LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
DOVILĖ ŽEBRAUSKAITĖ
EMULSIJŲ SU LINŲ SĖMENŲ ALIEJUMI KOKYBĖS IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data
EMULSIJŲ SU LINŲ SĖMENŲ ALIEJUMI KOKYBĖS IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė
Recenzentas Darbą atliko Magistrantė
Dovilė Žebrauskaitė
Data Data
TURINYS
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Linų sėmenų aliejaus apibūdinimas ... 11
1.1.1. Aliejaus sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas ... 11
1.1.2. Aliejaus oksidacinis stabilumas ir jo gerinimas ... 12
1.2. Natūralus antioksidantas – propolis ir jo panaudojimas dermatologinių produktų kūrime ... 13
1.3. Emulsija – dermatologinė vaisto forma ... 14
1.4. Emulsijų nestabilumas ... 15
1.5. Emulsiklių pasirinkimo svarba ... 16
1.6. Hidrofilinis – lipofilinis balansas (HLB) ir jo reikšmė emulsijų stabilumui ... 17
1.7. Emulsijų stabilumo tyrimo metodai ... 18
1.8. Antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų aktyvumas emulsinėse sistemose ... 19
2. TYRIMO METODIKA ... 20
2.1. Tyrimo medžiagos ir įranga ... 20
2.1.1. Tyrimo medžiagos ... 20
2.1.2. Tyrimo įranga ... 20
2.2. Linų sėmenų aliejaus rHLB skaičiaus a/v ir v/a emulsijoms nustatymas ... 21
2.3. Emulsijų a/v ir v/a gamybos technologija ... 22
2.4. Emulsijos tipo nustatymas ... 22
2.5. Emulsijų stabilumo ir kokybės tyrimas ... 22
2.6. Emulsijų stabilumo tyrimo metodai ... 23
2.6.1. Turbidimetrinė analizė ... 23
2.6.2. Emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimas ... 23
2.6.3. Klampos tyrimas ... 24
2.6.4. pH reikšmės nustatymas ... 24
2.6.5. Mikroskopinis emulsijų tyrimas ... 24
2.7. Linų sėmenų ir alyvuogių aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 24
2.7.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 25
2.7.2. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 25
2.8. Propolio ekstraktų įtakos emulsijų antioksidacinio aktyvumo stabilumui tyrimas ... 26
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 28
3.1. Linų sėmenų aliejaus rHLB skaičiaus a/v ir v/a emulsijoms nustatymas ... 28
3.1.1. Turbidimetrinė analizė ... 29
3.1.2. Emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo nustatymas ... 32
3.1.3. Linų sėmenų aliejaus reikalingo rHLB skaičiaus a/v ir v/a emulsijoms nustatymo rezultatų aptarimas ... 35
3.2. Linų sėmenų aliejaus a/v ir v/a emulsijų kokybės ir stabilumo vertinimas ... 36
3.2.1. Emulsijų a/v ir v/a klampos tyrimas ... 37
3.2.2. Emulsijų a/v ir v/a pH reikšmės vertinimas ... 38
3.2.3. Emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo bei mikrostruktūros analizė a/v ir v/a emulsijose ... 39
3.2.4. Emulsijų a/v ir v/a su linų sėmenų aliejumi kokybės ir stabilumo vertinimo rezultatų aptarimas ... 42
3.3. Linų sėmenų aliejaus ir jo emulsijų a/v ir v/a antioksidacinio aktyvumo tyrimas ... 42
3.3.1. Linų sėmenų aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 43
3.3.2. Laikymo sąlygų įtaka linų sėmenų aliejaus antioksidaciniam aktyvumui ... 45
3.3.3. Emulsijų a/v ir v/a su linų sėmenų aliejumi antioksidacinio aktyvumo ir jo stabilumo vertinimas ... 46
3.3.4. Etanolinio ir aliejinio propolio ekstraktų įtakos emulsijų su linų sėmenų aliejumi antioksidacinio aktyvumo stabilizavimui tyrimas ... 48
3.3.5. Linų sėmenų aliejaus ir jo a/v ir v/a emulsijų antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatų aptarimas ... 52
IŠVADOS ... 53
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 54
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 55
MOKSLINĖS PUBLIKACIJOS DARBO TEMA ... 61
SANTRAUKA
D. Žebrauskaitės magistro baigiamasis darbas „Emulsijų su linų sėmenų aliejumi kokybės ir antioksidacinio aktyvumo stabilumo tyrimas“/ mokslinė vadovė Doc. dr. A. M. Inkėnienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Klinikinės farmacijos katedra. - Kaunas.
Tyrimo tikslas – nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a emulsijoms
bei ištirti sumodeliuotų emulsinių sistemų kokybę ir stabilumą, įvertinant vaistų formos įtaką aliejaus antioksidaciniam stabilumui.
Darbo uždaviniai – nustatyti linų sėmenų aliejui reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a
emulsijoms suformuoti, taikant turbidimetrinį bei emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimo metodus; atlikti pagamintų a/v ir v/a emulsijų su linų sėmenų aliejumi stabilumo ir kokybės tyrimus; nustatyti ir palyginti linų sėmenų aliejaus bei emulsinių sistemų su linų sėmenų aliejumi antioksidacinį aktyvumą ir jo stabilumą; įvertinti etanolinio ir aliejinio propolio ekstraktų įtaką bei panaudojimo galimybes emulsinių sistemų su linų sėmenų aliejumi antioksidacinio aktyvumo stabilizavimui.
Tyrimo metodai – linų sėmenų aliejaus rHLB skaičius buvo nustatytas naudojant emulsinių
lašelių dydžio nustatymo metodą dalelių dydžio matuokliu Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK) bei taikant turbidimetrinę analizę. Taip pat emulsijų stabilumas buvo vertinamas pagal klampos, pH, mikrostruktūros kitimus 2 mėn. laikotarpyje, esant skirtingoms aplinkos sąlygoms (4oC, 15 - 25oC
ir 40±2oC temperatūrai, esant 75±5 proc. santykinei drėgmei). Bendras fenolinių junginių kiekio
nustatymas etanoliniuose linų sėmenų aliejaus ekstraktuose atliktas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu. Linų sėmenų aliejaus ir pagamintų emulsijų antioksidacinis aktyvumas vertintas spektrofotometriniu DPPH•metodu.
Tyrimo rezultatai ir išvados - nustatytas linų sėmenų aliejaus reikalingas HLB skaičius
emulsijai a/v suformuoti yra 13,93, o v/a emulsijai – 9,65; laikant abiejų tipų emulsijas 2 mėn. natūralių sąlygų temperatūroje (15 – 25oC), jos išlieka stabilesnės, lyginant su laikymu stresinėmis
sąlygomis (4oC ir 40±2oC temperatūroje, esant 75±5 proc. santykinei drėgmei). Taip pat nustatyta, kad
emulsijos v/a klampa, pH reikšmė 2 mėnesių laikotarpyje natūralių sąlygų temperatūroje, kito mažiausiai, užfiksuoti statistiškai nereikšmingi (p>0,05) emulsinių lašelių dydžio bei mikrostruktūros pokyčiai; antioksidacinio aktyvumo stabilumo tyrimų metu nustatyta, kad tiek a/v, tiek v/a emulsija 2 mėn. tiriamuoju laikotarpiu išlaiko linų sėmenų aliejaus antioksidacinį aktyvumą, tačiau statistiškai mažiau reikšmingi (p<0,05) jo pokyčiai užfiksuoti v/a tipo emulsijoje; tiek linų sėmenų aliejaus, tiek su juo modeliuojamų emulsijų antioksidacinio aktyvumo stabilumui užtikrinti, yra tikslinga panaudoti natūralią gamtinės kilmės medžiagą - propolį. Nustatyta, kad aliejinis propolio ekstraktas, nors ir pasižymi mažesniu antioksidaciniu aktyvumu, tačiau statistiškai reikšmingai (p<0,05) stabilizuoja linų sėmenų aliejaus antioksidacinį aktyvumą a/v emulsijose, o etanolinis propolio ekstraktas - v/a tipo emulsijose.
SUMMARY
D. Žebrauskaitė Master Thesis Evaluation of quality and antioxidant activity stability of linseed oil emulsions/Term paper advisor Doc. dr. A. M. Inkėnienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. – Kaunas.
The aim of the research: to determine linseed oil required HLB value for o/w and w/o emulsions and to determine designed emulsions quality and stability by evaluating influence of dosage forms on linseed oil antioxidant activity.
