2 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA Veterinarijos fakultetas
Tautvydas Bučnys
„Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė
šviežioje paukštienoje bei žaliame piene“
„Prevalence and species diversity of Arcobacter spp.
isolated from fresh poultry and raw milk“
Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų programos
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof., dr. Mindaugas Malakauskas
3 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė šviežioje paukštienoje bei žaliame piene“.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2015-04-30 Tautvydas Bučnys
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2015-04-30 Tautvydas Bučnys
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO
2015-04-30 Prof. dr. Mindaugas Malakauskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE Prof. dr. Mindaugas Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS
4 TURINYS SANTRAUKA ... 6 SUMMARY ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1 Arcobacter spp. genties bakterijos ... 10
1.1.1 Arcobacter spp. klasifikacija... 10
1.1.2 Morfologija ir biologinės savybės... 11
1.2 Arkobakterijų paplitimas maisto gamybos grandinėje ... 11
1.2.1 Maisto žaliavų užkrėstumas arkobakterijomis ... 11
1.2.2 Maisto produkų užkrėstumas arkobakterijomis ... 13
1.2.3 Arkobakterijų išgyvenimas maisto produktuose ... 14
1.3 Arkobakterijų sąsajos su žmonių susirgimais ŪŽIL ... 14
1.3.1 Žmonių arkobakteriozė ... 14
1.3.2 Galimi užsikrėtimo šaltiniai ... 15
1.3.3 Ligos simptomai ir patogenezė ... 15
1.3.4 Gydymas ir profilaktika ... 16
1.4 Arkobakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms ... 17
1.5 Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas ... 18
2. MEDŽIAGOS IR METODAI ... 21
2.1 Tyrimų planas ... 21
2.2 Arcobacter spp. išskyrimas iš maisto mėginių ... 21
2.3 Arkobakterijų identifikavimas PGR metodu ... 22
2.3.1 Arcobacter spp. DNR išskyrimas... 22
2.3.2 Arcobacter spp. identifikavimas PGR metodu ... 22
2.4 Atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas ... 23
2.5 Statistinė duomenų analizė ... 24
3. REZULTATAI ... 25
3.1 Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis ... 25
3.2 Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė ... 26
3.3 Arkobakterijų atsparumas antibiotikams ... 28
3.3.1 Arkobakterijų išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumas antibiotikams ... 28
5 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 30 5. IŠVADOS ... 35 6. REKOMENDACIJOS ... 36 7. PADĖKOS ... 37 8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 38
6 SANTRAUKA
Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė šviežioje paukštienoje bei žaliame
piene
Baigiamasis magistro darbas
Darbo vadovas: prof. dr. Mindaugas Malakauskas Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Veterinarijos akademija, Veterinarijos fakultetas Maisto saugos ir kokybės katedra
Kaunas, 2015
Darbo apimtis 41 puslapis, 6 lentelės, 6 paveikslai.
Darbo tikslas buvo įvertinti mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis. Tyrimo metu iš viso ištirta 50 šviežios paukštienos bei 60 žalio pieno mėginių. Arkobakterijos iš maisto mėginių buvo išskirtos atlikus selektyvų pagausinimą specifiniame Arcobacter sultinyje su penkių antibiotikų priedu, o po to tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro su CAT priedu. Arkobakterijos iki rūšies buvo identifikuojamos naudojant šiek tiek modifikuotą Douidah ir bendraautorių (2010) aprašytą PGR metodą. Taip pat atliktas iš maisto mėginių išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumo antibiotikams (ciprofloksacinui, eritromicinui, tetraciklinui, gentamicinui ir ceftriaksonui) įvertinimas agaro praskiedimo metodu.
Tyrimai parodė, kad 23 iš 50 tirtų šviežios paukštienos mėginių (46%) buvo užkrėsti
Arcobacter genties bakterijomis. Tuo tarpu žalio pieno mėginiuose šios bakterijos buvo rastos tik
11 iš 60 tirtų mėginių (18,22%). Šviežia paukštiena dažniausiai buvo užkrėsta A. butlzeri (69,56%), rečiau A. cryaerophilus (17,39%), A. cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%) rūšies arkobakterijomis. Žalias pienas buvo išskirtinai užkrėstas tik A. butzleri rūšies arkobakterijomis. Atlikus arkobakterijų, išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumą antibakterinėms medžiagoms nustatyta, kad A. cryaerophilus jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui ir ciprofloksacinui (MSK 4 µg/ml). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml). A. skirrowii atsparumas visiems tirtiems antibiotikams siekė 0,5 µg/ml.
Nustatyta, kad A. butzleri išskirtos iš šviežios paukštienos pasižymėjo didesniu atsparumu eritromicinui (MSK 16 µg/ml) ir ceftriaksonui (MSK 8 µg/ml) nei išskirtos iš pieno (MSK eritromicinui 8 µg/ml ir ceftriaksonui 4 µg/ml).
Raktiniai žodžiai: Arcobacter spp., užkrėstumas, paukštiena, žalias pienas, atsparumas antibiotikams.
7 SUMMARY
Prevalence and species diversity of Arcobacter spp. isolated from fresh poultry and raw milk Master thesis
Thesis supervisor: prof. dr. Mindaugas Malakauskas Lithuanian University of Health Science
Veterinary Academy Faculty of Veterinary
Departament of Food Safety and Quality Kaunas, 2015
The coverage of the work: 41 pages, 6 tables, 6 pictures.
The aim of this study was to evaluate contamination of fresh poultry and raw milk products with Arcobacter spp. sold at the retail sale. A total of 50 fresh poultry and 60 raw milk samples were collected and tested. Arcobacters from food samples were isolated by selective enrichment in Arcobacter broth with 5 antibiotics supplement and then accomplished dirrect inoculation on mCCDA agar with CAT supplement. Arcobacter species were identified by PCR method described by Douidah and co-authors (2010) with some modifications. Then was carried out evaluation of arcobacters, isolated from food samples, resistance to antibiotics (ciprofloxacin, erythromycin, tetracycline, gentamicin and ceftriaxone) by agar dilution method.
The study showed that out of the 50 tested fresh poultry samples 23 (46%) were contaminated with arcobacters while in raw milk samples these bacteria were found in 11 out of 60 tested samples (18,22%). Fresh poultry were contaminated mostly with A. butzleri (69,56%), following A.
cryaerophilus (17,39%), A. cibarius (8,69%) and A. skirrowii (4,34%). Raw milk was contaminated
only with A. butzleri. Examination of antibiotic resistance of Arcobacter spp. isolated from fresh poultry samples showed, that A. cryaerophilus strains were most sensitive to tetracycline (MIC 0,5 µg/ml), but resistant to erythromycin and ciprofloksacin (MIC 4µg/ml). A. cibarius strains were mosty sensitive to ciprofloksacin and tetracykline (MIC 0,5 µg/ml), but resistant to erythromycin (MIC 2 µg/ml). A. skirrowii resistance to all antibiotics was 0,5 µg/ml.
Our findings revealed that A. butzleri isolated from fresh poultry were characterized in higher resistance (erythromycin 16 µg/ml, ceftriaxone 8 µg/ml) then isolated from raw milk (erythromycin 8 µg/ml, ceftriaxone 4 µg/ml).
8 SANTRUMPOS µg – mikrogramai µm – mikrometrai µl – mikrolitrai ml – mililitrai pH – vandenilio potencialas bp – bazių pora DNR – deoksiribonukleorūgštis
rRNR – ribosominė ribonukleino rūgštis ELISA – imonofermentinis metodas KSV – kolonijas sudarantys vienetai MIC – minimali inhibuojanti koncentracija MSK – minimali slopinanti koncentracija df – laisvų narių skaičius
9 ĮVADAS
Arkobakteriozė – žmonių ūmi žarnyno infekcinė liga, kurią sukelia Arcobacter genčiai priklausančios bakterijos. Dauguma naminių gyvūnų ir paukščių yra dažnai užsikrėtę arkobakterijomis, tačiau jie suserga labai retai ir yra vienas iš pagrindinių šių patogeninių bakterijų rezervuaras. Gyvūnų mėsa skirta maistui dažniausiai užkrečiama arkobakterijomis skerdimo metu, o maisto produktai – kryžminės taršos būdu. Dažniausiai žmonių susirgimai arkobakterioze siejami su paukštienos ir jos subroduktų, nepasterizuoto pieno vartojimu, užterštu geriamuoju vandeniu arba higienos reikalavimų nesilaikymu maisto ruošimo metu [1].
Arkobakteriozė dažniausiai sukelia Arcobacter buzleri, Arcobacter cryaerophilus ir
Arcobacter skirrowii, tačiau yra ir kitų arkobakterijų rūšių, galinčių sukelti susirgimus žmonėms.
Tai ketvirta pagal dažnumą kampilobakteriozės tipo apsinuodijų sukėlėja. Nors yra atlikta nemažai eksperimentinių tyrimų, tačiau tikslios šią zoonozę galinčios sukelti sukeliančios infekcinės dozės nėra nustatyta. Visgi turima duomenų, kad didelę įtaką šiam susirgimui lemia ligonio organizmo atsparumas, amžius bei kitos individualios savybės. Paprastai arkobakteriozė pasireiškia gausia vandeninga diarėja su pilvo skausmais, pykinimu, vėmimu bei karščiavimu. Ligos simptomai gali trukti 2 – 5 dienas [1; 2; 3].
Kadangi Lietuvoje iš viso nėra jokių duomenų apie arkobakterijas ir jų paplitimą maisto produktuose, taip pat galimus susirgimus šia zoonoze, todėl siekėme būti vieni iš pirmųjų, atliekant tokio pobūdžio tyrimus Lietuvoje.
