, šis slopinamasis poveikis pasireiškė su mažu citotoksiškumu in vitro [13,17].

Imunomoduliacinis poveikis. Tyrime su žiurkėmis įrodyta, kad vandeninis paprastųjų juodgalvių ekstraktas, dėl sudėtyje esančios rozmarino rūgšties gali sumažinti histamino kiekį organizme. Metanolinis ekstraktas inhibuoja interleukino – 2 genų ekspresiją 50%, todėl pasireiškia imunomoduliacinis poveikis [17].

Antidiabetinis poveikis. Ištirtas paprastųjų juodgalvių ekstraktų poveikis gliukozės kiekiui kraujyje, egzogeninis jautrumas insulinui, ir insulino koncentracija plazmoje. Vartojant dozę 100 mg/kg pastebimas žymus gliukozės kiekio kraujyje sumažėjimas. Nustatyta, kad geriausias rezultatas, siekiant sumažinti gliukozės kiekį kraujyje, pasiekiamas naudojant paprastųjų juodgalvių ekstraktus kartu su glibenklamidu. Paprastųjų juodgalvių ekstraktai sustiprina ir prailgina egzogeninio insulino antihiperglikeminį poveikį [24].

Antioksidacinis poveikis. In vivo ir in vitro tyrimų metu įrodyta, kad fenolinės rūgštys, flavonoidai, saponinai, taninai, alkaloidai, polisacharidai pasižymi antioksidantiniu veikimu [25]. Paprastųjų juodgalvių žolė kaupia rozmarino, kavos rūgštį, raugines medžiagas, kurios pasižymi antioksidantiniu poveikiu, t.y. neutralizuoja organizme susidariusius laisvuosius radikalus, apsaugo ląsteles nuo pažaidos, mažina vėžinių susirgimų riziką [26,27].

Priešuždegiminis poveikis. Rozmarino rūgštis yra vienas pagrindinių biologiškai aktyvių junginių, kuriuos kaupia paprastųjų juodgalvių žolė. Ji yra COX-2 ir 5-LOX moduliatorius, todėl

pasižymi stipriu priešuždegiminiu poveikiu. Dvi ciklooksigenazės izoformos (COX-1 ir COX-2) katalizuoja reakciją konvertuojančią arachidono rūgštį į PGE2. Prostaglandinas E2 (PGE2) yra uždegimo mediatorius. Atliekant tyrimus su pelėmis įrodyta, kad etanolinės paprastųjų juodgalvių ištraukos slopina PGE2 gamybą [27]. Atlikti placebo kontroliuojami tyrimai įrodė, kad dantų pasta, kurios sudėtyje yra paprastųjų juodgalvių ekstrakto, yra veiksminga gydant gingivitą [28].

Antihipertenzinis poveikis. Tyrimai parodė, kad etanoliniai paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktai sukelia tiesioginį kraujagysles plečiantį poveikį, todėl pasižymi antihipertenziniu poveikiu. Nuo endotelio priklausomas kraujagysles plečiantis poveikis veikia per guanilatciklazės kelią. Tyrime su žiurkėmis įrodyta, kad vendeniniai ir etanoliniai paprastųjų juodgalvių ekstraktai gali sumažinti sistolinį kraujo spaudimą [13].

Priešvėžinės savybės. In vitro tyrimai su gyvūnais įrodo fenolinių junginių priešvėžinį aktyvumą. Dėl sudėtyje esančių polisacharidų paprastųjų juodgalvių ekstraktai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu, gali padidinti užkrūčio liaukos ir blužnies indeksą. Paprastųjų juodgalvių ekstraktai pasižymi dideliu antiestrogeniniu poveikiu ir gali sukelti apoptozę naviko ląstelėms [13,17].

1.4. Fenolinių junginių apžvalga

Fenoliniai junginiai plačiai paplitę augalų karalystėje ir yra vieni dažniausių antrinių metabolitų, kurie yra svarbūs augalo augimui ir reprodukcijai, apsaugo nuo ligų sukėlėjų [2,29]. Tai aromatinių junginių klasė, kurių molekulėse hidroksilo grupės yra prijungtos prie aromatinio žiedo anglies atomų. Jų kiekis augale priklauso nuo sezono ir vegetacinio laikotarpio, taip pat įtakos turi augalo sužeidimai, išsausėjimas, ligų sukėlėjai [26].

Fenoliniai junginiai pasižymi priešuždegiminiu, antioksidantiniu, priešvėžiniu aktyvumu. Nustatyta, kad fenoliniai junginiai yra stipresni antioksidantai nei vitaminai C, E ar karotinoidai [10]. Fenoliniai junginiai gali absorbuoti ir neutralizuoti laisvuosius radikalus, kurie sukelia oksidacinį stresą, taip pat pasižymi savybe moduliuoti fermentų ir ląstelių receptorių aktyvumą [2,30,31].

1 lentelė. Fenolinių junginių klasifikacija pagal anglies atomų skaičių [29]

Cheminė formulė Klasė Pavyzdys Šaltinis

C6 Paprastieji fenoliai, benzochinonai Hidrochinonas Miltinių meškauogių lapai C6-C1 Hidroksibenzkarboksi rūgštys p-hidroksibenzkarboksi rūgštis

Kokosų lukštai, baltasis vynas

rūgštys raudonasis vynas

C6-C3 Kumarinai Skopoletinas Cinamonas, šilkmedis iš Indijos, žalioji arbata

C6-C4 Naftochinonai Vitaminas K1 Špinatai, kopūstai, javai

C6-C2-C6 Stilbenai Trans-resveratrolis Vynuogės, riešutai

C6-C3-C6 Flavonoidai Luteolinas Alyvuogės, vynuogės

(C6-C3-C6) Kondensuoti taninai Procianidas Vynuogės, raudonasis vynas, vyšnios

Fenoliniai junginiai yra vieni pagrindinių antioksidantų. 2013 m. E. Bendary ir kt. aptarė ryšį tarp fenolinių junginių struktūros ir antioksidantinio aktyvumo. Hidroksilo grupių kiekis molekulėje, dvigubų ryšių konjugacijos, rezonansiniai reiškiniai yra vieni iš parametrų, kuriais galima vertinti antioksidantinę galią [32]. Struktūros bruožai, susiję su fenolinių junginių antioksidantiniu aktyvumu:

1. Hidroksilo grupių buvimas 3-oje ir 5-oje padėtyje (a); 2. Katecholio grupė B žiede (b);

3. C žiede 2, 3 padėtyje dvigubos jungtys su keto grupe (c).

2 pav. Struktūros bruožai, lemiantys antioksidantinį aktyvumą [29]

1.5. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas

Laisvieji radikalai – tai atomai, molekulės ar jonai, kurių sudėtyje yra bent vienas nesuporuotas elektronas. Laisvieji radikalai gali susidaryti veikiant pagrindiniams žmogaus medžiagų apykaitos procesams arba veikiant išoriniams veiksniams (radiacija, chemoterapija, pesticidų poveikis, rūkymas, aplinkos tarša, pramoniniai cheminiai preparatai) [33,34]. Šie laisvieji radikalai yra neutralizuojami antioksidantų sistemų, kurios gali būti fermentiniai (katalazės, superoksido

dismutazės, glutationo peroksidazės) ir nefermentiniai antioksidantai (vitaminai A, E, C, glutationas, ubichinonas, flavonoidai) [35].