Main tasks: to determine linseed oil required HLB value for o/w and w/o emulsions by droplet size and distribution analysis using Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK) and turbidimetric method; to evaluate quality and stability of designed and prepared linseed oil o/w and w/o emulsions; to determine and compare antioxidant activity and its stability in linseed oil and emulsions prepared with this plant oil; to estimate influence of ethanolic and oil extracts of propolis to linseed oil emulsions antioxidant activity stability.
Research methods: linseed oil required HLB values were determined by droplet size and distribution analysis using laser diffraction apparatus Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK) and turbidimetric method. Prepared linseed oil emulsion’s stability was assessed by evaluating pH, viscosity, microstructure changes for two months period in case of a different storage conditions (4oC, 15 - 25oC, 40±2oC + 75±5 % RH). The amount of phenolic compounds in prepared flaxseed oil extracts were determined by Folin – Ciocalteu method. Extracts of linseed oil and prepared emulsions were tested for antioxidant activity using DPPH•radical scavenging assay.
Results: determined required HLB of linseed oil for o/w emulsion is 13,93, for w/o emulsion
– 9,65; prepared emulsions for the period of two months were more stable in 15 - 25oC temperature
compared with other storage conditions (4oC and 40±2oC + 75±5 % RH); w/o emulsion in the research period of two months was more stable: meanings of pH, viscosity, also microstructure and droplet sizes and distribution changed significantly less (p>0,05) compared to o/w emulsion; antioxidant activity assay showed that both types of emulsion (o/w and w/o) present desirable antioxidant activity of linseed oil but less significant (p<0,05) changes of antioxidant activity during time were noticed in w/o linseed oil emulsion; studies showed that it’s necessary to develop topical emulsions by adding one of the best natural source of antioxidants – propolis to ensure stability of linseed’s oil antioxidant activity; in determination of the influence of different propolis extracts to stability of emulsions antioxidant activity, it was noticed that oil extract of propolis is more effective in o/w emulsions, while ethanolic propolis extract is more effective in w/o linseed oil emulsions (p<0,05).
PADĖKA
Už pagalbą, pastabas, konsultacijas ir palaikymą atliekant mokslinius tyrimus nuoširdžiai dėkoju visam Klinikinės farmacijos katedros kolektyvui. Taip pat dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedrai ir jos vedėjui už pagalbą atliekant antioksidacinio aktyvumo tyrimus.
SANTRUMPOS
a/v – aliejus vandenyje
aps./min – apsisukimai per minutę d. - dienos
DNR - deoksiribonukleorūgštis
DPPH• - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas g - gramai
GRE – galo rūgšties ekvivalentas HLB – hidrofilinis – lipofilinis balansas mėn. – mėnesiai
ml - mililitrai
mPa·s – milipaskaliai sekundei n – bandymų skaičius
nm - nanometrai
p – statistinio reikšmingumo lygmuo PAM – paviršiui aktyvios medžiagos pav. - paveikslas
pH – vandenilio potencialas proc. – procentai
sav. - savaitės
Span 80 - sorbitano monooleatas (Span 80)
Tween 80 - polioksietilen(20) sorbitano monooleatas val. - valandos
v/a – vanduo aliejuje µm - mikrometrai oC – laipsniai Celsijaus
ĮVADAS
Siekiant užtikrinti plačiai naudojamos dermatologinės vaisto formos - emulsijos kokybę, saugumą ir efektyvumą, itin svarbu yra tinkamai parinkti sudėtines medžiagas. Pastaruoju metu vis dažniau sintetinės lipofilinės medžiagos, naudojamos emulsinių sistemų gamyboje, yra pakeičiamos natūralios kilmės augaliniais aliejais, tokiais kaip alyvuogių, saulėgrąžų, ricinos, kiek rečiau ypač vertingos sudėties linų sėmenų aliejumi.
Vienas iš pagrindinių iššūkių, su kuriuo susiduriama modeliuojant emulsines sistemas su augaliniais aliejais, tame tarpe ir linų sėmenų aliejumi, yra reikalingo hidrofilinio – lipofilinio balanso (rHLB) skaičiaus nustatymas. Neradus patvirtintų mokslinių tyrimų duomenų apie šį skaičių, būtina tinkamai parinkti metodikas ir eksperimentiniu būdu nustatyti pasirinkto augalinio aliejaus rHLB skaičių, kuris padės parinkti optimalią emulsiklių ar jų mišinių koncentraciją stabiliai emulsijai suformuoti. Pastaruoju metu ieškoma tikslių ir efektyvių metodų, kurie padėtų greitai ir nesunkiai nustatyti rHLB skaičių, įvertinant pagamintos emulsijos stabilumą. Vieni iš tokių yra plačiai taikomi turbidimetrinis ir emulsinių lašelių dydžio bei pasiskirstymo tyrimo metodai [1–3].
Linų sėmenų aliejus dėl išskirtinai didelio polinesočiųjų riebalų rūgščių kiekio yra ypač vertingas gydant širdies ir kraujagyslių, sąnarių, virškinimo sistemos ligas, tačiau jo sudėtyje randamos antioksidaciniu poveikiu pasižyminčios medžiagos, tokios kaip tokoferoliai ar fenolinės rūgštys, skatina tirti šio vertingo augalinio aliejaus savybes ir panaudojimo galimybes odą apsaugančio poveikio dermatologinių produktų kūrime. Nustačius, kad linų sėmenų aliejus pasižymi laisvuosius radikalus surišančiu poveikiu ir panaudojus jį emulsinių sistemų modeliavime, ypač svarbu yra ištirti, kokią įtaką ši dermatologinė vaisto forma turi aliejaus antioksidacinio aktyvumo stabilumui ir kaip panaudojant natūralius antioksidantus, tokius kaip plačiai naudojamas propolis, būtų galima pagerinti linų sėmenų aliejaus antioksidacinio aktyvumo stabilumą [4–8].
Tyrimo objektas – linų sėmenų aliejus ir emulsinės sistemos a/v ir v/a su linų sėmenų aliejumi.
Darbo tikslas - nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a emulsijoms ir ištirti sumodeliuotų emulsinių sistemų kokybę bei stabilumą, įvertinant vaistų formos įtaką aliejaus antioksidacinio aktyvumo stabilumui.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a emulsijoms
bei ištirti sumodeliuotų emulsinių sistemų kokybę ir stabilumą, įvertinant vaistų formos įtaką aliejaus antioksidacinio aktyvumo stabilumui.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a emulsijoms suformuoti, taikant turbidimetrinį bei emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimo metodus.
2. Atlikti pagamintų a/v ir v/a emulsijų su linų sėmenų aliejumi stabilumo ir kokybės tyrimus. 3. Nustatyti ir palyginti linų sėmenų aliejaus, taip pat emulsinių sistemų su linų sėmenų aliejumi
antioksidacinį aktyvumą bei jo stabilumą.
4. Įvertinti etanolinio ir aliejinio propolio ekstraktų įtaką bei panaudojimo galimybes emulsinių sistemų su linų sėmenų aliejumi antioksidacinio aktyvumo stabilizavimui.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Linų sėmenų aliejaus apibūdinimas
Nuo seno visame pasaulyje linas (lot. Linum usitatissimum) auginamas ne tik kaip pluoštinis, bet ir kaip nemažai gydomųjų savybių turintis augalas. Ypač vertinamas produktas – iš natūraliai išaugintų linų sėklų gaunamas aliejus, kuris vis dažniau naudojamas kaip priemonė širdies ir kraujagyslių, sąnarių, virškinimo sistemos ir kitų ligų gydymui bei profilaktikai. Linų sėmenų aliejus gerina odos regeneraciją, pasižymi odos gijimą skatinančiomis savybėmis. Išoriškai šis vertingas aliejus naudojamas odos nudegimų gydymui [6,9].
1.1.1. Aliejaus sudėtis ir antioksidacinis aktyvumas
Linų sėmenų aliejus yra skaidrus, geltonas ar rudai geltonas skystis, gaunamas iš sėjamojo lino subrendusių sėklų šalto spaudimo metu. Išgaunant aliejų šiuo būdu nėra naudojami organiniai tirpikliai, temperatūra, todėl aliejuje išlieka daugiau naudingųjų medžiagų [7,10]. Aliejuje gausu polinesočiųjų riebalų rūgščių: virš 50% omega-3 (α-linoleno), apie 20% linolo (omega-6), apie 20% omega-9 (oleino). Aliejaus sudėtis unikali tuo, kad omega-3 riebiųjų rūgščių yra daugiau negu bet kuriame kitame aliejuje [11]. Pastaruoju metu kyla susidomėjimas linų sėmenų išspaudomis, kurios lieka po aliejaus išgavimo. Mokslininkų paskelbtais duomenimis, be polinesočiųjų rūgščių, jose gausu medžiagų, kurių neaptinkama aliejuje: baltymų (albumino), polisacharidų (gleivių), polifenolių (lignanų) [9]. Linų sėmenyse esančios gleivės pasižymi švelniai vidurius laisvinančiu poveikiu. Lignanai, reguliuodami moteriškų lytinių hormonų kiekį, gali sumažinti krūtų ligų riziką [6].