Darbo tikslas: įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis.
Darbo uždaviniai:
1. Įsisavinti naujausius Arcobacter spp. mikrobiologinius maisto produktų tyrimo metodus.
2. Įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp.
bakterijomis.
3. Įvertinti Arcobacter spp. rūšinę įvairovę šviežioje paukštienoje bei žaliame piene. 4. Nustatyti Arcobacter spp. bakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms.
10 1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Arcobacter spp. genties bakterijos
Arkobakterijų gentis priklauso Campylobacteracea šeimai. Pirmą kartą išskirtos iš galvijų abortuotų vaisių 1977m. [3]. Šis genties pavadinimas buvo suteiktas aerotolerantiškoms ir gebančioms vystytis žemoje temperatūroje bakterijoms. Šios bakterijos kaip patogenai plačiai paplitę maisto produktuose bei geriamajame vandenyje ir gali sukelti susirgimus žmonėms. A.
butzleri bei A. cryaerophilus buvo išskirtos iš klinikinių žmonių mėginių, sirgusių diarėja ar įvykus
abortui. Belgijoje ir Prancūzijoje šios minėtos dvi arkobakterijų rūšys dažniausiai aptinkamos klinikiniuose žmonių išmatų mėginiuose [4]. Taip pat šių rūšių bakterijos išskirtos ir iš mastitu bei diarėja sirgusių gyvulių. Kita arkobakterijų genties bakterijų rūšis – A. skirrowii siejama su chroniška diarėja vyresniems pacientams [2].
1.1.1 Arcobacter spp. klasifikacija
Šiuo metu Arcobacter genčiai priklauso 17 bakterijų rūšių: A. butlzeri, A. cryaerophilus (Grupės A ir B), A. skirrowii, A. nitrofigilis, A. cibarius, A. halophilus, A. molluscorum, A. defluvii,
A. marinus, A. trophiarum, A. mitily, A. thereius [3], A. cloacea, A. ellisii, A. bivalviorum, A. venerupis ir A. suis [5]. Pagal kilmę Campylobacter cryaerophila pervadinta į Arcobacter cryaerophilus. Vėliau viena iš šios bakterijos (Arcobacter cryaerophilus) padermių pervadinta į Arcobacter butzleri [6].
Kartu su Helicobacter, Wolinella ir Sulfurospirillum gentimis arkobakterijos sudaro svarbiausią rRNR VI superšeimą (1 pav.), arba yra priskiriamos Proteobacteria klasės ɛ grupės bakterijoms.
11 Iš visų 17 arkobakterijų rūšių - 11 (A. nitrofigilis, A. halophilus, A. molluscorum, A. defluvii,
A. marinus, A. mitily, A. cloacea, A. ellisii, A. bivalviorum, A. venerupis ir A. suis) dažniausiai
išskiriamos iš aplinkos mėginių, o likusios 6 (A. butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii, A.
trophiarum, A. cibarius ir A. thereius) išskiriamos iš klinikinių žmonių arba gyvūnų išmatų mėginių
[6].
A. skirrowii rūšis pirmiausia buvo išskirta iš ėriukų, sirgusių diarėja, vėliau taip pat išskirta iš
galvijų organų, kiaulių ir avių aborto liekanų, išmatų, vandens mėginių. Kita arkobakterijų genčiai priskiriama A. cibarius rūšis yra laikoma kaip artimiausias A. cryaerophilus filogenetinis kaimynas. Ir pirmiausia A. cibarius rūšis buvo išskirta iš paukščių skerdenų. A.thereius išskirta iš abortuotų kiaulių vaisių (paršelių) organų, taip pat ančių išmatų. A. mytili išskirta iš midijų. A.nitrofigilis yra azotą fiksuojanti bakterijų rūšis, išskirta iš pelkėse augančių Spartina alterniflora šaknų. A.halophilus išskirta iš vandens mėginių, paimtų netoli Havajų salų esančiose lagūnose [7; 8].
1.1.2 Morfologija ir biologinės savybės
Arcobacter spp. genties bakterijos yra mažos 0,2 – 0,4 µm. pločio ir 1 – 3 µm. ilgio, išlenktos
arba S formos, Gram neigiamos, sporų neformuojančios, tačiau gebančios sudaryti bioplėveles, lazdelės. Tai dažniausiai judrios, vieną poliarinį žiuželį turinčios bakterijos. Arkobakterijos gali augti 15 – 42˚C temperatūroje aerobinėmis ir anaerobinėmis sąlygoms bei joms nėra būtinas vandenilis (žr. 1 lentelę 11 psl.).
Jų gebėjimas augti 15˚C temperatūroje mikroaerofilinėmis sąlygomis būtent ir skiria nuo giminingų kampilobakterijų. Optimalus šių bakterijų pH yra 6 – 7 (A. butzleri) ar 7 – 7,5 (A.
cryaerophilus).
1.2 Arkobakterijų paplitimas maisto gamybos grandinėje
1.2.1 Maisto žaliavų užkrėstumas arkobakterijomis
Gyvūnai ir fekalijomis užterštas vanduo yra pagrindinis arkobakterijų šaltinis. Neretai arkobakterijomis būna užkrėsta ir žalia bei nepakankamai termiškai apdorota gyvūnų mėsa [9]. Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti aptinkamos ir sveikų gyvūnų ekskrementuose. Arkobakterijų paplitimas sveikų skerdžiamų naminių gyvūnų žarnyne ir fekalijose kelia didelę grėsmę mėsos bei skerdenos užkrėstumui šiomis bakterijomis. Tačiau arkobakterijos retai išskiriamos iš naminių paukščių virškinamojo trakto turinio, todėl skerdenos užterštumo šaltinis lieka iki galo neaiškus [3].
12 1 lentelė. Arkobakterijų biologinės savybės [3].
Bakterijų savybės 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Augimo sąlygos: + + + + V + + + N N N N Deguonis +25˚C Deguonis +37˚C - + V + - V + N + - + + Mikroaerobinės sąlygos +37˚C - + V + + - + V + - + + 2% NaCl V V V + - + + N N N N N 4% NaCl - - - + - + + + + - - +
Gebėjimas augti ant terpių:
+ - - - - - - N N - - -
Mitybinė terpė su 1% glicinu
MacConkey agaras V + V - + - - + N V + +
Minimal medium mitybinė terpė + + + - + - - - N - + - Fermentinis aktyvumas: + V + + V + - + - + + + Katalazė Oksidazė + + + + + + + + N N N N Ureazė - - - + - - - - + - Redukuoja nitratus + + V + - + + - + - + +
Indolo acetato hidrolizė + + + + + + + - + + + - 1 – A. thereius, 2 – A. butzleri, 3 – A. cryaerophilus, 4 – A. skirrowii, 5 – A. cibarius, 6 – A.
nitrofigilis, 7 – A. halophilus, 8 – A. mytili, 9 – A. marinus, 10 – A. trophiarum, 11 – A. defluvii, 12
– A. molluscorum.
+ ≥95% teigiamų padermių; - ≤11% neigiamų padermių; V 12 – 94% teigiamų padermių; N nėra nustatyta.
Pastaruosius 10 metų atlikta nemažai tyrimų, siekant nustatyti arkobakterijų paplitimą aplinkoje, maisto produktuose ir žaliavose. Japonijoje, Australijoje, Olandijoje, Belgijoje, Ispanijoje, Italijoje atliktų tyrimų metu nustatyta, kad paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis siekia nuo 23 – 100%, ir yra ženkliai didesnis nei paplitimas raudonoje mėsoje, pavyzdžiui, kiaulienoje ir jautienoje (2 – 51,5%). Tokie rezultatai sudaro prielaidas manyti, kad paukštiena gali būti arkobakterijų rezervuaras (žr. 2 lentelę) [10].
2011 metais Malaizijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad arkobakterijų paplitimas paukštienoje (krūtinėlė, sparneliai, šlaunelės) siekė 39% ir identifikuota išskirtinai A. butlzeri rūšis. Taip pat šviežia paukštiena (41%) buvo labiau užkrėsta arkobakterijomos negu šaldyta (37%) [10].
13 Arkobakterijų paplitimas paukštienoje yra didžiausias lyginant su kitais produktais ir siekia 24 – 96%, tuo tarpu kiaulienoje – 53%, jautienoje – 33 – 40%, jūros produktuose – 40%, vandenyje 3 – 50% [11].
2 lentelė. Arkobakterijų paplitimas gyvūninės kilmės maisto žaliavose [3].
Šalis Mėginių rūšis Arkobakterijų paplitimas (%)
Malaizija Jautiena 38
Belgija Jautiena 31,3
Australija Ėriena 15
Meksika Liesa kiauliena 51,5
JAV Kiauliena 54
Belgija Kiauliena 21
Airija Karvės pienas 46
Belgija Karvės pienas 3,18
1.2.2 Maisto produkų užkrėstumas arkobakterijomis
2014 metais Turkijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatytas karvių, buivolų pieno bei kaimiškų sūrių užkrėstumas arkobakterijomis. Karvės pieno užkrėstumas arkobakterijomis sudarė 36% ir dažniausiai aptinkamos A. butzleri (38.89%), A. cryaerophilus (22.23%), A. skirrowii (11.12%) bakterijų rūšys. Buivolų pieno užkrėstumas siekė 48% ir dažniausiai buvo aptinkamos A.
cryaerophilus (33.33%), A. cibarius (20.83%), A. butzleri (12.50%) rūšys. Atitinkamai šviežių
kaimiškų sūrių užkrėstumas Arcobacter spp. genties bakterijos sudarė 56%, iš kurių dažniausiai aptiktos A. skirrowii (28.57%), A. butzleri (21.43%) ir A. cryaerophilus (14.29%) rūšys [12].
