LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Viktorija Michailovaitė
Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė gyvūninės
kilmės maisto žaliavose
Prevalence and species diversity of Arcobacter spp. isolated from
foods of animal origin
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: lekt. Dainius Uljanovas
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Arcobacter spp. bakterijų paplitimas ir rūšinė įvairovė gyvūninės kilmės maisto žaliavose“:
1. yra atliktas mano pačios.
2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
Viktorija Michailovaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Jurgita Lukošienė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Lekt. Dainius Uljanovas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Prof. dr. Mindaugas Malakauskas
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas)
vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas Dr. Irena Klimienė
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
Turinys
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA... 101.1. Bendra Arcobacter spp. bakterijų charakteristika ... 10
1.2. Arkobakterijų paplitimas maisto produktų tiekimo grandinėje... 11
1.2.1. Arkobakterijų šaltiniai ...11
1.2.2. Paplitimas gamybinėje aplinkoje ...12
1.2.3. Žaliavų ir maisto produktų užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis ...13
1.3. Arkobakterijų perdavimas ... 14
1.4. Epidemiologinė situacija ... 15
1.5. Arkobakterijų reikšmė žmonių ir gyvūnų sveikatai ... 16
1.5.1. Infekcijos patogenezė ir arkobakterijų virulentiškumo faktoriai ...16
1.5.2. Klinikiniai simptomai ...16
1.5.3. Gydymas ir atsparumas antibakterinėms medžiagoms ...17
1.6. Bakterijų jautrumo antibiotikams reikšmė visuomenės sveikatai ... 18
1.7. Arcobacter spp. bakterijų identifikavimo ypatumai ... 19
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 20
2.1. Tyrimų vieta ir eiga ... 20
2.2. Mėginių rinkimas ... 20
2.3. Arkobakterijų išskyrimas iš maisto žaliavų ... 21
2.4. DNR išskyrimas... 22
2.5. Bakterijų identifikavimas iki rūšies dPGR metodu ... 22
2.6. PGR reakcijos rezultatų vertinimas pasitelkus gelio elektroforezę ... 23
2.7. Jautrumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas (E-testas) ... 23
2.8. Statistinė gautų duomenų analizė ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI ... 25
3.1. Mėginių užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis ... 25
3.2. Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė ... 27
3.3. Arcobacter spp. genties bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 28
3.3.1. Iš vištienos išskirtų Arcobacter spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms ...28
3.3.2. Iš žalio pieno išskirtų Arcobacter spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms ...30
4
3.3.4. Arcobacter spp. bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms pagal rūšį ...33
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 34
IŠVADOS ... 37
PADĖKA ... 38
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39
5
ARCOBACTER SPP. BAKTERIJŲ PAPLITIMAS IR RŪŠINĖ ĮVAIROVĖ GYVŪNINĖS KILMĖS
MAISTO ŽALIAVOSE Viktorija Michailovaitė Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Arcobacter spp. – žmonių gastroenteritus sukeliantis zoonotinis patogenas. A. butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii rūšys aptinkamos visuose maisto produktų tiekimo grandinės etapuose.
Darbo tikslas – nustatyti arkobakterijų paplitimą vištienos, žalio pieno ir jautienos faršo mėginiuose ir įvertinti išskirtų padermių jautrumą antimikrobinėms medžiagoms. Tyrimo metu nuo 2019 m. rugsėjo iki 2020 m. spalio mėn. iš viso ištirta 190 mėginių: 94 šviežios vištienos, 56 nepasterizuoto karvių pieno ir 40 jautienos faršo mėginių. Arkobakterijos iš žaliavų išskirtos pasitelkus selektyvaus pagausinimo ir membraninio filtravimo metodus. Arcobacter spp. rūšys identifikuotos pasitelkus dauginės PGR metodą. Bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms įvertintas nustatant MSK E-testo metodu.
Tyrimo metu nustatytas bendras gyvūninių maisto žaliavų užkrėstumas siekė 31,6 proc. (n=60). Didžiausias užkrėstumas buvo būdingas paukštienos mėginiams ir siekė 44,7 proc. (n=42). Tuo tarpu nepasterizuoto pieno ir jautienos užkrėstumas atitinkamai siekė 19,6 proc. (n=11) ir 17,5 proc. (n=7). Visi tyrimo metu išskirti izoliatai priskirti A. butzleri (88,3 proc.) ir A. cryaerophilus (11,7 proc.) rūšims.
A. skirrowii rūšis mėginiuose aptikta nebuvo. 95,2 proc. iš vištienos išskirtų izoliatų priskirti A. butzleri
rūšiai, o likusi dalis (4,8 proc.) – A. cryaerophilus. Iš žalio pieno išskirtos tik A. butzleri rūšies bakterijos (100 proc.). Tuo tarpu iš jautienos faršo dažniausiai išskirtos A. cryaerophilus (71 proc.) rūšies bakterijos. Likusi dalis izoliatų (29 proc.) priskirta A. butzleri rūšims. Nepriklausomai nuo rūšies, iš vištienos išskirtos padermės buvo labiausiai atsparios azitromicinui (78,6 proc. MSK > 4 μg/ml) ir labiausiai jautrios gentamicinui (97,6 proc. MSK ≤ 2 μg/ml). Iš žalio pieno išskirtos bakterijos buvo dažniausiai atsparios ampicilinui (81,8 proc. MSK > 8 μg/ml) ir jautrios ciprofloksacinui (91 proc. MSK ≤ 0,5 μg/ml). Jautienos farše aptiktoms bakterijoms mažiausiu veiksmingumu pasižymėjo eritromicinas (MSK > 4μg/ml) ir gentamicinas (MSK > 2 μg/ml), jiems atsparios buvo 57,1 proc. padermių. Didžiausiu veiksmingumu pasižymėjo azitromicinas (MSK ≤ 4 μg/ml), tetraciklinas (MSK ≤ 2 μg/ml) ir ampicilinas (MSK ≤ 8 μg/ml). Jiems jautrios buvo 85,7 proc. iš jautienos faršo išskirtų padermių. Nepriklausomai nuo išskyrimo šaltinio, 51,7 proc. visų padermių buvo būdingas dauginis atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. 57,1 proc. iš vištienos, 45,4 proc. iš žalio pieno ir 28,6 proc. iš jautienos faršo išskirtų bakterijų buvo būdingas dauginis atsparumas. A. butzleri buvo dažniau atspari ampicilinui, azitromicinui, eritromicinui ir ciprofloksacinui, o A. cryaerophilus – gentamicinui ir tetraciklinui.
Raktažodžiai: Arcobacter spp., paplitimas, vištiena, žalias pienas, jautienos faršas, antimikrobinės medžiagos
6 PREVALENCE AND SPECIES DIVERSITY OF ARCOBACTER SPP. ISOLATED FROM FOODS
OF ANIMAL ORIGIN Viktorija Michailovaitė
Master‘s Thesis
SUMMARY
Arcobacter species are considered emerging zoonotic pathogens associated with human
gastroenteritis. A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii species are found in all steps of food production chain. The aim of this study was to determine the prevalence of these bacteria in raw chicken (wings and drumsticks), raw milk and minced beef samples and to evaluate the susceptibility of isolated strains to antimicrobial drugs. During this study from 2019 September to 2020 October, 190 samples were tested (94 samples of raw chicken, 56 unpasteurized milk and 40 minced beef). Isolation of
Arcobacter spp. was performed using a combination of selective enrichment and membrane filtration
methods. Isolates were identified using multiplex PCR. Antimicrobial susceptibility of bacteria was determined by evaluating MIC using the E-test method.
The global prevalence of Arcobacter was 31.6 % (n = 60). The highest rate of contamination was found in chicken samples 44.7% (n = 42). In unpasteurized milk contamination rate was 19.6% (n = 11) and in minced beef 17.5% (n = 7). Overall, A. butzleri was the most prevalent species (88.3%), followed by A.
cryaerophilus (11.7%). During this study A. skirrowii was not isolated. The majority of chicken isolates
were identified as A. butzleri (95.2%) followed by A. cryaerophilus (4.8%). All isolates from raw milk were identified as A. butzleri (100%). Minced beef isolates were commonly identified as A. cryaerophilus (71%) and rarely as A. butzleri (29%) bacteria. Independently from species, strains isolated from chicken were the most resistant to azithromycin (78.6% MIC > 4μg/ml) and the most susceptible to gentamicin (97.6% MIC ≤ 2μg/ml). Bacteria from milk were the most resistant to ampicillin (81.8% MIC > 8μg/ml) and the most susceptible to ciprofloxacin (91% MIC ≤ 0,5μg/ml). For bacteria detected in minced beef the least effective antimicrobial drug was erythromycin (MIC > 4μg/ml) and gentamicin (MIC > 2μg/ml), there were 57.1 % resistant strains. The most effective antimicrobial drugs were azithromycin (MIC ≤ 4μg/ml), tetracycline (MIC ≤ 2μg/ml) and ampicillin (MIC ≤ 8μg/ml), there were 85.7% susceptible strains detected in minced beef. The overall incidence of multiresistant isolates was 51.7%. In chicken, raw milk and minced beef isolated bacteria multidrug resistance was found in 57.1%, 45.4% and 28.6%, respectively. A. butzleri was mostly resistant to ampicillin, azithromycin, erythromycin, ciprofloxacine and A. cryaerophilus was more frequently resistant to gentamicin and tetracycline.