Linų sėmenų aliejuje randama ir antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų, saugančių organizmo ląsteles nuo neigiamo laisvųjų radikalų poveikio. Svarbiausios jų – tokoferoliai (vitaminas E) ir fenolinės rūgštys [5,7]. Vitaminas E yra lipofilinis antioksidantas, sudarytas iš 4 tokoferolių (alfa, beta, gama, delta) ir 4 tokotrienolių (alfa, beta, gama, delta), kurie pasižymi skirtingu biologiniu poveikiu. Jie žymiai greičiau negu polinesočiosios rūgštys reaguoja su susidariusiu hidroksilo radikalu ir taip sustabdo lipidų peroksidacijos reakcijų grandinę [12]. Nors iš jų visų α – tokoferolis laikomas biologiškai aktyviausiu, tačiau mokslininkai įrodė (Liu ir kt., 2002), kad tokoferolių mišinys efektyviau slopina lipidų peroksidacijos reakcijas, negu vienas α – tokoferolis [13,14]. Linų sėmenų aliejuje daugiausia randama γ – tokoferolio (1 lentelė), o tuo tarpu kitame plačiai dermatologinių vaistų formų kūrime naudojamame alyvuogių aliejuje vyraujanti vitamino E izoforma yra α – tokoferolis [15].
1 lentelė. Tokoferolių (TOC) ir tokotrienolių (T3) izomerų kiekis linų sėmenų aliejuje, mg/100g [5]
Linų sėmenų
aliejus
α-TOC γ-TOC α -T3 γ -T3 δ -T3 Bendras
kiekis
0,59 ± 0,01 75,67± 1,30 0,63 ± 0,04 0,83 ± 0,14 1,68 ± 0,08 79,4 ± 0,13
Kitos svarbios medžiagos, pasižyminčios antioksidaciniu poveikiu, yra fenoliniai junginiai. Iš jų linų sėmenų aliejuje aptinkami nedideli kiekiai fenolinių rūgščių (2 lentelė): hidroksibenzoinių (p-hidroksibenzoinė rūgštis) ir hidroksicinamono ( vanilinė rūgštis, ferulinė rūgštis) [7,16].
2 lentelė. Fenolinės rūgštys, randamos linų sėmenų aliejuje, µg/100g [7] Linų sėmenų
aliejus
p - hidroksibenzoinė Vanilinė Ferulinė Bendras kiekis
3,1 ± 0,07 1,0 ± 0,15 1,0 ± 0,05 5,1 ± 0,27
Fenolinių junginių, randamų aliejuje, antioksidacinis, antiradikalinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus ir padėties fenolio žiede, taip pat nuo poliškumo, tirpumo bei stabilumo. Šalto spaudimo aliejuje randamas didesnis kiekis polifenolinių junginių. Jiems būdingas didesnis antioksidacinis aktyvumas lyginant su monofenoliniais junginiais [17,18]. Fenoliniai junginiai turi didelę įtaką aliejaus stabilumui, jautrumui ir maistinėms savybėms. Jie inaktyvuoja radikalines lipidų peroksidacijos reakcijas ir taip apsaugo produktą nuo gedimo [7].
1.1.2. Aliejaus oksidacinis stabilumas ir jo gerinimas
Dėl linų sėmenų aliejuje esančio didelio kiekio α-linoleno riebalų rūgšties, šis augalinis aliejus yra nestabilus. Tam, kad būtų užtikrintas ne tik aliejaus, bet ir su juo kuriamų dermatologinių produktų stabilumas bei optimalus jų galiojimo laikas, vienas iš pagrindinių būdų yra papildomas antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų įterpimas [19]. Pastaruoju metu kyla susidomėjimas sintetinių medžiagų, naudojamų dermatologinių produktų kūrime, keliamu neigiamu poveikiu žmogaus sveikatai. Tai yra vienas svarbiausių rodiklių, į kuriuos atsižvelgiant, yra stengiamasi atsisakyti sintetinių priedų ir kurti produktus iš natūralios kilmės medžiagų. Augalinių aliejų stabilumui padidinti vis plačiau yra naudojami natūralūs antioksidantai. Augaluose randami fenoliniai junginiai atlieka svarbų vaidmenį gerinant augalinių aliejų oksidacinį stabilumą. Gruzdienės (2007) atliktas tyrimas patvirtina augalinių antioksidantų efektyvumą didinant linų sėmenų aliejaus oksidacinį stabilumą. Jis parodė, kad 0,15 proc. etanolinis burnočių sėklų ekstraktas linų sėmenų aliejaus stabilumą, laikant bandinius 40°C temperatūroje, padidina 1,7 karto [20]. Ruth ir kt. (2001) nustatė,
kad sojų pupelių ekstraktas 30 proc. sumažina pirminių linų sėmenų aliejaus oksidacijos produktų susidarymą [21]. Mokslininkai taip pat yra nustatę, kad kai kuriais atvejais natūralūs antioksidantai yra efektyvesni, užtikrinant augalinių aliejų oksidacinį stabilumą, negu sintetiniai. Zhang ir kt. (2010), tirdami saulėgrąžų aliejų nustatė, kad natūralus antioksidantas karnozolio rūgštis, laikant aliejų 60oC
temperatūroje (pagreitintas stabilumo tyrimas), yra efektyvesnis negu plačiai farmacinių produktų kūrime naudojami sintetiniai antioksidantai butilhidroksianisolis (BHA) ir butilhidroksitoluenas (BHT). Taip pat labai svarbu atsižvelgti į tai, jog netinkamos laikymo sąlygos ir aukšta temperatūra sumažina tokoferolių kiekį ir aktyvina aliejaus sudėtyje esančių riebalų autooksidacijos procesus, todėl būtina jį laikyti tamsaus stiklo induose vėsioje vietoje [22]. Tik tokiu atveju aliejus nepraras vertingų savybių ir bus tinkamas dermatologinių produktų kūrimui.
1.2. Natūralus antioksidantas – propolis ir jo panaudojimas dermatologinių
produktų kūrime
Nuo seno visame pasaulyje plačiai ligų gydymui naudojamas bičių produktas propolis pastaruoju metu vis labiau kelia susidomėjimą užsienio, taip pat ir Lietuvos mokslininkams, ieškantiems natūralių, antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų [23]. Tyrimais buvo nustatyta (Gendrolis, Majienė ir kt., 2003), kad mūsų šalyje surinktas propolis kaupia apie 22 – 32 proc. fenolinių junginių [24]. Vėliau propolio sudėtį tyrinėję mokslininkai nustatė (Ramanauskienė ir kt., 2009), kad Lietuvoje surinkto propolio sudėtyje gausu polifenolinių junginių, tokių kaip fenolinės rūgštys (ferulo, galo, p-kumaro, kavos, vanilo, cinamono, rozmarino) ir jų esteriai, taip pat flavanoidai, kurie suteikia stiprių antioksidacinių savybių, leidžiančių propolį panaudoti ir farmacinių produktų kūrime [25]. Viena iš svarbiausių priežasčių, nuo kurios priklauso propolio antioksidacinis efektyvumas sukurtame produkte, yra pasirinktas tirpiklis ir jo koncentracija. Dažniausiai naudojamas ir efektyviausias tirpiklis, skirtas biologiškai aktyvių medžiagų ekstrakcijai iš propolio, yra 70 proc. etanolis [26,27].