Atsiradus disbalansui tarp laisvųjų radikalų atsiradimo ir antioksidantų apsaugos, sukeliamas oksidacinis stresas, kurio metu išsiskiria didelis kiekis aktyvių deguonies (ROS) ir/arba azoto rūšių (RNS), pvz: superoksido anijonas, vandenilio peroksidas, peroksinitritas [2,34]. Jie pažeidžia lipidus ir baltymus ląstelių membranose, todėl ląstelė negali atlikti savo gyvybinių funkcijų (maisto medžiagų transporto, atliekų šalinimo, ląstelės dalijimosi) [36].

2 lentelė. Reaktyvių deguonies ir azoto formų klasifikacija [36]

ROS RNS

O2

- ● _Superoksidas

NO● Azoto oksidas

·

-Peroksinitritas

H2O2 Vandenilio peroksidas ONOOH Peroksintrito

rūgštis

ROO· Peroksilo radikalas NO2 Azoto dioksidas

ROOH Organinis vandenilio peroksidas

O2 Singletinis deguonis

O3 Ozonas

Intensyvus fizinis aktyvumas yra vienas iš faktorių, skatinančių disbalanso atsiradimą. Mitochondrijos suformuoja laisvuosius radikalus iš 2 – 5 % sunaudoto deguonies kiekio. Fizinio aktyvumo metu padidėja oksidacinis fosforilinimas, išskiriamas katecholaminų kiekis, todėl padidėja laisvųjų radikalų kiekis organizme [35].

Oksidacinis stresas sąlygoja tokių ligų atsiradimą kaip aterosklerozė, diabetas, kvėpavimo takų ligos (astma, obstrukcinė plaučių liga), akių ligos (katarakta, tinklainės pažeidimai), širdies ligos, neurodegeneraciniai sutrikimai (Alzheimerio, Parkinsono liga), vėžys, skatinami senėjimo procesai [37]. Žmogaus organizmas pats nėra pajėgus visiškai apsiginti nuo oksidacinio streso, todėl naudinga vartoti natūralios kilmės antioksidantus [36].

3 pav. Laisvųjų radikalų pažaidos organizmui schema [16]

1.6. Antioksidantai, antioksidantinio poveikio nustatymas

Antioksidantai - tai medžiagos, kurios mažomis koncentracijomis gali apsaugoti biomolekules nuo laisvųjų radikalų sukelto oksidacinio streso [37]. Jie gali slopinti oksidacines reakcijas keliais būdais: tiesiogiai slopindami aktyvią deguonies formą, slopindami fermentus arba sudarydami kompleksus su metalų jonais [32]. Pagal veikimo mechanizmą juos galima skirti į dvi pagrindines grupes:

1. Fermentiniai antioksidantai. Šios reakcijos metu fermentai superoksidą paverčia vandenilio peroksidu. Jiems priskiriama: katalazė (CAT), glutationo peroksidazė (GPx), glutationo reduktazė (GRx), superoksido dismutazė (SOD).

2. Nefermentiniai antioksidantai. Jie gali priimti arba atiduoti elektroną radikalui taip nutraukdami grandinines reakcijas. Jie gali būti skirstomi:

 Lipidinės terpės antioksidantai (vitaminas E (tokoferolis)), kofermentas Q10, beta – karotenas, vitaminas A (retinolis), flavonoidai (flavanoliai, flavonai, izoflavonai));

 Vandeninės terpės antioksidantai (vitaminas C (askorbo rūgštis)), glutationas, šlapimo rūgštis, bilirubinas) [37].

Antioksidantinio aktyvumo nustatymas gali būti pagrįstas elektronų perdavimu (SET) arba vandenilio atomo perdavimu (HAT). Elektronų perdavimu pagrįstoms reakcijoms priskiriama DPPH radikalų surišimo, ABTS radikalų – katijonų surišimo metodai, bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodas Folin-Ciocalteu, geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos reakcijos. Reakcijoms, pagrįstoms vandenilio atomo perdavimu priskiriama deguonies radikalų absorbcijos

galios nustatymas (ORAC), bendras radikalų gaudyklės parametro nustatymo metodas (TRAP) [2,37,38].

ABTS radikalų surišimo metodas. ABTS yra dažnai taikomas antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas, kurio metu tiriamas laisvųjų radikalų susirišimo aktyvumas [3,25]. Šio tyrimo metu ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis), pridedant natrio persulfato, paverčiama į radikalą – katijoną (ABTS•+). Susidaręs radikalas – katijonas yra mėlynos – žalios spalvos, absorbuoja 734 nm ilgio šviesos bangas. Šis metodas gali būti naudojamas siekiant nustatyti hidrofilinius ir hidrofobinius antioksidantus, jo neveikia joninės jėgos [39].

DPPH laisvųjų radikalų metodas yra antioksidantinis tyrimas, paremtas elektronų pernaša. DPPH (2, 2-difenil-1-pikrilhidrazilo) yra stabilus, violetinės spalvos organinis azoto radikalas. Šiame tyrime violetinis DPPH radikalas redukuojamas į šviesiai geltonos spalvos hidraziną. Tai paprastas ir greitas metodas, kuriam reikalingas UV-Vis spektrofotometras. DPPH radikalų surišimo galią galima įvertinti matuojant absorbcijos sumažėjimą, esant 515–528 nm bangos ilgiui. Šio tyrimo trūkumas yra tas, kad DPPH tirpsta tik organinėje terpėje (ypač gerai alkoholiuose) ir netinkamas vandeninėje terpėje [38,40].

FRAP metodu atliekamas žaliavos ekstraktų redukcinių savybių tyrimas. Atliekant šį metodą fenoliniai junginiai geltoną geležies tripiridiltriazino kompleksą (Fe (III) - TPTZ) paverčia mėlynu geležies (Fe (II) - TPTZ) kompleksu. FRAP reagentas paruošiamas sumaišant acetatinį buferį, TPTZ (2,4,6 – tri (2-pyridyl) – 1,3,5 – triazino) ir 20 nM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą santykiu 10:1:1. Ši redukcija yra stebima spektrofotometru, esant 595 nm bangos ilgiui, rezultatai išreiškiami standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais gramui medžiagos (TEAC). FRAP metodu reakcija gali vykti tik rūgštinėje aplinkoje, tačiau nepaisant šio trūkumo metodas yra gana paprastas, pigus, greitai atliekamas ir patikimas [40].

CUPRAC tyrimas remiasi absorbcijos pokyčiais, kurie atsiranda antioksidantui redukuojant vario-kurpoino dvivalentę formą į vienvalentę. Šis katijonas yra tirpus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, todėl gali būti naudojamas hidrofiliniams ir lipofiliniams antioksidantams tirti. Absorbcija matuojama ties 490 nm bangos ilgiu. CUPRAC metodas paprastas, reikalinga nesudėtinga aparatūra, lengvas tyrimo atkuriamumas [38,41].