7
SANTRUMPOS
°C – laipsniai Celsijaus µg – mikrogramai µl – mikrolitrai µm – mikrometraiA. butzleri – Arcobacter butzleri
A. cryaerophilus – Arcobacter cryaerophilus
A. skirrowii – Arcobacter skirrowii
bp – bazių pora
C. A. .T. – cefoperazono, amfotericino B, teikoplanino selektyvus priedas CLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas
DNR – deoksiribonukleorūgštis
dPGR – dauginė polimerazės grandininė reakcija
EUCAST – Europos jautrumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimų komitetas mA – miliamperai
ml – mililitrai
MSK – minimali slopinanti koncentracija MIC – angl. minimal inhibitory concentration PGR – polimerazės grandininė reakcija pH – vandenilio potencialas
rDNR – ribosominę RNR koduojantis genas V – voltai
8
ĮVADAS
Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis maistu plintantys bakterinės kilmės patogenai kasmet sukelia 349 milijonus žmonių susirgimų (1). Tobulėjant bakterijų išskyrimo ir identifikavimo metodams vis daugiau dėmesio skiriama naujoms patogenų grupėms. Todėl Arcobacter genčiai priklausančios bakterijos tampa vis aktualesnės kalbant apie visuomenės ir gyvūnų sveikatos būklę (2). Arkobakterijos – zoonotiniai maistu plintantys patogenai (3). Arcobacter spp. bakterijos išsiskiria dideliu genetiniu kintamumu, todėl jos gali būti išskirtos iš įvairių šaltinių ir sukelti infekcijas skirtingiems šeimininkams. Šie patogenai išskiriami iš naminių ir laukinių gyvūnų bei žmonių išmatų, jūros vandens, nuotekų, geriamojo vandens, paruoštų vartoti šviežių daržovių, mėsos ir jos produktų, moliuskų, žuvų, kiaušinių, termiškai neapdoroto pieno ir jo produktų (3–6). Priklausomai nuo šalies, bakterijų paplitimas galvijų, kiaulių, broilerių tarpe atitinkamai siekia 3,6-39 proc., 10-85 proc. ir 1,3-14 proc. (6,7). Nors bakterijos dažnai išskiriamos iš produkcijos gyvūnų išmatų, susirgimus jiems sukelia rečiau nei žmonėms. Todėl ūkinės paskirties gyvūnai (galvijai, naminiai paukščiai ir avys) yra laikomi natūraliu arkobakterijų rezervuaru (2).
Žmonių ir gyvūnų infekcijas dažniausiai sukelia trys Arcobacter genčiai priklausančios rūšys –
A. butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii (8). Žmonių infekcijų atvejais sukeliamas gastroenteritas,
kuris pasireiškia lėtiniu vandeningu viduriavimu, pilvo skausmais, pykinimu, vėmimu ir hipertermija (9,10). Tuo tarpu galvijams bei kiaulėms arkobakterijos gali sukelti abortus, mastitą, diarėją. Žmonės arkobakterijomis užsikrečia fekaliniu-oraliniu būdu, vartodami užkrėstą maistą (nepakankamai termiškai apdorotą mėsą, pieną, daržoves), geriamąjį vandenį. Gyvūnai užsikrečia fekaliniu-oraliniu būdu, vertikaliu keliu (6). Bakterijų plitimui maisto žaliavose ir produktuose didelę įtaką turi kryžminė tarša, skerdimo ir mėsos perdirbimo įmonių higienos taisyklių laikymasis. Siekiant išvengti arkobakteriozės susirgimų, svarbu atkreipti dėmesį į vartojamus maisto produktus, gyvūnų mitybą, ūkių, mėsos perdirbimo įmonių sanitarinę kontrolę, vandens užterštumo kontrolę.
Tarptautinė maisto mikrobiologinių specifikacijų komisija Arcobacter genties bakterijas yra įtraukusi į žmonių sveikatai pavojų keliančių mikroorganizmų grupę (4). Tačiau duomenų (tarptautiniu ir nacionaliniu mastu) apie arkobakterijų paplitimą maisto žaliavose ir produktuose, rūšinę įvairovę, jautrumą antimikrobinėms medžiagoms, virulentiškumo veiksnius, patogeninį potencialą ir ryšį su visuomenės sveikata, trūksta. Todėl šiame darbe nuspręsta nustatyti gyvūninių žaliavų (paukštienos, jautienos faršo ir žalio pieno) užkrėstumą Arcobacter spp. bakterijomis ir įvertinti išskirtų padermių jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
9 Darbo tikslas: Įvertinti gyvūninės kilmės maisto žaliavų užkrėstumą Arcobacter genties bakterijomis. Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti Arcobacter genties bakterijų paplitimą gyvūninės kilmės maisto produktuose. 2. Pasitelkus dauginę polimerazės grandininę reakciją, įvertinti išskirtų arkobakterijų rūšinę
įvairovę.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bendra Arcobacter spp. bakterijų charakteristika
Arkobakterijos pirmą kartą išskirtos iš abortuotų galvijų vaisių audinių 1977 metais. Dėl fenotipinių savybių panašumų jos buvo priskirtos Campylobacter genčiai. Arcobacter genties pavadinimas pirmą kartą buvo pasiūlytas 1991 metais, norint apjungti dvi aerotolerantiškas
Campylobacter bakterijų rūšis: C. cryaerophila (dabartinė Arcobacter cryaerophilus) ir C. nitrofigilis
(dab. A. nitrofigilis) (2,11). Atlikus DNR-rRNR hibridizacijos, imunotipavimo tyrimus ir pastebėjus, kad minėtos rūšys formuoja atskirą filogenetinę grupę, nuspręsta jas perklasifikuoti. Arcobacter bakterijų gentis priklauso Epsilonbacteraeota tipui, Campylobacteria klasei, Campylobacterales poklasiui. Po perklasifikavimo susidomėjimas arkobakterijomis didėjo, todėl naujai išskirtų rūšių skaičius augo eksponentiškai (11,12). 2019 metų duomenimis Arcobacter gentį sudaro 29 rūšys (1 priedas) (11,13). Visuomenės ir gyvūnų sveikatingumo atžvilgiu aktualiausios yra trys rūšys: A. butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii (2). Šiuo metu yra ištirtas A. butzleri genomas (14). Jo palyginimas su kitų enteropatogenų genomais pateikiamas 1 lentelėje (15).
1 lentelė. Enteropatogenų genomų palyginimas
Genomas Dydis, Mb G + C, proc.
Arcobacter butzleri 2,3 26,79-26,85 Campylobacter jejuni 1,6-1,8 32 Listeria monocytogenes 2,9 39 Salmonella Typhimurium 4,9 52 Escherichia coli 4,6-5,7 50,6 Yersinia enterocolitica 4,6 47,27
Mb – milijonai bazių porų; G + C, proc. – guanino ir citozino kiekis, proc.
Pagrindinės Arcobacter spp. bakterijų morfologinės savybės: Gram-neigiamos, plonos (0,2–0,9 μm), 1-3 μm ilgio, spiralės arba S formos, sporų nesudarančios lazdelės. Bakterijoms būdingas vienas polinis žiuželis, kurio pagalba jos juda. Arkobakterijos gali augti 15-42 °C temperatūros ribose esant aerobinėms ir anaerobinėms aplinkos sąlygoms. Optimali augimo temperatūra – 30 °C, o pirminiam išskyrimui yra būtinos mikroaerofilinės sąlygos (85 proc. N2, 3–5 proc. CO2 ir 5–10 proc. O2). Bakterijos pilnai inaktyvuojamos 55 °C temperatūroje (16,17). Arcobacter spp. bakterijos ir kampilobakterijos pasižymi panašiomis morfologinėmis savybėmis, todėl remiantis vien biocheminiu ir fenotipiniu bakterijų vertinimu dažnai gaunami klaidingi rezultatai (2 lentelė, žr. 11 psl.) (16,18–20).
11 2 lentelė. Arcobacter spp. ir Campylobacter spp. savybių palyginimas
1.2. Arkobakterijų paplitimas maisto produktų tiekimo grandinėje
1.2.1. Arkobakterijų šaltiniaiArkobakterijų aptinkama tiek sveikų, tiek sergančių gyvūnų (galvijų, smulkiųjų atrajotojų, kiaulių, triušių, naminių paukščių, arklių) išmatų mėginiuose (5). Įvairių šalių paplitimo tyrimų duomenys skiriasi. Skirtumus lemia keli faktoriai: a) ūkininkavimo praktikos tipas ir gyvūnų laikymo būdas; b) tiriamos bandos ar pulko dydis; c) skirtingas higieninių sąlygų užtikrinimo lygis; d) naudojamo pašaro tipas; e) tyrimo imties dydis; f) mėginių ėmimo būdas; g) bakterijų išskyrimui ir identifikavimui naudojami metodai. Svorinis arkobakterijų paplitimo vidurkis galvijų, naminių paukščių ir avių tarpe atitinkamai siekia 54,3 proc., 35,9 proc. ir 13,7 proc. (3).
Galvijai ir avys yra vieni iš pagrindinių besimptomių arkobakterijų nešiotojų. Arcobacter spp. bakterijų paplitimas minėtų gyvūnų tarpe siekia nuo 3,6 iki 58,9 proc., o dažniausiai aptinkamos trys rūšys: A. butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii. Arkobakterijų paplitimui ir rūšiniam pasiskirstymui įtakos turi šie veiksniai: a) laikymo sistema; b) gyvūno amžius; c) racionas; d) sezoniškumas (3,6,21,22). 2015 metais Italijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad arkobakterijų paplitimas veršelių tarpe siekė 27,2 proc. ir buvo didesnis nei suaugusių galvijų (13,2 proc.). Tokie rezultatai rodo, kad tarp galvijų amžiaus
Savybės 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Fermentinis aktyvumas:
Katalazė V + + + + V – + – + + +
Ureazė – – – – + – – – – – – –
Nitratų redukcija + + + + + – + + + + + +
Indolo acetato hidrolizė + + + + + + + – + – + +
Kultivavimo sąlygos:
Deguonyje 37 °C + V + – V – + + + + – –
Mikroaerobinėse sąlygose 37 °C + V + – – + + + + + + +
4 proc. NaCl – – + – + – + + + + – –
Mitybinė terpė su 1 proc. glicinu – – – + – – + + + – + +
MacConkey agaras + V – V – + – + – + + +
1 A. butzleri, 2 A. cryaerophilus, 3 A. skirrowii, 4 A. thereius, 5 A. nitrofigilis, 6 A. cibarius, 7 A. halophilus, 8 A. mytili, 9 A. marinus, 10 A. molluscorum, 11 C. jejuni, 12 C. coli; + ≥95 proc. teigiamų padermių; ≤11 proc. neigiamų padermių; V 12–94 proc. teigiamų padermių
12 ir arkobakterijų paplitimo būdingas neigiamas koreliacinis ryšys (23). Irane, ištyrus skerdykloje laikomų gyvūnų išmatų mėginius nustatyta, kad Arcobacter spp. paplitimas galvijų (n=200) ir avių (n=108) tarpe atitinkamai siekė 12 ir 18,5 proc. 58,3 proc., 16,6 proc. ir 8,3 proc. visų izoliatų priskirti A. butzleri, A.
cryaerophilus ir A. skirrowii rūšims. Verta paminėti, kad 25 proc. mėginių buvo užkrėsti tiek A. butzleri,
tiek A. cryaerophilus rūšių bakterijomis. Iš avių išmatų mėginių A. skirrowii rūšis išskirta nebuvo (24). Kitas potencialus Arcobacter spp. šaltinis yra kiaulės. T. K. H. Ho ir kt. (25) atliktas tyrimas parodė, kad paršavedžių išmatų mėginių užkrėstumas birželio ir gruodžio mėnesiais skyrėsi nežymiai (atitinkamai 42,6 ir 42,2 proc.). Todėl galima teigti, kad arkobakterijų paplitimui ir jo kaitai sezoniškumas įtakos neturi. Birželį dažniau buvo išskiriamos A. skirrowii rūšies bakterijos (23 iš 26 izoliatų). Gruodį iš mėginių išskirtoms bakterijoms buvo būdingas tolygus rūšinis pasiskirstymas (A.
butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii rūšims atitinkamai priskirta 10, 13 ir 15 izoliatų).