Propolio panaudojimo svarbą, kuriant dermatologinius produktus, tame tarpe ir emulsijas, įrodo tai, kad mūsų oda, sąveikaudama su aplinka ir su joje esančiomis kenksmingomis medžiagomis, yra pirminis organizmo apsauginis barjeras. Viena iš priežasčių, lemiančių kenksmingų laisvųjų radikalų susidarymą, yra per didelė ir intensyvi UV spinduliuotė. Susidarę reaktyvūs cheminiai junginiai, sąveikaudami su baltymais, DNR ir kitomis molekulėmis, sukelia rimtus ir negrįžtamus ląstelės pažeidimus [28]. Marquele kartu su kolegomis (2006) nustatė, jog panaudojus propolį emulsijų gamyboje, jo sudėtyje esantys fenoliniai junginiai efektyviai atsipalaiduoja iš sistemos, todėl sumodeliuotas produktas tinka odos apsaugai bei gydymui [29]. Gonçalves ir kt. (2011) taip pat tyrė, kokią įtaką propolis turi pagamintos emulsijos stabilumui. Buvo nustatyta, kad vienas propolio
etanolinis ekstraktas arba mišinyje su tokoferolio acetatu užtikrina pagamintos emulsijos stabilumą – padeda išsaugoti svarbiausias emulsijos reologines savybes [30]. Visi paminėti tyrimai patvirtina tai, kad propolis, kaip natūralus antioksidantas, yra tinkamas naudoti kuriant dermatologinius produktus bei užtikrinant jų kokybę bei stabilumą.
1.3. Emulsija – dermatologinė vaisto forma
Emulsija yra viena iš plačiausiai vartojamų dermatologinių vaisto formų. Ji yra apibūdinama kaip dispersinė sistema, kurią sudaro du tarpusavyje nesimaišantys skysčiai. Vienas iš jų yra dispersinė fazė, o kitas – dispersinė terpė [31]. Yra išskiriami du pagrindiniai emulsijų tipai: aliejus/vandenyje (a/v) ir vanduo/aliejuje (v/a). Emulsija, kurios dispersinę fazę sudaro hidrofobinės, o dispersinę terpę – hidrofilinės medžiagos, priskiriama a/v emulsijos tipui (1a pav.). Ir atvirkščiai, ta emulsija, kurios dispersinė fazė yra hidrofilinės medžiagos, o dispersine terpe tampa hidrofobinės medžiagos, apibūdinama kaip v/a arba atvirkštinio tipo emulsija (1b pav.) [32].
1a pav. Emulsija a/v 1b pav. Emulsija v/a
Dermatologinių produktų kūrimo etape, emulsijos tipo pasirinkimą sąlygoja keletas svarbių aspektų. Vienas jų - veikliosios medžiagos atsipalaidavimo greitis iš vaisto formos. Vandenyje tirpios medžiagos greičiau atsipalaiduoja iš a/v emulsijų, o riebaluose tirpios medžiagos – iš atvirkštinio tipo emulsijos. Taip pat svarbios ir emulsijos juslinės savybės. Tolygus pasiskirstymas, greitas įsigėrimas į odą, neriebi tekstūra, lengvai nuplaunama – dėl visų šių savybių a/v emulsija yra kur kas labiau priimtinesnė vartotojui. Tačiau išsausėjusios odos drėkinimui bei sutrikusios apsauginės odos funkcijos atstatymui dėl savo savybių labiau tinkama yra v/a tipo emulsija.
Ne mažiau svarbus yra ir aliejinės fazės pasirinkimas. Pastaruoju metu, kuriant dermatologinius produktus, tame tarpe ir emulsijas, vis dažniau yra stengiamasi atsisakyti sintetinių ir rinktis natūralias gamtinės kilmės medžiagas. Tam puikiai tinka augaliniai aliejai, tokie kaip saulėgrąžų, alyvuogių, ricinos, migdolų, taip pat iki šiol pakankamai mažai naudojamas linų sėmenų aliejus [4]. Tinkamai pasirinktas aliejus ne tik yra puikus natūralių antioksidantų šaltinis, bet ir užtikrina reikiamą emulsijos klampą ir efektyvų vaistinės medžiagos pernešimą.
1.4. Emulsijų nestabilumas
Viena iš didžiausių problemų, su kuria susiduriama modeliuojant emulsines sistemas, yra jų nestabilumas. Prieš pradedant gaminti pasirinktos sudėties emulsiją, būtina išanalizuoti visus veiksnius, galinčius paveikti jos stabilumą ir išsiaiškinti pagrindinius būdus emulsijos fizikiniam bei cheminiam stabilumui užtikrinti.
Pagamintos emulsijos nepastovumą gali sąlygoti įvairūs išoriniai veiksniai (2 pav.), iš jų dažniausiai pasitaikantys yra mikrobinis užterštumas, paprastai pakeičiantis juslines emulsijos savybes bei netinkamai pasirinktos laikymo sąlygos, kurios daro įtaką fizikiniam emulsijos stabilumui.
2 pav. Emulsijų stabilumą veikiantys išoriniai veiksniai
Yra išskiriami pagrindiniai fizikinio emulsijų nestabilumo tipai: išsisluoksniavimas, sedimentacija, flokuliacija ir koalescensija (3 pav.). Pirmieji du nestabilumo mechanizmai susiję su padidėjusiu skirtumu tarp dispersinės terpės ir dispersinės fazes tankių. Padidinus dispersinės terpės klampą arba sumažinus emulsinių lašelių dydį galima išvengti emulsijos sedimentacijos. Išsisluoksniavimą sąlygoja didesnis dispersinės terpės negu vidinės fazės tankis, dėl to šis procesas dažniausiai pasireiškia a/v tipo emulsijose. Flokuliaciją galima apibūdinti kaip procesą, kurio metu įvyksta emulsinių lašelių susijungimas, neprarandant vientisumo. Jeigu jis tęsiasi ilgą laiką, emulsinius lašelius skirianti plėvelė dėl pastovaus molekulių judėjimo plonėja ir pratrūksta, taip sukeldama lašelių susiliejimą į stambesnius – koalescensiją. Ji gali įvykti dėl per mažo emulguotų lašelių kiekio – emulsiklio pakeitimas arba jo koncentracijos padidinimas dažnai išsprendžia šią problemą [33].
3 pav. Pagrindiniai emulsijos nestabilumo atvejai
Dar vienas iš nepageidaujamų reiškinių, galinčių paveikti pagamintos emulsijos stabilumą, yra fazių inversija. Šis reiškinys apibūdinamas kaip dispersinės fazės ir dispersinės terpės apsikeitimas. Ji gali įvykti emulsijos gamybos metu, jeigu dispersinės fazės bus daugiau kaip 60 proc. [34]. Pavyzdžiui, gaminant v/a emulsiją, kurios sudėtyje yra daugiau kaip 60 proc. vandens, įvyks fazių inversija – gausime priešingo tipo – a/v emulsiją.
1.5. Emulsiklių pasirinkimo svarba
Emulsikliai yra medžiagos, kurios net tik padeda suformuoti emulsijos tipą, bet svarbiausia – užtikrina jos stabilumą. Jie padengia dispersinės fazės daleles plėvele, taip suformuodami stabilius, koalescencijai atsparius lašelius bei mažina paviršinę įtampą fazių sąveikos vietoje [35]. Emulsikliai gali būti klasifikuojami į dvi pagrindines grupes: sintetinės arba pusiau sintetinės ir natūralios kilmės medžiagos. Vieni iš plačiausiai farmacijos pramonėje naudojamų emulsiklių yra pusiau sintetinės kilmės nejonogeninės paviršinio aktyvumo medžiagos, tokios kaip Tween (polioksietileno sorbitano esteris) ir Span (sorbitano monoleatas) [34,36]. Šios medžiagos paprastai yra naudojamos dėl mažo toksiškumo bei odą dirginančio poveikio nebuvimo. Jos yra lengvai suderinamos su kitomis medžiagomis (kitaip nei anijoninės ar katijoninės paviršinio aktyvumo medžiagos), taip pat yra mažiau jautrios pH pokyčiams ar padidėjusiai elektrolitų koncentracijai [34]. Būtent šių dviejų emulsiklių mišinys, sudarytas iš Span (lipofilinio) ir Tween (hidrofilinio), naudojamas tiek a/v, tiek v/a tipo emulsijų gamyboje. Vienas pagrindinių parametrų, padedančių užtikrinti pagamintos emulsijos stabilumą, yra tinkama pasirinktų emulsiklių koncentracija [37]. Per maža emulsiklių koncentracija
sąlygoja aliejinės fazės lašelių agregaciją, o per didelė turi įtakos greitai pasireiškiančiai koalescensijai. Optimalų emulsiklių santykį padeda nustatyti hidrofilinio – lipofilinio balanso (HLB) sistema [38].