Revez ir bendraautoriai (2013) Suomijoje atliko tyrimus, siekiant išsiaiškinti arkobakterijų paplitimą ir rūšinę įvairovę žaliame piene. Iš tirtų 177 pieno mėginių arkobakterijų atžvilgiu teigiamų nustatyta 26 (15% užkrėstumas) iš kurių – 25 A. butzleri ir 1 A. cryaerophilus. Svarbu tai, kad šios dvi rūšys buvo rastos tame pačiame mėginyje. Brazilijoje ir Turkijoje atlikti panašaus pobūdžio tyrimai, kurie parodė esant mažesnį pieno užkrėstumą arkobakterijomis, atitinkamai 3% ir 6% [13].
Čilėje 2010 – 2013 metais vykdomi tyrimai, siekiant nustatyti galimą arkobakterijų paplitimą dvigeldžiuose moliuskuose. Tyrimo laikotarpiu surinkta ir ištirta 106 mėginiai – 21 jūros moliuskas, 18 midijų, 20 austrių, 20 pailgųjų moliuskų, 11 šukučių ir 16 makrelių. Didžiausias arkobakterijų paplitimas nustatytas makrelėse ir siekė 87,5%, pailguosiuose moliuskuose 65%, midijose 33%,
14 jūros moliuskuose 23,8%, šukutėse 18% ir austrėse 15%. Bendras dvigeldžių moliuskų užkrėstumas siekė 40,5%. Dažniausiai aptinkama arkobakterijų rūšis A. butzleri (62%), A. cryaerophilus (21%),
A. skirrowii (16%) ir A. defluvii (1%). Tokie atlikto tyrimo rezultatai rodo, kad moliuskai gali būti
vienas iš arkobakteriozės užsikrėtimo šaltinių [14].
1.2.3 Arkobakterijų išgyvenimas maisto produktuose
Atlikti tyrimai, kuriais įrodyta, kad A. butzleri negali išgyventi paukštienoje 5˚C temperatūroje, esant pH=5, arba kai pH=9, o NaCl koncentracija siekia 8% [15].
Optimali vystymosi temperatūra yra 25 – 35˚C, bet gali svyruoti 15 – 37˚C temperatūros ribose. Tačiau nors ir ne taip intensyviai gali augti +4 – 8˚C temperatūroje. A. butzleri gali išgyventi bei daugintis +5˚C temperatūroje, ir tai reiškia, kad šios bakterijos geba išlikti skerdyklų aplinkoje bei laikino sandėliavimo sąlygose šaldytuvuose [16].
Arkobakterijos geba daugintis esant 3,5% – 4% NaCl, o išgyventi esant ir 5% NaCl (paprastai maisto produktuose NaCl koncentracija siekia apie 2%) [3].
A. butzleri esant 64% santykinei drėgmei gali net 4 paras išbūti prisitvirtinusi prie
nerūdijančio plieno, stiklinių bei plastikinių paviršių [17]. Tačiau nuvalius minėtus paviršius 10% etanolio tirpalu, šios bakterijos yra visiškai sunaikinamos [18].
Arcobacter spp. bakterijos gali būti inaktyvuojamos pakaitinant maisto produktus iki +70˚C
temperatūros ir veikiant jonizuojančia spinduliuote (0,27 – 0,30kGy) 10 sekundžių. >0,2% acto bei citrinų rūgščių panaudojimas – efektyvi priemonė sumažinant produktų užkrėstumą A. butzleri bakterijomis. Chloras taip pat gali būti naudojamas A. butzleri inaktyvavimui. Tinkamas vandens chloravimas galėtų ženkliai sumažinti su užterštu vandeniu užsikrečiamos arkobakteriozės atvejų skaičių [3].
1.3 Arkobakterijų sąsajos su žmonių susirgimais ŪŽIL
1.3.1 Žmonių arkobakteriozė
Žmonėms susirgimus dažniausiai sukelia A. butzleri rūšis siejama su septicemija ir enteritu, tačiau A. cryaerophilus ir A. skirrowii buvo išskirtos iš pacientų, sirgusių diarėja, išmatų mėginių. Arkobakterijozės simptomai yra panašūs į kampilobakteriozės, tačiau su ilgesne vandeninga, kartais iki dviejų mėnesių trunkančia, diarėja. A.butzleri buvo nustatyta kaip ketvirta pagal dažnumą kampilobakteriozės tipo apsinuodijimų sukėlėja Belgijos bei Prancūzijos pacientams ir dažniausiai nustatyta vaikams bei vyresnio amžiaus asmenims, sergantiems lėtinėmis ligomis. A. cryaerophilus
15 išskirta iš pacientų, sirgusių diarėja ir septicemija, kai tuo tarpu A. skirrowii išskirta iš vyresnių pacientų, sirgusių diarėja [10].
Atlikta studija tyrimų, siekiant išsiaiškinti Campylobacter, Helicobacter ir Arcobacter genties bakterijų paplitimą iš Pietų Afrikos pacientų, sergančių ir nesergančių ŽIV, išmatų mėginių. Nustatyta, kad A. butzleri buvo trečia pagal dažnumą nustatoma bakterijų rūšis (6,2%), po
Helicobacter pylori (50,6%) ir C. jejuni (10,2%). Visai neseniai išsiaiškinta, kad Arcobacter spp.
bakterijos gali būti siejamos su europiečių, keliaujančių po Meksiką, Gvatemalą ir Indiją, ūmiais žarnyno apsinuodijimais (8% paplitimas) [1].
Arkobakterijos gali būti išskirtos ir iš sveikų žmonių išmatų mėginių. Šveicarijos skerdykloje iš sveikų darbuotojų 1,4% išmatų mėginių buvo išskirtos A. cryaerophilus rūšies bakterijos. Kito Pietų Afrikoje atlikto tyrimo metu A. bulzleri nustatyta 8,8% sveikų asmenų išmatų mėginiuose, tačiau diarėja sergančių žmonių mėginiuose šios bakterijos buvo aptinkamos dažniau (12,9%) nei žmonių, kuriems nepasireiškė jokie susirgimo požymiai[1].
1.3.2 Galimi užsikrėtimo šaltiniai
Arkobakterijų paplitimas vandenyje ir gyvūninės kilmės maisto produktuose, - tokiuose kaip paukštiena, kiauliena ir jautiena, yra laikomas kaip pagrindinis arkobakteriozės užsikrėtimo šaltinis žmonėms [19].
Be to, tyrimais įrodyta, kad žmonių kontaktas tarpusavyje ir su gyvūnais gali būti užsikrėtimo arkobakterioze priežastis [20].
Taip pat arkobakterijų užsikrėtimo šaltiniu laikomi ir naminiai gyvūnai, pavyzdžiui, avys ir ožkos. 2011 metais Belgijoje atlikti tyrimai, kurių metu nustatyta, kad iš 153 avių išmatų mėginių arkobakterijų atžvilgiu teigiamų nustatyta 66 (43,1%), atitinkamai ožkų – 19 iš 177 (10,7%). Pabrėžtina, kad nustatytos dominuojančios rūšys priklausė A. butzleri ir A. cryaerophilus. Tačiau iš šių naminių gyvūnų pieno mėginių arkobakterijų nebuvo išskirta [21].
Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti siejamos su susirgimais sukeltais C. jejuni, C.
coli, C. concisus ir H. pylori bakterijomis [1].
1.3.3 Ligos simptomai ir patogenezė
Pagrindiniai žmonių arkobakteriozės susirgimo požymiai: gausi vandeninga diarėja su pilvo skausmais, pykinimas, vėmimas, karščiavimas, smegenų pažeidimai [22]. Taip pat manoma, kad
A.butzleri gali būti susijusi su kitų organų kolonizacija ir su tuo susijusiomis komplikacijomis –
16
A. butzleri protrūkio Italijos mokykloje metu susirgo 10 vaikų, iš kurių 3 buvo hospitalizuoti.
Pagrindiniai ligos simptomai nustatyti kaip pasikartojantys pilvo diegliai su arba be diarėjos. Turima duomenų, kad arkobakterijos gali būti perduodamos motinų vaisiui transplacentiniu keliu ir gali sukelti nėščiosioms gimdos kraujavimą [1].
Kol kas nėra žinių, kaip arkobakteriozė susijusi ligonių amžiumi bei imunine būkle. Tačiau Samie ir kt. nustatė mažesnį arkobakterijų paplitimą (3%; 2/67) sveikų mokyklinukų (3 – 15 metų amžiaus) tarpe lyginant su tokio paties amžiaus hospitalizuotų vaikų (10,4%; 12/115) [23].
Net ir po dviejų Arcobacter spp. genties bakterijų tyrinėjimo dešimtmečių yra mažai žinių apie infekcinę dozę bei patogeniškumą. Vaivorykštinių upėtakių užkrėtimas 2,25x104 A.
cryearophilus lėmė 100% mirtingumą su pažeistomis žiaunomis, kepenimis, inkstais [25]. O
albinoses laboratorines žiurkes užkrėtus 109 KSV/ml. A. butzleri ir A. cryaerophilus buvo nustatytas 100% arkobakteriozės sergamumas, tačiau nebuvo nustatyta mirties atvejų [26]. Kito tyrimo metu vienos dienos paršeliai buvo užkrėsti skirtingų rūšių arkobakterijomis, kurios kolonizavo virškinamąjį traktą ir buvo vėliau išskiriamos su ekskrementais, tačiau tik A. butzleri gebėjo kolonizuoti kitus organus – kepenis, inkstus, nervinį audinį [3].