Priklausomai nuo paukščių tipo Arcobacter genties bakterijų paplitimas pulkuose skiriasi ir siekia nuo 2 iki 97 proc. Didžiausias paplitimas yra fiksuojamas vištų pulkuose (52,5 proc.), po kurių seka ančių (26,1 proc.) ir žąsų (18 proc.) pulkai. Iš paukščių išmatų ir skerdenų mėginių dažniausiai išskiriamos su žmonių susirgimais susijusios rūšys – A. butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii. Verta paminėti, kad paukščių skerdenos yra dažniau užkrėstos arkobakterijomis nei išmatų mėginiai. Tokį rezultatą gali lemti du veiksniai: 1) skerdena yra užkrečiama per kelis šaltinius (skerdimo aplinka, skerdimo procese naudojamas vanduo ar personalas); 2) naudojami neefektyvūs išskyrimo ir identifikavimo metodai (3,8,26,27).
1.2.2. Paplitimas gamybinėje aplinkoje
Remiantis įvairių šaltinių duomenimis galima teigti, kad gamybinei aplinkai būdingi tokie arkobakterijų svoriniai paplitimo vidurkiai: a) 40 proc. (pieno); b) 29,4 proc. (daržovių); c) 13,6 proc. (paukštienos) ir d) 6,2 proc. (jautienos) (3,28,29).
Arkobakterijų paplitimas maisto žaliavose gali būti tiesiogiai susijęs su gamyboje naudojamu užterštu vandeniu ar skerdimo įranga. Taip pat bakterijos gali plisti per darbuotojų rankas ar mažas kailio daleles, esančias ore odos nulupimo metu (30,31). L. H. Rasmussen ir kt. (29) ištyrė Arcobacter spp. paplitimą ant įrangos, naudojamos broilerių skerdimo procese. Didžioji dalis A. butzleri padermių (90,6 proc.) buvo aptikta ant vidaus organų šalinimo mašinų. Taip pat šio tyrimo metu nustatyta, kad dauguma
Arcobacter izoliatų pasižymi padidėjusiu atsparumu dezinfekcinei medžiagai (natrio hipochloritui). 2003
metais Belgijoje buvo atlikti panašaus pobūdžio tyrimai. Jų metu buvo tiriami skerdimo linijos ir įrangos paviršių nuoplovų mėginiai. Mėginiai buvo imami prieš skerdimą, darbo savaitės pradžioje ir pabaigoje. Arkobakterijos buvo išskirtos iš 66,9 proc. mėginių. 88 proc. mėginių buvo užkrėsti išskirtinai A. butzleri
13 rūšies bakterijomis, o 8,4 proc. mėginių – A. cryaerophilus. Iš vieno mėginio buvo išskirtos abiejų rūšių bakterijos. Taip pat šio tyrimo metu nustatyta, kad savaitės eigoje bakterinis įrangos užterštumas didėjo (32). Arkobakterijos geba išgyventi ant plastiko, stiklo ir nerūdijančio plieno paviršių. Todėl padidėjusi bakterijų akumuliacija ant įrangos paviršiaus galėjo lemti mažesnį dezinfekcijos efektyvumą (30,32,33). Patogenus gamybinėje aplinkoje ir ūkiuose gali pernešti įvairūs kenkėjai (vabzdžiai ir graužikai). Danijoje atlikti tyrimai parodė, kad 8,2 proc. prie broilerių laikymo vietų pagautų musių galėjo pernešti kampilobakterijas, salmoneles ir kitus patogenus šiems paukščiams. Musės gali patekti pro ventiliacijos angas, todėl prie jų būtina įrengti musių gaudykles. Taip pat svarbu mėsos perdirbimo įmonėse vykdyti graužikų kontrolės programą (8,33,34).
1.2.3. Žaliavų ir maisto produktų užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis
Bakterijų randama ant vartojimui paruoštų šviežių daržovių paviršiaus, mėsoje ir jos produktuose, moliuskuose, žuvyje, kiaušiniuose, termiškai neapdorotame piene ir jo produktuose, geriamajame vandenyje. Tam įtakos turi kryžminė tarša maisto perdirbimo įmonėse, prekybos vietose, vartotojų namuose (4,5). Neužtikrinus tinkamų higienos sąlygų skerdimo metu bakterijos iš virškinamojo trakto ar nuo gyvūnų odos paviršiaus gali patekti ant skerdenos (7,33). Pieno ūkiuose bakterijos plinta į pieno žaliavą per fekalijomis užterštus karvių spenius ir melžimo prietaisus (23).
Arkobakterijų paplitimas įvairiuose šaltiniuose skiriasi (4,5,35). Didžiausias arkobakterijų paplitimas būdingas pieno produktams ir kiaulienai (atitinkamai 36,4 ir 36,3 proc.). Mažiausias – triušienai (10 proc.). Kitų produktų svoriniai paplitimo vidurkiai: a) jūros gėrybės – 32,3 proc.; b) jautiena – 31,2 proc.; c) paukštiena – 26,4 proc.; d) ėriena – 24,9 proc. ir e) daržovės – 14 proc. (3).
2019 metais Turkijoje buvo tiriamas galvijų skerdenos, smulkintos jautienos bei jautienos faršo užkrėstumas arkobakterijomis. Bendras Arcobacter spp. paplitimas mėginiuose siekė 8,5 proc. Galvijų skerdena buvo labiau užkrėsta (11 proc.) nei smulkinta jautiena ir faršas (po 6 proc.) (35). 2009 metais Ispanijoje nustatytas didesnis jautienos užkrėstumas, kuris siekė 31,3 proc. (36). 2004 - 2012 metais Jungtinėje Karalystėje, Čekijoje, Australijoje ir Malaizijoje atliktų tyrimų metu nustatytas 22-46,8 proc. arkobakterijų paplitimas jautienos farše (3). Arcobacter spp. paplitimo dažnis vištienoje siekia nuo 21,1 iki 95 proc. (3,36,37). Y. Badilla-Ramirez ir kt. (38) atliktame tyrime nustatyta, kad A. butzleri geba augti 4 - 10 ℃ temperatūroje, todėl yra potencialus rizikos veiksnys paukštieną vartojantiems žmonėms. Jungtinėje Karalystėje, Malaizijoje ir Turkijoje (2006-2014 m.) ištyrus žalio karvių pieno mėginius nustatytas 5,8 - 46 proc. arkobakterijų paplitimas (3).
Iš termiškai neapdorotos vištienos ir jautienos dažniausiai išskiriamos A. butzleri (58,5 proc.), A.
14 Italijoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad 80 proc. žalio karvių pieno mėginių buvo užkrėsta
Arcobacter spp. bakterijomis, o visi izoliatai priskirti A. butzleri rūšiai (23).
1.3. Arkobakterijų perdavimas
Dažniausiai žmonių infekcijos yra siejamos su užkrėstų maisto produktų ir vandens vartojimu. Pavyzdžiui, 2009 metais Anglijoje bei Velse atlikto tyrimo metu nustatyta, kad bakterijomis užkrėsta jautiena lėmė 7 proc. visų (1,7 mln.) žmonių infekcijų atvejų (40). Kiti patogeno perdavimo būdai žmonių tarpe: 1) fekalinis-oralinis (horizontalus); 2) vertikalus (vaisiaus infekavimas per placentą); 3) tiesioginis kontaktas su gyvūnais (įkandimai ar augintiniui laižant savininką) ir 4) tiesioginis arba netiesioginis kontaktas su gyvūnų išmatomis (4).
Nustatyta, kad 63 proc. A. butzleri sukeltų žmonių infekcijų lemia kontaktas su užkrėstu vandeniu ar jo vartojimas. Arcobacter spp. siejama su mažiausiai trimis protrūkiais Slovėnijoje bei Jungtinėse Amerikos Valstijose. Tikslios protrūkių priežastys nėra žinomos. Tačiau manoma, kad įtakos galėjo turėti arkobakterijų gebėjimas prisitvirtinti prie metalinių paviršių ir formuoti bioplėveles vandentiekio vamzdžiuose (6,41). Gyvulinės kilmės maisto produktai pavojingi tada, kai nėra tinkamai termiškai apdorojami arba vartojami žali. Užkrėsti augalinės kilmės maisto produktai gali lemti žmonių infekcijų atvejus. Tinkamas daržovių plovimas sumažina užsikrėtimo riziką (4). Taip pat labai svarbus maisto perdirbimo įmonių higienos ir sanitarinių normų laikymasis ir kontrolė, nes patogenas lengvai plinta per įrangą, paviršius, personalą. Pavyzdžiui, A. butzleri turi savybę prikibti prie nerūdijančio plieno ar plastiko paviršių ir formuoti bioplėveles (4,8,16). Į bioplėvelės struktūrą įeinančios bakterijų ląstelės ir ekstraląstelinė polimerinė medžiaga lemia padidėjusį atsparumą paviršių dezinfekcijos priemonėms (4,16).
