MĖSOS PUSGAMINIŲ IR GAMINIŲ KOKYBĖS IR SAUGOS GERINIMAS PRITAIKANT CHEMINES IR BIOLOGINES MEDŽIAGAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Anita Rokaitytė

MĖSOS PUSGAMINIŲ IR GAMINIŲ

KOKYBĖS IR SAUGOS GERINIMAS

PRITAIKANT CHEMINES IR BIOLOGINES

MEDŽIAGAS

Daktaro disertacija

Žemės ūkio mokslai, veterinarija (02A)

Disertacija rengta 2013–2018 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje.

Mokslinė vadovė

prof. dr. Gintarė Zaborskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. dr. Rasa Želvytė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A).

Nariai:

prof. dr. Loreta Šernienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A);

prof. dr. Jūratė Šiugždaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A);

doc. dr. Antanas Šarkinas (Kauno technologijos universitetas, technologijos mokslai, chemijos inžinerija – 05T);

prof. dr. Thomas Alter (Maisto saugos ir maisto higienos institutas (Vokietija), žemės ūkio mokslai, veterinarija – 02A).

Disertacija bus ginama viešajame Veterinarijos mokslo krypties tarybos posėdyje 2018 m. birželio mėn. 21 d., 10 val., dr. S. Jankausko auditorijoje.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES VETERINARY ACADEMY

Anita Rokaitytė

APPLICATION OF CHEMICAL AND

BIOLOGICAL SUBSTANCES FOR

QUALITY AND SAFETY IMPROVEMENT

OF MEAT PREPARATIONS AND

PRODUCTS

Doctoral Dissertation

Agricultural Sciences, Veterinary (02A)

Dissertation has been prepared at the Department of Food Safety and Quality of Veterinary Academy of Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2013–2018.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Gintarė Zaborskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A).

Dissertation is defended at the Veterinary Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences.

Chairperson

Prof. Dr. Rasa Želvytė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A).

Members:

Prof. Dr. Loreta Šernienė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A);

Prof. Dr. Jūratė Šiugždaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A);

Assoc. Prof. Dr. Antanas Šarkinas (Kaunas University of Technology, Technological Sciences, Chemical Engineering – 05T);

Prof. Dr. Thomas Alter (Institute of Food Safety and Food Hygiene, Agricultural Sciences, Veterinary – 02A).

Dissertation will be defended at the open session of the Veterinary Research Council of Lithuanian University of Health Sciences, Veterinary Academy, Dr. S. Jankauskas Auditorium, at 10:00 a.m. on the 21th _{of June,} 2018.

TURINYS

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1. Cheminių medžiagų panaudojimas mėsos pramonėje ... 13

1.1.2. Cheminių medžiagų tarpusavio sąveika mėsos matricoje ... 13

1.1.3. Cheminių medžiagų antioksidacinis aktyvumas ... 15

1.1.4. Cheminių medžiagų antimikrobinis poveikis ... 16

1.1.5. Cheminių medžiagų funkcionalumas ... 17

1.1.6. Cheminių medžiagų panaudojimo mėsos produktų gamyboje trūkumai ... 19

1.2. Biologinių medžiagų skirstymas ir panaudojimas mėsos pramonėje 19 1.2.1. Biologinių medžiagų antimikrobinis poveikis ... 20

1.2.2. Biologinių medžiagų poveikis biogeninių aminų susidarymui ... 22

1.2.3. Biologinių medžiagų funkcionalumas ... 23

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS ... 24

2.1. Tyrimų atlikimo etapai, vieta ir laikas ... 24

2.2. Tyrimo metu naudotos medžiagos ir objektai ... 25

2.2.1. Cheminės medžiagos... 25

2.2.2. Bakterijų kultūros ... 25

2.2.3. Patogeninių bakterijų padermių kultūros ... 25

2.2.4. Organų taikininių ląstelių kultūros ... 26

2.2.4. Mėsos pusgaminiai ... 26

2.2.4.1. Smulkinta kiauliena ir jautiena ... 26

2.2.4.2. Smulkinta kiauliena ir jautiena supakuota naudojant skirtingas pakuotes ... 27

2.2.4.3. Šviežios kiaulienos dešrelės su bakterijų kultūromis ... 27

2.2.5. Mėsos gaminiai ... 28

2.2.5.1. Vytintos ir šaltai rūkytos dešros ... 28

2.3. Tyrimo metodikos ... 29

2.3.1. Mikrobiologiniai tyrimai ... 29

2.3.1.1. Difuzijos į agarą (įdubų) metodas ... 29

2.3.1.2. Mėsos pusgaminių ir gaminių mikrobiologiniai tyrimai... 30

2.3.2. Fizikiniai cheminiai tyrimai ... 31

2.3.2.1. Cheminiai riebalų oksidacijos ir hidrolizės tyrimo metodai ... 31

2.3.2.2. Spektrofotometriniai metodai ... 31

2.3.2.4. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodas ... 33

2.3.2.5. Dujų chromatografijos metodas ... 34

2.3.2.3. pH nustatymas ... 35

2.3.2.4. Spalvos koordinačių nustatymas ... 35

2.3.2.5. Tekstūros analizė ... 36

2.3.3. Fermentinis D(–)- ir L(+)- pieno rūgšties izomerų nustatymas ... 36

2.3.4. Mėsos gaminių juslinė profilinė analizė ... 36

2.3.5. Pasirinktų cheminių medžiagų ir jų mišinių poveikis ląstelių gyvybingumui in vitro ... 37

2.3.5.1. Pasirinktų organų taikinių ląstelių kultūrų paruošimas ... 37

2.3.5.2. Ląstelių proliferacijos nustatymas ... 38

2.3.5.3. Ląstelių apoptozės nustatymas ... 38

2.4. Statistinių duomenų analizė ... 39

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 40

3.1. Cheminių medžiagų ir jų mišinių tyrimai ... 40

3.1.1. Antimikrobinio aktyvumo įvertinimas in vitro ... 40

3.1.2. Fizikiniai cheminiai tyrimai ... 42

3.1.2.1. Suminis flavonoidų ir fenolinių junginių kiekybinis nustatymas bei antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 42

3.2. Cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių poveikis mėsos pusgaminių saugai ir kokybei ... 44

3.2.1. Cheminių medžiagų ir jų mišinių poveikis smulkintai kiaulienai ir jautienai (I bandymas) ... 44

3.2.2. Cheminių medžiagų poveikis smulkintai kiaulienai (II bandymas) ... 44

3.2.2.1. Juslinė profilinė analizė ... 44

3.2.2.2. Mikrobiologiniai tyrimai ... 45

3.2.2.3. Fizikiniai cheminiai tyrimai ... 46

3.2.3. Cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių poveikis smulkintai jautienai supakuotai naudojant skirtingas pakuotes ... 47

3.2.3.1. Mikrobiologiniai tyrimai ... 47

3.2.3.2. Fizikiniai cheminiai tyrimai ... 49

3.2.4. Cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių poveikis smulkintai kiaulienai supakuotai naudojant skirtingas pakuotes ... 51

3.2.5. Biologinių medžiagų poveikis šviežių dešrelių saugai ir kokybei ... 51

3.3. Cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių poveikis mėsos gaminių saugai ir kokybei ... 52

3.3.1. Vytintos dešros (I bandymas) ... 52

3.3.1.1. Mikrobiologiniai tyrimai ... 52

3.3.2. Šaltai rūkytos dešros ... 60

3.3.2.1. Mikrobiologiniai tyrimai ... 60

3.3.2.2. Fizikiniai cheminiai tyrimai ... 61

3.3.2.3. Juslinė profilinė analizė ... 65

3.3.3. Vytintos dešros (II bandymas) ... 66

3.3.3.1. Mikrobiologiniai tyrimai ... 66

3.3.3.2. Fizikiniai cheminiai tyrimai ... 68

3.3.3.3. Fermentinis D(–)/L(+)-pieno rūgšties izomerų įvertinimas ... 77

3.4. Pasirinktų cheminių medžiagų ir jų mišinių poveikis ląstelių gyvybingumui in vitro ... 79

4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 81

IŠVADOS ... 91 REKOMENDACIJOS ... 92 BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 93 PASKELBTOS PUBLIKACIJOS ... 107 SUMMARY ... 176 3.1. Investigation venue ... 178

3.2.1. Chemicals used in experiments ... 178

3.2.2. Bacterial cultures... 179

3.2.3 Microorganisms ... 179

3.2.4. Organ cell lines ... 179

3.2.4. Meat preparations ... 180

3.2.4.1. Minced pork and beef ... 180

3.2.4.2. Minced pork and beef packed using different packages ... 180

3.2.4.3. Fresh pork sausages with BC ... 181

3.2.5. Meat products ... 181

3.3.1. The agar well diffusion method ... 182

3.3.2. Microbiological analysis of preparations and meat products... 182

3.6. Statistical analysis ... 187

4.2.2. Effects of chemical substances and their mixtures on minced pork, packed in different packages ... 192

4.3. Effects of biological and chemical substances and their mixtures to safety and quality of meat products ... 192

PRACTICAL RECOMMENDATIONS ... 202

PRIEDAI ... 204

CURRICULUM VITAE ... 224

SANTRUMPOS

AI – aterogeniškumo indeksas ANOVA – dispersinė analizė AP – aerobinė pakuotė AR – askorbo rūgštis b* – gelsvumas

BA – biogeniniai aminai B. cereus – Bacillus cereus

BHK-21 pelių inkstų linija – Sirijos žiurkėno vienos dienos amžiaus individo inkstų ląstelės KAR – L-karnozinas CN – cinamaldehidas D-GPT – D-glutamato-piruvato transaminazė DNPH – 2,4-dinitrofenilhidrazinas DPPH – 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas EA – eteriniai aliejai

ESCh – efektyvioji skysčių chromatografija E. coli – Escherichia coli

FC – Folin-Ciocalteu reagentas Fe – geležis

FeCl2 – geležies (2) chloridas GR – galo rūgštis

GRE – galo rūgšties ekvivalentas h* – spalvos intensyvumas

HCl – druskos rūgštis

HeLa – pastovi žmogaus gimdos kaklelio vėžio ląstelių linija HPLC – aukšto slėgio skysčių chromatografija