1.6. Hidrofilinis – lipofilinis balansas (HLB) ir jo reikšmė emulsijų stabilumui
Griffin buvo pirmasis mokslininkas sukūręs sistemą, kuri leidžia paskaičiuoti emulsiklių kiekius, užtikrinančius stabilios emulsijos suformavimą. Šis metodas buvo pavadintas hidrofilinio – lipofilinio balanso (HLB) metodu [35,38]. Norint pagaminti a/v tipo emulsiją, reikia naudoti hidrofilinius emulsiklius, kurie ant aliejaus sudaro struktūrines plėveles, neleidžiančias emulsijos fazėms atsiskirti. Hidrofilinių emulsiklių HLB skaičius yra didesnis kaip 10. Jis parodo hidrofilinių grupių skaičių emulsiklio molekulėje. Kuo skaičius didesnis, tuo jų daugiau ir didesnė tikimybė susiformuoti a/v emulsijai. Hidrofobiniai emulsikliai, atvirkščiai, yra naudojami v/a emulsijos suformuoti. Jų HLB skaičius yra mažesnis negu 10 [34].
Vienas iš pagrindinių iššūkių, modeliuojant emulsijas, yra tinkamas emulsiklių bei jų kiekio pasirinkimas, kurį padeda užtikrinti HLB sistema. Kiekviena lipofilinė medžiaga, kuri yra įterpiama į emulsijas, turi nustatytą tam tikrą rHLB skaičių. Lipofilinės medžiagos emulgavimui pasirinkti emulsikliai ar jų mišiniai, kurių HLB skaičius yra toks pat arba artimiausias lipofilinės medžiagos rHLB skaičiui, yra tinkamiausi stabiliai emulsijai suformuoti. Gaminant įvairių tipų emulsijas, dažnai yra naudojami įvairios lipofilinės medžiagos, tame tarpe ir augaliniai aliejai, kuriems jau yra nustatytas rHLB skaičius stabiliai emulsijai suformuoti [35]. Tačiau iki šiol nėra paskelbta mokslinių tyrimų duomenų apie linų sėmenų aliejaus rHLB skaičių, todėl prieš modeliuojant emulsines sistemas su šiuo augaliniu aliejumi, būtina eksperimentiniu būdu nustatyti šį skaičių. Tuo tikslu yra gaminama emulsijų eilė, naudojant įvairių koncentracijų bei skirtingo HLB skaičiaus nejonogeninių emulsiklių mišinius (3 lentelė).
3 lentelė. Įvairių aliejų rHLB skaičiaus stabiliai emulsijai nustatyti dažniausiai naudojami nejonogeniniai emulsikliai ir jų HLB reikšmės
Nejonogeninis emulsiklis HLB reikšmė
Sorbitano tristeratas (Span 65) 2,1
Sorbitano monooleatas (Span 80) 4,3
Sorbitano monolauratas (Span 20) 8,6
Polioksietilen(20) sorbitano tristearatas (Tween 65) 10,5 Polioksietilen(20) sorbitanomonooleatas(Tween 80) 15,0
Stebint kiekvienos iš pagamintų emulsijų stabilumą, yra nustatoma aliejaus rHLB reikšmė [34]. Dažniausiai nustatinėjant įvairių aliejų rHLB reikšmes stabilioms emulsinėms sistemoms paruošti, emulsikliais yra pasirenkami Span 80, turintis žemą HLB reikšmę ir Tween 80, turintis aukštą HLB reikšmę (3 lentelė) [39,40].
1.7. Emulsijų stabilumo tyrimo metodai
Pasirinkus tinkamus metodus, labai svarbu yra įvertinti pagamintos emulsijos stabilumą ir taip užtikrinti produkto efektyvumą bei kokybę. Pastaruoju metu ieškoma tikslesnių ir efektyvesnių metodų, padėsiančių greitai ir tiksliai identifikuoti pagamintos emulsijos nestabilumą. Vienas iš jų – turbidimetrinis metodas, kuriuo remiantis galima greitai ir nesunkiai įvertinti tiek a/v, tiek v/a tipo emulsijų stabilumą [1,2]. Šis metodas pagrįstas spektrofotometriniu tirpalo šviesos pralaidumo kitimo matavimu, esant skirtingam bangos ilgiui. Matuojant tirpalo šviesos pralaidumą prie 600 nm bangos ilgio, galima apskaičiuoti turbidiškumo reikšmes, kurių kitimas rodo emulsijos lašelių dydžio pasikeitimus: Turbidiškumas = 100 - %T; T – šviesos pralaidumas prie 600 nm bangos ilgio [41]. Kuo mažesni emulsiniai lašeliai, tuo emulsija rodo didesnį turbidiškumą [42]. Remiantis šia teorija, Shahin M. kartu su kolegomis (2011) pritaikė turbidimetrinį metodą tiriant simondsijų aliejaus rHLB stabilioms a/v emulsijų suformuoti [1]. Šis metodas taip pat buvo mokslininkų (Song ir kt., 2002)pritaikytas ir v/a emulsijų stabilumo tyrimui, tačiau vertinant pagal kitą parametrą - drumstumo santykį (R), kuris apskaičiuojamas remiantis pagaminto tirpalo šviesos pralaidumo kitimu prie dviejų skirtingo ilgio bangų: 450nm ir 850nm: Drumstumo santykis (R) = T850 / T450; T - pralaidumas. Kuo
šis santykis mažesnis, tuo emulsinė sistema yra stabilesnė [2].
Kitas efektyvus metodas, skirtas emulsijų stabilumui stebėti, yra emulsinių lašelių pasiskirstymo nustatymas, kuris atliekamas dalelių dydžio matuokliu Mastersizer 3000 (Malvern, UK). Jis yra pagrįstas lazerio spinduliuotės sklaidos matavimu. Taikant šį metodą būtina prisiminti, jog jis nurodo tirpale esančių dalelių pasiskirstymą pagal tūrį, o ne tikslų dalelių kiekį [43]. Pastaruoju metu vis daugiau mokslininkų renkasi šį metodą tiek emulsijų stabilumui tirti, tiek ir įvairių faktorių, tokių kaip pH, vandens kiekio, paviršiui aktyvių medžiagų (PAM) įtakos emulsinių lašelių pasiskirstymo nustatymui. Neirynck ir kt. (2007), pasitelkdami šį dalelių dydžio nustatymo metodą, analizavo, kokią įtaką emulsinių lašelių dydžiui ir pasiskirstymui turi skirtingas pasirinktų biopolimero/polisacharido (išrūgų baltymų/pektino) kiekis bei pH pasikeitimas. Buvo nustatyta, kad esant šių medžiagų santykiui 1/2, emulsinių lašelių dydis yra mažiausias (tai patvirtino ir mikroskopinė analizė) ir pagaminta emulsija yra stabliausia [44].
Taip pat emulsijų stabilumas gali būti įvertimas ir tiriant kitus svarbius parametrus, tokius kaip klampa, pH, organoleptinės savybės, tekstūra, mikrobinis užterštumas, fazių atsiskyrimas ir kt. [33].
1.8. Antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų aktyvumas emulsinėse
sistemose
Kuriant dermatologinius produktus ir siekiant jais apsaugoti žmogaus odą nuo laisvųjų radikalų poveikio, didelis dėmesys yra skiriamas jų antioksidaciniam poveikiui. Nors į emulsijų sudėtį dažniausiai įeinantys natūralūs augaliniai aliejai turi nemažai antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių veikliųjų medžiagų, tačiau jų poveikis emulsinėje sistemoje dažnai gali pasikeisti. Dispersinę fazę ar terpę sudarantis aliejus, lyginant su grynu, paprastai yra labiau jautresnis oksidacijos procesams, nepaisant didelio antioksidacinių medžiagų kiekio. Antioksidantų veikimas gali priklausyti ir nuo vandeninės fazės buvimo. Vienas iš antioksidantų, tarp jų ir fenolinių rūgščių, veikimo mechanizmų yra gebėjimas atiduoti vandenilio atomą. Ši savybė gali būti šiek tiek slopinama susiformavus vandeniliniams ryšiams su vandeniu [45].