ORAC metodas yra pagrįstas vandenilio atomo perdavimu, kurio metu matuojamas antioksidanto slopinamas peroksidacijos radikalas. Šio tyrimo privalumas yra tas, kad galima naudoti kelis skirtingus laisvųjų radikalų generatorius ar antioksidantus, todėl yra tinkamas, kai mėginyje yra daug skirtingų ingredientų ir turi sudėtingą reakcijų kinetiką. Originali šio metodo versija yra sukurta matuoti tik vandenyje tirpių antioksidantų galią, todėl metodas buvo tobulinamas tam, kad būtų galima matuoti ir riebaluose tirpius antioksidantus, tačiau naujasis metodas yra mažiau jautrus [40,42].

TRAP tyrimo metu matuojama antioksidanto geba įsiterpti į reakciją tarp peroksido radikalų (generuojamų (AAPH, 2,2′-azobis(2amidinopropano) dihidrochlorido (ABAP)) ir taikinio. Šis metodas yra jautrus visiems antioksidantams, tačiau gali matuoti tik ribotą skaičių mėginių ir yra sudėtingai atliekamas [40,42].

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimų objektas

Paprastųjų juodgalvių (Prunella vulgaris L.) žolė, žiedai, lapai ir stiebai, surinkti 2015 metais 8 skirtingose Lietuvos augavietėse. Rinkta liepos – rugpjūčio mėnesiais. Augalinė žaliava buvo džiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, kambario temperatūroje, apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių.

3 lentelė. Tyrimo objekto rinkimo vieta, laikas ir vegetacinis laikotarpis

Augavietė

Rinkimo data

Vegetacinis

laikotarpis

Rinkimo data:

2015.08.10 Masinis žydėjimas

4. Utena,

Alaušo ežero pakrantė

Rinkimo data: 2015.08.10 Masinis žydėjimas 5. Jonavos rajonas, Ruklos miestelis, pieva Rinkimo data: 2015.08.02 Masinis žydėjimas 6. Šakių rajonas, Lukšių miestelis, nuosavo namo kiemas

Rinkimo data:

2015.08.13 Masinis žydėjimas

7. Jonavos rajonas, Upninkų kaimas,

Šventosios upės pakrantė

Rinkimo data:

2015.07.31 Masinis žydėjimas

Varnutės tvenkinio pakrantė (stiebai, lapai, žiedai)

2015.08.08

9. Jonava (1),

Varnutės tvenkinio pakrantė

Rinkimo data:

2015.07.25 Vegetacijos pradžia 10. Jonava (2),

Varnutės tvenkinio pakrantė

Rinkimo data:

2015.08.01 Masinis žydėjimas 11. Jonava (3),

Varnutės tvenkinio pakrantė

Rinkimo data:

2015.08.08 Masinis žydėjimas 12. Jonava (4),

Varnutės tvenkinio pakrantė

Rinkimo data:

2015.08.15 Masinis žydėjimas 13. Jonava (5),

Varnutės tvenkinio pakrantė

Rinkimo data:

2015.08.25 Sėklų branda

2.2. Naudoti reagentai

Etilo alkoholis 96,3 proc. V/V (AB „Stumbras”, Kaunas, Lietuva), galo rūgšties monohidratas (,,Sigma-Aldrich“, St. Louis, JAV), Folin-Ciocalteu reagentas (,,Sigma-Aldrich“, St. Louis, JAV), natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija), 98 - 100 proc. V/V acto rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, St. Louis, JAV), ABTS (2,2-azinobis (etil-2,3-dihidrobenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis, ,,Alfa Aesar” Massachusetts, JAV), kalio persulfatas (,,Alfa Aesar GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija), natrio acetatas (,,Sigma–Aldrich“, Steinheim, Vokietija), ledinė acto rūgštis (UAB „Fasuotos cheminės medžiagos“, Lietuva), 35 proc. V/V vandenilio chlorido rūgštis (,,Sigma – Aldrich“, St. Louis, JAV), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) („Alfa Aesar“ GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija), acetonitrilas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), skruzdžių rūgštis („Sigma-Aldrich“, Vokietija), geležies (III) chlorido heksahidratas („Sigma-Aldrich“, Steinheim, Vokietija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) (,,Sigma-Aldrich“ St. Louis, JAV).

2.3. Naudota aparatūra

Augalinės žaliavos susmulkintos elektriniu malūnėliu (Binatone, Jungtinė Karalystė), žaliavų ir reagentų svėrimui naudotos analitinės svarstyklės (Sartorius Cp6M-0CE, Vokietija), nuodžiūvis įvertintas „Precisa HA 300“ (Šveicarija) prietaisu, etanoliniams ekstraktams ruošti naudota ultragarsinė vonelė (Bandelin SONOREX Digital,Vokietija), bendras fenolinių junginių kiekis,

laisvųjų radikalų surišimas įvertintas spektrofotometru (Beckman DU – 70, JAV), chromatografinė analizė atlikta naudojant ,,Waters 2695“ (Milford, USA) chomatografą.

2.4. Nuodžiūvio nustatymas, tiriamojo ekstrakto gamyba

Išdžiovinta augalinė žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu. Atsvėrus 1 g žaliavos tiriamas nuodžiūvis. Gauti rezultatai atitiko Europos farmakopėjos reikalavimus, nes nuodžiūvis nustatytas mažesnis nei 10 %.

Tiriamieji ekstraktai ruošiami atsveriant 0,25 g (0,0001 g tikslumu) sausos susmulkintos P. vulgaris augalinės žaliavos ir užpilant 25 ml 70% V/V etanoliu. Ekstraktai dedami į ultragarso vonelę ir laikomi 30 minučių kambario temperatūroje. Filtruojama pro vatą į tamsaus stiklo buteliukus.

2.5. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendras fenolinių junginių kiekis yra nustatomas Folin- Ciocalteu kolorimetriniu metodu. Tiriamasis tirpalas ruošiamas 200 µl paprastųjų juodgalvių ekstrakto sumaišant su 1000 µl darbinio FC reagento ir 800 µl natrio karbonato. Mišinys valandą paliekamas tamsoje kambario temperatūroje. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tačiau vietoj tiriamojo ekstrakto pilama 200 µl 70 proc. V/V etanolio.

Galo rūgšties kalibracinei kreivei ruošiami skirtingų koncentracijų etaloniniai tirpalai (0,01 mg/ml, 0,025 mg/ml, 0,05 mg/ml, 0,075 mg/ml, 0,1 mg/ml). Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GAE) gramui sausos žaliavos (mg/g) ir apskaičiuojamas pagal šią formulę:

GAE = ; (mg/g)

c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

a – skiedimo faktorius;

4 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė Folin-Ciocalteu metodu (R2=0.997)

2.6. Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas ABTS metodu

Motininis ABTS tirpalas ruošiamas 0,0548 g ABTS miltelių ištirpinant 50 ml distiliuoto vandens ir pridedant 0,0095 g kalio persulfato. Mišinys sumaišomas ir tamsoje, kambario temperatūroje paliekamas 16 val. Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas praskiedžiant motininį ABTS tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamas tirpalas yra distiliuotas vanduo.