1.3.4 Gydymas ir profilaktika
Gydymas antibiotikais skiriamas esant sunkiai ligos eigai ir sisteminei arkobakteriozei. Gydymui gali būti skiriami tokie antibiotikai kaip cefoperazonas, fluorochinolonai ir tetraciklinas [1; 27; 28]. Pernelyg didelis ir nepagrįstas antibiotikų naudojimas gydant tokias zoonozes, kaip kampilobakteriozė ar salmoneliozė, leido arkobakteriozės sukėlėjams tapti atspariems ampicilinui, chloksacilinui, azitromicinui, klindamicinui [27; 29].
Profilaktikos priemonės, kurios galėtų apsaugoti žmones nuo susirgimų arkobakterioze būtų šios:
laikytis švaros,
vengti kontakto su naminiais gyvūnais,
atskirti žaliavą ir pagamintą maistą,
maistą kruopščiai termiškai apdoroti,
maistą laikyti saugioje temperatūroje,
17 1.4 Arkobakterijų atsparumas antibakterinėms medžiagoms
Arkobakterijos, kaip parodė tyrimai, yra atsparios tokiems antibiotikams kaip eritromicinas bei ciprofloksacinas, kurie yra naudojami kampilobakteriozės gydymui. Manoma, kad A. butzleri ir
A. cryaerophilus yra jautresnės rezveratroliui nei kitos Gram neigiamos bakterijos [30].
Yesilmen ir bendraautoriai atliko arkobakterijų, išskirtų iš karvių, buivolų pieno bei šviežių kaimiškų sūrių, atsparumo antibiotikams tyrimus. Rezultatai parodė, kad A. cryaerophilus buvo atspari cefoperazonui, kloksacilinui ir penicilinui G. Tačiau papildomai A. butzleri ir A. skirrowii izoliatai buvo atsparūs tetraciklinui, ampicilinui ir eritromicinui [12].
2013 metais Portugalijoje atlikti tyrimai, siekiant nustatyti iš paukščių skerdyklos išskirtų arkobakterijų atsparumą antibakterinėms medžiagoms (žr. 3 lentelę). Iš išskirtų 43 A. butzleri izoliatų nustatyta, kad visi jautrūs gentamicinui, 2,3% atsparūs chloramfenikoliui, kai tuo tarpu 24 padermės (55,8%) buvo atsparios ciprofloksacinui [28].
3 lentelė. 43 A. butzleri izoliatų atsparumas antibiotikams [28].
Antibiotikai Minimali slopinanti koncentracija (MSK)a MSK50 (mg/L)b MSK90 (mg/L)c MSK riba Atsparių izoliatų skaičius (%) Ampicilinas ≥32 128 256 1/>256 42 (97,7) Ciprofloksacinas ≥4 4 >8 0.03/>8 24 (55.8) Vankomicinas ≥32 >512 >512 512/>512 43 (100) Trimetoprimas ≥16 >512 >512 >512 43 (100) Piperacilinas ≥128 512 >512 8/>512 42 (97,7) Cefoperazonas ≥64 >512 >512 16/>512 42 (97,7) Chloramfenikolis ≥32 8 16 4/32 1 (2,3) Gentamicinas ≥8 0,5 1 0.125/1 0 (0) Amoksicilinas ≥32 64 128 1/128 42 (97,7)
a MSK – atsparumo antibiotikams riba; jei bakterijos gali augti esant didesnei antibiotiko koncentracijai terpėje nei
nurodyta MSK, jos yra laikomos atspariomis
b, c MSK
50 ir MSK90 parodo koncentraciją (mg/L), prie kurios 50% ir 90% tirtų izoliatų augimas buvo slopinamas
18 2 pav. A. butzleri atsparumas antibakterinėms medžiagoms [31].
Kito Malaizijoje atlikto tyrimo metu siekta išsiaiškinti iš kliniškai sveikų galvijų, ožkų bei geriamojo vandens išskirtų A. butzleri izoliatų atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Tyrimo rezultatai pateikti aukščiau esančiame paveiksle (2 pav.).
Išsiaiškinta, kad tik 1 A. butzleri izoliatas buvo jautrus visiems 9 tirtiems antibiotikams. Nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijų padermės dažniausiai buvo atsparios ampicilinui (55,6%), cefatoksimui (33,4%) ir ciprofloksacinui (33,4%). Šis tyrimas atskleidė, kad net 20% tirtų izoliatų buvo atsparūs 4 ir daugiau antibiotikų. Remiantis šio tyrimo rezultatais buvo padaryta išvada, kad gentamicinas ir enrofloksacinas galėtų būti naudojami arkobakteriozės gydymui [31].
1.5 Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas
Houf ir bendraautoriai (2001) paskelbė daug metodų ir įrodė, kad naudojant mikroaerobinę aplinką sudarančias sistemas, galima išskirti arkobakterijas iš klinikinių mėginių. Arkobakterijų patvirtinimas iš maisto ir aplinkos mėginių gali užtrukti iki 6 dienų, tai sukelia sunkumų protrūkių metu. Naudojant įvairius metodus galima sutrumpinti arkobakterijų išskyrimo ir patvirtinimo laiką. Šių bakterijų identifikavimui paprastai reikalingas bakterijų pagausinimas [32].
Imunologiniai metodai
Arkobakterijos sukelia užkrėstų šeimininkų antikūnų atsaką ir šitie baltymai gali būti naudojami greitam patogenų išaiškinimui ir/arba patvirtinimui maiste. Antolin ir kt. (2001) apibūdino PGR – ELISA metodą arkobakterijų aptikimui ir išskyrė šios rūšies bakterijas iš paukštienos mėginių. PGR tyrimų taikinys yra arkobakterijų DNR oligonukleotidų zondų 16S rRNR tarpgeninės sritys. Šie tyrimai parodė, kad PGR – ELISA metodo pagalba galima aptikti arkobakterijas ir iki galo identifikuoti pagausintuose paukštienos mėsos mėginiuose [33].
19 Fenotipinis metodas
Arkobakterijos neretai nustatomos remiantis klasikinėmis fenotipinėmis savybėmis, įskaitant kolonijų morfologiją, judrumą, katalazės, ureazės, nitratų rekukcijos testais, indoksilo acetato hidrolize, jautrumu antibiotikams (cefoperazonas, trimetoprimas) [1]. Klasikinio fenotipinio identifikavimo metodo trūkumas yra tas, kad rūšių išskyrimas dažnai remiasi viena ar dviem skirtingomis charakteristikomis, pavyzdžiui, katalazės ir ureazės aktyvumu. Tai sukelia problemų identifikuojant rūšis, kai išimtinai taikomas tik fenotipinis tyrimas, tačiau šis metodas dažniausiai naudojamas išskirti Arcobacter spp. įprastose laboratorijose. Norint tiksliai nustatyti kitas arkobakterijas reikia atlikti papildomus biocheminius testus ir/arba molekulinius metodus.
Molekuliniai metodai
DNR paremti aptikimo metodai, tokie kaip PGR, yra naudojami arkobakterijoms identifikuoti. Priešingai nei klasikiniais metodais, kai nustatomos tik gyvos, galinčios augti bakterijos, genomu paremti metodai aptinka DNR tiek iš gyvų, tiek mirusių bakterijų. Tai nesudaro problemų, kada mėginiai yra šviežių išmatų arba iš aklosios žarnos su dideliu skaičiumi gyvybingų arkobakterijų, tačiau yra rimtų sunkumų, kada tiriami aplinkos ar maisto mėginiai, kuriuose yra ir gyvų, ir mirusių bakterijų. Pavyzdžiui, keptoje paukštienoje arba pasterizuotame piene bus didelis skaičius žuvusių – negyvybingų arkobakterijų. Šis molekulinių metodų trūkumas yra susijęs ne tik su arkobakterijomis, bet ir su kitais mikroorganizmais.
PGR metodo atradimas sukėlė tikrą revoliuciją molekulinės biologijos technologijų, taikomų biologijos bei medicinos mokslų tyrimuose, medicininėje diagnostikoje bei teismo medicinos praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika, leidžianti padauginti DNR fragmentus nuo pikograminių iki mikrograminių kiekių. Žurnalas „Science” 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu metų mokslo įvykiu. PGR metodo esmė yra individo DNR fragmento padauginimas, dalyvaujant fermentui polimerazei [34].
Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) - tai nebrangus ir greitas specifinių DNR atkarpų pagausinimo (amplifikacijos) metodas, galintis per keliolika minučių pagaminti tūkstančius specifinių DNR fragmentų iš nedidelio kiekio DNR.
PGR ciklas susideda iš 3 etapų:
1. DNR išvyniojimas: aukštoje temperatūroje dviguba DNR grandinė išsivyniojama ir tampa prieinama jungčiai su vienos DNR grandinės specialiai tam pagamintais 2 pradmenimis; 2. Pradmenų prijungimas: sumažinus temperatūrą, DNR pradmenys prisijungia prie bandomos
20 3. DNR sintezė: pakėlus temperatūrą, pradedant nuo pradmens, sintetinama nauja DNR grandinė DNR polimerazės enzimo pagalba pagal bandomos DNR nukleotidų sekas. Ciklas kartojamas kelis kartus, kuo daugiau ciklų tuo daugiau pagaminama DNR fragmentų. Siekiant aptikti arkobakterijų genties bakterijas naudojamas 16S arba 23S rRNR regionas, kuris yra PGR taikinys, nors mažiau specifiniai lokusai yra skirti nustatyti konkrečias rūšis. Tradicinis PGR aptikimas reikalauja didesnės darbuotojų techninės patirties, kurios reikia siekiant išvengti kryžminės amplifikuotos DNR taršos. Dėl šios ir kitų priežasčių buvo sukurta tikro laiko PGR. Metodo privalumas yra tai, kad gausinimo reakcijos metu padauginama ne viena, o keletas DNR sekų. Dauginės PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dėmesio reakcijos sąlygų optimizacijai. Tai pradmenų koncentracija, PGR buferio sudėtis, magnio chlorido ir nuleozidtrifosfatų (dNTP) koncentracijų balansas, DNR mėginio ir termostabilių polimerazių koncentracija bei gausinimo režimas. Didžiulis metodo jautrumas gali kelti problemų – reikia labai saugotis, kad į PGR skirtą reakcijos mišinį nepatektų šalutinės DNR priemaišos [35]. Sėkminga dauginės PGR optimizacija padidina reakcijos jautrumą, specifiškumą, pagerina netolygų analizuojamų sričių gausinimo efektyvumą [34].