Gaminant įvairių tipų emulsijas su augaliniais aliejais, dažnai susiduriama su viena pagrindinių problemų – oksidacija. Didelis emulsijų paviršiaus plotas palengvina lipidų bei vandenyje tirpių prooksidantų sąveiką, todėl oksidacijos procesas vyksta greitai [46]. Siekiant ne tik apsaugoti emulsijos sudėtyje esančius aliejus nuo oksidacijos, bet tuo pačiu padidinti ir jos laisvuosius radikalus inaktyvuojantį poveikį, dažnai yra pridedamas papildomas antioksidantų kiekis arba medžiagos, skatinančios jų veikimą. Per pastarąjį dešimtmetį atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad antioksidacinių medžiagų molekulės, tame tarpe ir fenolinių junginių, gali sąveikauti su baltymais, sudarydamos kovalentinius kompleksus, kurie padidina emulsinės sistemos atsparumą oksidacijai ir pagerina jos antioksidacines savybes [47,48]. Dermatologinių produktų kūrimui renkantis antioksidaciniu poveikiu pasižyminčias medžiagas, taip pat svarbu nepamiršti ir dažnai pasitaikančio „poliškumo paradokso“. Frankel E. N. kartu su kitais mokslininkais (1994) įrodė, kad vandenyje tirpus antioksidantas troloksas yra efektyvesnis gryname aliejuje, tačiau mažiau efektyvus a/v emulsijoje, lyginant su riebaluose tirpiu α – tokoferoliu [49]. Tačiau ne visi mokslininkai sutinka su šios teorijos tikslumu. Laguerre ir kt. (2009) atliko tyrimus, kurie patvirtino, jog ne visi antioksidantai veikia pagal „poliškumo paradokso“ teoriją, todėl buvo padaryta išvada, kad antioksidantų veikimo mechanizmas tokiose sistemose kaip emulsijos yra žymiai sudėtingesnis ir tam įrodyti reikalinga atlikti daugiau mokslinių tyrimų [50].
Taip pat svarbu, jog ilgą laiką emulsijų oksidaciniam stabilumui didinti naudoti sintetiniai antioksidantai yra keičiami natūraliais – saugesniais ir mažesnį poveikį žmogaus sveikatai darančiais antioksidantais, esančiais vynuogių sėklose, rozmarinuose, žaliojoje arbatoje ir daugelyje kitų augalinės kilmės žaliavų [51].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medžiagos ir įranga
2.1.1. Tyrimo medžiagos
Linų sėmenų aliejus (šalto spaudimo) (Carl Roth GmbH+Co., Vokietija)
Emulsiklis Tween 80 (AppliChem, Vokietija)
Emulsiklis Span 80 (AlfaAesar, Vokietija)
Etanolis 96 proc. V/V (Stumbras, Lietuva)
DPPH• reagentas (Sigma – Aldrich, Vokietija)
Išgrynintas vanduo (Ph.eur. 01/2008:0008, LSMU laboratorija)
Chitozanas (Sigma – Aldrich, Vokietija)
Pieno rūgštis (Fluka, Ispanija)
Folin – Ciocalteu reagentas (Sigma – Aldrich, Šveicarija)
Natrio karbonatas, Na2CO3 (Sigma – Aldrich, Saint Luisas, JAV) Alyvuogių aliejus (šalto spaudimo) (Carl Roth GmbH+Co., Vokietija)
Propolio žaliava (UAB „Bičių korys“, Lietuva)
2.1.2. Tyrimo įranga
Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija)
Analitinės svarstyklės SBC – 31 (Scaltec Instruments GmbH, Vokietija)
Homogenizatorius Ultra Turrax (Janke&Kunkel, Vokietija)
Spektrofotometras Agilent 8453 UV- Vis (Agilent Technologies, JAV)
Magnetinė maišyklė su kaitinimo įranga IKA® C – MAG H57 (IKA® – Werke GmbH&Co, Vokietija)
Termostatas GEL® (Gesellschaft für mgH, Vokietija)
Viskozimetras Vibro viscometer SV - 10 (A&D Company Limited, Japonija)
pH – metras 766 su elektrodu Knick SE 104N (Knick Elektronische MeßgeräteGmbH&Co, Vokietija)
Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK)
Centrifūga („SIGMA3 – 18KS“, Vokietija)
2.2. Linų sėmenų aliejaus rHLB skaičiaus a/v ir v/a emulsijoms nustatymas
Tyrimų metu buvo nustatinėjami du skirtingi linų sėmenų aliejaus rHLB dydžiai, kuriems esant šis aliejus suformuoja patvarias dviejų tipų emulsijas: a/v ir v/a. Emulsikliais buvo pasirinkti mažai toksiški Span 80 (HLB 4,3) ir Tween 80 (HLB 15), kuriuos maišant skirtingomis koncentracijomis buvo suformuotos 6 v/a emulsijos (Nr. 1 – 6) (HLB 5,37 – 9,65) ir 5 a/v emulsijos (Nr. 7 – 11) (HLB 10,72 - 13,93) (4 lentelė) [52]. Tyrimams buvo naudojamas patvirtintos kokybės šalto spaudimo linų sėmenų aliejus (1 priedas).
4 lentelė. Emulsijų sudėtis, emulsiklių kiekiai ir jų HLB
Eil. Nr.
Vandens/aliejaus konc., proc.
HLB Emulsiklių Span 80/Tween 80 kiekis, proc. (g) Emulsijos tipas 1 20/80 4,3 100 (4,0) / 0 (0) v/a 2 20/80 5,37 90 (3.6) /10 (0.4) v/a 3 20/80 6,44 80 (3.2) / 20 (0.8) v/a 4 20/80 7,51 70 (2.8)/ 30 (1.2) v/a 5 20/80 8,58 60 (2.4) / 40 (1.6) v/a 6 20/80 9,65 50 (2.0) / 50 (2.0) v/a 7 80/20 10,72 40 (1.6) / 60 (2.4) a/v 8 80/20 11,79 30 (1.2) / 70 (2.8) a/v 9 80/20 12,86 20 (0.8) / 80 (3.2) a/v 10 80/20 13,93 10 (0.4) / 90 (3.6) a/v 11 80/20 15,0 0 (0) / 100 (4,0) a/v
Emulsiklių HLB reikšmės buvo skaičiuojamos pagal formulę:
Ka – emulsiklio a kiekis (tirpaus aliejuje, Span 80). Kv – emulsiklio v kiekis (tirpaus vandenyje, Tween 80).
2.3. Emulsijų a/v ir v/a gamybos technologija
Emulsijos a/v buvo suformuotos emulsiklių mišinį sumaišius su linų sėmenų aliejumi (dispersine faze) ir maišant homogenizatoriumi Ultra Turrax (Janke & Kunkel, Vokietija) 10 min. 8000 aps./min greičiu, pamažu buvo įterpiama dispersinė terpė – išgrynintas vanduo.
Priešingo tipo emulsijos v/a buvo suformuotos emulsiklių mišinį sumaišius su išgrynintu vandeniu (dispersine faze) ir maišant homogenizatoriumi Ultra Turrax (Janke & Kunkel, Vokietija) 10 min. 8000 aps./min greičiu, pamažu buvo įterpiama dispersinė terpė – linų sėmenų aliejus.
Iš pradžių emulsijos buvo gaminamos įterpiant emulsiklių mišinio 20 proc. nuo aliejinės fazės. Siekiant kuo tiksliau nustatyti ir išskirti stabiliausias a/v ir v/a emulsijas, tyrimai buvo pakartoti pasirinkus mažesnę – 5 proc. emulsiklių mišinio koncentraciją [35].
2.4. Emulsijos tipo nustatymas
Emulsijų tipas buvo nustatomas skiedimo metodu: lašas emulsijos užlašinamas ant vandens lašo. Jei lašas maišosi su vandeniu, jis pasklinda, nurodydamas, kad vanduo yra dispersinė terpė – a/v tipo emulsija, jei lašai nesusimaišo – v/a tipo emulsija [32].
2.5. Emulsijų stabilumo ir kokybės tyrimas
Siekiant nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a emulsijoms suformuoti, pagamintų emulsijų stabilumas buvo vertinamas atsižvelgiant į emulsinių lašelių dydį ir pasiskirstymą, taikant tikslią ir efektyvią turbidimetrinę analizę bei emulsinių lašelių dydžio nustatymą dalelių dydžio matuokliu Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK). Tyrimai buvo atliekami 14 dienų, imant mėginius praėjus 24 val. ir 14 dienų nuo emulsijų pagaminimo. Kiekvienas matavimas buvo kartojamas 3 kartus.
Remiantis gautais rHLB nustatymo rezultatais, buvo pagamintos dvi emulsijos - a/v ir v/a, aliejine faze pasirenkant linų sėmenų aliejų, o vandenine - 1 proc. chitozano tirpalą (5 lentelė). Pagamintų emulsijų stabilumas ir kokybė buvo vertinami ne tik pagal emulsinių lašelių dydį ir pasiskirstymą, bet ir pagal klampą, pH, mikrostruktūrą bei antioksidacinį aktyvumą. Tyrimai buvo atliekami 2 mėn., imant mėginius po 24 val., 2 sav., 1 mėn. ir 2 mėn. nuo emulsijų pagaminimo. Kiekvienas matavimas buvo kartojamas 3 kartus.