Tiriamieji tirpalai ruošiami į 3 ml darbinio ABTS tirpalo pridedant 20 µl tiriamojo ekstrakto. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Absorbcijos pokytis matuojamas spektrofotometru esant 734 nm bangos ilgiui.

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:

TE

c – trolokso koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

5 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS metodui (R2=0.99719)

2.7. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

Darbinis FRAP reagentas ruošiamas sumaišant acetatinį buferį, TPTZ tirpalą ir geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą santykiu 10:1:1. Acetatinis buferis gaunamas 3,1 g natrio acetato ištirpinus 1 l matavimo kolboje, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir distiliuotu vandeniu skiedžiama iki žymės. TPTZ tirpalas gaunamas 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties įpylus į 50 ml distiliuoto vandens ir pridėjus 0,1562 g TPTZ miltelių. 20 nM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas gaunams 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato ištirpinus 50 ml distiliuoto vandens.

Tiriamieji tirpalai ruošiami pridedant 20 µl tiriamojo ekstrakto (skiedimas 1:3) į 3 ml darbinio FRAP reagento. Mišinys sumaišomas ir tamsoje paliekamas 1 val. Mišinio absorbcija išmatuojama spektrofotometru esant 593 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tačiau vietoj ekstrakto dedama 20 µl 70% V/V etanolio.

Redukcinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:

TEFRAP= ; (mg/g)

c – trolokso koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);

a – skiedimo faktorius;

6 pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP metodui (R2=0.98879)

2.8. Efektyvioji skysčių chromatografija

ESC analizė atlikta su Waters 2695 chomatografu (Milford, USA) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, USA). Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 5-μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 × 4.6 mm) su prieškolone 5-μm ACE C18 (20 × 4.0 mm) (Aberdeen, Scotland), 25 °C temperatūroje. Eliuentų sistema sudaryta iš: 1% (v/v) skruzdžių rūgšties (A) ir acetonitrilo (B). Eliucijos sistema: 10–15% tirpiklis B 0–20 min, 15% tirpiklis B 20–30 min, 15–30% tirpiklis B 30–45 min, 30–40% tirpiklis B 45–55 min. Judrios fazės tėkmės greitis 1 ml/min, injekuoto ekstrakto tūris - 10 μl. Fenoliniai junginiai identifikuoti pagal junginių sulaikymo trukmę ir UV spektrą (λ = 200–600 nm) palyginant juos su žinomais standartais. Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas atliktas pagal standartų kalibracines kreives.

2.9. Duomenų statistinis įvertinimas

Tyrimų duomenys apdorojami „Microsoft Office Excel 2007“ (Microsoft, JAV) programa bei statistiškai įvertinami ,,SPSS Statistics 20“ (IBM, JAV). Visi atlikti bandymai buvo kartojami po 3 kartus, apskaičiuotas rezultatų standartinis nuokrypis (SN) bei santykinis standartinis nuokrypis (SNN). Tiesinis regresijos modelis buvo panaudotas priklausomybės ryšiui tarp kintamųjų nustatyti. Koreliacinio ryšio stiprumas įvertintas Pirsono koreliacijos koeficientu (R). Hierarchinės klasterinės analizės metodas buvo panaudotas Euklidiniu atstumu paremtų dendrogramų sudarymui. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, jei p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas P. vulgaris žolėje surinktoje iš skirtingų augaviečių. Bendras fenolinių junginių kiekis įvairiose augavietėse rinktoje žolėje įvairuoja nuo 64,77±3,29 mg/g iki 91,21±2,79 mg/g (p<0,05), vidutiniškai 73,8±2,50 mg/g. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas Jonavoje 91,21±2,79 mg/g. Mažiausiu fenolinių junginių kiekiu pasižymi žolė, rinkta Kaune 64,77±3,29 mg/g ir Klaipėdoje 65,34±3,93 mg/g. Fenolinių junginių kiekis įvairiose augavietėse statistiškai reikšmingai nesiskyrė tarp Ruklos ir Utenos, Balkasodžio kaimo, Lukšių, Upninkų kaimo, tarp Balkasodžio kaimo ir Kauno, Klaipėdos bei tarp Klaipėdos ir Kauno, Utenos. Nustatytas fenolinių junginių kiekis įvairiose augavietėse pavaizduotas 7 pav.

7 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) P. vulgaris žolėje, surinktoje iš įvairių Lietuvos augaviečių, masinio žydėjimo metu

Lyginant rezultatus su kitų tyrėjų duomenimis, pastebimas stiprus bendro fenolinių junginių kiekio varijavimas. 2013 m. Tadžone, Pietų Korėjoje rinktoje paprastųjų juodgalvių žolėje Yu-Jin Hwang ir kiti nustatė žymiai didesnį bendrą fenolinių junginių kiekį nei mūsų atliktame tyrime. Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis siekė 303.66±3.61 mg/g [4]. 2008 m. Kinijoje Hua-Bin Li ir kt. atliktame tyrime bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas 5,84±0,15 mg/g. Šie duomenys yra 15 kartų mažesni už mūsų gautus rezultatus [43].

Sudaryta paprastųjų juodgalvių žolėje kaupiamų fenolinių junginių dendrograma (8 pav.). Išskiriamos dvi pagrindinės grupės. Pirmajai grupei priklauso Kaune ir Klaipėdoje rinkta žaliava, kuri

pasižymi mažiausiu fenolinių junginių kiekiu (vidutiniškai 65,06±3,61 mg/g). Antrąją grupę galima skirti į du pogrupius. Pirmam pogrupiui priklauso Balkasodžio kaime, Lukšiuose ir Upninkų kaime rinkta žaliava, kuriuose sukauptas fenolinių junginių kiekis yra didesnis nei pirmoje grupėje (vidutiniškai 71,48±4,82 mg/g). Antram pogrupiui priklauso Jonavoje, Rukloje ir Utenoje rinkta žaliava, kuri pasižymi didesniu nei vidutinis mūsų tyrime nustatytas fenolinių junginių kiekiu (81,41±2,76 mg/g).

8 pav. Paprastųjų juodgalvių žolėje kaupiamų fenolinių junginių dendrograma.

1-Jonava, 2-Rukla, 3-Utena, 4-Balkasodžio kaimas, 5-Lukšiai, 6-Upninkų kaimas, 7-Kaunas, 8 –

Klaipėda.

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas P. vulgaris žolėje vegetacijos eigoje. Nustatytas fenolinių junginių kiekis augalo vegetacijos tarpsniais: vegetacijos pradžioje, masinio žydėjimo ir sėklų brandos metu. Suminis fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 46,60±2,58 mg/g iki 91,21±2,79 mg/g (p<0,05), vidutiniškai 70±2,95 mg/g. Nustatyta, kad augalo vegetacijos tarpsnių kaita reikšmingai įtakoja fenolinių junginių kaupimosi dėsningumus. Mažiausias suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas masinio atžėlimo metu - 46,60±2,58 mg/g (liepos pabaiga). Augalui pereinant į žydėjimo tarpsnį fenolinių junginių kiekis didėja. Didžiausias kiekis užfiksuotas masinio žydėjimo metu 91,21±2,79 mg/g (rugpjūčio vidurys). Sėklų brandos metu nustatytas fenolinių junginių sumažėjimas 76,19±4,33 mg/g (rugpjūčio pabaiga). Statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas laikotarpyje nuo liepos pabaigos iki rugpjūčio pradžios (9 pav.).