KSV/g – kolonijas sudarantys vienetai grame KV – kristalinis violetinis

L* – šviesumas

LDH – laktato dehidrogenazė

L. carnosum – Leuconostoc carnosum L. monocytogenes – Listeria monocytogenes

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MAP – modifikuotos atmosferos pakuotė

MH-22A – pelės hepatomos ląstelių linija MNRR – mononesočiosios riebalų rūgštys Mo – molibdenas

MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolino bromidas n-3 – omega 3 riebalų rūgštys

n-6 – omega 6 riebalų rūgštys Na2S2O3 –natrio tiosulfatas NaCl – natrio chloridas

NAD – nikotinamido adenino dinukleotidas

NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas P. pentosaceus – Pediococcus pentosaceus

pH – aktyvusis rūgštingumas

PNRR – polinesočiosios riebalų rūgštys PR – pieno rūgštis

PS – peroksidų skaičius r – koreliacijos koeficientas

R2 _{– determinacijos (apibrėžtumo) koeficientas} RE – rutino ekvivalentas

RR – riebalų rūgštys RS – rūgščių skaičius

S. aureus – Staphylococcus aureus

S. typhimurium – Salmonella typhimurium S. xylosus – Staphylococcus xylosus SD – standartinis nuokrypis

SRR – sočiosios riebalų rūgštys TBR – 2-tiobarbitūrinė rūgštis TCR – trichloracto rūgštis TI – trombogeniškumo indeksas TM – timolis

TFL – taksifolinas

UESCh –ultra efektyvioji skysčių chromatografija UV – ultravioletinės šviesos spinduliuotė

ĮVADAS

Gaminat mėsos pusgaminius ir gaminius cheminės ir biologinės medžiagos dažniausiai įterpiamos maisto priedais technologiniais tikslais arba veikliųjų medžiagų forma, siekiant produkto funkcionalumo [1, 2]. Šiuolaikinė visuomenė domisi sveika gyvensena, o sveika mityba yra neatsiejama jos dalis. Todėl šiandieną yra aktualu gaminti kokybiškus ir saugius vartotojų sveikatai mėsos gaminius, kuriuose naudojamos cheminės ir biologinės medžiagos slopintų biologinius ir cheminius rizikos veiksnius gamybos ir laikymo metu. Tuo tikslu pasaulyje nuolat atliekami moksliniai tyrimai, kaip praturtinti mėsos gaminius kuo natūralesnėmis biologinėmis ir cheminėmis medžiagomis, kurios ne tik konservuotų produktą, mažintų jo riebalinės fazės oksidaciją, bet ir tuo pačiu suteiktų vartotojui teigiamą fiziologinį poveikį [3, 4, 5]. Todėl šiandieną mėsos perdirbėjai laukia naujų, moksliniais tyrimais pagrįstų ir gamybos sąnaudas mažinančių, sprendimo būdų, kaip efektyviai užtikrinti gaminių kokybę ir saugą.

Tiek cheminės, tiek biologinės medžiagos gali būti išskiriamos iš natūralių šaltinių. Bakteriocinų gamyba pasižyminčios bakterinės kultūros neretai yra išskiriamos iš raugintų augalinės ir gyvūninės kilmės maisto produktų, tačiau apie jų savybes ir galimybes panaudoti mėsos pusgaminių ir gaminių gamyboje mokslinių tyrimų trūksta [6]. Cheminės medžiagos gali būti natūraliai išgaunamos iš augalų ir gyvūnų žaliavos arba gaminamos sintezės būdu [7]. Moksliniuose šaltiniuose vis dažniau pateikiama, kad natūraliai išskirti augaliniai flavanoidai ir polifenoliai, naudojami mėsos žaliavoje ir jos produktuose ne tik gali pagerinti juslines savybes, bet užtikrinti kokybę ir saugą – efektyviai mažinti riebalų ir baltymų oksidaciją bei slopinti maisto produktuose patogeninių bakterijų dauginimąsi [8, 9].

Oksidacija yra viena iš priežasčių, kodėl yra prarandama mėsos gaminių ir pusgaminių kokybė bei tinkamos juslinės savybės [10, 11]. Augalinės ir gyvūninės kilmės bioaktyvūs junginiai dažniausiai pasižymi svarbiu antioksidaciniu aktyvumu. Augaluose esantys flavanoidai gali veikti prieš laisvųjų radikalų formavimąsi, sudarant metalų chelatus, slopinant fermentines reakcijas [12]. Natūralūs antioksidantai gali būt naudojami, siekiant išsaugoti mėsos kokybę bei prailginti tinkamumo vartoti terminą [1]. Pridėti į mėsos gaminių receptūras fenoliniai junginiai pasižymi ne tik stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, bet ir plačiu antimikrobiniu aktyvumu. Jie gali slopinti vienu metu keletą mikroorganizmų virulentiškumo veiksnių (pvz., slopinti bioplėvelių susidarymą, neutralizuoti bakterinius toksinus ir t.t.) bei veikti sinergiškai su kitomis medžiagomis [13, 14]. Todėl kai kurie fenoliniai junginiai gali ne tik sumažinti bendrą bakterijų skaičių,

Literatūroje plačiai aprašoma atskirų cheminių komponentų antimikrobinis aktyvumas. Iki šiol yra atlikti tik pavieniai tyrimai, kurie nustatytų šių natūralių cheminių priedų sinergetinį poveikį [16]. Naudojant kartu chemines ir biologines medžiagas jų bendras veikimas viršija jų veikimą atskirai, todėl pasiekiami efektyvesni rezultatai. Be to, kai yra naudojamos kelios bioaktyvios medžiagos, veikiančios daugialypiškai, sumažėja tikimybė išsivystyti bakterijų rezistentiškumui [17]. Apibendrinant galima teigti, kad natūralių cheminių ir biologinių priedų sąveika yra sudėtingas reiškinys ir turėtų būti toliau tiriamas, nes iki šiol buvo gauta prieštaringų rezultatų. Nors yra tyrimų, apie natūralių cheminių ir biologinių medžiagų antibakterinį ir antioksidacinį sąveikos poveikį gaminamo produkto kokybei, tačiau tiriant poveikio efektyvumą, būtina atsižvelgti į skirtingas maisto matricas bei gamybos technologijas. Todėl labai svarbu tirti kuo įvairesnes iš natūralių šaltinių išskirtas chemines ir biologines medžiagas bei jų mišinius, siekiant tikslingai pagerinti mėsos gaminių kokybės ir saugos rodiklius.

Darbo tikslas

Įvertinti tiriamųjų cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių antimikrobines ir antioksidacines savybes bei pritaikyti mėsos gaminių ir pusgaminių saugos ir kokybės gerinimui.

Darbo uždaviniai

1. Nustatyti pasirinktų cheminių medžiagų ir jų mišinių antioksidacines ir antibakterines savybes difuzijos į agarą metodu in vitro.

2. Nustatyti pasirinktų cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių įtaką mėsos pusgaminių saugai ir kokybei: fizikiniams cheminiams, mikrobiologiniams rodikliams ir juslinėms savybėms po pagaminimo ir laikymo metu.

3. Nustatyti veiksmingų cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių įtaką mėsos gaminių saugai ir kokybei: fizikiniams cheminiams, mikrobiologiniams rodikliams, juslinėms savybėms jų laikymo metu.

4. Nustatyti tirtų cheminių medžiagų ir jų mišinių funkcionaliąsias savybes – slopinantį poveikį organų taikinių ląstelių kultūrų proliferacijai ir apoptozei modelinėse sistemose in vitro.

Darbo naujumas ir praktinė reikšmė

Nustatytas pasirinktų cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių antioksidacinis ir antimikrobinis aktyvumas modelinėse sistemose ir realiose

mėsos pusgaminių ir gaminių matricose, taikant skirtingas gamybos technologijas. Pirmieji įvertinome flavonoido taksifolino savybes bei stabilumą vytintose ir šaltai rūkytose dešrose laikymo metu. Stabilumo įvertinimui sumodeliavome taksifolino iš dešrų matricos ekstrakcijos sąlygas, naudojant ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Be to, nustatėme pasirinktų cheminių medžiagų ir jų mišinių poveikį organų taikinių ląstelių kultūrų gyvybingumui modelinėse sistemose in vitro.

Darbe pateikti tyrimų rezultatai turi praktinį pritaikomumą, atveria galimybes naujų kokybiškesnių ir saugesnių mėsos gaminių ir pusgaminių kūrimui.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Cheminių medžiagų panaudojimas mėsos pramonėje

Šiandien maisto produktai yra naudojami ne tik alkiui numalšinti, bet taip pat aprūpinti žmones būtinomis maistinėmis medžiagomis, kurios būtų naudingos ligų profilaktikai. Siekiant patenkinti šiuos vartotojų poreikius, mėsos pramonėje vis dažniau bandoma pritaikyti natūralias biologines ir chemines medžiagas, kurios būtų patrauklios vartotojams [5].

Daugelis biologiškai aktyvių peptidų yra pagaminami mėsos fermentacijos ir hidrolizės metu, todėl tokių junginių gamyba didėja, o tolesnis mėsos produktų praturtinimas jais gali būti naudingas žmogaus sveikatai. Mėsos pramonėje vis dažniau bandoma pritaikyti biologiškai aktyvius peptidų junginius, tokius kaip L-karnozinas, L-karnitinas, kreatinas, glutationas, anserinas, ir taurinas, kurie praturtina sudėtį bei pagerina gaminių kokybę bei saugą [1, 18, 19].

Natūralioms cheminėms medžiagoms, priskiriami ir polifenoliai, kurie efektyviai mažina lipidų bei baltymų oksidaciją bei slopina maisto produktų gedimą sukeliančių bakterijų, mikromicetų augimą, infekcijų sukėlėjų dauginimąsi. Be to, žinoma, kad polifenoliai sudaro kompleksus su baltymais, kurie sąlygoja abiejų junginių struktūrinių, funkcinių ir maistinių savybių pokyčius [1]. Prieš naudojant natūralius cheminius komponentus mėsos žaliavoje ir jos produktuose būtina atkreipti dėmesį į kai kurias aplinkybes. Vienas iš svarbesnių veiksnių yra natūralių cheminių medžiagų pritaikymo parametrai bei sąveika su mėsoje esančiomis endogeninėmis ir egzogeninėmis medžiagomis [20].