21 2. MEDŽIAGOS IR METODAI
2.1 Tyrimų planas
Tyrimai buvo atlikti LSMU Veterinarijos akademijoje Maisto saugos ir kokybės katedros Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje. Siekiant įvertinti šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis, mėginiai tyrimams rinkti 2014 m. vasario – gegužės ir rugsėjo – spalio mėnesiais. Iš viso surinkta 110 mėginių – 60 žalio pieno (1 mėginys – 1l. pieno) bei 50 šviežios paukštienos (1 mėginys – 1 paukštienos blauzdelė). Šviežios paukštienos bei žalio pieno mėginiai buvo renkami pirmadieniais Kauno mieste esančiose turgavietėse bei prekybos centruose, iš čia esančių žalio pieno pardavimo automatų. Vidutiniškai per savaitę buvo ištiriama 10 mėginių – vieną savaitę buvo tiriami paukštieno mėginiai, kitą – pieno mėginiai. Iki tyrimo mėginiai saugoti šaldytuve +4o C temperatūroje ne ilgiau kaip 12 valandų.
Tyrimai atlikti etapais: 1) arkobakterijų išskyrimas iš maisto mėginių; 2) arkobakterijų identifikavimas PGR metodu; 3) išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas; 4) statistinė duomenų analizė.
2.2 Arcobacter spp. išskyrimas iš maisto mėginių
Arkobakterijų išskyrimas iš maisto mėginių atliktas naudojant selektyvų pagausinimą. Pristačius mėginius į laboratoriją steriliomis priemonėmis tyrimui buvo paimama 1g tiriamos paukštienos arba 1ml žalio pieno. Tyrimui skirta mėginio dalis perkelta į homogenizavimo maišelį užpiltant 9 ml Arcobacter selektyvaus pagausinimo sultinio (CMO 965 Oxoid., LTD., Basingstoke, Hampshire, England) su penkių antibiotikų priedu: 5 – fluorouracilo (100mg/l)(F6627–5G, Sigma– Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA), amfotericino B (10mg/l)(A9528–100MG, Sigma–Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA), cefoperazono (16mg/l)(C4292–1G, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA), novobiocino (32mg/l)(N1628–1G, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA) trimethoprimo (32mg/l)(T7883–5G Sigma–Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA). Toliau paukštienos mėginiai buvo homogenizuoti persitaltinėje maišyklėje (BagMixer, Interscience 78860 st. Nom – France), pieno mėginiai – išmaišant homogenizavimo maišelio turinį purtymo būdu. Taip paruošti mėginiai inkubuoti +30˚C temperatūroje 24 valandas termostate aerobinėmis sąlygomis.
Po selektyvaus pagausinimo arkobakterijos išskirtos užsėjant 20µl pagausinimo sultinio iš homogenizavimo maišelio ant Petri lėkštelių su mCCDA agaru (Campylobacter Blood Free Medium Base, Liofilchem s.r.l. Bacteriology products, Italy) su priedais (1– Campylobacter CCDA Supplement Ref. 81037, Liofilchem s.r.l. Roseto D.A. – Italy; 2 – C.A.T. Selective Supplement
22 SR0174E, Oxoid LTD., Basingstoke, Hampshire, England). Užsėtos Petri lėkštelės inkubuotos aerobinėmis sąlygomis +30˚C temperatūroje 48 valandas.
Po inkubavimo būdingos arba į arkobakterijas panašios kolonijos nuo Petri lėkštelių su mCCDA agaru inokuliacine kilpele persėtos ant Petri lėkštelių su 5% defibrinuoto arklio kraujo agaru (Blood Agar Base Nr.2 ISO 10560, Liofilchem s.r.l. Bacteriology products, Italy; Lysed Horse Blood. Ref: HBL 100, E & Labaratories Limited, Burnhouse, Bannybridge, Scotland). Užsėtos lėkštelės inkubuotos +37˚C temperatūroje 48 valandas termostate aerobinėmis sąlygomis. Iš kiekvieno mėginio buvo persėjamos po 3 būdingos arba įtariamos kolonijos tolimesniems tyrimams.
2.3 Arkobakterijų identifikavimas PGR metodu
2.3.1 Arcobacter spp. DNR išskyrimas
Po inkubavimo, nuo Petri lėkštelių inokuliacine kilpele paimtos kelios įtartinos arkobakterijų kolonijos (0,5 – 1mm pilkai baltos, apvalios kolonijos) ir perkeltos į mėgintuvėlį su 200µl „PrepMan Ultra“ DNR išskyrimo tirpalo (Applied Biosystems by Life Technologies, 2130 Woodward St. Austin, TX 788744, USA) ir išmaišyta su purtykle (Bio Vortex V1, Profitec, Gunnar Holm – Petersen, GmbH and Co, Hamburg, Germany). Toliau mėgintuvėlis perkeltas į termomikserį (Thermomixer compact, Eppendorf AG, Hamburg, Germany), ir kaitintas prie +99oC temperatūros 10 minučių. Tada mėgintuvėliai buvo centrifūguojami 16 000 aps./min. greičiu ir paimta 150µl viršutinio „PrepMan Ulta“ tirpalo, ir perkelta į kitą Epindorfo mėgintuvėlį. Mėgintuvėliai vėl buvo centrifūguojami tomis pačiomis sąlygomis ir po centrifugavimo 70µl viršuje esančio „PrepMan Ulta“ tirpalo su DNR buvo perkelta į naujus mėgintuvėlius, kurie iki tolesnio tyrimo saugoti -20˚C temperatūroje.
2.3.2 Arcobacter spp. identifikavimas PGR metodu
Į 200µl PGR mėgintuvėlį buvo įpilama 12,5µl DreamTaq Green PCR Master Mix(2x) mišinio (#K1081 1,25ml LOT 00121201, Thermo Scientific), po 1µl pradmenų (ButR, SkiR, Ther R, CibR, ArcoF, Gyras F ir Gyras R (Thermo Fisher Scietific, Life technologies, Invitrogen Custom Primers), 0,5µl tiriamosios bakterijų DNR ir 5µl sterilaus vandens (Water, nuclease – free 1,25ml #R0581, LOT 00117365, Thermo Scientific). Reakcijos mišinį viso sudarė 25µl. PGR reakcija vykdyta termocikleryje (Programmable Thermal Controller PTC – 100 SN:19176, MJ Research Inc., Grove Street, Watertown, USA), esant tokioms sąlygoms (4 lentelė):
23 1. Pradinė denatūracija (94˚C 3min.)
2. Denatūracija (94˚C 45 s.)
3. Pradmenų prilipinimas (58˚C 45 s.) 4. Sintezė (72˚C 2 min.)
5. Galutinė sintezė (72˚C 5 min.)
4 lentelė. Polimerazinės grandininės reakcijos sąlygos
Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
94˚C 3 min. 1 94˚C 45 sec. 30 58˚C 45 sec. 72˚C 2 min. 72˚C 5 min. 1 4˚C - - Viso: 2 val. 32
Po DNR amplifikacijos į paruoštus 2% agarozės gelio (TopVision Agarose #R0491, LOT 00220705, Thermo Scientific) šulinėlius (pirmą ir paskutinį) buvo atmatuojama po 3µl DNR žymeklio (GeneRuler 100bp Plus DNA Ladder, #SM0323, LOT 00117273, Thermo Scientific), o į likusius po 11µl PGR produkto. Lovelis su geliu buvo įstatomas į elektroforezės vonelę pripildytą buferiu (10xTBE Electrophoresis Buffer #B52, LOT 00114844, Thermo Scietific, Fermentas). Elektroforezė vykdyta naudojant 120 V elektros srovę, kurios dažnis 98 mA, 1 valandą. Pasibaigus elektroforezei, agarozės gelis perkletas į BioRAD (Molecular Imager Gel Doc XR+) aparatą ir Image Lab kompiuterinės programos pagalba padaryta agarozės gelio fotografija, naudojant ultravioletinius spindulius.
2.4 Atsparumo antibakterinėms medžiagoms nustatymas
Arkobakterijų atsparumas antibiotikams buvo nustatytas agaro praskiedimo metodu užsėjant atskiras šių bakterijų padermes ant paruoštų Petri lėkštelių su Mueller – Hinton agaru ir 5% defibirinuoto avies kraujo priedu (Mueller Hinton Agar Ref. 610033, LOT 12159202 Liofilchem, Italy; Defibrinated Sheep Blood 25ml, Ref. DSC025, LOT 70423168, E&O Labaratories Limited, Burnhouse, Bonnybridge, Scotland) bei su skirtingomis antibiotikų koncentracijomis. Tyrimui buvo pasirinkti 5 skirtingi antibiotikai (gentamicinas G3632–1G, cefriaksonas C5793–250MG,
24 eritromicinas E5389–1G, ciprofloksacinas 17850–5G–F ir tetraciklinas T3258–5G Saint Louis, Missouri, USA) ir 7 skirtingos šių antibiotikų koncentracijos: 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32 (µg/ml).