Produkcijos gyvūnų tarpe bakterijos taip pat plinta vertikaliu ir horizontaliu keliu. T. K. H. Ho ir kt. atlikus pulsuojančio lauko gelio elektroforezę pastebėta, kad iš paršavedžių (amniono skystis) ir jų jauniklių (tiesioji žarna) organizmų išskirtos padermės pasižymi panašiais DNR fragmentų išsidėstymo profiliais. Tai reiškia, kad A. cryaerophilus geba pereiti paršavedžių placentos barjerą ir užkrėsti vaisių (8,25). Horizontaliai bakterijos plinta per ūkių darbuotojų aprangą, įrangą, vandenį, dirvožemį, graužikus, pašarus, transportą (8,42). Paukščių ir kiaulių fermose dezinfekcinių kilimėlių naudojimas prie skirtingų patalpų gali sumažinti patogenų pernešimo riziką. Tačiau tai efektyvu tik tada, kai kilimėliai reguliariai papildomi dezinfekcine medžiaga. Taip pat svarbu ūkiuose įrengti biosaugos barjerus: darbuotojai pakeičia aprangą, plauna avalynę prieš eidami į kitos paskirties ūkio patalpą (8).
Augintiniai bei laukiniai gyvūnai gali užsikrėsti horizontaliu tiesioginiu ir netiesioginiu būdu (kontaktuojant su kitų gyvūnų išmatomis, kuriose yra arkobakterijų) (2). K. Houf ir kt. atlikto tyrimo
15 metu Arcobacter genties bakterijos išskirtos iš 0,7 proc. šunų burnos ertmės ir 1,9 proc. išmatų mėginių. Tuo tarpu kačių išmatų ir burnos ertmės mėginiai arkobakterijomis užkrėsti nebuvo (43). Priešingi rezultatai gauti 2008 metais atliktame tyrime. Jo metu, ištyrus kačių burnos ertmės, periferinio kraujo ir limfmazgių aspiracinės biopsijos mėginius nustatytas 78,8 proc. arkobakterijų paplitimas. Rezultatų skirtumus galėjo lemti didesniu tikslumu pasižymintys molekuliniai bakterijų identifikavimo metodai (43,44). Gyvūnai, kaip ir žmonės, enteropatogenais gali užsikrėsti ėsdami žalią užkrėstą jautieną, vištieną ir kiaulieną. Tai ypač aktualu renkantis RAW mitybos būdą (šėrimas žalia mėsa ir gyvūninės kilmės subproduktais) augintiniams (45).
1.4. Epidemiologinė situacija
Nors arkobakterijų sukeliami infekcijų atvejai yra fiksuojami visame pasaulyje, paplitimo duomenys skiriasi ir vieningas tendencijas įžvelgti sunku. Taip pat manoma, kad infekcijų mastai yra nuvertinami. Tam daug įtakos turi skirtingų laboratorinių metodų naudojimas. Dažnais atvejais naudojami netinkami aptikimo ir identifikavimo metodai (tai lemia standartinio metodo nebuvimas). Praktikoje pasitaiko klaidingai neigiamų atvejų ir vietoje A. butzleri nustatomos kitos bakterijų rūšys:
Campylobacter coli arba Campylobacter fetus. Arcobacter genties bakterijų paplitimas klinikiniuose
žmonių mėginiuose svyruoja nuo 0,1 iki 12,9 proc. (3,6,13).
A. Samie ir kt. (46) atliktuose tyrimuose Pietų Afrikoje nustatyta, kad A. butzleri trečia pagal paplitimo dažnį (6,2 proc.) pacientų, kuriems būdinga diarėja, tarpe. Didesnis paplitimas buvo būdingas tik Helicobacter pylori (50,6 proc.) ir Campylobacter jejuni (10,2 proc.). Tuo tarpu Belgijoje ištyrus 6774 pacientų su ūminiu enteritu išmatų mėginius (nuo 2008 iki 2013 metų) nustatyta, kad Arcobacter spp. (A. cryaerophilus, A. butzleri ir A. thereius) paplitimas siekia 1,31 proc. Didesnis paplitimas buvo būdingas tik Campylobacter spp. (5,61 proc.), Salmonella spp. (2,04 proc.) ir Clostridium difficile (1,61 proc.) bakterijoms (47). Pastaruoju metu Arcobacter spp. kartu su E. coli, Shigella spp., Campylobacter spp. ir Salmonella spp. yra siejamos su keliautojų diarėja (48). Kelių stebėjimų metu buvo tiriami turistai iš Europos ir JAV keliavę į Jungtines Meksikos Valstijas, Indijos ir Gvatemalos Respublikas. Šių stebėjimų dėka nustatyta, kad A. butzleri vidutiniškai 8 proc. atvejų buvo etiologinis keliautojų diarėjos faktorius (2,49,50).
Predisponuojantys faktoriai susirgti arkobakterioze, taip pat kaip ir kitų žarnyno bakterijų infekcijomis, yra nusilpusi organizmo būklė, vyresnis amžius, hipertenzija. Invazinė infekcijos forma, kuri pasireiškia bakteriemija, dažniausiai būdinga imunosupresinės būklės pacientams (16).
16
1.5. Arkobakterijų reikšmė žmonių ir gyvūnų sveikatai
1.5.1. Infekcijos patogenezė ir arkobakterijų virulentiškumo faktoriai
Arkobakterijos pastaraisiais metais tampa vis labiau reikšmingos, nes atskiros rūšys pripažįstamos kaip enteropatogenai bei potencialūs zoonozių sukėlėjai. Arcobacter genčiai priklausančios bakterijos skiriasi nuo kitų proteobakterijų, nes geba išgyventi įvairių šeimininkų organizmuose (2). Arcobacter spp. nėra normali žmogaus žarnyno mikrofloros dalis. Trys arkobakterijų rūšys yra pripažintos patogeniškomis: A. butzleri, A. cryaerophilus ir A. skirrowii (5,16). Infekcijai įtakos turi kelių tipų faktoriai, kuriuos galima padalinti į 2 grupes: 1) susiję su patogeniniu mikroorganizmu (adhezinės, invazinės savybės ir bakterijų išskiriami toksinai) ir 2) susiję su šeimininko organizmu – citokinas IL-8 (interleukinas - 8) (2) Tik 2 arkobakterijų rūšys (A. butzleri ir A. cryaerophilus) ištirtos invazinių ir adhezinių savybių atžvilgiu. R. Bücker ir kt. atliktame tyrime nustatyta, kad A. butzleri sutrikdo gaubtinės žarnos epitelinių ląstelių (HT-29/B6) funkcionavimą. Gaubtinės žarnos epitelio ląstelių barjero funkciją užtikrinti padeda klaudinų šeimos baltymai (klaudinas – 1, 5 ir 8). Būtent dėl A.
butzleri infekcijos įvyksta šių baltymų pokyčiai: a) mažėja klaudino – 1 ir klaudino – 5 kiekis; b) kinta
jų išsidėstymas. Taip pat A. butzleri inicijuoja ląstelių apoptozę. Visi šie veiksniai lemia gaubtinės žarnos epitelio ląstelių barjero disfunkciją (51).
Atliekant naujus tyrimus buvo ieškoma ryšio tarp arkobakterijų genų ir virulentiškumo mechanizmo. Ištyrus A. butzleri ATCC 49616 genomą, nustatyta dešimt skirtingų genų, kurie galimai susiję su šios bakterijos virulentiškumu: 1) cadF; 2) ciaB (Campylobacter invazinis antigenas B); 3) cj1349; 4) hecA; 5) iroE; 6) hecB; 7) irgA; 8) mviN; 9) pldA; 10) tlyA (79, 42, 80). Šie genai siejami su įvairiomis patogeninių mikroorganizmų (pvz.: E. coli, Campylobacter ir Vibrio spp.) funkcijomis: a) cadF, hecA, cj1349 – adhezija; b) ciaB – invazija; c) hecB, tlyA, pldA – eritrocitų lizavimu; d) irgA, iroE – geležies jonų įsisavinimu; e) mviN – peptidoglikano sinteze (52,53). Dėl šios priežasties pastarųjų tyrimų duomenys byloja apie enteropatogeninę Arcobacter spp. prigimtį.
1.5.2. Klinikiniai simptomai
Arkobakterijų sukeliamos infekcijos yra siejamos su gastroenterito, enterokolito, bakteriemijos ir apendicito simptomais. Bakterijos taip pat aptinkamos kepenų ciroze bei apendikolitu sergančių asmenų kraujyje (6). Žmonių arkobakteriozės klinikiniai simptomai yra nespecifiniai ir primena kitų enteropatogenų sukeliamus susirgimus: ūmus vandeningas viduriavimas, pilvo skausmas, pykinimas, vėmimas, rečiau karščiavimas (5,16,33,40). A. butzleri įvardijama kaip svarbiausia ir labiausiai paplitusi rūšis (2,16). Ji dažnai sukelia persistuojantį vandeningą viduriavimą, nes sutrikdo žarnų epitelio barjerinę
17 funkciją (16). Kadangi arkobakterijos ir kampilobakterijos pasižymi panašiomis fenotipinėmis savybėmis ir yra genetiškai artimos, jų sukeliamų infekcijų simptomatika taip pat panaši (3 lent.).
Nustatyta, kad A. butzleri bakterijos galvijams ir kiaulėms sukelia gastroenteritą. Tuo tarpu A.
skirrowii galvijams gali sukelti viduriavimą bei hemoraginį kolitą (8). Tačiau bakterijas galima išskirti
ir iš asimptomių gyvūnų išmatų mėginių. Tai rodo, jog maisto pramonei auginami gyvuliai gali būti patogeninių bakterijų nešiotojai (2). Taip pat kaip ir žmonėms, gyvūnams arkobakteriozė pasireiškia vandeningu ir ilgai trunkančiu viduriavimu (2,30). A. cryaerophilus siejama su gyvūnų abortais, A.
butzleri ir A. skirrowii juos sukelia rečiau (2). Arcobacter spp. galvijams sukelia ir komplikuoja mastitą
(4).