Natūralių cheminių medžiagų panaudojimui maisto pramonėje didžiausią įtaką turi temperatūra, pH, baltymų tipas, fenolinių junginių rūšis bei koncentracija [1, 11, 21]. Nors tikslus mechanizmas, kaip baltymai veikia polifenolinius junginius, dar pilnai nėra ištyrinėtas, bet nustatyta, kad fenolinių junginių ir baltymų sąveika turi įtakos jų struktūrai, kiekiui ir pasiskirstymui maisto produktuose bei antimikrobiniam ir antioksidaciniam aktyvumui [11, 22]. Geresnis polifenolinių junginių ir peptidų sąveikos supratimas padėtų kontroliuoti natūralių cheminių priedų funkcines savybes maisto produktuose technologinio proceso bei laikymo metu [7].

1.1.2. Cheminių medžiagų tarpusavio sąveika mėsos matricoje

Maisto pramonėje natūralūs peptidai yra naudojami dėl skirtingų funkcinių savybių, pvz., siekiant padidinti stabilumą, elastingumą, vandens ir riebalų

absorbciją bei pagerinant mėsos produktų juslines savybes [21, 23]. Šioms funkcinėms savybėms didelės įtakos turi baltymų tirpumas, padedantis įvertinti baltymų funkcionalumą mėsos matricoje, nes baltymų negrįžtama koaguliacija gali apriboti ir kitas jų savybes [24]. Baltymų makromolekulės gali kontaktuoti viena su kita bei su kitomis makromolekulėmis, dažnai sudarydamos itin painios struktūros stambiamolekulinius kompleksus. Tokie ryšiai pagrįsti daugybe silpnų sąveikų tarp dviejų skirtingų molekulių paviršių, kurioms susidaryti įtakos turi peptidų savybės (pvz., aminorūgščių kompozicijos ir sekos) bei išoriniai (pH, temperatūros ir t.t.) veiksniai [23].

Dėl peptidų ir fenolinių junginių sąveikos pasikeičia mėsos matricos tiek baltymai, tiek fenoliniai junginiai. Pagrindiniai baltymų pokyčiai iš esmės yra susiję su struktūros ir funkcinių savybių stabilumu bei sumažėjusi arba padidėjusiu virškinamumu [21, 25]. Kita vertus, šios sąveikos rezultatai lemia ir fenolinių ar flavonoidinių junginių kiekio pokyčius, antioksidacinį aktyvumą bei atskirų šių junginių biologinį prieinamumą in vitro ir in vivo. Tam įtakos turi skirtingos panaudojimo sąlygos, kaip temperatūra, pH, polifenolinių junginių rūšis ir struktūra bei keletas kitų veiksnių [26, 27]. Yra keletas prieštaringų rezultatų, susijusių su polifenolinių junginių sąveika su baltymais. Nustatyta, kad polifenolinių junginių reakcija su baltymų molekulėmis gali sumažinti jų tirpumą, nes reakcijos metu padidėja baltymų molekulinė masė. Be to, gali pakisti baltymų antrinės ir tretinės struktūros, dėl kurių jos būna hidrofilinės. Šis hidrofilinių / hidrofobinių sąveikų pokytis gali turėti įtakos ne tik tirpumui, bet ir kitoms funkcinėms savybėms kaip stabilumui ir absorbcijai [25].

Kita vertus, baltymų sąveika su polifenolinais junginiais gali pagerinti baltymų šiluminį stabilumą. Nustatyta, kad aukštesnės temperatūros taikymas mėsos matricai padidina fenolinių junginių sąveiką su peptidais, dėl ko, padidėja panaudotų priedų stabilumas ir antioksidacinis aktyvumas [27]. Vis dėlto visų šių parametrų poveikio tyrimai yra labai riboti ir juos reikėtų išsamiau išnagrinėti, kad optimizuoti mėsos produkto gamybos proceso sąlygas ir užtikrinti naudojamų natūralių cheminių priedų naudą sveikatai.

Prieštaringi rezultatai yra stebimi ir mėsos matricos medžiagų biologinio prieinamumo tyrimuose. Kai kurie tyrimai parodė, kad sąveika tarp peptidų ir polifenolinių junginių mažina biologinį prieinamumą, kiti teigia, kad nėra reikšmingų pokyčių, arba net padidina [24, 28]. Todėl labai svarbu įvertinti natūralių cheminių ir biologinių priedų sąveiką ir jų biologinį prieinamumą in vitro sąlygomis, kas suteiks vertingų duomenų, norint išsiaiškinti šių junginių tikrąją biologinę reikšmę.

1.1.3. Cheminių medžiagų antioksidacinis aktyvumas

Lipidų ir baltymų oksidacija yra kritiškas ir nepageidaujamas reiškinys mėsos pramonėje, nes sąlygoja produkto spalvos kitimą, blogesnes juslines savybes bei greitesnį gedimą [29]. Laisvieji radikalai vykstant lipidų ir baltymų oksidacijai susidaro iš reaktyvių deguonies formų maisto perdirbimo ir saugojimo metu [30]. Laisvieji radikalai, susidarę dėl lipidų oksidacijos reakcijų, gali būti lengvai perkeliami į kitas molekules, pvz., baltymų, angliavandenių ir vitaminų, ypač metalo jonų [7]. Reakcijų pobūdis priklauso nuo produkto sudedamųjų dalių, taip pat perdirbimo sąlygų. Makromolekulių oksidacijos pokyčiai turi įtakos skonio, aromato bei spalvos nepageidaujamoms pokyčių reakcijoms ir maistinei produkto vertei. Baltymų oksidacija sukelia amino rūgščių nuostolius, keičia baltymų tirpumą, funkcionalumą, tekstūrą, gali net sukelti toksiškų junginių formavimąsi [31].

Gyvi organizmai taip pat susiduria su reaktyviomis deguonies formomis. Vykstant cheminėms reakcijoms organizme, susidaro žalingų deguonies darinių (laisvųjų radikalų), kurie gali pažeisti ląstelių DNR [32]. Baltymų oksidacija žmogaus organizme susijusi su vykstančiais senėjimo pokyčiais, ligomis ir sutrikimais, pvz., oksidaciniai baltymų procesai vyksta infekcinių bei autoimuninių ligų, taip pat neuropsichiatrinių ir neurologinių sutrikimų atvejais [33].

Literatūroje nurodoma, kad lipidų ir baltymų oksidacija gali būti efektyviai kontroliuojama ar, bent jau, sumažinama, pridedant antioksidantų, kurių aptinkama ir augalų EA, ypač į kurių sudėtį įeina fenoliniai junginiai [34]. Antioksidantai žmogaus organizme sudaro sudėtingą daugiakomponentinę gynybinę sistemą, kuri užtikrina reaktyvios deguonies formos, reaktyvios azoto formos radikalų ir neradikalų sujungimą, modifikaciją, slopinimą arba ardymą [35]. Fenoliniai junginiai gali būti naudojami lipidų oksidacijos slopinimui, nes slopina laisvųjų radikalų susidarymą. Antioksidantinį EA veiksmingumą gali lemti jų sudėtyje esantys aromatiniai komponentai tokie kaip terpenai ir terpenoidai [36].

Iš fenolinių junginių grupės didžiausiu antioksidaciniu poveikiu pasižymi flavonoidai, kurių bendras antioksidacinis mechanizmas yra susijęs su laisvųjų radikalų ir chelatų metalo jonų reakcijomis [37]. Tie patys flavonoidai gali būti ir kaip antioksidantai ir kaip prooksidantai, priklausomai nuo koncentracijos ir laisvųjų radikalų šaltinio [38], flavonoidai gali tiesiogiai reaguoti su pereinamųjų metalų jonais. Įrodyta, kad metalo flavonoidų kompleksas dalyvauja oksidacijos-redukcijos reakcijose, metalo-flavonoidų chelatai žymiai geriau veikia prieš laisvųjų radikalų žalingą poveikį, nei motininiai flavonoidai. Flavonoidų junginiai veikia kaip antioksidantai

elektronų donorai, nutraukiantys radikalų susidarymo grandinines reakcijas, taip pat gali surišti metalo jonus į kompleksus [37].

1.1.4. Cheminių medžiagų antimikrobinis poveikis

Mėsos žaliava ir jos produktai yra palanki terpė daugintis daugeliui bakterijų tarp jų ir maistinių zoonozių sukėlėjams (Salmonella spp., Campylobacter spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cerius, Listeria monocytogenes ir kt.), kurie yra pavojingi žmonių sveikatai bei gali sukelti ekonominius nuostolius. Polifenolių junginių antimikrobinis aktyvumas buvo išsamiai ištirtas prieš platų spektrą mikroorganizmų [9, 10]. Daugiausia dėmesio buvo skiriama fenoliniams junginiams dėl jų plataus veikimo spektro ir didesnio antimikrobinio aktyvumo, palyginti su kitais polifenoliais. Skirtingi fenoliniai junginiai gali turėti skirtingą antimikrobinio poveikio mechanizmą tačiau dažniausiai pažeidžia ląstelės membraną ir citoplazmą, o kai kuriais atvejais gali visiškai pakeisti ląstelės morfologiją (pav. 1.1.4.) [14]. Fenoliniai junginiai gali slopinti keletą mikroorganizmų virulentiškumo veiksnių (pvz., slopinti bioplėvelių susidarymą, neutralizuoti bakterinių toksinus ir t.t.) bei veikti sinergiškai su antibiotikais [13, 14]. Todėl kai kurie fenoliniai junginiai gali ne tik sumažinti bendrą bakterijų skaičių, bet ir slopinti patogeninių bakterijų augimą bei dauginimąsi [39, 40]. Atlikti įvairūs tyrimai nustatė, kad EA antibakterinį poveikį stipriausiai lemia jų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai, tokie kaip, TM ir CN [39, 41]. Be to, bakterijų augimo kontrolė, sulėtina mėsos produktų gedimą, dėl ko, pailgėja vartojimo terminas bei sumažėja nepageidaujami juslinių savybių pokyčiai [42, 43].