9 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) P. vulgaris žolėje vegetacijos laikotarpiu

Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose. Ištyrus paprastųjų juodgalvių stiebus, lapus ir žiedus - didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas žieduose 80,76±1,03 mg/g. Lapuose fenolinių junginių kiekis siekia 50,18±2,04 mg/g. Žymiai mažesnis fenolinių junginių kiekis randamas stiebuose 18,57±0,24 mg/g (10 pav.).

10 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) P. vulgaris lapuose, stiebuose ir žieduose, masinio žydėjimo metu

2013 m. Šiaurės Amerikoje Haider M. Hassan ir kt. nustatė bendrą fenolinių junginių kiekį paprastųjų juodgalvių stiebuose, kuris siekė 249,13±3,25 mg/g, lapuose fenolinių junginių kiekis siekė 350,60±3,30 mg/g [44]. Šie fenolinių junginių kiekiai yra didesni lyginant su mūsų tyrime nustatytais.

3.2. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu

Antiradikalinio aktyvumo nustatymas P. vulgaris žolėje surinktoje iš skirtingų augaviečių. Antiradikalinis aktyvumas įvairiose augavietėse įvairuoja nuo 559,72±6,88 μmol/g iki 1022,17±0,98 μmol/g (p<0,05), vidutiniškai 868±2,69 μmol/g. Didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymi žaliava, rinkta Klaipėdoje 1022,17±0,98 μmol/g, panašus kiekis rastas Jonavoje 1016,15±11,16 μmol/g ir Utenoje 1002,09±4,09 μmol/g. Žymiai mažesnis kiekis nei vidutinė reikšmė nustatytas Upninkų kaime 550,72±0,86 μmol/g. Statistiškai nereikšmingas antiradikalinio aktyvumo skirtumas nustatytas tarp Utenos ir Klaipėdos, Jonavos ir Utenos, Balkasodžio kaimo, Lukšių ir Klaipėdos, todėl galima teigti, kad šiuose miestuose nustatytas vienodas antiradikalinis aktyvumas. Aptiktas antiradikalinis aktyvumas įvairiose Lietuvos augavietėse pavaizduotas 11 pav.

Kitų šalių mokslininkai nustatė žymiai mažesnį antiradikalinį aktyvumą nei mūsų atliktame tyrime. 2010 m. Kinijoje Liang Feng ir kt. didžiausią antiradikalinį aktyvumą paprastųjų juodgalvių žolėje nustatė 89,31 μmol/g [25].

11 pav. Antiradikalinis aktyvumas (μmol/g) P. vulgaris žolėje, rinktoje įvairiose Lietuvos augavietėse, masinio žydėjimo metu

Sudaryta paprastųjų juodgalvių žolės antiradikalinio aktyvumo dendrograma (12 pav). Pirmajai grupei priklauso Upninkų kaime ir Lukšiuose rinkta žaliava, kuri pasižymi mažiausiu antiradikaliniu aktyvumu (vidutiniškai 617,06±2,72 μmol/g). Antrąją grupę galima skirti į du pogrupius. Pirmajam pogrupiui priskiriama Balkasodžio kaime ir Kaune rinkta žaliava, kuri pasižymi didesniu antiradikaliniu aktyvumu nei pirmoje grupėje (vidutiniškai 855,80±2,99 μmol/g). Antrajam

pogrupiui priskiriama Jonavoje, Utenoje, Klaipėdoje ir Rukloje rinkta žaliava, kuri pasižymi didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu (vidutiniškai 999,26±4,64 μmol/g).

12 pav. Paprastųjų juodgalvių žolės antiradikalinio aktyvumo dendrograma.

1-Jonava, 2-Rukla, 3-Utena, 4-Balkasodžio kaimas, 5-Lukšiai, 6-Upninkų kaimas, 7-Kaunas, 8 –

Klaipėda.

Antiradikalinio aktyvumo nustatymas P. vulgaris žolėje vegetacijos eigoje. Nustatytas antiradikalinis aktyvumas augalo vegetaciniais tarpsniais: vegetacijos pradžioje, masinio žydėjimo ir sėklų brandos metu. Skirtingais vegetacijos laikotarpiais antiradikalinis aktyvumas statistiškai reikšmingai įvairuoja nuo 747,79±1,61 μmol/g iki 1016,15±11,16 μmol/g (p<0,05), vidutiniškai 910±5,05 μmol/g. Mažiausia laisvųjų radikalų surišimo geba nustatyta vegetacijos pradžioje 747,79±1,61 μmol/g (liepos pabaiga), didžiausia masinio žydėjimo metu 1016,15±11,16 μmol/g (rugpjūčio vidurys). Pastebimas sumažėjimas sėklų brandos metu 988,47±6,88 μmol/g (rugpjūčio pabaiga). Antiradikalinis aktyvumas paprastųjų juodgalvių žolėje vegetacijos eigoje pavaizduotas 13 pav.

13 pav. Antiradikalinis aktyvumas (μmol/g) P. vulgaris žolėje vegetacijos laikotarpiu

Antiradikalinis aktyvumas P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose. Didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas žieduose 878,60±4,05 μmol/g, žymiai mažesnis aktyvumas lapuose 452,32±6,17 μmol/g. Mažiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas stiebuose 284,22±6,41 μmol/g (14 pav.).

14 pav. Antiradikalinis aktyvumas (μmol/g) P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose, masinio

žydėjimo metu

2014 m. Kanadoje Haider M. Hassan ir kt. atliktame tyrime nustatytas antiradikalinis aktyvumas paprastųjų juodgalvių stiebuose ir lapuose yra žymiai mažesnis lyginant su mūsų tyrime

gautais rezultatais. Minėtų mokslininkų atliktame tyrime antiradikalinis aktyvumas paprastųjų juodgalvių lapuose siekė 160±1,57 μmol/g, stiebuose 98,89±5,91 μmol/g [44].

3.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

Redukcinės galios nustatymas P. vulgaris žolėje surinktoje iš skirtingų augaviečių. Redukcinis aktyvumas įvairiose augavietėse įvairuoja nuo 707,03±22,23 μmol/g iki 989,73±41,45 μmol/g (p<0,05), vidutiniškai 877±45,09 μmol/g. Didžiausias kiekis nustatytas Jonavoje 989,73±41,45 μmol/g, Balkasodžio kaime 932,97±76,44 μmol/g ir Lukšiuose 919,63±63,59 μmol/g. Mažiausiu redukciniu aktyvumu pasižymi žaliava, rinkta Upninkų kaime 707,03±22,23 μmol/g ir Kaune 789,68±72,34 μmol/g. Nustatyta, kad redukcinis aktyvumas statistiškai reikšmingai nesiskyrė tarp Utenos ir Balkasodžio kaimo, Lukšių, Klaipėdos, taip pat tarp Ruklos ir Lukšių, bei tarp Balkasodžio kaimo ir Lukšių, Klaipėdos Jonavos, todėl galima teigti, kad šiuose miestuose nustatytas vienodas redukcinis aktyvumas.Redukcinis aktyvumas paprastųjų juodgalvių žolėje pavaizduotas 15 pav.