Pagamintų emulsijų stabilumas ir kokybė buvo vertinami pasirenkant tris skirtingas aplinkos sąlygas: laikant pagamintas emulsijas 2 mėn. natūralių sąlygų temperatūroje (15 – 25oC), šaldytuve
(4oC temperatūroje) ir pagreitinto sendinimo sąlygomis klimatinėje spintoje 40±2oC temperatūroje, esant 75±5 proc. santykinei drėgmei. Visi matavimai buvo atlikti natūralių sąlygų temperatūroje, praėjus 2 val. po mėginių išėmimo iš šaldytuvo ar klimatinės spintos [54].
5 lentelė. Stabilumo ir antioksidacinio aktyvumo tyrimui pagamintų emulsijų sudėtis 1 proc. chitozano
tirpalo/aliejaus konc., proc.
HLB Emulsiklių Span 80 /
Tween 80 kiekis, proc. (g)
Emulsijos tipas
70/30 13,93 10 (0,6) / 90 (5,4) a/v
30/70 9,65 50 (7,0) / 50 (7,0) v/a
1 proc. chitozano tirpalo gamyba: chitozano milteliai brinkinami 1,0 proc. pieno rūgšties
tirpale. Naudojama rūgštis, kadangi chitozanas tirpus esant pH reikšmei <6,5. Tirpinimui panaudojama aukšta temperatūra ir magnetinė maišyklė [55].
2.6. Emulsijų stabilumo tyrimo metodai
2.6.1. Turbidimetrinė analizė
Praskiedus emulsiją vandeniu, susidaro drumstas tirpalas, sukeliantis krintančios šviesos stiprio sumažėjimą, kurį galima išmatuoti turbidimetrijos metodu. Kuo labiau išsklaidoma šviesa, tuo didesnis drumstumas (turbidiškumas) [41]. 0,1g pagamintos emulsijos yra praskiedžiama išgrynintu vandeniu 500 kartų. Kolba su pagamintu tirpalu lengvai apverčiama 25 kartus [41] ir iš karto UV spektrofotometru (Agilent 8453 UV – Vis) matuojamas tirpalo šviesos pralaidumas ir absorbcija, esant 600 nm bangos ilgiui [39].
Turbidiškumas apskaičiuotas remiantis formule [1]:
T – šviesos pralaidumas prie 600 nm bangos ilgio.
2.6.2. Emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimas
Aliejinės fazės dalelių dydis matuojamas (n=3) dalelių dydžio matuokliu Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK). Preparatas paruošiamas po nedidelį kiekį emulsijos perkeliant į aparato priedą – maišyklę Hydro 3000S (Malvern), į kurią kiekvieno matavimo metu pripilamas vienodas kiekis (400 ml) distiliuoto vandens. Preparatas tinkamai praskiestas, kai lazerio šviesos spindulių pralaidumas yra apie 10 proc. Dalelės matuojamos pagal šviesos išbarstymą. Matavimų metu
nustatytas refrakcinis indeksas yra 1,48, o absorbcijos indeksas - 1,000. Nustatant dalelių dydį, kiekviena emulsija vienodai suplakama ir matavimai atliekami praėjus 1 valandai [56].
2.6.3. Klampos tyrimas
Klampa nustatyta viskozimetru Sine – wave Vibro Viscometer SV – 10 (A&D Company, Limited, Japonija). 40 g tiriamojo mėginio perkeliama į specialų matavimui skirtą indą. Po to jis yra įtvirtinamas ant prietaiso paviršiaus ir į tiriamąją medžiagą yra nuleidžiami davikliai. Klampa matuojama 20°C temperatūroje (mPa·s).
2.6.4. pH reikšmės nustatymas
pH reikšmės nustatytos taikant potenciometrinį metodą. Matavimai atlikti naudojant pH – metrą (Knick pH – Meter 766 Calimatic), skirtą matuoti puskiečių sistemų pH reikšmėms.
2.6.5. Mikroskopinis emulsijų tyrimas
Mikrostruktūra tirta Motic (Motic instruments, Kinija) mikroskopu. Tiriamoji emulsija užtepama ant stiklelio labai plonu sluoksniu, tada gerai prispaudžiama mikroskopavimo stikleliu ir užlašinamas imersinio aliejaus (Immersion oil, Reactifs Ral S.A., Prancūzija) lašas. Tada stiklelis su tiriamąja medžiaga įtvirtinamas ant prietaiso darbinio paviršiaus ir nuleidžiamas mikroskopo objektyvas. Tyrime panaudotas x100 didinimas. Duomenys apdoroti kompiuterine programa Motic Images Plus 2.0 ML, panaudota Moticam 1000 1,3 MPixel USB 2.0 kamera.
2.7. Linų sėmenų ir alyvuogių aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio ir
antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Linų sėmenų ir alyvuogių aliejaus fenolinių junginių ekstrakcija: aliejai (2,5g) buvo
skiedžiami 96 proc. etanoliu (santykiu 1:1 pagal masę), 3 min. maišomi Ultra Turrax homogenizatoriumi ir centrifūguojami 4000 aps./min. greičiu 5 minutes.
2.7.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojamas spektrofotometrinis metodas, panaudojant Folin - Ciocalteu reagentą. Jis yra pagrįstas spalvine reakcija: į 2 ml išgryninto vandens ir 1ml Folin – CioCalteu reagento mišinį pilamas atitinkamas aliejaus etanolinio ekstrakto kiekis mikrolitrais arba mikrogramais. Pilama 1,5 ml 20 proc. natrio karbonato tirpalo, skiedžiama matavimo kolbutėje iki 10 ml žymės išgrynintu vandeniu. Mišinys paliekamas 30 minučių natūralių sąlygų temperatūroje, kad įvyktų reakcija. Palyginamuoju tirpalu, matuojant absorbciją esant 765nm bangos ilgiui, naudojamas išgrynintas vanduo [57].
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) mg/g žaliavos. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal formulę:
C – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (ml);
m – atsvertas aliejaus kiekis (g).
2.7.2. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas
Aliejaus ir emulsijų antioksidacinis aktyvumas nustatomas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) laisvojo radikalo sujungimo metodu. Antiradikalinis aktyvumas įvertinamas matuojant, kiek procentų stabilaus DPPH• radikalo neutralizuoja aliejaus sudėtyje esantys fenoliniai junginiai [58].
Emulsijų paruošimas antioksidacinio aktyvumo tyrimui: 5,0 g tiriamųjų emulsijų buvo
skiedžiamos 96 proc. etanoliu (santykiu 1:1 pagal masę) ir 3 min. maišomos Ultra Turrax homogenizatoriumi. Gauti tirpalai buvo centrifūguojami 4000 aps./min. greičiu 5 minutes ir atliekama laisvojo DPPH• radikalo sujungimo reakcija.
Etanolinis 0,1 mM DPPH• tirpalas pagamintas 10 mg reagento ištirpinant 250 ml 96 proc. etanolyje ir laikant tirpalą 24 val. šaldytuve. Tyrimo metu į kiuvetę įpilama 2,9 ml paruošto DPPH• reagento, 0,1 ml tiriamojo tirpalo ir 30 min. laikoma tamsioje vietoje (praėjus 15 min., kiuvetė supurtoma). Šviesos absorbcija matuojama Agilent 8453 UV – vis spektrofotometru (Agilent Technologies, Santa Clara, JAV), esant 518 nm bangos ilgiui. Kaip lyginamasis tirpalas buvo naudojamas 96 proc. etanolis. Antioksidacinis aktyvumas išreikštas inaktyvuoto DPPH• radikalo kiekio procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę [58]:
Ab– tuščiojo mėginio absorbcija (t = 0)
Aa – bandinio su tiriamuoju aliejumi absorbcija (t = 30).
2.8. Propolio ekstraktų įtakos emulsijų antioksidacinio aktyvumo stabilumui
tyrimas
Atliekant šį tyrimą buvo siekiama nustatyti, kaip propolio ekstraktai pagerina ir stabilizuoja abiejų tipų linų sėmenų aliejaus emulsijų antioksidacinį aktyvumą ir palyginti gautus rezultatus su kitu augaliniu aliejumi - alyvuogių aliejumi. Šis aliejus buvo pasirinktas dėl to, kad jo sudėtyje yra daugiau laisvuosius radikalus surišančiu poveikiu pasižyminčių medžiagų ir žymiai mažiau polinesočiųjų riebalų rūgščių, lyginant su linų sėmenų aliejumi [59].