Kai kurie cheminiai komponentai pasižymi natūraliu fungicidiniu poveikiu prieš grybelinius patogenus. Literatūroje nurodoma, kad karvakrolis, TM, euganolis ir CN efektyviai slopina per maistą plintančius patogeninius grybus, įskaitant Aspergillus niger, Aspergillus flavus ir Aspergillus parasiticus [44]. Veikiant EA efektyviai slopinamas micelio augimas, didėjant koncentracijai šių grybų atžvilgiu pasireiškia ir fungicidinis efektas [45].

Dažniausiai naudojant kelių skirtingų cheminių medžiagų kombinacijas pasiekiami efektyvesni rezultatai. Tačiau maisto matricoje esančios medžiagos ir priedai gali veikti antagonistiškai, pvz. baltymų ir polifenolių sąveika gali sumažinti pastarųjų junginių antimikrobines savybes. Von Staszewski ir kt. (2011) [46] įvertino skirtingų žaliosios arbatos rūšių antimikrobinių savybių pokyčius, įtraukiant išrūgų baltymus.

1.1.4 pav. Fenolinių junginių poveikis ląstelės membranai ir citoplazmai [14]

Rezultatai parodė, kad, kai dedama išrūgų baltymų, arbatos ekstraktų antimikrobinis aktyvumas sumažėjo. Tuo tarpu Gutierrez ir kt. (2009) [47] studijavo sąveiką tarp mėsoje esančių organinių medžiagų ir EA ir nustatė, kad antimikrobinis aktyvumas sumažėja, esant didesnei riebalų koncentracijai, nes EA komponentams ištirpus lipidų fazėje jie silpniau veikia mikroorganizmus esančius vandens fazėje [48]. Mėsos žaliavos ir produktų pH yra taip pat reikšmingas parametras natūralių cheminių medžiagų efektyvumui. Jau seniau pastebėta, kad EA slopinantis poveikis didesnis esant rūgštinei terpei, nes padidėja bakterijų hidrofobiškumas dėl ko greičiau iš pažeistos ląstelės pašalinami lipidai [49].

1.1.5. Cheminių medžiagų funkcionalumas

Per pastaruosius dešimtmečius labai pasikeitė požiūris į flavonoidus kaip į svarbią biologiškai aktyvių junginių grupę, dalyvaujančią įvairiuose organizmo biocheminiuose procesuose bei reguliacijos mechanizmuose. Jau žinoma, kad flavonoidai žmogui būtini ir turi būti gaunami su maistu. Kasdien suvartojamų flavonoidų kiekis gali siekti iki 1 gramo [50]. Daugelis epidemiologinių tyrimų patvirtina ryšį tarp antioksidantų kiekio maiste ir įvairių patologijų, tame tarpe, vėžio, Alzheimerio, širdies ir kraujagyslių ligų [8]. Natūralūs flavanoidai pasižymi ir funkcionalumu – slopina cholesterolio

oksidaciją, lėtinį uždegimą, apsaugo ląsteles nuo žalojančių uždegimo padarinių, o kraujagyslių sieneles nuo aterosklerozės.

Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad flavonoidai tiesiogiai veikia trombocitus, monocitus, mažo tankio lipoproteinus bei kraujagyslių lygiuosius raumenis. Be to, slopina kraujo plokštelių adheziją, agregaciją bei sekreciją. Kvercetinas ir kamferolis inhibuoja adenozino deaminazę aortos endotelio ląstelėse bei slopina mažo tankio lipoproteinų oksidaciją, taip apsaugodami nuo aterosklerozės išsivystymo Be to, flavonoidų naudojimas gerina smegenų išemija, ir aktyvuoja kolageno skaidulų formavimąsi [50].

Paskutiniu metu daugėja mokslinių darbų, nagrinėjančių flavonoidų reikšmę siekiant apsaugoti skirtingas organizmo ląsteles [51]. Nustatyta, kad kuriems flavonoidams būdingas hepatoprotekcinis ir citoprotekcinis poveikis [52]. Tačiau flavonoidai vis dažniau tiriami ne kaip vėžio prevencinės medžiagos, bet kaip, chemoterapinės medžiagos.

Vėžinių ląstelių atsparumas gydymui dažnai būna susijęs su apoptozės procesų sutrikimais. Daugiau kaip 50 proc. vėžinių ląstelių nustatoma geno p53 mutacija. Daug genetinių pažaidų turinčiose ląstelėse baltymas p53 aktyvina apoptozę. Tačiau vėžinėse ląstelėse, įprastai turinčiose daug genetinių pažaidų, mutuotas baltymas p53 apoptozės aktyvinti nesugeba. Kartais vėžinėse ląstelėse apoptozė nevyksta dėl didelio antiapoptozinių Blc-2 šeimos baltymų aktyvumo. Tyrimais įrodytą, kad svogūnuose ir obuoliuose esantis kvercetinas sumažina tikimybę sirgti prostatos, plaučių, skrandžio ir krūties vėžiu [52], nes slopina p53 baltymo mutaciją. Be to, flavonoidai gali slopinti vėžinių ląstelių ciklą bei Ras baltymų ekspresiją [53]. Siekiant sustabdyti vėžinių ląstelių dauginimusi svarbu išsiaiškinti kaip tokias ląsteles veikia natūralios cheminės medžiagos ir kokie mechanizmai suaktyvinami vėžinių ląstelių sunaikinimui. Žinoma, kad pažeistos ląstelės gali būti naikinamos apoptozės, nekrozės, autofagijos, mitozinių ir autolizės pokyčių atvejais. Minėtieji ląstelių sunaikinimo tipai skiriasi ląstelėse vystančiais biocheminiais ir morfologiniais pakitimais, kuriuos lemia panaudotos cheminės medžiagos [50].

Norint efektyviai kovoti su vėžiniais susirgimais, labai svarbu pasirinkti tinkamas chemoterapines medžiagas, kurios atitiktų norimus farmakokinetinius ir farmakodinaminius parametrus tam tikriems gydymo atvejam. Žinoma, kad flavonoidai yra stiprūs antioksidantai ir apsaugo ląsteles nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio, tačiau gali pasižymėti ir citotoksinėmis savybėmis gydant piktybinės melanomos ląsteles, žmogaus leukemijos, neuroblastomos ląsteles, stiprią limfoblastinę leukemiją ir epidermoidinę karcinomą [54]. Manoma, kad flavonoidų mišinių citotoksinį poveikį vėžinėms ląstelėms galima paaiškinti deguonies ciklu ir oksidaciniu

flavonoidus su AR, šios medžiagos nepraranda savo savybių ir gali suformuoti dehidroaskorbatą ir pusiau laisvą chinoninį radikalą. Pusiau chinonas retai kada reoksiduojamas į chinoninę formą molekuliniu deguonimi, kuris generuoja reaktyviojo deguonies atmainas tokias kaip superoksido anijoną, peroksidą, hidroksilo radikalus. Vis dėlto, skirtingų flavonoidų ir kitų cheminių medžiagų veikimo mechanizmai dar nėra visiškai žinomi, todėl jų poveikį bandoma išsiaiškinti. Ląstelių apoptozė, nekrozė ir dar kai kurie ląstelių žūties tipai, tokie kaip paraptolizė, autošizė ir onkolizė taip pat gali egzistuoti vėžinėse ląstelėse [53].

1.1.6. Cheminių medžiagų panaudojimo mėsos produktų gamyboje trūkumai

Viena iš pagrindinių natūralių cheminių medžiagų apribojimo priežasčių panaudojimo mėsos žaliavose ir jos produktuose yra jų stiprus aromatas, kuris nėra priimtinas daugeliui vartotojų. Be to, stiprus natūralių medžiagų aromatas gali nustelbti produkto natūralias juslines savybes [12]. Tačiau suderinus šių medžiagų sudėtinius komponentus su kitomis natūraliomis konservavimo medžiagomis būtu galima sumažinti dozę dėl ko sumažėtu poveikis mėsos produktų juslinėms savybėms [1].

Nors EA yra klasifikuojami kaip GRAS (Generally Recognised As Safe) [54], tačiau yra pranešimų apie jų toksiškumą. Vartojant didesnius šių natūralių komponentų kiekius galima turėti rimtų problemų dėl apsinuodijimo [5]. Todėl yra svarbu surasti balansą tarp efektyvios EA dozės ir keliančios rizikos žmogaus sveikatai. Emiroglua ir kt. (2010) nustatė, kad EA dozė, kuri visiškai sustabdo bakterijų augimą (0,005%) in vitro turi didelį citotoksinį poveikį žarnyno ląstelėms. Mažesnės EA dozės (0,001%) nepažeidžia ląstelių, tačiau antimikrobinės savybės tampa ribotos [55].

1.2. Biologinių medžiagų skirstymas ir panaudojimas mėsos pramonėje

Šiandien pirkėjai pageidauja mikrobiologiškai saugių ir pastovios kokybės mėsos gaminių, todėl technologijų valdymui vis dažniau yra naudojamos BK. Į mėsos matricą pageidaujamos bakterijų kultūros gali būti pridedamos, siekiant skirtingų tikslų:

(I) padidinti produktų saugą (slopinant patogenines bakterijas);

(II) prailginti galiojimo laiką (slopinant gedimą sukeliančių bakterijų augimą);

(IV) suteikti funkcionalumo ir naudos vartotojų sveikatai (teigiamas poveikis žarnyno mikroflorai).

Apsauginės BK pasižymi slopinančiu poveikiu prieš patogenines ir gedimą sukeliančias bakterijas taip prailgindamos maisto produktų galiojimą laiką (I ir II), bet turi mažai įtakos juslinėms savybėms [56]. BK naudojimas garantuotų, kad gamybos ir realizacijos metu dominuos ta pati bakterijų rūšis. Tai reiškia, kad nepakitus receptūrai ir technologijai, galutinio produkto spalva, aromatas, rūgštingumas ir kietumas bus visada toks pat [57].