15 pav. Redukcinis aktyvumas (μmol/g) P. vulgaris žolėje, surinktoje iš įvairių Lietuvos augaviečių,

masinio žydėjimo metu

Lyginant su kitų šalių tyrėjų duomenimis, mūsų atliktame tyrime nustatytas didelis redukcinis aktyvumas paprastųjų juodgalvių žolėje. Liang Feng ir kt. (Kinija, 2010 m.) atliktame tyrime paprastųjų juodgalvių žolėje nustatytas redukcinis aktyvumas siekė 0,1567 μmol/g [25]. Hua-Bin Li ir kt. (Kinija, 2008 m.) taip pat ištyrė paprastųjų juodgalvių žolės redukcinį aktyvumą, kuris siekė 56,08±0,56 μmol/g [43].

Sudaryta paprastųjų juodgalvių žolės redukcinio aktyvumo dendrograma, kurioje išskiriamos dvi pagrindinės grupės (16 pav.). Pirmajai grupei priklauso Upninkų kaime ir Kaune rinkta žaliava, kuri pasižymi mažiausiu redukciniu aktyvumu (vidutiniškai 748,36±42,91 μmol/g). Antroji grupė padalinta į kelis pogrupius. Pirmajam pogrupiui priskiriama Rukloje rinkta žaliava, kuri šioje grupėje pasižymi mažiausiu redukciniu aktyvumu, bet didesniu nei pirmojoje grupėje (856,23±24,94 μmol/g). Jonavoje, Balkasodžio kaime ir Utenoje rinkta žaliava pasižymi didesniu redukciniu aktyvumu nei pirmoje grupėje (vidutiniškai 942,67±51,84 μmol/g). Didžiausiu redukciniu aktyvumu pasižymi Klaipėdoje ir Lukšiuose rinkta žaliava (vidutiniškai 918,75±41,06 μmol/g).

16 pav. Paprastųjų juodgalvių žolės redukcinio aktyvumo dendrograma.

1-Jonava, 2-Rukla, 3-Utena, 4-Balkasodžio kaimas, 5-Lukšiai, 6-Upninkų kaimas, 7-Kaunas, 8 – Klaipėda.

Palygintos antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo dendrogramos. Upninkų kaime rinkta paprastųjų juodgalvių žolė patenka į dendrogramų grupes, kurios pasižymi mažiausiu antiradikaliniu ir redukciniu aktyvumu. Lukšiuose rinkta paprastųjų juodgalvių žolė priskiriama grupei, kuri pasižymi didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu, tačiau redukcinio aktyvumo dendrogramoje priskiriama mažiausio aktyvumo grupei. Didžiausiose antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo dendrogramų grupėse priskiriama Klaipėdoje rinkta paprastųjų juodgalvių žolė.

Redukcinio aktyvumo nustatymas P. vulgaris žolėje vegetacijos eigoje. Nustatytas redukcinis aktyvumas augalo vegetaciniais tarpsniais: vegetacijos pradžioje, masinio žydėjimo ir sėklų brandos metu. Skirtingu vegetaciniu laikotarpiu redukcinis aktyvumas statistiškai reikšmingai įvairuoja nuo 731,63±12,47 μmol/g iki 989,73±41,54 μmol/g (p<0,05), vidutiniškai 862±24,62 μmol/g. Mažiausias redukcinis aktyvumas nustatytas vegetacijos pradžioje 731,63±12,47 μmol/g (liepos

pabaiga). Vegetacijos eigoje redukcinis aktyvumas didėja, didžiausias redukcinė galia nustatyta masinio žydėjimo metu 989,73±41,54 μmol/g (rugpjūčio vidurys). Sėklų brandos pradžioje pastebimas nežymus sumažėjimas 889,69±54,49 μmol/g (rugpjūčio pabaiga). Redukcinės galios kitimas pavaizduotas 17 pav.

17 pav. Redukcinis aktyvumas (μmol/g) P. vulgaris žolėje vegetacijos laikotarpiu

Redukcinės galios nustatymas P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose. Didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas žieduose 934,40±4,48 μmol/g, lapuose 833,35±3,33 μmol/g. Mažiausiu redukciniu aktyvumu pasižymi stiebai 435,44±2,97 μmol/g (18 pav.).

18 pav. Redukcinis aktyvumas (μmol/g) P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose, masinio žydėjimo

3.4. Fenolinių junginių identifikavimas ESC metodu

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu paprastųjų juodgalvių žolėje identifikuoti fenoliniai junginiai: rutinas, rozmarino rūgštis, chlorogeno rūgštis. Šių junginių įvairavimas ištirtas įvairiose Lietuvos augavietėse, vegetacijos eigoje ir atskiruose augalo organuose (stiebuose, lapuose ir žieduose).

19 pav. Paprastųjų juodgalvių žolės ekstrakto chromatograma.

1 – rozmarino rūgštis, 2 – rutinas, 3 – chlorogeno rūgštis.

Rutino, rozmarino ir chlorogeno rūgšties nustatymas P. vulgaris žolėje, surinktoje iš skirtingų augaviečių. Rutino kiekis varijuoja nuo 3,90±0,11 mg/g iki 8,08±0,17 mg/g, vidutiniškai 5,42±0,17 mg/g. Didžiausias rutino kiekis aptiktas Utenoje 8,08±0,17 mg/g, Klaipėdoje 8,04±0,29 mg/g surinktuose P. vulgaris žolės ėminiuose. Mažiausias rutino kiekis nustatytas Kaune 3,90±0,11 µg/g surinktuose P. vulgaris žolės ėminiuose. Rozmarino rūgšties kiekis svyruoja nuo 2,92±0,84 mg/g iki 51,12±0,10 mg/g, vidutiniškai 37,86±1,07 mg/g. Didžiausiu rozmarino rūgšties kiekiu pasižymi žolė, rinkta Jonavoje 51,12±0,10 mg/g. Mažiausiu rozmarino rūgšties kiekiu pasižymi Kaune rinkta žaliava 29,22±0,84 mg/g (20 pav.).

20 pav. Rutino ir rozmarino rūgšties kiekis (mg/g) P. vulgaris žolėje, surinktoje iš įvairių Lietuvos augaviečių, masinio žydėjimo metu

Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyti rutino ir rozmarino rūgšties kiekiai yra didesni lyginant kitų šalių mokslininkų gautais duomenimis. 2011 m. Turkijoje Saliha Sahin ir kiti ištyrė paprastųjų juodgalvių žolę, rinktą birželio – liepos mėnesiais. Didžiausias aptiktas rutino kiekis 1,27±0,050 mg/g, rozmarino rūgšties 21,85±0,45 mg/g [45].