Tyrimams buvo paruošta bakterijų suspensija atitinkanti 109 KSV/ml bakterijų kiekį (vertinant spektrofotometru bakterijų suspensijos optinį tankį OD600). Kiekvienos tiriamos padermės taip paruoštos suspensijos pipete 5 µl buvo perkeliami ant atitinkamos koncentracijos Petri lėkštelių su atitinkamais antibiotikais.
Taip užsėtos Mueller – Hinton agaro lėkšteles su antibiotikais inkubuotos +37˚C temperatūroje 16 – 20 valandų termostate aerobinėmis sąlygomis. Vertinta kaip antibakterinės medžiagos slopino bakterijų augimą ir kokia buvo minimali augimą slopinanti antibiotikų koncentracija.
2.5 Statistinė duomenų analizė
Statistiškai duomenys buvo įvertinti Microsoft Office Excel 2007 programa ir SPSS 16.0 programiniu paketu, apskaičiuojant rodiklių statistinį patikimumą, o skirtumai tarp imčių besiskiriančių pagal vieną požymį buvo vertinami skaičiuojant vienfaktorinę ANOVA analizę.
25 3. REZULTATAI
3.1 Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis
Mūsų atlikti tyrimai parodė, kad šviežios paukštienos mėginių užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis buvo labai didelis ir siekė net 46%, t.y., iš 50 tirtų paukštienos mėginių arkobakterijos buvo aptiktos 23 mėginiuose (df=50, p<0,001) (žr. 2 pav.). Tuo tarpu tirti žalio pieno mėginiai buvo užkrėsti ženkliai rečiau (18,33%) ir iš 60 tirpų žalio pieno mėginių arkobakterijos aptiktos tik 11 mėginių (df=60, p=0,001) (žr. 2 pav.). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumo (χ2=14,55; df=4; p=0,006).
2 pav. Šviežios paukštienos ir žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis
Iš trečiame paveiksle pateiktų duomenų galime matyti, kad žiemą tirti šviežios paukštienos mėginiai buvo santykinai mažiau užkrėsti arkobakterijomis (8 užkrėsti mėginiai), nei rinkti pavasarį (15 užkrėstų mėginių).
26 Tuo tarpu vertinant sezoninį žalio pieno užkrėstumą (4 pav.), galime matyti, kad didžioji dalis arkobakterijomis užkrėstų mėginių buvo nustatyta pavasario laikotarpiu rinktuose mėginiuose.
4 pav. Žalio pieno užkrėstumas Arcobacter spp. skirtingu laikotarpiu
3.2 Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė
Iš tiriamųjų maisto mėginių išskirtų arkobakterijų izoliatų identifiakvimas PGR metodu leido sėkmingai identifikuoti visas keturias dažniausiai maisto žaliavose ir produktuose aptinkamas arkobakterijų rūšis (5 pav.).
5 pav. Arcobacter spp. genties bakterijų identifikavimas dauginės PGR metodu (1,9,16 – DNR žymeklis GeneRuler 100 bp Plus; 2,12 – A.cryaerophilus (400bp); 3,5,6,7,8,11,13,14 –
A.butzleri (2061 bp); 4 – A. cibarius (1120 bp); 10 – A. skirrowii (198 bp); 15 – neigiama kontrolė)
Įvertinus išskirtų iš tiriamųjų maisto mėginių arkobakterijų izoliatų rūšių įvairovę PGR metodu nustatyta, kad šviežios paukštienos mėginiai buvo užkrėsti skirtingomis arkobakterijų rūšimis (6 pav.). Dominuojanti arkobakterijų rūšis buvo A. butzleri aptikta 16 paukštienos mėginių,
27 tuo tarpu A. cryaerophilus – keturiuose, A. cibarius dvejuose, o A. skirrowii tik viename tirtame mėginyje.
Tyrimai taip pat parodė, kad tas pats mėginys gali būti užkrėstas ir keliomis skirtingomis arkobakterijų rūšimis, nes dvi arkobakterijų rūšys buvo aptiktos tame pačiame šviežios paukštienos mėginyje – A. butzleri ir A. cryaerophilus.
Tuo tarpu visi arkobakterijų izoliatai išskirti iš 11 žalio pieno mėginių, pirktų prekybos centre esančio pieno automato, buvo identifikuoti kaip A. butzleri rūšis.
28 3.3 Arkobakterijų atsparumas antibiotikams
3.3.1 Arkobakterijų išskirtų iš šviežios paukštienos atsparumas antibiotikams
Atlikti išskirtų iš šviežios paukštienos arkobakterijų padermių atsparumo antibakterinėms medžiagoms tyrimai atskleidė, kad šių bakterijų atsparumas tam pačiam antibiotikui buvo gana panašus (5 lentelė).
5 lentelė. Arkobakterijų, išskirtų iš šviežios paukštienos mėginių, atsparumas antibiotikams Eil.
Nr. Arkobakterijų rūšis
Antibiotikų minimali slopinanti koncentracija (MSK) µg/ml
Gentamicinas Eritromicinas Ciprofloksacinas Tetraciklinas Ceftriaksonas
1. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 2. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 3. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 4. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 5. A. butzleri 2 16 4 0,5 4 6. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 7. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 8. A. butzleri 1 16 4 0,5 8 9. A. butzleri 1 16 2 0,5 4 10. A. butzleri 1 32 2 1 8 11. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 12. A. butzleri 1 16 4 0,5 4 13. A. butzleri 0,5 16 4 0,5 4 14. A. butzleri 1 32 4 0,5 4 15. A. butzleri 1 32 4 1 4 16. A. butzleri 0,5 16 4 0,5 4 17. A. cryaerophilus 1 4 4 0,5 1 18. A. cryaerophilus 2 4 4 1 2 19. A. cryaerophilus 1 4 4 1 2 20. A. cryaerophilus 1 2 2 0,5 1 21. A. cibarius 1 2 0,5 0,5 1 22. A. cibarius 1 2 0,5 0,5 0,5 23. A. skirrowii 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Tyrimai parodė, kad net 13 iš 16 tirtų A. butzleri rūšies padermių augimą slopino 1 µg/ml gentamicino koncentracija, 1 vienos padermės - 2 µg/ml koncentracija ir tik vienintelė padermė buvo dar jautresnė gentamicinui, kada ir 0,5 µg/ml gentamicino koncentracija slopino šios bakterijos augimą. Nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijos išskirtos iš šviežios paukštienos buvo jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml; 14 iš 16 padermių), o atspariausios eritromicinui (MSK 16 µg/ml (13 iš 16 padermių); 32 µg/ml (3 iš 16 padermių)). A. cryaerophilus rūšies bakterijos jautriausios taip pat tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (3 iš 4 padermių); 1 µg/ml (1 iš 4 padermių)), o
29 atspariausios eritromicinui ir ciprofloksacinui (MSK 2 µg/ml (1 iš 4 padermių); 4 µg/ml (3 iš 4 padermių)). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (2 iš 2 padermių)), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml (2 iš 2 padermių)). Vienintelės išskirtos A.
skirrowii rūšies atsparumas visiems tirtiems antibiotikams tesiekė 0,5 µg/ml.
3.3.2 Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams
Atlikus išskirtų iš žalio pieno arkobakterijų izoliatų analogišką atsparumo antibakterinėms medžiagoms įvertinimą, gauti tyrimo rezultatai (6 lentelė) atskleidė, kad šių bakterijų atsparumas tiems patiems antibiotikams buvo gana panašus. Tyrimai parodė, kad A. butzleri rūšies bakterijų padermės išskirtos iš žalio pieno buvo jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml (8 iš 11 padermių); 1 µg/ml (3 iš 11 padermių)), bei gentamicinui (MSK 0,5 µg/ml (4 iš 11 padermių); 1 µg/ml (MSK 7 iš 11 padermių)). Atspariausios A. butzleri padermės nustatytos eritromicinui (MSK 4 µg/ml (3 iš 11 padermių); 8 µg/ml (7 iš 11 padermių)).
6 lentelė. Arkobakterijų išskirtų iš žalio pieno atsparumas antibiotikams
Eil.
Nr. Arkobakterijų rūšis
Antibiotikų minimali slopinanti koncentracija µg/ml
Gentamicinas Eritromicinas Ciprofloksacinas Tetraciklinas Ceftriaksonas
1. A. butzleri 1 8 4 0,5 4 2. A. butzleri 1 8 4 0,5 4 3. A. butzleri 1 8 4 1 4 4. A. butzleri 0,5 8 2 0,5 2 5. A. butzleri 1 8 4 0,5 4 6. A. butzleri 0,5 4 4 0,5 4 7. A. butzleri 1 8 4 1 4 8. A. butzleri 1 4 4 0,5 4 9. A. butzleri 1 8 4 1 2 10. A. butzleri 0,5 4 2 0,5 4 11. A. butzleri 0,5 4 4 0,5 4
30 4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šių tyrimų metu buvo įvertinta šviežios paukštienos bei žalio pieno, įsigyto iš mažmeninės prekybos vietų Kaune, užkrėstumas Arcobacter genties bakterijomis bei nustatytas išskirtų arkobakterijų izoliatų atsparumas antibakterinėms medžiagoms.