Apsauginės BK slopina patogeninių ir maisto gedimą sukeliančių mikroorganizmų augimą išskirdamos bakteriocinus ar kitas antagonistines medžiagas bei konkuruodamos dėl maistinių medžiagų. Šiuo metu yra iškelta hipotezė, kad mėsoje ir jos gaminiuose BK padermių mišiniai gali būti efektyvesni nei naudojant atskirai. Tačiau juos sunku technologiškai pritaikyti, nes, yra žinoma, kad įvairių rūšių BK mišiniai mėsos produktų ekosistemoje tarpusavyje konkuruoja dėl maistinių medžiagų. Pridėtų kultūrų augimas fermentacinio proceso ir laikymo metu gali pakisti, priklausomai nuo kiekvienos padermės gebėjimo augti ir išgyventi [58, 59].

BK, savo sudėtyje turinčios stafilokokų, spartina spalvinį vystymąsi ankstyvoje dešrų fermentavimo stadijoje, nes vyksta stipri nitratų redukcija. Tai garantuoja ne tik kultūros aktyvumą, bet ir padeda išsaugoti gerą gaminio spalvą visą saugojimo laiką. Be to, stafilokokai gali skaldyti riebalus ir baltymus į mažesnes molekules, kurios pagerina dešros aromatines savybes [60]. Vienas iš svarbiausių aromatinių charakteristikų dešrose – rūgštingumas. Pienarūgštės bakterijos naudodamos cukrus, fermentuoja PR, kuri suteikia dešrai švelnios rūgšties skonį, tačiau Pediococcus spp. išskirti fermentai gamina didesnę įvairovę organinių rūgščių be PR. Šis aromatinių komponentų spektras suteikia mėsos gaminiams malonų aromatą [61]. Be to, pienarūgštės bakterijos turi didžiausią potencialą būti naudojamos kaip biokonservantai mėsoje, nes yra saugios ir tinkamos vartoti žmonėms [62].

Probiotikai (IV) yra mikroorganizmai, kurie papildo ir išlaiko teigiamą natūralių mikroorganizmų pusiausvyrą žmogaus virškinamajame trakte [63]. Tačiau probiotikai privalo turėti maistinės ir klinikinės saugos bei naudos sveikatai mokslinius įrodymus, nes ne visų probiotikų efektyvumas yra vienodas [64].

1.2.1. Biologinių medžiagų antimikrobinis poveikis

Norint sumažinti patogeninių arba toksinių mikroorganizmų riziką maisto produktų gamyboje naudojamos BK. Be to, kai kuriais atvejais BK padermės

poveikį, kuris slopina Clostridium botulinum ir L. monocytogenes bakterijas [67]. Tačiau ir vienos naudojamos BK formuoja antagonistiškai veiklias medžiagas, pvz.: organines rūgštis (pieno, skruzdžių, acto, propiono, benzoinę), etanolį, H₂O₂, CO₂, acetaldehidą, diacetilą, polisacharidus ir bakteriocinus (pvz. niziną), kurie konkuruoja su esama flora dėl maisto medžiagų ir jungimosi vietų ant substratų ar geresnio prisitaikymo prie deguonies kiekio [6]. Bakterijų išskiriami bakteriocinai yra aktyvesni prieš bakterijas, kurios yra genetiškai artimesnės bakteriociną išskyrusiai padermei [59]. Be to, žemas pH ir didelis rūgštingumas padidina lipidų tirpumą ir difuziją per ląstelių membraną į citoplazmą. Bakteriocinai gali būti naudojami daugeliu atvejų, tačiau pagrindinis dėmesys skiriamas patogenų kontrolei, taip pat maisto produktų gedimą sukeliančių mikrorganizmų mažinimui [65].

BK išskiriami bakteriocinai yra natūralūs antimikrobiniai peptidai, kurie galėtų pagerinti mėsos produktų kokybę užkirsdami kelią patogenų, tokių kaip L. monocytogenes, ar įvairių kitų gedimą sukeliančių mikroorganizmų dauginimąsi produkte [66]. Be to, BK išskiriančios antimikrobinius peptidus yra naudojamos kaip maisto konservantai, pvz. nizinas naudojamas kaip maisto konservantas prailgina produktų galiojimo laiką. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad nizinas gali inhibuoti peptidogliukano biosintezę sąveikaujant su ląstelės sienelės pirmtakais, t.y. lipidais. Elektriniam transmembraniniam potencialui stipriai sumažėjus – ląstelė žūsta [64].

Skirtingos BK gali sintetinti antimikrobinius peptidus arba bakteriocinus, inhibuojačius patogeninius ar gedimą sukeliančias bakterijas. Nors antimikrobiniai peptidai ir pasižymi bakteriocidinėmis savybėmis, bakteriocinai, turi patekti ant bakterijų membranų, prasikverbti pro jas ir indukuoti bakterijų inaktyvaciją kartu su kitais antimikrobinį poveikį sustiprinančiais aplinkos faktoriais, tokiais kaip žema temperatūra, organinės rūgštys ir detergentai [59, 62].

Siekiant pašalinti maiste esančius patogenus, mėsos pramonėje yra naudojama pieno rūgštis (PR), kuri yra aptinkama kaip pienarūgščių bakterijų fermentacijos produktas, veikiantis bakteriostatiškai ar bakteriocidiškai, priklausomai nuo gamybos sąlygų [6]. Tačiau fermentacijos metu susidariusi PR ne tik veikia kaip antimikrobinė medžiaga, bet ir formuoja produktų struktūrą ir suteikia jiems malonų rūgštų skonį. Nustatyta, kad daugiausia PR produkuoja: Lactobacillus, Sporolactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Bacillus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc ir kt. Šios bakterijas, pagal galutinius gliukozės skaidymo produktus yra skirstomos į 2 grupes: homofermentines – gliukozę suraugina tik į PR ir heterofermentines – į PR ir etanolį. Maisto pramonėje labiausiai tinka homofermentinės bakterijos, nes jos gamina tik L(+)-PR izomerus ir neišskiria D(–)-PR izomerų, kurie gali būti kenksmingi žmonių sveikatai [68].

L(+)-PR izomeras žmogaus organizme yra tarpinis medžiagų apykaitos produktas, metabolizmo procese lengvai virstantis į pirovynuogių rūgštį, kuri vėliau skyla į CO2 ir H2O trikarboninių rūgščių cikle. Su maisto produktais į žmogaus organizmą patenkantis L(+)-PR izomeras paprastai nepažeidžia metabolizmo procesų ir žarnyno mikrofloros gyvybinės veiklos. Ši PR forma svarbi oksidaciniams medžiagų apykaitos procesams, gliukozės, glikogeno, aminorūgščių sintezei. Fermentacijos metu susidaręs L(+)-PR izomeras padidina mitybinę produktų vertę. Tuo tarpu D(–)-PR izomeras susidaro tik mikroorganizmų medžiagų apykaitos metu ir todėl yra fiziologiškai svetimas žmogaus organizmui. D(–)-PR izomeras, priešingai nei L(+)-PR, žmogaus organizme skyla labai lėtai. Mėsos gaminių gamyboje stengiamasi taikyti tuos BK mišinius, kurie gamintų didesnį kiekį L(+)-PR izomerų [6, 67]. Žinoma, kad gaminant fermentuotus mėsos gaminius, gamybos proceso trukmė ir temperatūra neturi reikšmingos įtakos susidariusiems PR izomerų konfigūracijai. Tačiau nustatyta, kad PR izomerų kiekis ir rūšis priklauso nuo pusgaminio ar gaminio matricos pH [69].

1.2.2. Biologinių medžiagų poveikis biogeninių aminų susidarymui Nustatyta, kad BK ne tik slopina gedimą sukeliančių ir patogeninių bakterijų augimą, bet turi įtakos ir BA susidarymui mėsos produktuose. BA kiekis šviežiuose ar apdorotuose gaminiuose kelia didelį susidomėjimą dėl jų toksinio pavojaus [70]. Mėsos gaminiuose BA susidarymui įtakos turi mikroorganizmai, kurie sugeba dekarboksilinti aminorūgštis. Tačiau maži BA kiekiai maisto produktuose laikomi natūraliu reiškiniu, nes tai yra natūralūs medžiagų apykaitos produktai arba tarpinės jos grandys ir maži kiekiai laikomi nepavojingi žmogaus sveikatai [71].

BA koncentracija maisto produktuose priklauso nuo: produkto sudėties, pagalbinių maisto priedų, gamybos sąlygų ir technologijų, naudojant teigiamas BA raugų kultūras, kuomet daugėja teigiamų dekarboksilazei mikroorganizmų [71, 72]. Yra pastebėta, kad BA kiekio skirtumai priklauso nuo žaliavų kokybės, nors gaminant iš tos pačios žaliavos kelis gaminius galima aptikti skirtingą aminų kiekį dėl dekarboksiluojančių mikroorganizmų buvimo, BK bei aplinkos veiksnių [72]. Aminų koncentracija ir profiliai gali keistis priklausomai nuo įvairių išorinių ir vidinių veiksnių gamybos proceso metu, tokių kaip pH, redokso potencialo, temperatūros, natrio chlorido, gaminio dydžio, gamybos higienos sąlygų praktikos ir BK poveikio [69, 73]. pH yra esminis veiksnys, turintis įtakos aminorūgščių dekarboksilazės veiklai. pH mažėjimas sukelia dekarboksilazės bakterijų veiklos didėjimą. Todėl bakterijos gamina daugiau dekarboksilazės, kurios sudaro dalį

sumažėjimas sumažina amino – teigiamų mikroorganizmų augimą [71]. Tačiau terminis apdorojimas yra vienas iš veiksnių, skatinančių BA koncentracijos didėjimą [74], nes 20 – 37°C temp. yra optimali daugumos bakterijų augimui ir dauginimuisi, turinčių savyje dekarboksilazės [75]. Tačiau tinkamai parinktos BK gali būti naudojama kaip priemonė sauganti produktą nuo kadaverino, putrescino ir triptamino susidarymo ir kaupimosi mėsos produktuose laikymo metu [71, 76].