Lyginant su kitų mokslininkų Lamiaceae šeimos augaluose nustatytu rozmarino rūgšties kiekiu galima teigti, kad mūsų tiriamoje paprastųjų juodgalvių žolėje nustatytas didelis rozmarino rūgšties kiekis. 1999 m. Vengrijoje Gabor Janicsak ir kt tyrė rozmarino rūgšties kiekį Lamiaceae šeimos augaluose. Gautas rozmarino rūgšties kiekis įvairavo nuo 0,01 mg/g iki 9,30 mg/g [46]. Tai yra 5 kartus mažesnis kiekis nei mūsų atliktame tyrime. 2013 m. Kroatijoje, Zagrebe, Sanda Vladimir-Knežević ir kt. taip pat tyrė rozmarino rūgšties kiekį Lamiaceae šeimos augaluose. Rozmarino rūgšties kiekis įvairavo nuo 0,70 mg/g iki 61,05 mg/g , tačiau vidutiniškai tik 19,70 mg/g [47].

Chlorogeno rūgšties kiekis paprastųjų juodgalvių žolės ėminiuose įvairuoja nuo 0,44±0,01 mg/g iki 0,94±0,03 mg/g, vidutiniškai 0,64±0,02 mg/g. Didžiausiu chlorogeno rūgšties kiekiu pasižymi paprastųjų juodgalvių žolė, rinkta Balkasodžio kaime 0,94±0,03 mg/g, mažiausiu kiekiu pasižymi Jonavoje rinkta žaliava 0,44±0,01 mg/g (21 pav.). Lyginant su paprastųjų juodgalvių žolėje aptiktu rutino ir rozmarino rūgšties kiekiu, chlorogeno rūgšties aptinkama mažiausiai.

21 pav. Chlorogeno rūgšties kiekis (mg/g) P. vulgaris žolėje, surinktoje iš įvairių Lietuvos augaviečių, masinio žydėjimo metu

Atlikta paprastųjų juodgalvių žolėje ESC metodu aptiktų fenolinių junginių klasterinė analizė, pagal kurią sudaryta dendrograma (22 pav.). Išskiriamos dvi pagrindinės grupės. Pirmajai grupei priskiriama Jonavoje, Rukloje ir Kaune rinkta žaliava, kuri pasižymi mažiausiu rutino, chlorogeno ir rozmarino rūgšties kiekiu (vidutiniškai nustatomi kiekiai: rutino 4,12±0,12 mg/g, chlorogeno rūgšties 0,66±0,02 mg/g, rozmarino rūgšties 37,52±1,04 mg/g). Antrąją grupę galima išskirti į du pogrupius. Pirmajam pogrupiui priklauso Lukšiuose ir Upninkų kaime rinktos žaliavos, kurios pasižymi vidutiniu kiekiu rutino ir rozmarino rūgšties (rutino vidutiniškai: 4,94±0,15 mg/g, rozmarino rūgšties vidutiniškai: 35,87±1,03 mg/g). Lukšiuose rinkta žaliava pasižymi didžiausiu chlorogeno rūgšties kiekiu 0,94±0,03 mg/g. Antram pogrupiui priklauso Utenoje, Klaipėdoje ir Balkasodžio kaime rinktos žaliavos. Utenoje ir Klaipėdoje nustatyti didžiausi rutino ir chlorogeno rūgšties kiekiai (rutino vidutiniškai: 8,06±0,23 mg/g, chlorogeno rūgšies: 0,52±0,2 mg/g). Balkasodžio kaime rinkta žaliava pasižymi didžiausiu rozmarino rūgšties kiekiu 39,97±1,15 mg/g.

22 pav. Paprastųjų juodgalvių žolėje ESC metodu identifikuotų junginių dendrograma.

1-Jonava, 2-Rukla, 3-Utena, 4-Balkasodžio kaimas, 5-Lukšiai, 6-Upninkų kaimas, 7-Kaunas, 8 – Klaipėda

.

Rutino, rozmarino ir chlorogeno rūgšties nustatymas P. vulgaris žolėje vegetacijos eigoje. Nustatyti rutino, rozmarino ir chlorogeno rūgščių kiekiai augalo vegetaciniais tarpsniais: vegetacijos pradžioje, masinio žydėjimo ir sėklų brandos metu. Rutino kiekis maksimalią reikšmę pasiekia masinio žydėjimo metu 4,05±0,09 mg/g (rugpjūčio vidurys), sėklų brandos metu pastebimas sumažėjimas 2,73±0,08 mg/g (rugpjūčio pabaiga). Didžiausias rozmarino rūgšties kiekis nustatytas masinio žydėjimo metu 51,12±1,10 mg/g (rugpjūčio vidurys), sėklų brandos metu pastebimas sumažėjimas 31,57±0,91 mg/g (rugpjūčio pabaiga) (23 pav.).

Chlorogeno rūgšties didžiausi kiekiai nustatyti vegetacijos pradžioje 0,57±0,01 mg/g (liepos pabaiga) ir sėklų brandos laikotarpiu 0,53±0,02 mg/g (rugpjūčio pabaiga). Masinio žydėjimo metu chlorogeno rūgšties kiekis svyruoja nuo 0,43±0,01 mg/g iki 0,44±0,09 mg/g (24 pav.).

24 pav. Chlorogeno rūgšties kiekis (mg/g) P. vulgaris žolėje vegetacijos eigoje

Rutino, rozmarino ir chlorogeno rūgšties nustatymas P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose. Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas žieduose (rutino 1,62±0,06 mg/g, rozmarino rūgšties 32,95±1,19 mg/g, chlorogeno rūgšties 0,82±0,03 mg/g), mažiau nustatyta lapuose (rozmarino rūgšties 21,55±0,62 mg/g, chlorogeno rūgšties 0,33±0,01 mg/g), tačiau rutino nustatyta daugiau nei žieduose (2,76±0,08 mg). Mažiausi kiekiai fenolinių junginių randami stiebuose (rutino 0,48±0,01 mg/g, rozmarino rūgšties 10,38±0,22 mg/g, chlorogeno rūgšties 0,02±0,0005 mg/g) (25 pav.).

25 pav. Fenolinių junginių sudėtis (mg/g) P. vulgaris stiebuose, lapuose ir žieduose, masinio žydėjimo metu

3.5. Koreliacinių ryšių įvertinimas

Atlikta koreliacinė analizė pagal Pirsono koreliacijos koeficientą tarp antiradikalinio, redukcinio aktyvumo ir ESC metodu identifikuotų rutino ir rozmarino rūgšties (p<0,05). Nustatyta stipriausia priklausomybė tarp rozmarino rūgšties ir redukcinio aktyvumo (4 lentelė).

4 lentelė. Koreliacinių ryšių analizė tarp antioksidantinio aktyvumo ir ESC metodu identifikuotų fenolinių junginių

Rutinas Rozmarino rūgštis Antiradikalinis aktyvumas 0,289 0,035 Redukcinis aktyvumas 0,353 0,407

Atlikus koreliacinę analizę pagal Pirsono koreliacijos koeficientą nustatytas stiprus ryšys tarp antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo R=0,787, p<0,05. Taip pat nustatytas stiprus ryšys tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir redukcinės galios R=0,854, p<0,05, bei tarp bendro fenolinių junginių kiekio ir antiradikalinio aktyvumo R=0,767, p<0,05 (5 lentelė).