3 lentelė. Arkobakteriozės ir kampilobakteriozės klinikinių simptomų palyginimas (32) Klinikinis simptomas Arkobakteriozė, proc. Kampilobakteriozė, proc.
Hematochezija 6 29,4 Leukocitai išmatose 3 17,9 Viduriavimas 67,2 78 Ūmus viduriavimas 50,8 73,3 Nuolatinis viduriavimas 16,4 4,7 Vandeningas viduriavimas 50,8 31,9 Karščiavimas 32,8 43,5 Pykinimas, vėmimas 27,9 24,6 Pilvo skausmas 29,5 27,7
1.5.3. Gydymas ir atsparumas antibakterinėms medžiagoms
Dauguma Arcobacter spp. infekcijų praeina savaime ir gydymas antibiotikais nėra reikalingas. Tačiau esant sunkiems, ilgai besitęsiantiems simptomams, gali būti taikomas gydymas antibiotikais. Dažniausiai naudojamos fluorochinolonų (ciprofloksacinas), tetraciklinų (tetraciklinas, doksiciklinas), aminoglikozidų (gentamicinas, streptomicinas) ir makrolidų (eritromicinas) klasėms priskiriamos antimikrobinės medžiagos (2,9,13,54).
2006 metais JAV atliktame tyrime nustatyta, kad 93,7 proc. (n=163) tirtų Arcobacter spp. padermių (išskirtų iš broilerių skerdenų) buvo atsparios vienam ir daugiau antibiotikų. 71,8 proc. (n=125) padermių buvo atsparios dviems ir daugiau antibiotikų. A. butzleri izoliatai buvo ypač atsparūs klindamicinui (90 proc.; N=126) ir azitromicinui (81,4 proc.; n=114). A. cryaerophilus didžiausias atsparumas nustatytas klindamicinui (82,3 proc., n=28) ir azitromicinui (20,6 proc.; n=7). Viena A.
cryaerophilus padermė buvo atspari ciprofloksacinui. Tyrimo rezultatai parodė, kad Arcobacter spp.
bakterijų atsparumas antibiotikams turi ryšį su Campylobacter spp. genties atsparumu. Abi gentys dažniausiai būna atsparios tiems patiems antibiotikams (55).
18 S. Abay ir kt. (56) atliktame tyrime nustatyta, kad A. butzleri pasižymi didesniu rezistentiškumu nei A. cryaerophilus ir A. skirrowii. Šio tyrimo metu buvo naudojami arkobakterijų izoliatai išskirti iš: vištienos skerdenų, maltos jautienos, kalakutienos, žmonių, kuriems būdingas gastroenteritas, išmatų mėginių. Visi A. butzleri rūšies izoliatai buvo jautrūs gentamicinui, tačiau rodė atsparumą trimetoprimui, cefuroksimui ir rifampicinui. Taip pat didžiajai daliai izoliatų buvo būdingas rezistentiškumas ampicilinui (78,57 proc. visų izoliatų buvo atsparūs šiai medžiagai).
2019 metais S. Ferreira ir kt. atliko Arcobacter spp. bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimų rezultatų metaanalizę. Analizei buvo atrinkta 40 straipsnių, kuriuose nagrinėtas bakterijų jautrumas dažniausiai infekcijų gydymui naudojamoms medžiagoms. Į vertinimą įtraukta 15 makrolidų, fluorochinolonų, aminoglikozidų, tetraciklinų, cefalosporinų ir penicilinų klasėms priklausančių antibiotikų. Apibendrinus rezultatus nustatyta, kad daugiausiai arkobakterijų izoliatų (69,3-99,2 proc.) buvo atsparūs penicilinui bei cefalosporinui (30,5-97,4 proc.). Jei penicilinas buvo naudojamas su kitos grupės antibiotiku, atsparumas mažėjo. Makrolidams buvo atsparūs 10,7-39,8 proc., tetraciklinams 1,8-12,9 proc., o aminoglikozidams 0,8-7,1 proc. izoliatų. Apibendrinus rezultatus nustatyta, kad arkobakterijos mažiausiai atsparios aminoglikozidams (57).
Izoliatai iš maisto ir mėsos perdirbimo įmonių paviršių mėginių buvo jautresni amoksicilinui su klavulano rūgštimi, cefalotinui, cefoperazonui, azitromicinui, ampicilinui ir amoksicilinui. Maisto mėginių izoliatai jautresni ampicilinui lyginant su kitomis grupėmis ir atsparesni eritromicinui lyginant su vandens mėginiais. Taip pat, maisto izoliatai atsparesni eritromicinui labiau nei vandens. Analizuojant taip pat nustatyta, kad 68,9 proc. izoliatų yra atsparūs bent vienam antibiotikui iš 3 ar daugiau skirtingų klasių. Atsparumo daugiau negu vienam antibiotikui paplitimas vandens mėginiuose buvo mažiausias, o žmonių mėginiuose didžiausias (57).
1.6. Bakterijų jautrumo antibiotikams reikšmė visuomenės sveikatai
Visuomenės sveikatai pavojų kelia didėjantis bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Tai susiję su dažnu ir menkai kontroliuojamu antibiotikų naudojimu veterinarijoje ir medicinoje. Padidėjusį rezistentiškumą lemiantys genai gali būti perduodami kitiems patogenams. Tai gali lemti silpną antimikrobinės terapijos efektyvumą sunkių bakterinių infekcijų atvejais (18,58). Dėl vis didėjančio Arcobacter spp. ir kitų bakterijų atsparumo antmikrobinėms medžiagoms, vis dažniau siūloma pasitelkti alternatyvias inovatyvias terapeutines priemones (59,60). Šiuo metu vis daugiau dėmesio skiriama terapijai ir profilaktikai, kurios pagrįstos bakteriofagų, probiotikų, kiaušinio trynio antikūnų, citokinų, RNRi technologijos, vaistažolių ekstraktų ir eterinių aliejų panaudojimu (6).19 Europos Sąjungoje galioja teisės aktai, kuriais siekiama mažinti antibiotikams atsparių bakterijų skaičių veterinarinės medicinos srityje. 2006 metais uždraustas augimą skatinančių antibiotikų (monenzino, salinomicino, avilamicino, flavofosfolipolio) naudojimas ūkinės paskirties gyvūnams. Taip pat pagal teisės aktus turi būti vykdomas naudojamų antimikrobinių medžiagų atsekamumas. Skirtingos sritys (žemės ūkis, veterinarija, medicina, aplinkosauga) visame pasaulyje turėtų susivienyti ir kurti bei vykdyti veiksmingesnes reguliavimo priemones. Siūloma skatinti infekcijų prevenciją: į ūkinės paskirties gyvūnų racioną įtraukti prebiotikus ir probiotikus, skatinti gyvūnų vakcinaciją nuo užkrečiamųjų ligų (58,61). Svarbu diegti ir tobulinti biosaugos programas ūkiuose, apsaugant gyvūnus nuo netiesioginio užsikrėtimo patogenais per užterštus pakratus, personalą, įrangą (61).
1.7. Arcobacter spp. bakterijų identifikavimo ypatumai
Arcobacter spp. turi daug morfologinių panašumų su Campylobacter spp. bakterijomis: 1) Gram
neigiamos; 2) spiralės formos lazdelės; 3) būdingas polinis žiuželis be apvalkalo (viename ar abiejose ląstelės galuose), kuris užtikrina judėjimo funkciją. Vienintelis skirtumas, kuris gali padėti diferencijuoti šias dvi gentis - arkobakterijų gebėjimas augti mikroaerobinėmis sąlygomis žemesnėje temperatūroje (15 - 30℃) (62). Naudojant tik fenotipinius ar biocheminius identifikavimo metodus dažnai gaunami klaidingai neigiami rezultatai (Arcobacter genties bakterijų atžvilgiu). Todėl naudojant molekulinio identifikavimo metodus užtikrinami tikslesni rezultatai su mažesne paklaida.
Plačiausiai paplitęs arkobakterijų molekulinio identifikavimo metodas – dauginė polimerazės grandininė reakcija arba dPGR (nuo angl. „multiplex PCR“). Šis metodas pirmą kartą panaudotas 2000 m., K. Houf ir bendraautorių atliktame tyrime (63). Šio metodo taikinys – 16S rRNR ir 23S rRNR genai, todėl vienu metu galima identifikuoti 3 arkobakterijų rūšis: 1) A. butzleri (16S rDNR); 2) A.
cryaerophilus (23S rDNR) 3) ir A. skirrowii (16S rDNR). 16S rRNR genas koduoja ribosominės RNR
16S komponentą, kuris įeina į 30S subvieneto struktūrą. 23S rRNR genas koduoja prokariotų ribosominės RNR 23S komponentą, kuris įeina į 50S subvieneto struktūrą (6,64).
Atliekant epidemiologinius tyrimus (rizikos veiksnių ir transmisijos būdų analizę), svarbų vaidmenį atlieka genotipavimas. Arkobakterijų padermių diferencijavimui naudojamas ERIC-PGR metodas. Analizei atlikti naudojami dveji pradmenys: a) ERIC 1R ir b) ERIC 2. Šio molekulinės analizės metodo taikinys – palindrominės ERIC (nuo angl. „enterobacterial repetitive intergenic consensus“) sekos, kurios susideda iš 127 bazių porų. Bakterijų genomui būdingi šių sričių pasikartojimai. Kopijų pasikartojimo skirtumai padeda diferencijuoti individualias padermes. Šis metodas naudojamas ir kitų patogenų charakterizavimui (pvz.: E. coli, Salmonella spp.) (65).
20
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Tyrimų vieta ir eiga
Tyrimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje nuo 2019 m. rugsėjo mėn. iki 2020 m. spalio mėn. Tyrimai atlikti septyniais etapais (1 pav.).