1.2.3. Biologinių medžiagų funkcionalumas

Tyrimais nustatyta, kad didžiausią poveikį žmonių sveikatai turi probiotikai, kurių sudėtyje yra Lactobacillus padermės, nes jos sintetina trumpos grandinės riebalų rūgštis bei esencines organines rūgštis (folio, oroto), dėl ko sumažėja žarnyno turinio pH. Žarnyne esančios Lactobacillus taip pat dalyvauja B ir K vitaminų sintezėje, tulžies rūgščių ir kitų sterolių, ksenobiotikų metabolizmo procesuose [77]. Be to, probiotikai pasižymi imunomoduliaciniu veikimu: jie sąveikauja su žarnų limfoidiniu audiniu ir gerina imuninį atsaką. Išskirtinis imunomoduliacinis veikimas būdingas Lactobacillus probiotikamas, kurie aktyviai veikia enterinių infekcijų sukėlėjus, kaip adjuvantai vartojami esant nepakankamai mitybai, saugo nuo chemiškai indukuotų navikų [78]. Be to, gerina žarnyno mikrofloros sudėtį, didina žarnyno bakterijų fermentų aktyvumą, stabilizuoja žarnų sienelių pralaidumą. Taip pat, nustatytas, teigiamas Lactobacillus padermės poveikis siekiant sumažinti žmonių diarėją. Įrodyta, kad BK gali sumažinti kai kurių skrandžio ir žarnyno infekcinių ligų dažnumą, trukmę ir sunkumą [79].

Probiotikai plačiai ir sėkmingai vartojami įvairių ligų gydymui ir profilaktikai: esant antibiotikų sukeltai diarėjai, bakteriniam ir virusiniam viduriavimui (taip pat kūdikių ir vaikų rotavirusinei infekcijai), laktozės netoleravimui, sukrozės ir maltozės stokai [80].

Pridėtinės cheminės ir biologinės medžiagos gali turėti įvairiapusišką poveikį mėsos pusgaminių ir gaminių kokybei, tai ypač aktualu gamintojams ir šiuolaikiniam mokslui. Galime teigti, kad cheminių ir biologinių medžiagų panaudojimas mėsos pramonėje yra vienas iš būdų, siekiant prailginti jų vartojimo trukmę, apsaugoti nuo mikroorganizmų sukeliamo gedimo, riebalinės fazės ir baltymų oksidacijos bei suteikti gaminiams funkcionalių savybių. Tačiau būtina atkreipti dėmesį, kad skirtingos šių medžiagų grupės pasižymi skirtingu biologiniu aktyvumu ir veikimu, todėl siekiant užtikrinti mėsos pusgaminių ir gaminių saugą ir kokybę, būtina kompleksiškai įvertinti jų sąveiką skirtingose mėsos matricose.

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS

Tyrimai atlikti LSMU Veterinarijos akademijos Maisto saugos ir kokybės katedroje, LSMU Farmacijos fakulteto farmakognozijos katedroje, KTU Maisto instituto Mikrobiologijos laboratorijoje ir mėsos perdirbimo įmonėse X ir Y 2013–2017 metais. Siekiant išanalizuoti iškeltus uždavinius, mokslinis tiriamasis darbas buvo atliekamas etapais, kurie pavaizduoti schemoje (2.1.1 pav.).

2.1.1 pav. Principinė darbo schema

I etapas Cheminių medžiagų parinkimas III etapas Cheminių medžiagų ir jų mišinių funkcionalumo testavimas modelinėse sistemose, sudarytoms iš taikininių organų

ląstelių kultūrų II etapas Cheminių ir biologinių medžiagų ir jų mišinių panaudojimas mėsos pusgaminių ir gaminių gamyboje saugos ir kokybės gerinimui  Antimikrobinis aktyvumas  Antioksidacinis aktyvumas Smulkinta jautiena ir kiauliena Termiškai neapdorotos dešrelės

Vytintos ir šaltai rūkytos dešros Ląstelių apoptozės ir proliferacijos nustatymas  Antimikro-binis aktyvumas  Fizikiniai cheminiai tyrimai  Antioksida-cinis aktyvumas  Chromatog-rafinė analizė  Juslinė profilinė analizė

2.2. Tyrimo metu naudotos medžiagos ir objektai

2.2.1. Cheminės medžiagos

Tirtos cheminės medžiagos: LN (97,0 proc.), TM (99,5 proc.), CN (93,0 proc.), TFL (≥85,0 proc.), PR (50,0 proc.), AR (≥99,0 proc.) ir KAR (99,0 proc.) įsigyti iš Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany).

Tirtų cheminių medžiagų kiekiai:

 Antimikrobinio ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimui vandeniniuose tirpaluose: LN nuo 0,012 iki 0,003 proc.; TM nuo 0,012 iki 0,003 proc.; CN nuo 0,012 iki 0,003 proc.; PR nuo 1,0 iki 0,5 proc.; AR nuo 2,0 iki 1,0 proc.; KAR 50 mM; TFL nuo 0,05 iki 0,01 proc.

 Mėsos pusgaminiuose: LN 0,003 proc.; TM 0,003 proc.; CN 0,003 proc.; PR 0,5 proc.; AR 1,0 proc.; KAR 50 mM; TFL 0,025 proc. (II vytintų dešrų tyrime naudotos didesnės TFL koncentracijos – 0,05 ir 0,1 proc.)

 Ląstelių proliferacijos ir apoptozės įvertinimui mitybinėje terpėje: LN nuo 0,8 iki 0,05 µM; PR nuo 0,4 iki 0,03 µM; AR nuo 20,0 iki 1,3 mM; KAR nuo 50,0 iki 3,0 mM; TFL nuo 1,0 iki 0,07 mM; Iki tyrimų, mėginiai buvo laikomi –20 °C temp.

Cheminių medžiagų paruošimas:

 LN, TM, CN, KAR, AR ir PR iki nustatytos koncentracijos skiedžiami su distiliuotu vandeniu. TFL milteliai ištirpinti ir praskiesti iki reikiamos koncentracijos naudojant 35 ° C temp. distiliuotą vandenį.

 Ląstelių proliferacijos ir apoptozės nustatymui: TFL ir KAR milteliai ištirpinti 1 ml dimetilsulfokside (DMSO) (Sigma-Aldrich, Germany) praskiesti iki reikiamos koncentracijos ląstelių augimo terpėse. LN, AR ir PR ištirpinti tik ląstelių augimo terpėje. Tiriamųjų mėginių tirpalai nufiltruoti per baktericidinį filtrą (Q-Max® Syringe Filter 25 mm, 0,22 µm, Danija).

2.2.2. Bakterijų kultūros

Mėsos pusgaminių ir gaminių gamyboje naudoti BK mišiniai: F-1 (Pediococcus pentosaceus; Staphylococcus xylosus); (P. pentosaceus; S. xylosus); B-SF-43 (Leuconostoc carnosum). Pasirinktų BK funkcijos ir paskirtis aprašytos priede. BK mišinių kiekis receptūroje:0,25 g / kg.

2.2.3. Patogeninių bakterijų padermių kultūros

Tiriamųjų medžiagų antimikrobiniam aktyvumui įvertinti naudotos maisto produktuose nepageidaujamos, tarp jų – ir patogeninių padermių kultūros:

Escherichia coli ATCC 8739, Listeria monocytogenes ATCC 13932, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Bacillus cereus ATCC 11778.

2.2.4. Organų taikininių ląstelių kultūros

Cheminių medžiagų ir jų mišinių poveikio ląstelių apoptozės ir proliferacijos įvertinimui pasirinktų organų taikinių ląstelių kultūros:

 BHK-21 pelių inkstų linija – Sirijos žiurkėno vienos dienos amžiaus individo inkstų ląstelės;

 HeLa – pastovi žmogaus gimdos kaklelio vėžio ląstelių linija;  MH-22A – pelės hepatomos ląstelių linija.

Ląstelės gautos iš Vilniaus universiteto Biochemijos instituto. 2.2.4. Mėsos pusgaminiai

2.2.4.1. Smulkinta kiauliena ir jautiena

Kiaulienos ir jautienos kumpinė ir nugarinė įsigytos iš Lietuvos gamintojo X be pridėtinio vandens ir prieskonių. Technologinio proceso eigos pradžioje mėsa sumalama naudojant sterilų 3 mm sietelį. Smulkinta mėsa sudalinta po 0,5 kg ir laikyta aerobinėmis sąlygomis + 4 °C temp. Cheminės medžiagos ir jų koncentracijos pasirinktos remiantis literatūros apžvalga bei ankstesnių tyrimų analizėmis. Pasirinkti EA komponentai – CN, TM ir LN, kurie derinami kartu su PR ir TFL.

I tyrimo metu naudotos cheminių medžiagų kombinacijos: I grupės mėginiai – TM+PR; II grupės mėginiai – CN+PR; III grupės mėginiai – LN+PR, IV grupės mėginiai – TM+CN+LN+PR ir V grupės mėginiai – kontrolė be tirtų cheminių medžiagų.

II tyrimo metu atrinktos cheminės medžiagos ir jų kombinacijos: I grupės mėginiai – TFL+PR+LN; II grupės mėginiai – TFL+PR; III grupės mėginiai – PR ir IV grupės mėginiai – kontrolė be tirtų cheminių medžiagų.

Mėginių mikrobiologiniai ir fizikiniai cheminiai tyrimai atlikti po 24 val., 3 d., 5 d. ir 7 d. Mėginių juslinių savybių tyrimas atliktas po 3 d., bendras priimtinumas – po 7 d.

2.2.4.2. Smulkinta kiauliena ir jautiena supakuota naudojant skirtingas pakuotes

Jautienos kumpinė ir nugarinė įsigyta iš Lietuvos gamintojo X be pridėtinio vandens ir prieskonių. Technologinio proceso eigos pradžioje mėsa sumalama naudojant sterilų 3 mm sietelį. Pasverti smulkintos jautienos mėginiai (po 0,5 kg) suskirstyti į 3 tiriamąsias grupes: I grupės mėsos mėginiai paveikti TFL+PR+LN, II grupės mėginiai – TFL+PR; III grupės mėginiai be priedų – kontrolė be tirtų cheminių medžiagų. Cheminių medžiagų koncentracijos pasirinktos remiantis literatūros apžvalga bei ankstesnių tyrimų analizėmis.