5 lentelė. Koreliacinių ryšių analizė tarp antioksidantinio aktyvumo ir bendro fenolinių junginių kiekio

Bendras fenolinių junginių kiekis

Antiradikalinis aktyvumas 0,767

Redukcinis aktyvumas 0,854

Priklausomybę tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo nustatė ir kitų šalių mokslininkai. 2010 m. Kinijoje Liang Feng ir kiti paprastųjų juodgalvių žolės ekstraktuose nustatė priklausomybę tarp fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo. Nustatyta stipri priklausomybė tarp fenolinių junginių ir antiradikalinio aktyvumo R=0.9988, bei tarp fenolinių junginių ir redukcinio aktyvumo R=0.9608 [25]. Remiantis gautais rezultatais galima teigti, kad antioksidantinis aktyvumas tiesiogiai priklauso nuo fenolinių junginių kiekio.

4. IŠVADOS

1. Bendras fenolinių junginių kiekis įvairiose augavietėse rinktose žolės ėminiuose įvairuoja nuo 64,77±3,29 mg/g (Kaune rinktoje žaliavoje) iki 91,21±2,79 mg/g (Jonavoje rinktoje žaliavoje), (p<0,05). Didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas masinio žydėjimo metu 91,21 mg/g.

2. Antiradikalinis aktyvumas įvairiose augavietėse rinktose žolės ėminiuose įvairuoja nuo 550,72±0.86 μmol/g (Upninkų kaime rinktoje žaliavoje) iki 1022,17±0,98 μmol/g (Klaipėdoje rinktoje žaliavoje), (p<0,05). Didžiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu 1016,15±11,16 μmol/g.

3. Redukcinis aktyvumas įvairiose augavietėse rinktose žolės ėminiuose įvairuoja nuo 707,03±22,23 μmol/g (Upninkų kaime rinktoje žaliavoje) iki 989,73±41,45 μmol/g (Jonavoje rinktoje žaliavoje), (p<0,05). Didžiausias redukcinis aktyvumas nustatytas masinio žydėjimo metu 989,73±41,45 μmol/g. 4. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu nustatyti junginiai: rutinas 3,90±0,11 mg/g iki 8,07±0,17 mg/g, rozmarino rūgštis 29,22±0,84 mg/g iki 51,12±0,10 mg/g, chlorogeno rūgštis 0,44±0,01 µg/g iki 0,94±0,03 mg/g. Didžiausias chlorogeno rūgšties kiekis nustatytas vegetacijos pradžioje 0,57±0,01 mg/g, rutino ir rozmarino rūgšties – masinio žydėjimo metu (atitinkamai 4,05±0,09 mg/g ir 51,12±1,10 mg/g).

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Ištyrus paprastųjų juodgalvių žaliavą vegetacijos eigoje nustatyta, kad vertingiausia paprastųjų juodgalvių žolę rinkti masinio žydėjimo laikotarpiu, nes šiuo vegetaciniu tarpsniu aptinkamas didžiausias fenolinių junginių kiekis ir nustatomas didžiausias antioksidantinis aktyvumas.

Dėl nustatyto antioksidantinio aktyvumo paprastųjų juodgalvių žaliavoje būtų naudinga tęsti šios žaliavos tyrimus įvairiose Lietuvos augavietėse augančioje žaliavoje. Ateityje paprastųjų juodgalvių žolė galėtų būti naudojama gaminant augalinius maisto papildus. Dėl aptinkamo didelio rozmarino rūgšties kiekio paprastųjų juodgalvių žolė galėtų būti perspektyvus rozmarino rūgšties šaltinis. Šiame darbe atliktas kiekybinis paprastosios juodgalvės žolės įvertinimas gali būti naudingas palyginimui su kitomis paprastųjų juodgalvių žolės cenopopuliacijomis tam, kad atrinkti aukščiausios kokybės paprastųjų juodgalvių žaliavą.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Integrated Taxonomic Information System. Prieiga per internetą:

http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=32381.

2. Jin Dai, Russe J. Mumper. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties. Molecules 2010, 15, 7313-7352.

3. Yu-Jin Hwang, Eun-Ju Lee, Haeng-Ran Kim and Kyung-A Hwang. NF-κB-Targeted Anti-Inflammatory Activity of Prunella vulgaris var. lilacina in Macrophages RAW 264.7. International Journal of molecular sciences 2013; 14(11): 21489–21503.

4. Yu-Jin Hwang, Eun-Ju Lee, Haeng-Ran Kim and Kyung-A Hwang. In vitro antioxidant and anticancer effects of solvent fractions from prunella vulgaris var. lilacina. BioMed Central 2013, 13:310.

5. Xuya Fang, Raymond Chuen-Chung Chang, Wai-Hung Yuen, Sze Yong Zee. Immune modulatory effects of Prunella vulgaris L. International Journal of Molecular medicine 2005. p. 491-496.

6. Saliha Şahin, Ferda Ari, Cevdet Demir and Engin Ulukaya. Isolation of Major Phenolic Compounds from the Extracts of Prunella L. Species Grown in Turkey and Their Antioxidant and Cytotoxic Activities. Journal of Food Biochemistry 2014 p. 248–257.

7. Andr s Mourea, Jose M. Cruza, Daniel Francob, J.Manuel Dom _{ngueza, Jorge Sineirob, Herminia} Dom ngueza, Mar a Jos N ezb, J.Carlos Parajóa. Natural antioxidants from residual sources. Food Chemistry, 2001, 145–171.

8. Juozas Jaskonis. Augalai – mūsų gyvenimas. Vilnius, 1996 p. 139-140.

9. Xiaojie Gu, Youbin Li, Jun Mu, Yi Zhang. Chemical constituents of Prunella vulgaris. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 55 (2011), 1227–1230.

10. The international plant names index. Prieiga per internetą:

http://www.ipni.org/ipni/simplePlantNameSearch.do?find_wholeName=prunella+vulgaris&output_for

mat=normal&query_type=by_query&back_page=query_ipni.html.

11. Ge Meng, Mei Wang, Kejie Zhang, Zengjun Guo, Juan Shi. Research Progress on the Chemistry and Pharmacology of Prunella vulgaris Species. Open Access Library Journal 2014, 1-19.

12. Yuhang Chen, Zaibiao Zhu, Qiaosheng Guo, Lixia Zhang And Xiaoming Zhang. Variation in concentrations of major bioactive compounds in Prunella vulgaris L. related to plant parts and phenological stages. Biol Res 2012, 45: 171-175.

13. Yubing Bai, Bohou Xia, Wenjian Xie, Yamin Zhou, Jiachi Xie, Hongquan Li, Duanfang Liao, Limei Lin, Chun Li. Phytochemistry and pharmacological activities of the genus Prunella. Food Chemistry 2016, 483–496.