1 pav. Tyrimų eiga ir apimtis
2.2. Mėginių rinkimas
Siekiant įvertinti arkobakterijų paplitimą paukštienoje, žaliame piene ir jautienos farše, šių maisto žaliavų mėginiai buvo renkami nuo 2019 m. rugsėjo mėn. iki 2020 m. rugpjūčio mėn. Mėginiai nebuvo renkami kovo-gegužės mėnesiais. Žaliavos buvo perkamos iš Kaune esančių mažmeninės prekybos vietų, neįspėjant pardavėjų. Vištiena (kilmės šalis – Lietuva) pirkta turgavietėse bei prekybos centruose. Nepasterizuotas karvių pienas buvo perkamas turgavietėse, o jautienos faršas prekybos centruose. Tyrimams buvo surinkta 190 mėginių, iš jų: 94 vištienos (46 atvėsintų viščiukų broilerių sparneliai ir 48 blauzdelės), 56 nepasterizuoto karvių pieno ir 40 jautienos faršo mėginių. Pritaikius paprastąją atsitiktinę atranką mėginiai buvo renkami kas dvi savaites - pirmąsias dvi savaites tirti vištienos mėginiai (n=10 arba n=11), kitas dvi savaites – pieno mėginiai (n=6 arba n=7) ir jautienos faršo mėginiai (n=4 arba n=5).
1. Mėginių rinkimas (n = 190)
2. Arkobakterijų išskyrimas iš maisto žaliavų
3. DNR išskyrimas
4. Bakterijų identifikavimas iki rūšies dPGR metodu
5. Amplifikavimo reakcijos rezultatų vertinimas pasitelkus gelio elektroforezę
6. Jautrumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas (n = 60)
21 Nepriklausomai nuo žaliavos tipo, mėginiai iki tyrimo buvo laikomi šaldytuve 4 ºC temperatūroje ne ilgiau kaip 12 valandų.
2.3. Arkobakterijų išskyrimas iš maisto žaliavų
Arkobakterijų išskyrimas buvo atliekamas pasitelkus selektyvaus pagausinimo ir membraninio filtravimo metodus. Selektyviam pagausinimui užtikrinti buvo naudojama skysta terpė, kurią sudarė selektyvus Arcobacter pagausinimo sultinys (CM0965, Oxoid LTD., Basingstoke, UK) ir selektyvus C.A.T. priedas (SR174E, Oxoid LTD.). Pasyvi filtracija užtikrinta pasitelkus sterilius 0,45 μm dydžio poras turinčius celiuliozės esterių membraninius filtrus.
Pirmiausiai steriliomis priemonėmis (žirklės ir pincetas) į mėgintuvėlius su 9 ml pagausinimo terpės perkelta 1 g tiriamos paukštienos ar smulkintos jautienos. Žalio pieno atveju tiriamoji mėginio dalis (1 ml) perkelta pasitelkus sterilią serologinę pipetę. Po to visi mėginiai homogenizuoti sūkuriniu maišytuvu (Bio Vortex V1, Profitec, Gunnar Holm-Petersen, GmbH and Co, Hamburg, Germany). Po homogenizavimo mėginiai inkubuoti termostate 28 ºC temperatūroje 48 valandas mikroaerofilinėmis sąlygomis (5 proc. O2, 10 proc. CO2, 85 proc. N2). Mikroaerofilinės sąlygos buvo užtikrintos naudojant specialius sandarius indus ir vienkartinius CampyGen paketus (CN0025, Oxoid LTD.).
Gyvūninės kilmės maisto žaliavų mėginiams yra būdingas didelis bakterinis užterštumas. Todėl po 48 val. inkubavimo, siekiant sumažinti bakterijų skaičių vienam tūrio vienetui, atlikti dešimtkartiniai skiedimai. Skiedimai atlikti steriliuose 1,5 ml tūrio mėgintuvėliuose, į juos įpilant 100 µl pradinės suspensijos ir 900 µl buferinio peptono vandens. Paukštienos mėginių skiedimai atlikti kol gauti 10-2 skiediniai, o smulkintos jautienos bei nepasterizuoto pieno atveju - 10-1. Paruošti skiediniai naudoti atliekant membraninę filtraciją. Filtracijos tikslas – pasitelkus filtrus atskirti skiedinyje esančias arkobakterijas nuo pašalinės mikrofloros. Filtracijos eiga: 1) naudojant sterilų pincetą, ant Petri lėkštelių su Mueller-Hinton agaru (CM0405, Oxoid LTD.), praturtintu 5 proc. defibrinuotu avies krauju (DSC025, E&O Labaratories Limited, Burnhouse, Scotland), uždėti membraniniai filtrai (Sartorius, Epsom, UK); 2) 300 µl skiedinio mikropipete perkelta ant centrinės filtro dalies; 3) pasyvi filtracija vykdyta Petri lėkštelės vienai valandai patalpinus į termostatą (aerobinėmis sąlygomis 28 ºC temperatūroje); 4) po valandos filtrai pašalinti nuo agaro paviršiaus, o lėkštelės įdėtos į termostatą ir inkubuotos 28 ºC temperatūroje 48 valandas aerobinėmis sąlygomis.
Po kultivavimo, atsižvelgus į arkobakterijų morfologiją (judrios, lenktos formos lazdelės), iš kiekvienos lėkštelės atrinkta iki 5 Arcobacter spp. būdingų kolonijų (iki 1 mm dydžio, bespalvės, apvalios, išgaubtos, lygiais kraštais). Kiekviena kolonija atskirai persėta į lėkšteles su Mueller-Hinton agaru, praturtintu 5 proc. avies krauju. Bakterijos kultivuotos termostate 48 valandas 28 ºC temperatūroje
22 mikroaerofilinėmis sąlygomis. Po kultivavimo sterilia 1 µl mikrobiologine kilpele arkobakterijos nuo agaro paviršiaus perkeltos į mėgintuvėlius su smegenų ir širdies sultiniu (CM1135, Oxoid LTD.) ir 30 proc. gliceroliu. Izoliatai iki tyrimo pradžios buvo saugomi -82 ºC temperatūroje. Po mikroskopinio ir makroskopinio vertinimo tolimesniems tyrimų etapams atrinkta 60 izoliatų, iš jų: 42 vištienos, 11 nepasterizuoto pieno ir 7 jautienos faršo izoliatai.
2.4. DNR išskyrimas
Po 48 val. kultivavimo išaugusios kolonijos surinktos 1 µl mikrobiologine kilpele ir perkeltos į Ependorfo mėgintuvėlius su 200 μl „PrepMan Ultra“ DNR išskyrimo tirpalo (Applied Biosystems by Life Technologies, Austin, USA). Tada mėgintuvėlių turinys išmaišytas sūkurinio tipo maišykle. Po maišymo mėgintuvėliai perkelti į termomikserį (Thermomixer compact, Eppendorf AG, Hamburg, Germany), kur vykdytas bakterinių ląstelių suardymas (10 minučių 99 ºC temperatūroje). Po ląstelių lizavimo etapo mėgintuvintėliai atvėsinti iki kambario temperatūros ir centrifuguoti (Centrifuge 5418, Eppendorf AG) 5 minutes 14 000 aps./min greičiu. Po to viršutinė tirpalo dalis (150 μl) perkelta į naujus mėgintuvėlius, kurie dar kartą centrifuguoti tomis pačiomis sąlygomis. Po pakartotinio centrifugavimo, 70 μl „Prepman Ultra“ tirpalo su DNR perkelta į naujus PGR mėgintuvėlius, kurie iki dPGR tyrimo laikyti šaldytuve 4 ºC temperatūroje.
2.5. Bakterijų identifikavimas iki rūšies dPGR metodu
Molekulinis arkobakterijų (A. butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii) identifikavimas iki rūšies atliktas pasitelkus dauginės polimerazės grandininės reakcijos metodą. Metodas paremtas 16S rRNR ir 23S rRNR struktūrinius vienetus koduojančių genų pagausinimu.
Į kiekvieną 200 μl tūrio PGR mėgintuvėlį buvo įpilta po 25 μl reakcijos mišinio, kurį sudarė: 12,5 μl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) mišinio (K1081, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, US), 2,25 μl pradmenų (po 0,5 μl ARCO, BUTZ, CRY1, CRY2 ir 0,25 μl SKIR (Thermo Fisher Scientific, Life technologies, Invitrogen Custom Primers, Waltham, Massachusetts, US)), 2 μl tiriamos bakterijų DNR ir 8,25 μl sterilaus distiliuoto vandens. PGR reakcija vykdyta termocikleryje (Veriti 96-Well Thermal Cycler, Thermo Fisher Scientific). Reakcijos sąlygos pateikiamos 4 lentelėje (žr. 23 psl.). Iki gelio elektroforezės PGR produktai laikyti termocikleryje 4 ºC temperatūroje.
23 4 lentelė. Dauginės polimerazės grandininės reakcijos sąlygos
PGR žingsnis Temperatūra Laikas Ciklų skaičius
1. Pradinė denatūracija 94 ºC 2 min 1
2. Denatūracija 94 ºC 45 sek.
32
3. Pradmenų prisijungimas 61 ºC 45 sek.
4. Sintezė 72 ºC 30 sek.
5. Galutinė sintezė 72 ºC 5 min. 1
2.6. PGR reakcijos rezultatų vertinimas pasitelkus gelio elektroforezę
Po DNR pagausinimo paruoštas 2 proc. agarozės gelis. Gelio paruošimui naudota 2,4 g agarozės (R0491, TopVision Agarose, Thermo Scientific), 120 ml TBE buferio ir 6,5 μl etidžio bromido. Forma su sustingusiu agarozės geliu įstatyta į buferiu pripildytą (#B52, 10xTBE Electrophoresis Buffer, Thermo Scientific, Fermentas International) elektroforezės vonelę (ConsortEV261 Power Supply Electrophoresis, Turnhout, Belgium). Į pirmą ir paskutinį šulinėlius įpilta po 3 μl DNR žymeklio (#SM0243, GeneRuler 100bp DNA Ladder, Thermo Scientific), o į likusius po 11 μl PGR reakcijos mišinio. Sujungus horizontalią sistemą su srovės šaltiniu elektroforezė vykdyta 45 minutes naudojant 110 V elektros srovę (dažnis 98 mA; galia − 300 W). Po elektroforezės PGR rezultatai įvertinti padarius nuotraukas UV spindulių šviesoje (UVIpro Silver (Uvitec, Cambridge, UK) aparatas ir Image Lab programinė įranga). PGR reakcijos metu susidariusių DNR fragmentų dydžiai: 257 bp (A. cryaerophilus 1 ir 2 pogrupiai), 401 bp (A. butzleri) ir 641 bp (A. skirrowii).