Siekiant gauti kiek įmanoma patikimesnius ir tikslesnius rezultatus, buvo pasirinktas arkobakterijų nustatymo metodas – apimantis pagausinimą specifiniame Arcobacter sultinyje su 5 antibiotikų priedu bei po to sekantį sėjimą ant mCCDA agaro su CAT priedu, inkubuojant 30˚C temperatūroje aerobinėmis sąlygomis. Merga ir bendraautoriai (2010) Jungtinėje Karalystėje atliko tyrimus, kurių tikslas buvo ištirti jau naudojamų arkobakterijų nustatymo metodų jautrumą ir specifiškumą [36]. Buvo pasirinkti 5 dažniausiai mokslininkų taikomi arkobakterijų aptikimo metodai:
HH (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su 5 antibiotikų priedu: 5-fluorouracilas (100mg/l), amfotericinas B (10mg/l), cefoperazonas (16mg/l), novobiocinas (32mg/l), trimetoprimas (64mg/l); bakterijų išskyrimas ant H medium agaro su tais pačiais 5 antibiotikais; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [32].
HCC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su 5 antibiotikų priedu: 5-fluorouracilas (100mg/l), amfotericinas B (10mg/l), cefoperazonas (16mg/l), novobiocinas (32mg/l), trimetoprimas (64mg/l); bakterijų išskyrimas ant mCCDA agaro su CAT priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [37].
ACH (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu (cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų išskyrimas ant H medium agaro 5-ių antibiotikų priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis) [38].
ACCC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu (cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų išskyrimas ant mCCDA agaro su CAT priedu; inkubuota 30˚C temp. aerobinėmis sąlygomis).
CC (selektyvus bakterijų pagausinimas – specifinis Campylobacter sultinys su 5% defibrinuoto arklio kraujo ir CVTC priedu (cefoperazonas (20mg/l), vankomicinas (20mg/l), trimetoprimas (20mg/l), cikloheksimidas (50mg/l); bakterijų išskyrimas ant Campylobacter specific agaro; inkubuota 36˚C temp. mikroaerofilinėmis sąlygomis) [37].
Autoriai (Merga ir kt., 2010) atlikę tyrimus padarė išvadą, kad pats specifiškiausias (63,9%) ir jautriausias (70,7%) yra HCC arkobakterijų nustatymo metodas, po to sekė HH (59,7% ir 41,5%),
31 CC (43,2% ir 43,9%), ACH (23,9% ir 43,9%) ir mažiausiai specifiškas (16,6%) bei jautrus (43,9%) – ACCC metodas [36].
Iki šiol tokių tyrimų Lietuvoje nebuvo atlikta ir šis tyrimas buvo pirmasis kurio metu nagrinėtas arkobakterijų paplitimas maiste. Tyrimų rezultatai parodė, kad tirtų maisto mėginių užkrėstumas arkobakterijomis buvo labai didelis ir šviežios paukštienos užkrėstumas (46%) buvo didesnis nei tirtų žalio pieno mėginių (18,22%).
Skirtingai nei Lietuvoje, panašūs tyrimai yra atliekami ir kitose šalyse. Ispanijoje paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis siekė 45% (23 iš 51 mėginių) [39], Irane Arcobacter spp. užkrėstumas paukštienoje siekė 45% (244 iš 540 mėginių) [40]. Malaizijoje buvo tirtas šaldytos ir žviežios paukštienos užkrėstumas, kuris siekė 39% (48 iš 123 mėginių). Arkobakterijų išskyrimui naudotas HCC metodas. Verta pažymėti, kad šviežios paukštienos užkrėstumas arkobakterijomis buvo šiek tiek didesnis (25 iš 61 (41%)), nei atšaldytos (23 iš 62 (37,1%)) [10].
Vertinant sezoniškumo įtaką šviežios paukštienos užkrėstumui arkobakterijomis atlikti tyrimai rodo, kad paukštienos mėginiai buvo santykinai mažiau užkrėsti arkobakterijomis (8 užkrėsti mėginiai) žiemą, nei rinkti pavasarį (15 užkrėstų mėginių). Tyrimų, nagrinėjančių sezoniškumo įtaką arkobakterijų paplitimui maisto produktuose kol kas nėra, tačiau galėtume daryti prielaidą, kad aplinkos temperatūra susijusi su spartesniu arkobakterijų dauginimusi produkte.
Tuo tarpu analizuojant žalio pieno užkrėstumą arkobakterijomis situacija įvairiose šalyse buvo skirtinga – Malaizijoje pieno užkrėstumas siekė 5,7% (naudotas ACH metodas) [20], Suomijoje – 15% (26 iš 177 mėginių; ACCC metodas) [13], Turkijoje - 36% (18 iš 50 mėginių; modifikuotas AC metodas – selektyviam bakterijų pagausinimui naudotas specifinis Arcobacter sultinys su CAT priedu (cefoperazonas (8mg/l), amfotericinas B (10mg/l) ir teicoplaninas (4mg/l); bakterijų išskyrimui naudotas kraujo agaras)) [12], Šiaurės Airijoje – 46% [41].
Vertinant sezoniškumo įtaką žalio pieno užkrėstumui arkobakterijomis atlikti tyrimai rodo, jog didžioji dalis arkobakterijomis užkrėstų žalio pieno mėginių buvo nustatyta pavasario laikotarpiu. Tačiau šiltesnio rudens sezono metu, iš 20 pieno mėginių nei viename nebuvo nustatyta arkobakterijų. Tokius rezultatus sudėtinga vertinti, nes nėra atlikta tyrimų vertinančių sezoniškumo įtaką pieno užkrėstumui arkobakterijomis. Visgi gautus tyrimo rezultatus galėtume sieti su tuo, kad galbūt žalio pieno pardavimo automatai buvo kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti, arba pardavimui buvo tiekiamas sveikų arkobakteriozės atžvilgiu karvių pienas.
Atlikus išskirtų izoliatų rūšinės įvairovės nustatymą PGR metodu (atliktas remiantis Douidah ir bendraautorių (2010) aprašytu metodu [42] su tam tikromis modifikacijomis – vietoj 5 µl 10×PCR buferio naudota 12,5µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x), o galutinis reakcijos mišinys sudarė 25 µl vietoj 50 µl) nustatėme, kad mažmeninėje prekyboje parduodamoje
32 paukštienoje dominavo A. butzleri rūšies bakterijos (69,56%), A. cryaerophilus (17,39%), A.
cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%). Skirtingi rezultatai gauti Vokietijoje, kai paukštienoje
nustatytos išskirtinai A. butzleri rūšies arkobakterijos (15 iš 56 tirtų mėginių) [43]. Tačiau panašūs rezultatai gauti lyginant Irano mokslininkų atliktus tyrimus, kurių metu nustatyta, kad paukštienoje dominavo A. butzleri rūšies bakterijos (73%), po to sekė A. cryaerophilus (9%) [40]. Korėjoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad vėl dominavo A. butzleri (18,9%), A. cryaerophilus (3,3%) [44], o Malaizijoje visi 48 iš 123 teigiami arkobakterijų atžvilgiu mėginiai priskirti imtinai A. butzleri rūšiai [10].
Mūsų atlikto tyrimo duomenis piene nustatytos tik vienos rūšies arkobakterijos – A. butzleri (100%). Tačiau remiantis kitais mokslininkų atliktais tyrimais ir studijomis kitose šalyse, nustatyta, kad piene, tirtame Turkijoje taip pat dažniausiai dominavo A. butzleri (38,89%), po to sekė A.
cryaerophilus (22,23%) ir A. skirrowii rūšies bakterijos (11,12%) [12]. Papildomai, pieno
mėginiuose kartu rastos kelios arkobakterijų rūšys – A. butzleri ir A. cryaerophilus. Kito 2011 metais Suomijoje atlikto tyrimo metu piene dominavo A. butzleri (96%), A. cryaerophilus – 4% [13]. Taip pat pieno mėginiuose tirtuose Malaizijoje kartu rastos netgi kelios arkobakterijų rūšys –
A. butzleri ir A. skirrowii bei A. butzleri ir A. cryaerophilus [20].
Atlikus išskirtų iš maisto mėginių arkobakterijų izoliatų atsparumą antibakterinėms medžiagoms nustatyta, kad A. butzleri rūšies bakterijos išskirtos iš šviežios paukštienos bei žalio pieno atspariausios eritromicinui, o jautriausios tetraciklinui. Tiesa, verta pažymėti, jog A. butzleri padermių, išskirtų iš šviežios paukštienos, augimą slopino 16 µg/ml eritromicino koncentracija (13 iš 16 padermių), kai tuo tarpu išskirtų iš žalio pieno 8 µg/ml (7 iš 11 padermių). Tačiau vertinant A.
butzleri padermių jautrumą tetraciklinui tokių skirtumų nepastebėta: 0,5 µg/ml (14 iš 16 iš
paukštienos išskirtų padermių), 0,5 µg/ml (8 iš 11 iš žalio pieno išskirtų padermių). Atlikti tyrimai parodė labai panašius rezultatus, vertinant A. butzleri padermių atsparumą kitoms antibakterinėms medžiagoms. Nustatyta minimali A. butzleri bakterijų augimą slopinanti antibiotiko gentamicino koncentracija 1µg/ml (13 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 7 iš 11 iš žalio pieno išskirtų padermių), ciprofloksacino 4 µg/ml (14 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 9 iš 11 iš žalio pieno išskirtų padermių) ir cefriaksono 4 µg/ml (15 iš 16 iš paukštienos išskirtų padermių; 9 iš 11 iš žalio pieno išskirtų padermių).