Pakavimo parametrai. Tiriamosios grupės supakuotos naudojant hermetinį mėsos produktų pakavimą vakuume (VP) ir modifikuotos atmosferos pakuotėje (MAP), kontrolinė grupė supakuota naudojant aerobinę pakuotę (AP). VP ir MAP mėginiai supakuoti naudojant Multivac R230 pakavimo mašiną (Modelis 542, Vokietija). Pakavimo metu naudoti 90 μm storio polimeriniai maišeliai (Clingvac 90; Curevac AB, Geteborgas, Švedija). MAP naudojamų dujų sudėtis 80 proc. O2 ir 20 proc. CO2. Kontroliniai mėginiai (AP) pakuojami naudojant atmosferos orą. Tyrimo metu smulkinta jautiena laikoma +4 o_{C temp. iki 9 parų.}

Mėginių mikrobiologiniai ir fizikiniai cheminiai tyrimai atlikti po 24 val., 3 d., 5 d., 7 d. ir 9 d. Mėginių sudėties tyrimas (baltymų, drėgmės, riebalų ir kolageno) atliktas po 24 val.

2.2.4.3. Šviežios kiaulienos dešrelės su bakterijų kultūromis

Tyrimo metu pagamintos keturios skirtingos kiaulienos dešrelių mėginių grupės. Viena mėginių grupė – kontrolinė nenaudojant BK (I), o likusios trys grupės – su skirtingais BK mišiniais: (II) F-1 (P. pentosaceus; S. xylosu); (III) T-SPX (P. pentosaceus; S. xylosus); (IV) B-SF-43 (L. carnosum).

Kiaulienos dešrelių sudėtis nurodyta priede (1 lentelė). Kiaulienos žaliava sumalama mėsmale (6 mm diametro), ir 3 min maišoma su prieskoniais. Į skirtingus mėginius pridedama BK mišinių ir gauta masė sukemšama į natūralias kiaulių žarnas (formuojamas 30 mm skersmens ir 10 cm ilgio dešrelės). Tyrimo metu termiškai neapdorotos dešrelės laikomos +4 o_{C temp.} iki 9 parų. Dešrelių gamyba ir tyrimai kartojami tris kartus. Mėginių mikrobiologiniai ir fizikiniai cheminiai tyrimai atlikti po 24 val., 3 d., 5 d., 7 d. ir 9 d. Mėginių juslinis tyrimas atliktas po 3 d., bendras priimtinumas – po 7 d.

2.2.5. Mėsos gaminiai

2.2.5.1. Vytintos ir šaltai rūkytos dešros

Šaltai rūkytos ir vytintos dešros pagamintos Y mėsos perdirbimo įmonėje. Technologinio proceso eigos pradžioje kiaulienos nuopjovos ir kiaulienos kumpis sumalamas per sietelį, kurio akučių skersmuo 13 mm. Į kuterį sudedama sumalta žaliava ir prieskoniai (žr. priedai, 2–3 lentelės), gauta masė suskirstyta į skirtingas tiriamąsias grupes (žr. priedai, 4–5 lentelės).

2.2.5.1.1 pav. Vytintų ir šaltai rūkytų dešrų gamybos technologijos schema

Žaliavos, prieskonių ir priedų sumaišymas

(žr. priedai, 2-3 lentelės) I variantas BK įvedimas (0,25 g / kg, 18 o_{C temp., 60 min)} + TFL priedas (žr. priedai, 4 lentelė) Dešrų formavimas (30 mm skersmens ir 100 mm ilgio) II variantas

Atrinktų cheminių medžiagų ir jų mišinių įvedimas

(žr. priedai, 5 lentelė)

Brandinimas, džiovinimas – rūkymas – džiovinimas (žr. priedai, 6-7 lentelės)

Laikymo sąlygos

(0 – + 15 ºC temp.)

Mėginių ėmimas po 30, 60, 90, 120 d.

Toliau masė kemšama į natūralų apvalkalą (kiaulių žarnas), užrišus galus, dešros kabinamos ant rėmų, kad nesiliestų tarpusavyje. Rėmai su dešromis patalpinami į klimo kameras, kuriose vykdomas iki 24 val. brandinimo procesas pagal numatytą programą (šaltai rūkytų ar vytintų dešrų). Siekiant optimalaus rūgštėjimo brandinimo proceso parametrai kruopščiai parenkami (žr. priedai, 6–7 lentelės). Kitas etapas – rūkymas; šaltai rūkytų dešrų rūkymo procesas trunka 5 val., vytintų – 15 min Rūkymo laikas parenkamas atsižvelgiant į reikiamą gauti skonio stiprumą. Šaltai rūkytų ir vytintų dešrų džiovinimas prasideda klimo džiovykloje 25 ºC temp., pabaigoje sumažėja iki 16 ºC temp. Pasibaigus džiovinimo procesui, pasiekiama reikalinga tekstūra ir kietumas dėl išgaravusio vandens ir baltymų denatūracijos.

Pagamintos dešros laikomos 0 – + 15 ºC temp. Dešrų gamyba ir tyrimai buvo kartojami tris kartus, pateiktos vidutinės reikšmės ir standartinis nuokrypis. Mėginių mikrobiologiniai ir fizikiniai cheminiai, spektrofotometriniai bei fermentiniai tyrimai atlikti po 30, 60, 90, 120 d. Mėginių juslinis tyrimas ir bendras priimtinumas atliktas po 30 d. laikymo. Vytintų ir šaltai rūkytų dešrų gamybos technologijos schema pateikta 2.2.5.1.1 pav.

2.3. Tyrimo metodikos

2.3.1. Mikrobiologiniai tyrimai

2.3.1.1. Difuzijos į agarą (įdubų) metodas

Difuzijos į agarą metodas atliktas pagal Hammer ir kt. (1999) [81] aprašytą metodiką. E. coli skaičius nustatytas giluminiu sėjimo būdu, naudojant triptono, tulžies ir gliukuronido terpę (Biolife katalogo Nr. 4021562), kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 44 _{C temp. pagal LST ISO 16649-2} [82]. S. typhimurium skaičius nustatytas paviršiniu sėjimo būdu ant ksilozės lizino dezoksicholato agaro (Oxoid, katalogo Nr. CM 0469), kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 37 _{C temp. pagal LST ISO 6579-1:2017 [83]. L.} monocytogenes skaičius nustatytas paviršiniu sėjimo būdu ant ALOA agaro (Biolife katalogo Nr. 4016052), kultivuojant pasėlius 48 val. termostate 37 C temp. pagal LST ISO 11290-2:2003 [84], LST ISO 11290-2:2003/A1:2005 [84]. S. aureus skaičius nustatytas paviršiniu sėjimo būdu ant Baird-Parker agaro (Liofilchem Diagnostici Nr. 610004), kultivuojant pasėlius 48 val. termostate 37 _{C temp. pagal LST 6888-1+A1:2005 [86]. B. cereus skaičius} nustatytas paviršinio sėjimo būdu ant MYP agaro (Oxoid, katalogo Nr. CM 0929), kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 30 _{C temp. pagal LST EN} ISO 7932:2005 [87].

Antimikrobinis poveikis BK vertinamas pagal Hammer ir kt. (1999) [81] aprašytą metodiką. Tirtų medžiagų poveikis vertintas pagal skaidriųjų zonų, susidariusių aplink įdubas, skersmenį. Jei aplink įdubas skaidriosios zonos nesusidaro, daroma išvada, kad tirta medžiaga ar koncentracija tiriamai kultūrai baktericidinio poveikio neturėjo.

2.3.1.2. Mėsos pusgaminių ir gaminių mikrobiologiniai tyrimai

Tiriamųjų mėginių, pradinės suspensijos ir dešimtkarčių skiedinių ruošimas mikrobiologiniams tyrimams buvo atliktas remiantis Lietuvoje galiojančiu LST EN ISO 6887-2:2005 [88] standartu. Bendrasis žarninių lazdelių (E. coli), pasižyminčių teigiama beta gliukuronidazės reakcija,

skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į triptono, tulžies ir gliukuronido terpę giluminiu būdu, kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 44 _{C temp. pagal LST ISO 16649-2:2002 [82]. Bendras koliforminių}

bakterijų skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į Violetinį/raudoną tulžies agarą (su laktozės priedu) (70188 Sigma-Aldrich, Vokietija) giluminiu būdu, kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 37 _C

temp. pagal LST ISO 4832:2006 [89]. Salmonelių aptikimas atliktas paviršiniu sėjimo būdu ant ksilozės lizino dezoksicholato agaro, kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 37 _{C temp. pagal LST ISO 6579-1:2017 [83].}

Monocitogeninių listerijų (L. monocytogenes) skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į ALOA agarą paviršiniu būdu, kultivuojant pasėlius 48 val. termostate 37 _{C temp. pagal LST EN ISO 11290-2:2003 [84], LST}

EN ISO 11290-2:2003/A1:2005 [85]. Koagulazę gaminančių stafilokokų (S. aureus ir kitų rūšių) skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į Baird-Parker agarą paviršiniu būdu, kultivuojant pasėlius 48 val. termostate 37 _{C temp. pagal LST EN ISO 6888-1+A1:2005 [86]. Numanomų vaškinių}

bacilų (B. cereus) skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į MYP agarą paviršiniu būdu, kultivuojant pasėlius 24 val. termostate 30 _{C temp.}

pagal LST ISO 7932:2005 [87]. Bendras mielių ir pelėsinių grybų kolonijų skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į Dichloran Rose agarą (DRBC; REF 17147, Sigma-Aldrich, Italy) su chloramfenikolio seletyviu suplementu, giluminiu būdu, kultivuojant pasėlius 120 val. termostate 25 _C

temp. pagal LST ISO 21527-1:2008 [90]. Bendrasis mikroorganizmų skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į PCA agarą (REF 610040, Liofilchem, Italija) giluminiu būdu, kultivuojant pasėlius 72 val. termostate 30 _{C temp. pagal LST EN ISO 4833-1:2013 [91]. Numanomų pseudomonų} (Pseudomonas spp.) skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į PAB agarą (Pseudomonas Agar Base, Oxoid, CM 0559, Anglija) su CFC

kultivuojant pasėlius 48 val. termostate 25 _{C temp. pagal LST EN ISO} 13720:2011 [92]. Bendrasis mezofilinių pieno rūgšties bakterijų skaičius nustatytas sėjimo į lėkšteles metodu, sėjant į MRS agarą (Oxoid, CM 0361, Anglija) giluminiu būdu, kultivuojant pasėlius 72 val. termostate 30 _{C temp.} anaorobinėmis sąlygomis (AnaeroGen, AN0025A, Anglija) pagal LST ISO 15214:2009 [93].