2.7. Jautrumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas (E-testas)
Jautrumas ampicilinui, azitromicinui, tetraciklinui, gentamicinaui, eritromicinui ir ciprofloksacinui įvertintas nustatant minimalią slopinančią koncentraciją (MSK) juostelės difuzijos metodu (E-testas). Jautrumas antimikrobinėms medžiagoms tirtas 60 padermių, išskirtų iš vištienos (n=42), nepasterizuoto pieno (n=11) ir jautienos faršo (n=7).
Pirmiausiai grynos arkobakterijų kultūros ir kontrolinė Escherichia coli ATCC 25922 padermė pasėtos į Petri lėkšteles su Mueller-Hinton agaru, praturtintu 5 proc. defibrinuotu avies krauju.
Arcobacter spp. bakterijos kultivuotos 30 ºC temperatūroje 48 valandas mikroaerofilinėmis sąlygomis.
Tuo tarpu E. coli kultivuotos 37 ºC temperatūroje 48 valandas aerobinėmis sąlygomis.
Po kultivavimo sterilia 1 µl mikrobiologine kilpele A. butzleri ir E. coli (ATCC 25922) bakterijos nuo agaro paviršiaus perkeltos į atskirus mėgintuvėlius su 2 ml Brucella sultinio (#4012742, Biolife,
24 Italy). A. cryaerophilus rūšies bakterijoms būdingas lėtas augimas, todėl kiekviena padermė buvo perkelta į 3 mėgintuvėlius su skysta terpe. Mėgintuvėliai inkubuoti 30 ºC temperatūroje mikroaerofilinėmis sąlygomis 24 valandas. Mėgintuvėlis su E. coli bakterijomis inkubuotas 37 ºC temperatūroje aerobinėmis sąlygomis. Siekiant padidinti A. cryaerophilus bakterijų skaičių tūrio vienete, po inkubavimo iš trijų suspensijų buvo paruošta viena 600 μl suspensija.
Jautrumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymui naudota 1 x 108 KSV/ml tankio bakterijų suspensija. Mikropipete 100 µl suspensijos perkelta ant Petri lėkštelių su Mueller-Hinton agaru, praturtintu 5 proc. defibrinuotu avies krauju ir tolygiai paskleista Drigalski špateliu. Tada steriliu pincetu ant terpių paviršiaus, ties lėkštelės viduriu, buvo uždedama skirtingų koncentracijų antimikrobine medžiaga prisotinta ETEST® juostelė (E-testTM, bioMérieux, Nürtingen, Germany). Užsėtos lėkštelės su antmikrobinių medžiagų juostelėmis inkubuotos 30 ºC temperatūroje 48 valandas mikroaerofilinėmis sąlygomis. MSK vertės nustatytos vertinant apatinę slopinamosios zonos ir ETEST juostelės susikirtimo ribą.
Duomenų apie arkobakterijų jautrumą antibiotikams nėra daug, taip pat nėra ir standartizuotų CLSI ir EUCAST rekomendacijų šios genties bakterijoms. Todėl gauti rezultatai vertinti pagal C. jejuni rūšies (jautrumas azitromicinui, eritromicinui, tetraciklinui, ciprofloksacinui) ir Enterobacterales eilės bakterijoms (jautrumas gentamicinui, ampicilinui) taikomas EUCAST klinikinio lūžio taško reikšmes (5 lent.).
5 lentelė. Antimikrobinių medžiagų MSK lūžio taškai Antimikrobinių medžiagų klasė Antimikrobinė medžiaga Jautru (μg/ml) Atsparu (μg/ml) Makrolidai Azitromicinas ≤4 >4 Eritromicinas ≤4 >4 Tetraciklinai Tetraciklinas ≤2 >2 Fluorochinolonai Ciprofloksacinas ≤0,5 >0,5 Aminoglikozidai Gentamicinas ≤2 >2 Penicilinai Ampicilinas ≤8 >8
2.8. Statistinė gautų duomenų analizė
Paplitimo ir jautrumo tyrimų metu gauti duomenys apdoroti pasitelkus Microsoft Office Excel 2013 programą ir IBM SPSS Statistics 23.0 programinį paketą. MS Office Excel programa naudota duomenų suvedimui, dažnių skirstinių ir pasikliautinio intervalo skaičiavimui. Naudojant IBM SPSS Statistics Chi-kvadrato (χ2) testą nustatytas statistinis duomenų patikimumas. Skirtumai tarp imčių, kurios skiriasi pagal vieną požymį, įvertinti pasitelkus vienfaktorinę ANOVA analizę. Duomenys buvo laikomi statistiškai patikimais, jei statistinio reikšmingumo lygmuo buvo mažesnis nei 0,05 (p<0,05).
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. Mėginių užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis
Iš viso ištirta 190 mėginių, iš jų: 94 vištienos (46 sparneliai ir ir 48 blauzdelės), 56 žalio pieno ir 40 jautienos faršo mėginių. Atliktais tyrimais nustatyta, kad 31,6 proc. (n=60; 95 proc. PI 25,0-38,7 proc.) visų mėginių buvo užkrėsti arkobakterijomis. Didžiausias Arcobacter spp. paplitimas buvo vištienos mėginiuose - 44,7 proc. (n=42; 95 proc. PI 34,4-55,3 proc.). Žalio pieno ir jautienos faršo mėginių užkrėstumas buvo atitinkamai 19,6 proc. (n=11; 95 proc. PI 10,2-32,4 proc.) ir 17,5 proc. (n=7; 95 proc. PI 7,3-32,8 proc.) (2 pav.). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas tarp vištienos, žalio pieno ir jautienos faršo mėginių užkrėstumo (χ2=12,55; p<0,05).
2 pav. Vištienos, žalio pieno ir jautienos faršo mėginių užkrėstumas arkobakterijomis
Taip pat nustatyta, kad mėginių užkrėstumas Arcobacter spp. bakterijomis nuo skirtingo sezono laikotarpio nepriklauso (3 pav., žr. 26 psl.) (p>0,05). Didžiausias vištienos mėginių užkrėstumas nustatytas vasario mėn. (63,6 proc.; 95 proc. PI 30,8-89 proc.), mažiausias – lapkričio mėn. (30 proc.; 95 proc. PI 6,7-65,3 proc.). Pieno mėginiai labiausiai užkrėsti rugsėjo mėn. (42,9 proc.; 95 proc. PI 9,9-81,6 proc.), mažiausiai gruodžio ir liepos mėn. (0 proc.; 95 proc. PI 0-45,9 proc.). Jautienos faršo mėginiai dažniausiai buvo užkrėsti spalio mėn. (40 proc.; 95 proc. PI 5,3-85,3 proc.), rečiausiai – lapkričio, gruodžio ir rugpjūčio mėn. (0 proc.; 95 proc. PI 0-52,5 proc.).
42 11 7 52 45 33 0 10 20 30 40 50
Vištiena Žalias pienas Jautienos faršas
M ėgi ni ų ska ič ius Mėginio tipas Užkrėsti Neužkrėsti
26 3 pav. Mėginių užkrėstumas skirtingu laikotarpiu
Vištienos mėginių užkrėstumo skirtumai priklausomai nuo pirkimo vietos pavaizduoti 4 paveiksle. Tiek turgavietėse, tiek prekybos centruose iš viso buvo nupirkta po 47 mėginius. Labiau užkrėstos buvo šlaunelės ir sparneliai, pirkti prekybos centruose (46,8 proc.). Turgavietėse pirktos vištienos užkrėstumas siekė 42,6 proc. Patikimo statistinio ryšio tarp mėginių pirkimo vietos ir paukštienos užkrėstumo nenustatyta (p>0,05).
4 pav. Vištienos mėginių pirkimo vietos įtaka užkrėstumui
Pieno mėginiai buvo pirkti iš trijų skirtingų ūkininkų. Užkrėstumas pagal kilmės vietą pavaizduotas 5 paveiksle (žr. 27 psl.). Daugiausiai izoliatų (36,8 proc.; 95 proc. PI 16,3-61,6 proc.) išskirta iš ūkio „B“ pieno. Daugiau nei triskart mažesnis užkrėstumas užfiksuotas ūkio „A“ ir „C“ piene (10,5-11,1 proc.). Tačiau patikimo statistinio ryšio tarp ūkio ir pieno užkrėstumo nenustatyta (p>0,05).
0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 M ėgi ni ų už kr ės tum as , pr oc . Mėnuo Vištiena Pienas Jautienos faršas 0 10 20 30 40 50
Turgavietės Prekybos centrai
V iš tie no s m ėgi ni ų ska ič ius , vn t.
Mėginių pirkimo vieta
Pirkti mėginiai Užkrėsti mėginiai
27 5 pav. Žalio pieno mėginių užkrėstumas priklausomai nuo kilmės vietos
3.2. Išskirtų arkobakterijų rūšinė įvairovė
Atlikus dauginę PGR ir gelio elektroforezę, arkobakterijos identifikuotos iki rūšinio lygmens. Iš visų gyvūninės kilmės mėginių buvo išskirtos dvi Arcobacter spp. rūšys – A. butzleri ir A. cryaerophilus (6 pav.). Tyrimo metu A. skirrowii rūšis nebuvo išskirta.
6 pav. Arkobakterijų rūšių identifikavimas dPGR metodu (1, 20 – žymeklis (#SM0243, GeneRuler 100bp); 2, 3,
5-12 – A. butzleri (401bp); 4, 13-15 – A. cryareophilus (257bp); 16 – A. cryaerophilus teigiama kontrolė (ATCC 43158); 17 – A. butzleri teigiama kontrolė (ATCC 49616); 18 – A. skirrowii teigiama kontrolė (ATCC 51132); 19 – neigiama kontrolė)
A. butzleri buvo dažniausiai nustatoma rūšis mėginiuose (88,33 proc. atvejų) (n=53; 95 proc. PI
77,4-95,2 proc.). A. cryaerophilus bakterijos nustatytos 11,67 proc. mėginių (n=7; 95 proc. PI 4,8-22,6 proc.). Diagramoje pavaizduota, kaip identifikuotos rūšys pasiskirstė atskirose mėginių grupėse (7 pav., žr. 28 psl.). 0 5 10 15 20
Ūkis „A“ Ūkis „B“ Ūkis „C“
P ie n o m ėgi ni ų ska ič ius , vn t.