Insook ir bemdraautoriai (2007) atliko panašius tyrimus, kurių metu siekė išsiaiškinti arkobakterijų, išskirtų iš paukštienos skerdienos mėginių, atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Nustatytas atsparumas antibiotikams skyrėsi nuo mūsų tyrimo metu nustatyto atsparumo (MSK): ciprofloksacino ≥4 µg/ml, eritromicino ≥32 µg/ml, gentamicino ≥16 µg/ml, tetraciklino ≥16 µg/ml. Iš 140 A. butzleri padermių nei viena nebuvo atspari ciprofloksacinui, gentamicinui ir tetraciklinui
33 bei tik 6 (8,4%) padermės buvo atsparios eritromicinui. Iš 34 A. cryaerophilus padermių ciprofloksacinui atspari buvo tik 1 (2,94%), o etritomicinui, gentamicinui ir tetraciklinui visos padermės buvo neatsparios [27].
Lyginant Insook ir bendraautorių (2007) bei mūsų tyrimo rezultatus, pasirenkant tokias pat MSK ribas, iš šviežios paukštienos išskirtos A. butzleri rūšies atsparumas ciprofloksacinui siekė 4 µg/ml (atsparios 14 iš 16 (87,5%) padermių), eritromicinui 16 µg/ml (atsparios 3 iš 16 (18,75%) padermių), gentamicinui 1µg/ml (visos neatsparios), tetraciklinui 0,5 µg/ml (visos neatsparios). Panašūs rezultatai pastebimi ir su A. cryaerophilus rūšimi – ciprofloksacinas 4 µg/ml (atsparios 3 iš 4 (75%) padermių), o eritromicinas 4 µg/ml, gentamicinas 1 µg/ml, tetraciklinas 1 µg/ml – visos tirtos padermės buvo neatsparios.
Ferreira ir bendraautoriai (2013) [28] taip pat tyrinėjo A. butzleri, išskirtų iš paukštienos skerdienos mėginių, atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Nustatyta atsparumo ciprofloksacinui MSK buvo tokia pat kaip ir Insook ir bendraautorių (2007) (≥4 µg/ml), tačiau gentamicinui buvo per pus mažesnė ir siekė ≥8 µg/ml. Tačiau lyginant su mūsų duomenimis gauti panašūs rezultatai, net 14 iš 16 (87,5%) padermių yra galėtų būti priskiriamos kaip atsparios ciprofloksacinui, o gentamicinui visos 16 padermių neatsparios.
Atabay ir bendraautoriai (2001) tyrė A. butzleri, išskirtų iš paukščių skerdenos mėginių, parduodamų mažmeninės prekybos tinkluose, atsparumą antibiotikams. Nustatytos MSK buvo tokios: eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 30 µg. Atlikus testus nustatyta, kad 34 iš 39 (87,17%) A. butzleri padermių buvo neatsparios eritromicinui, 38 iš 39 (97,43 %) neatsparios gentamicinui ir visos 39 (100%) neatsparios tetraciklinui [45].
Po daugiau nei dešimtmečio Abay ir bendraautoriai (2012), atliko panašius tyrimus [46]. Pasirinktos atsparumo antibiotikams MSK ribos buvo identiškos kaip ir Atabay ir bendraautorių – eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 30 µg. Nustatyta, kad 6 iš 31 (19,3%) A.
butzleri padermių atsparios eritromicinui, 100% neatsparios gentamicinui, o 18 iš 31 (58%)
neatsparios tetraciklinui.
Rahimi 2014 m. irgi atliko panašius tyrimus Irane [47]. Pasirinktos MSK buvo labai panašios – ciprofloksacino 15 µg, eritromicino 15 µg, gentamicino 10 µg, tetraciklino 15 µg. Išsiaiškinta, jog
A. butzleri – ciprofloksacinas atsparios 1 iš 64 (1,5%), o eritromicinui, gentamicinui ir tetraciklinui
visos padermės buvo neatsparios. Taip pat visos 5 tirtos A. cryaerophilus padermės buvo neatsparios minėtiems antibiotikams. Tačiau A. skirrowii viena padermė (1 iš 2) buvo atspari eritromicinui, o likusiems antibiotikams taip pat buvo neatspari.
Yesilmen ir bendraautoriai (2014) tyrė A. bulzleri, išskirtų iš karvių pieno, atsparumą antibakterinėms medžiagoms. Nustatytos MSK ribos: eritromicino 15 µg/disc, tetraciklino 30
34
µg/disc, gentamicino+amoksicilino 35 µg/disc. Eritromicinas – 13 iš 16 padermių (81,25%)
atsparios, tetraciklinas – 15 iš 16 (93,75%) atsparios, gentamicinas+amoksicilinas – 10 iš 16 padermių (62,5%) buvo neatsparios [12].
Taigi lyginant mūsų atlikto tyrimo rezultatus su Yesilmen ir bendraautorių (2014) galėtume daryti prielaidą, kad visos A. butzleri padermės išskirtos iš žalio pieno buvo neatsparios visiems tirtiesiems antibiotikams.
Fera ir bendraautoriai (2002) metais atliktos studijos metu nustatyta A. butzleri ir A.
cryaerophilus atsparumo ceftriaksonui MSK buvo ≤8 µg/ml [48]. Remiantis mūsų atliktais tyrimais
matyti, kad tiek A. butzleri, tiek A. cryaerophilus iškirtos iš paukštienos ir žalio pieno yra neatsparios ceftriaksonui.
Lyginant arkobakterijų atsparumą toms pačioms antibakterinėms medžiagoms su jų filogenetinių kaimynu – kampilobakterijomis pastebimi skirtumai. Insook ir bendraautoriai (2007) atliktos tyrimų studijos metu nustatyta, kad C. jejuni išskirtų iš šviežios paukštienos mėginių atsparumas ciprofloksacinui sudarė 30,3% (57 iš 188 padermių), C. coli 3,7% (1 iš 27 padermių) o iš viso sudarė 27% (58 iš 215 padermių). Tiek eritromicinui, tiek gentamicinui C. jejuni ir C. coli visos visos tirtos padermės buvo neatsparios. Tačiau tetraciklinui net 99,5% (187 iš 188 padermių)
C. jejuni atsparios, o C. coli 96,3% (26 iš 27 padermių). Tuo tarpu lygiagrečiai tiriant A. butzleri
padermių atsparumą nustatyta, kad ciprofloksacinui, gentamicinui ir tetraciklinui buvo neatspari, o eritromicinui atsparumas sudarė 8,4% [27].
Kovalenko ir bendraautoriai 2014 metais Latvijoje atliko kampilobakterijų, išskirtų iš paukštienos, parduodamos mažmeninės prekybos vietose, atsparumo antibakterinėms medžiagoms tyrimus [49]. Nustatytos atsparumo antibiotikams MSK ribos buvo tokios: eritromicino >4 µg/ml (C. jejuni), >16 µg/ml (C. coli), ciprofloksacino >1 µg/ml, tetraciklino >2 µg/ml ir gentamicino >1 µg/ml (C. jejuni), o >2 µg/ml (C. coli). Atlikus tyrimus nustatyta, kad C. jejuni padermių atsparumas eritromicinui sudarė 32,2%, ciprofloksacinui visos 28 tirtos padermės buvo atsparios, atsparumas tetraciklinui siekė 78,6%, o gentamicinui 57,2%. Kitos tirtos rūšies - C. coli atsparumas eritromicinui sudarė 56,7%, ciprofloksacinui visos tirtos 30 padermių buvo atsparios, atsparumas tetraciklinui siekė 76,7%, o gentamicinui – 66,6%.
Mūsų žiniomis, tokio pobūdžio tyrimas, siekiant nustatyti mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos bei žalio pieno užkrėstumą arkobakterijomis, Lietuvoje buvo atliktas pirmą kartą. Atlikti ir Lietuvoje tyrimai parodė, kad nors ir Europos Sąjungoje šiuo metu arkobakterijų skaičius paukštienoje ir žaliame piene nėra reglamentuojamas, būtina plėsti tokio pobūdžio tyrimus, siekiant išsiaiškinti maisto žaliavų ir produktų vaidmenį žmonių arkobakteriozės epidemiologijoje.
35 5. IŠVADOS
1. Tyrimai parodė, net 46% mažmeninėje prekyboje parduodamos šviežios paukštienos yra užkrėsta Arcobacter genties bakterijomis, tuo tarpu prekybos centre iš automato parduodamo žalio pieno užkrėstumas yra mažesnis ir siekia 18,22%. Nustatyta, kad šviežia paukštiena yra dažniau užkrėsta arkobakterijomis nei žalias pienas parduodamas mažmeninėje prekyboje (χ2=14,55; df=4; p=0,006).
2. Šviežioje paukštienoje dažniausiai buvo aptinkamos A. butlzeri (69,56%), rečiau A.
cryaerophilus (17,39 proc.), A. cibarius (8,69%) ir A. skirrowii (4,34%) rūšies
arkobakterijomis.
3. Nepasterizuotas pienas buvo išskirtinai užkrėstas tik A. butzleri rūšies arkobakterijomis. 4. A. butzleri išskirtos iš šviežios paukštienos pasižymėjo didesniu atsparumu antibakterinėms
medžiagoms (eritromicino MSK 16 µg/ml, ceftriaksono MSK 8 µg/ml) nei išskirtos iš pieno (eritromicino MSK 8 µg/ml, ceftriaksono MSK 4 µg/ml).
5. A. butzleri išskirtos išskirtos iš žalio pieno buvo jautriausios tetraciklinui – MSK 0,5 µg/ml (14 iš 16 šviežios paukštienos išskirtų padermių ir 8 iš 11 žalio pieno išskirtų padermių). 6. A. cryaerophilus jautriausios tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui ir
ciprofloksacinui (MSK 4 µg/ml). A. cibarius jautriausios ciprofloksacinui ir tetraciklinui (MSK 0,5 µg/ml), o atspariausios eritromicinui (MSK 2 µg/ml). A. skirrowii atsparumas visiems tirtiems antibiotikams siekė 0,5 µg/ml.