2.3.2. Fizikiniai cheminiai tyrimai

2.3.2.1. Cheminiai riebalų oksidacijos ir hidrolizės tyrimo metodai Peroksidų skaičiaus (PS) nustatymas. PS nustatytas pagal LST EN ISO 3960:2010 [94].

Rūgščių skaičiaus (RS) nustatymas. RS nustatytas pagal LST EN ISO 660:2009 [95].

2.3.2.2. Spektrofotometriniai metodai

Mėginių ekstraktų paruošimas spektrofotometriniams tyrimams. Nuo dešros paviršiaus pašalinamas apvalkalas, o likusi dalis susmulkinama naudojant elektrinį smulkintuvą. Kiekvieno homogenizuoti mėginio atsverta po 10 g (0,001 g tikslumu) ir užpilta 10 ml distiliuotu vandeniu (mg/ml) [96]. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas. Bendras flavonoidų kiekis nustatytas pagal Brighente ir kt., (2007) [97] aprašytą metodiką. Absorbcijos intensyvumas matuojamas prie 415 nm bangos ilgio. Kaip palyginamasis tirpalas naudotas 70 proc. (v/v) etanolis. Rutino kalibracinė kreivė pateikta priede (1 pav.)

Duomenys įvertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį:

y = 0,9341x – 0,0894, kur: y = absorbcijos dydis;

x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu (RE) mg/ml. Suminis fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu (FC) metodu. Suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas pagal Singleton ir kt. (1999) [98] aprašytą metodiką. Absorbcijos intensyvumas matuojamas prie 765 nm bangos ilgio. Kaip palyginamasis tirpalas naudotas 70 proc. (v/v) etanolis. Suminis fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu (GRE) (mg/g). Galo rūgšties (GR) kalibracinė kreivė pateikta priede (2 pav.)

Fenolinių junginių kiekis apskaičiuojamas pagal formulę:

𝐶 = 𝛾 ∗ ∗ 100, kur:

C – visas fenolinių junginių kiekis, mg GRE/100g mėginio; γ – koncentracija, gauta iš kalibracinės kreivės, mg/ml; V – vandeninio etanolio tūris, naudotas ekstrakcijai; m – sauso mėginio svoris, g.

Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu. Tyrimo metodas, aprašytas Takao ir kt. (1994) [99] ir pakoreguotas pagal Kumarasamy ir kt. (2007) [100] aprašytą metodiką. Absorbcijos intensyvumas matuojamas prie 517 nm bangos ilgio. Kaip bazinis etalonas naudoja GR ištirpinta etanolyje (96 proc.), siekiant pagaminti tokios pačios koncentracijos (1 mg/ml) pradinį tirpalą. Kontrolinis (tuščias) mėginys paruoštas be bandomųjų junginių bei antioksidantų. Kaip blankas naudotas 96 proc. (v/v) etanolis.

DPPH antiradikalinis aktyvumas (proc.) apskaičiuojamas, naudojant formulę:

𝐴𝑛𝑡𝑖𝑜𝑘𝑠𝑖𝑑𝑎𝑐𝑖𝑛𝑖𝑠 𝑎𝑘𝑡𝑦𝑣𝑢𝑚𝑎𝑠 (proc. ) = ė ė

ė × 100 proc., kur:

A _ė− kontrolinio (tuščiojo) tirpalo absorbcija; A ė − tiriamojo tirpalo absorbcija.

Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe2+ _jonų surišimo metodu. Chelatinės ekstraktų savybės įvertintos pagal Pearson ir kt. (1983) [101] aprašytą metodiką. Absorbcijos intensyvumas matuojamas prie 562 nm bangos ilgio. Palyginamasis tirpalas –70 proc. (v/v) etanolis.

Ekstrakto chelatinės savybės išreikšiamos proc. ir apskaičiuojamos pagal formulę:

Fe+2_{surišimas ꞊ [(Ab–Aa)/Ab] × 100 proc., kur:} Ab–tuščio bandinio absorbcijos dydis;

Aa–bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis.

Bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymas fosforo-molibdeno kompleksiniu metodu. Bendras antioksidacinis aktyvumas įvertintas pagal

matuojamas prie 695 nm. bangos ilgio. AR naudojama kaip standartas, o bendras antioksidacinis akyvumas išreiškiamas AR ekvivalentu (mg/g).

Baltymų karbonilo grupių kiekybinis įvertinimas DNPH metodu. Baltymų karbonilo grupių kiekis įvertintas naudojant Oliver ir kt. (1987) [103], aprašytą metodiką. Absorbcijos intensyvumas matuojamas prie 370 nm bangos ilgio. Apskaičiuota baltymų karbonilų grupių koncentracija mėginyje išreiškiama μmol/1 g.

Baltymų karbonilo grupių koncentracija apskaičiuojama pagal formulę:

c =

,

,

AT – tiriamojo tirpalo absorbcija; AK – kontrolinio tirpalo absorbcija;

0,022 μM dinitrofenilhidrazino molinės ekstinkcijos koeficientas; L – nueitas šviesos kelias (kiuvetės plotis).

Maistinės sudėties nustatymas infraraudonųjų spindulių spektrofotometriniu metodu. Kompozicijos analizė (riebalų, baltymų ir drėgmės) atliekama naudojant AOAC patvirtintą (oficialų metodą 2007.04) infraraudonųjų spindulių spektrofotometrą (FOSS Food ScanTM 78800; Specialieji analizės sprendimai, Hillerod, Danija). Kompozicijos vertės pateikiamos proc.

2.3.2.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas

BA nustatymas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos (ESCh) metodu. Mėginiai derivatizuoti taikant Ben-Gigirey ir kt. (2000) [104] aprašytą metodiką. ESCh sistema pateikta priede. Kiekybinė analizė atlikta taikant vidinio standarto metodą, skaičiuojant smailės plotą apibrėžtam etaloninės medžiagos kiekiui. Metodo nustatymo riba – 0,1 mg/kg.

Biogeninių aminų indeksas (BAI) – apskaičiuotas pagal Hernandez-Jover ir kt. (1996) [105] aprašytą metodiką.

BAI paskaičiuojama mėsos pusgaminiuose ir gaminiuose pagal formulę: BAI = putrescinas+kadaverinas+histaminas+tiraminas

2.3.2.4. Ultra efektyviosios skysčių chromatografijos metodas

Tiriamųjų mėginių paruošimas ultra efektyviosios skysčių chromatografijos (UESCh) tyrimams. Nuo dešros paviršiaus pašalinamas

apvalkalas, o likusi dalis susmulkinama naudojant elektrinį smulkintuvą. Bandymų būdu tiriamiesiems mėginiams parinkta ekstrakcijos tirpiklio koncentracija ir ekstrakcijos trukmė termostatuojančioje purtyklėje. Kiekvieno mėginio atsveriama po 1 g (0,0001 g tikslumu) ir užpilama 100 ml 96 proc. (v/v) etanolio ir ekstrahuojama sandariuose tamsaus stiklo buteliukuose naudojant termostatuojančią purtyklę (Thermo Scientific MaxQ 4000 shaker) 30 min esant 300 aps/min (25 ˚C temp.). Gautas ekstraktas filtruojamas per filtravimo popierių (Whatman, 601A) ir paliekamas 20 min šaldiklyje (–20 ˚C temp.), kad atsiskirtų riebalinė frakcija, kuri pašalinama filtruojant per popierinį filtrą. Toliau ekstraktai centrifuguojami 20 min esant 8500 aps/min (+ 4 ˚C temp.), tolimesniems tyrimams paimama reikiama centrifugato alikvotinė dalis. Prieš atliekant analizę, ekstraktai papildomai filtruojami per 0,22 µm porų dydžio membraninius filtrus (Acrodisc LC13 PVDF, Sigma, Kanada) ir įpurškiami į UESCh kolonėlę.

UESCh tyrimo sąlygos. Kiekinė ekstraktų analizė atliekama efektyviosios chromatografijos metodu chromatografine Waters 2695 Alliance sistema („Waters”, Milfordas, MA, JAV) su diodų matricos detektoriumi Waters 996. Tyrimo metu naudojama kolonėlė (Waters) Acquity UPLC C18 BEH (2,1 × 100 mm, 1,7 μm). Judrios fazės tekėjimo greitis 0,5 ml / min. Skirstymui naudota ACE C18 („ACT”, Didžioji Britanija) kolonėlė (150 mm × 4,6 mm, dalelių dydis 3μm) su ACE C18 („ACT”, Didžioji Britanija) prieškolonė (dalelių dydis 3 μm).

UESCh metodikos eliuentas sudarytas iš 0,1 proc. trifluoracto rūgšties (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Naudotas gradiento kitimas: 0 – 1 min 88 proc. A, 1 – 3 min 70 proc. A, 3 – 4 min 10 proc. A. Nustatytas eliuentų tėkmės greitis – 0,5 ml/min, o injekcijos tūris – 1 µL. Kolonėlė termostatuojama 25 ˚C temp.

Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal ekstraktų analites ir etaloninio mėginio sulaikymo laiką. Lyginami diodų matricos detektoriumi gauti etaloninių junginių ir analičių UV absorbcijos spektrai. Kiekinis analičių įvertinimas atliktas pagal analitės smailės ploto priklausomybę nuo analitės koncentracijos tirpale. Sudarytos TFL ir kvercetino identifikuotų junginių kalibracijos kreivės pagal kurias apskaičiuotas junginių kiekis. Detektorius nustatytas 200 – 400 nm diapazone. Chromatografiniai duomenys apdorojami "Empower 3" programine įranga (Milford, JAV). TFL ekstrakcijos metodo optimizavimas aprašytas priede (3 – 7 pav.).

2.3.2.5. Dujų chromatografijos metodas