Pieno kilmės vieta
Mėginių skaičius Izoliatų skaičius
28 7 pav. Arkobakterijų rūšių pasiskirstymas mėginių grupėse
Didžioji dalis iš vištienos išskirtų izoliatų priskirti A. butzleri (95,2 proc.; 95 proc. PI 83,8-99,4 proc.), o likusi dalis - A. cryaerophilus rūšiai (4,8 proc.; 95 proc. PI 0,6-16,2 proc.). Visi žalio pieno izoliatai priskirti išskirtinai A. butzleri rūšiai (100 proc.; 95 proc. PI 71,5-100 proc.). Dauguma jautienos faršo izoliatų priskirti A. cryaerophilus bakterijoms (71,4 proc.; 95 proc. PI 29-96,3 proc.). A. butzleri rūšis nustatyta beveik trečdalyje (28,6 proc. 95 proc. PI 3,7-70,1 proc.) jautienos faršo izoliatų.
3.3. Arcobacter spp. genties bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
3.3.1. Iš vištienos išskirtų Arcobacter spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagomsAtlikti jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimai ir nustatytas bakterijų jautrumas makrolidų (azitromicinas, eritromicinas), penicilinų (ampicilinas), aminoglikozidų (gentamicinas), tetraciklinų (tetraciklinas) ir fluorochinolonų (ciprofloksacinas) klasių antimikrobinėms medžiagoms (2 priedas). Iš vištienos išskirtų arkobakterijų padermių jautrumo antibiotikams rezultatai pateikiami 6 lentelėje.
6 lentelė. Iš vištienos išskirtų arkobakterijų padermių jautrumas antibiotikams Antimikrobinė medžiaga Jautrios
padermės, vnt. Atsparios padermės, vnt. Azitromicinas 9 33 Eritromicinas 18 24 Tetraciklinas 36 6 Ciprofloksacinas 30 12 Gentamicinas 41 1 Ampicilinas 14 28 0 10 20 30 40 50
Vištiena Žalias pienas Jautienos faršas
M ėgi ni ų skai či us , vn t. Mėginių grupė A. butzleri A. cryaerophilus
29 Dažniausiai padermės atsparios azitromicinui (78,6 proc.; 95 proc. PI 63,2-89,7 proc.) (8 pav.). 66,7 proc. atsparumas nustatytas ampicilinui (95 proc. PI 50,5-80,4 proc.). Kitam makrolidų grupės antibiotikui – eritromicinui – atsparumas nustatytas 57,1 proc. padermių (95 proc. PI 40,1-72,3 proc.).
8 pav. Iš vištienos išskirtų padermių atsparumas azitromicinui
Padermės labiausiai jautrios gentamicinui (97,6 proc.; 95 proc. PI 87,4-99,9 proc.) (9 pav.).
9 pav. Iš vištienos išskirtų padermių jautrumas gentamicinui
Dauginis atsparumas (atsparumas 3 ir daugiau antimikrobinių medžiagų) nustatytas 24 iš 42 (57,1 proc.) tirtų padermių. Iš 13 padermių, kurios buvo atsparios trims antimikrobinėms medžiagoms, 8 buvo atsparios makrolidų ir penicilinų, 2 – makrolidų, penicilinų ir fluorochinolonų, dar 2 - makrolidų, penicilinų ir tetraciklinų, 1 – makrolidų ir fluorochinolonų klasių antimikrobinėms medžiagoms. Iš 9
0 50 100 150 200 250 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 A zi tr o m ic in o M S K , µ g/m l Padermės nr.
C. jejuni klinikinis lūžio taškas
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 Ge n ta m ic in o M S K , µ g/m l Padermės nr.
30 padermių, kurios buvo atsparios keturioms antimikrobinėms medžiagoms, 5 buvo atsparios makrolidų, penicilinų ir fluorochinolonų, 2 - makrolidų, penicilinų ir tetraciklinų, 1 – makrolidų, fluorochinolonų ir tetraciklinų, 1 - makrolidų, fluorochinolonų ir penicilinų klasių antimikrobinėms medžiagoms. Iš 2 padermių, kurios buvo atsparios penkioms antimikrobinėms medžiagoms, abi buvo atsparios makrolidų, fluorochinolonų, penicilinų klasių medžiagoms, viena iš padermių papildomai atspari aminoglikozidų, o kita – tetraciklinų klasės antimikrobinėms medžiagoms.
Gauti rezultatai palyginti tarp skirtingų prekybos vietų (7 lent.).
7 lentelė. Atsparių padermių skaičius mėginiuose iš skirtingų prekybos vietų
Antimikrobinė medžiaga
Atsparių padermių skaičius Turgavietė Prekybos centras
Azitromicinas 16 17 Eritromicinas 10 14 Tetraciklinas 2 4 Ciprofloksacinas 4 8 Gentamicinas 1 0 Ampicilinas 14 14
Atsparių antimikrobinėms medžiagoms padermių skaičius buvo panašus skirtingose prekybos vietose. Šiek tiek išsiskyrė eritromicinui ir ciprofloksacinui atsparių padermių skaičius – dažniau jiems buvo atsparios iš prekybos centrų pirktų mėginių padermės (p<0,05).
3.3.2. Iš žalio pieno išskirtų Arcobacter spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Iš žalio pieno mėginių išskirtų padermių jautrumas antibiotikams pateikiamas 8 lentelėje, pilna lentelė su MSK reikšmėmis pateikiama 3 priede.
8 lentelė. Arkobakterijų padermių, išskirtų iš žalio pieno mėginių, jautrumas antibiotikams Antimikrobinė medžiaga Jautrios
padermės, vnt. Atsparios padermės, vnt. Azitromicinas 4 7 Eritromicinas 4 7 Tetraciklinas 9 2 Ciprofloksacinas 10 1 Gentamicinas 9 2 Ampicilinas 2 9
81,8 proc. (95 proc. PI 48,2-99,8 proc.) bakterijų pasižymėjo atsparumu ampicilinui (10 pav., žr. 31 psl.). Taip pat padermės dažnai buvo atsparios azitromicinui ir eritromicinui – atsparumas jiems siekė 63,6 proc. (95 proc. PI 30,8-89,1 proc.).
31 10 pav. Iš pieno išskirtų padermių atsparumas ampicilinui
Padermės 91 proc. (95 proc. PI 58,7-99,8 proc.) atvejų buvo jautrios ciprofloksacinui (11 pav.), o 81,8 proc. (95 proc. PI 48,2-99,8 proc.) jautrumas nustatytas gentamicinui ir tetraciklinui.
11 pav. Iš pieno išskirtų padermių jautrumas ciprofloksacinui
6 iš 11 tirtų padermių nustatytas dauginis atsparumas. Iš 3 padermių, kurios buvo atsparios trims antimikrobinėms medžiagoms, visos buvo atsparios makrolidų ir penicilinų klasės antibiotikams. Iš 2 padermių, kurios buvo atsparios keturioms medžiagoms, abi buvo atsparios makrolidų ir penicilinų, viena
0 10 20 30 40 50 60 70 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 A m pi c il in o M S K , µ g/m l Padermės nr.
Enterobacterales klinikinis lūžio taškas
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 C ipr o fl o ks ac in o M S K , µ g/m l Padermės nr.
32 iš jų – papildomai aminoglikozidų, kita – tetraciklinų klasės antimikrobinėms medžiagoms. Viena padermė buvo atspari visiems šešiems tyrimo antibiotikams.
Gauti rezultatai taip pat palyginti tarp skirtingų ūkių pieno (9 lent.):
9 lentelė. Skirtingų ūkių pieno mėginių atsparių padermių kiekis Antimikrobinė medžiaga Atsparių padermių kiekis, proc.
Ūkis „A“ Ūkis „B“ Ūkis „C“
Azitromicinas 0 85,7 50 Eritromicinas 0 85,7 50 Tetraciklinas 0 28,6 0 Ciprofloksacinas 0 14,3 0 Gentamicinas 0 28,6 0 Ampicilinas 100 85,7 50
Iš ūkio „A“ pieno išskirtos padermės buvo atsparios tik vienai antimikrobinei medžiagai. Tarp ūkio „B“ pieno Arcobacter bakterijų padermių buvo nustatytas atsparumas vienai ar kelioms medžiagoms, dauginį atsparumą turėjo 5 padermės iš 7. Padermė, kuri buvo atspari visoms tirtoms antimikrobinėms medžiagoms, taip pat buvo išskirta iš ūkio „B“ pieno. Ūkio „C“ piene aptiktos pavienės padermės, atsparios vienai medžiagai.
3.3.3. Iš jautienos faršo išskirtų Arcobacter spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Iš jautienos faršo mėginių išskirtų padermių jautrumo antibiotikams rezultatai pateikiami 10 lentelėje (žr. 33 psl.), o pilna lentelė su MSK reikšmėmis pateikiama 4 priede. 85,7 proc. (95 proc. PI 42,1-99,6 proc.) išskirtų bakterijų buvo jautrios azitromicinui, tetraciklinui ir ampicilinui. Didžiausias atsparumas nustatytas eritromicinui ir gentamicinui (57,1 proc.; 95 proc. PI 18,4-90 proc.).
10 lentelė. Arkobakterijų, išskirtų iš jautienos faršo mėginių, jautrumas antimikrobinėms medžiagoms Antimikrobinė medžiaga padermės, vnt. Jautrios padermės, vnt. Atsparios
Azitromicinas 6 1 Eritromicinas 3 4 Tetraciklinas 6 1 Ciprofloksacinas 5 2 Gentamicinas 3 4 Ampicilinas 6 1
2 padermėms (28,6 proc.; 95 proc. PI 3,7-70,1 proc.) buvo nustatytas dauginis atsparumas. Viena padermė atspari penicilinų, aminoglikozidų, makrolidų ir fluorochinolonų, kita - aminoglikozidų, makrolidų, tetraciklinų ir fluorochinolonų klasės medžiagoms.