Tyrime buvo naudojami skirtingi propolio ekstraktai, kurie gaminant abiejų tipų emulsijas, buvo įterpiami į skirtingas fazes: etanolinis propolio ekstraktas buvo įterpiamas į vandeninę, o aliejinis – į aliejinę emulsijos fazę. Iš viso buvo pagamintos 8 emulsijos: 4 su linų sėmenų aliejumi ir 4 su alyvuogių aliejumi (6 lentelė). Pasirinktas ekstraktų kiekis – 1 proc. nuo viso emulsijos kiekio. Pagamintos emulsijos buvo laikomos 48 val. termostate 60°C temperatūroje. Mokslininkų nustatytais duomenimis, laikymas 24 val. nurodytomis sąlygomis atitinka 1 mėn. laikymą natūralių sąlygų temperatūroje [59].
6 lentelė. Emulsijų su propolio ekstraktais sudėtis Emulsijos tipas a/v v/a Linų sėmenų ir alyvuogių aliejaus emulsijos
su etanoliniu propolio ekstraktu su etanoliniu propolio ekstraktu
su aliejiniu propolio ekstraktu su aliejiniu propolio ekstraktu
Etanolinio propolio ekstrakto gamyba: paruošiamas 30 proc. ekstraktas tirpikliu naudojant
70 proc. V/V etanolį. 30 g smulkintos žaliavos užpilama ekstrahentu iki 100 ml žymės, paliekama maceruotis savaitei pasirinktomis sąlygomis, dažnai pamaišant. Filtruojama pro popieriaus filtrą į tamsaus stiklo talpyklę. Laikoma vėsioje vietoje.
Aliejinio propolio ekstrakto gamyba: taip pat ruošiamas 30 proc. ekstraktas. Tirpikliu
aliejumi iki bendros 100 g masės. Paliekama savaitei maceruotis natūraliomis sąlygomis, dažnai pamaišant. Filtruojama pro popieriaus filtrą į tamsaus stiklo talpyklę. Laikoma vėsioje vietoje.
Apibendrintas atliktų mokslinių tyrimų su linų sėmenų aliejumi ir emulsinėmis sistemomis planas pateiktas 2 priede.
2.9. Statistinė analizė
Atliekant tyrimus bandymai kartoti tris kartus (n=3). Duomenų statistinė analizė atlikta Microsoft Office Exel 2013 bei IMB SPSS 22 statistinėmis programomis. Tyrimų duomenų analizei taikytas vieno faktoriaus dispersinės analizės modelis (One – Way ANOVA), naudojant LSD kriterijų. Apskaičiuoti vidurkiai su standartiniais nuokrypiais, nustatytas patikimumo lygmuo (skirtumai tarp vidurkių patikimi, jei p<0,05).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Linų sėmenų aliejaus rHLB skaičiaus a/v ir v/a emulsijoms nustatymas
Vienas iš pagrindinių rodiklių, modeliuojant abiejų tipų emulsines sistemas, yra hidrofilinis – lipofilinis balansas [34]. Tik pasirinkus tinkamą reikalingą HLB skaičių aliejaus, su kuriuo bus formuojama emulsinė sistema, bus galima tiksliai parinkti emulsiklį ar jų mišinius. Tik tada bus gaunama stabili ir kokybiška emulsija. Siekiant nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v ir v/a emulsijoms, buvo gaminama emulsijų eilė su linų sėmenų aliejumi ir emulsiklių Span 80 (HLB 4,3) ir Tween 80 (HLB 15) mišiniais, kurių HLB skaičius yra nuo 4,3 iki 15 [52]. Pasirinktas emulsiklių kiekis buvo 20 proc. nuo aliejinės fazės (4 pav.). Norint įsitikinti gautų rezultatų tikslumu ir išrinkti stabiliausias emulsijas, jos buvo pakartotinai pagamintos ir ištirtos, pasirinkus 5 proc. emulsiklio mišinio koncentraciją nuo aliejinės fazės [35].
4 pav. Linų sėmenų aliejaus rHLB skaičiaus nustatymui pagamintos a/v ir v/a emulsijos su 20 proc. emulsiklių mišiniu
Emulsijų tipas buvo nustatytas atliekant skiedimo testą. Ištyrus visas emulsijas, pasitvirtino nurodytos testo sąlygos: Nr. 7 - 11 a/v emulsijos (HLB 10,72-13,93), praskiedus vandeniu išliko stabilios, o Nr. 1 - 6 v/a emulsijos (HLB 5,37 – 9,65) - išsisluoksniavo [32].
Tokia pasirinktų emulsiklių HLB reikšmė, pagal kurią nurodyti emulsiklių kiekiai užtikrina patį didžiausią emulsijos stabilumą, yra aliejinės fazės reikiama HLB reikšmė [35,60]. Nustatant linų sėmenų aliejaus rHLB skaičių, pagamintų emulsijų stabilumas buvo vertinamas pagal emulsinių lašelių dydį bei pasiskirstymą, nustatant šiuos emulsijų stabilumo parametrus tikslia ir efektyvia turbidimetrine analize bei emulsinių lašelių dydžio nustatymu dalelių dydžio matuokliu Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, UK) [1,39,40].
3.1.1. Turbidimetrinė analizė
Pagaminus Nr. 7 - 11 a/v emulsijas (HLB 10,72 – 15) ir Nr. 1 - 6 v/a emulsijas (HLB 5,37 – 9,65), jų stabilumas buvo tiriamas 14 dienų ir vertinamas taikant turbidimetrinę analizę. Emulsijų stabilumas, remiantis šiuo metodu, gali būti vertinamas pagal kelis parametrus: drumstumo santykį, stabilumo indeksą ir turbidiškumą. Vertinant pagal drumstumo santykį, kuo jis mažesnis, tuo stabilesnė yra emulsinė sistema [61]. Tiriant pagamintas emulsijas ir nustatinėjant lipofilinės medžiagos reikalingą HLB skaičių, galima atsižvelgti ir į stabilumo indeksą. Stabiliausia ta emulsinė sistema, kurios stabilumo indeksas bėgant laikui išlieka mažiausias [62]. Šio tyrimo metu nustatant linų sėmenų aliejaus rHLB skaičių, emulsijų stabilumas buvo vertinamas pasirinkus vieną iš parametrų – turbidiškumą. Tos emulsijos, kurių turbidiškumas laikui bėgant yra didžiausias, laikomos stabiliausiomis. Nustačius, kurios emulsijos pasižymi didžiausiomis turbidiškumo reikšmėmis, galima teigti, kad jose aptinkami mažiausi emulsiniai lašeliai ir jos yra stabiliausios [1,39].
Iš pradžių buvo tiriamos linų sėmenų aliejaus Nr. 7 - 11 a/v emulsijos (HLB 10,72 – 15,0). Statistinė duomenų analizė parodė, kad visų emulsijų turbidiškumo reikšmės po 14 dienų pakito statistiškai nereikšmingai (p>0,05). Tačiau lyginant tarpusavyje Nr. 7 – 11 a/v emulsijas nustatyta, jog didžiausiomis turbidiškumo reikšmėmis tiriamuoju laikotarpiu (99,87 proc.) pasižymėjo emulsija Nr. 10, tačiau gauti rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05), lyginant su emulsija Nr. 8 (99,41 proc.), Nr. 9 (99,63 proc.) ir Nr. 11 (99,29 proc.) (5 pav.).
5 pav. Emulsijų a/v turbidiškumo tyrimo rezultatai
Norint kuo tiksliau nustatyti stabiliausią a/v emulsiją, tyrimas buvo tęsiamas pakartotinai pagaminus Nr. 7 – 11 linų sėmenų aliejaus a/v emulsijas, tačiau pasirinkus mažesnę 5 proc. emulsiklių mišinio nuo aliejinės fazės koncentraciją [35]. Gauti rezultatai parodė, kad didžiausiomis turbidiškumo reikšmėmis pasižymėjo emulsijos Nr. 9 ir Nr. 10, tačiau apie 3,22 proc. reikšmingai didesnis
97.49 98.93 99.19 99.51 98.77 97.72 99.41 99.63 99.87 99.29 97 97.5 98 98.5 99 99.5 100 100.5 Nr. 7 (10,72) Nr. 8 (11,79) Nr. 9 (12,86) Nr. 10 (13,93) Nr. 11 (15,0) Tu rb id išk u m as, pr oc . Emulsijos eilės Nr. ir HLB Po 24 val. Po 14 d.
turbidiškumas (p=0.011) nustatytas emulsijoje Nr. 10 (6 pav.). Tai patvirtino ankstesnių tyrimų su 20 proc. emulsiklių mišinio kiekiu rezultatus, todėl atlikus turbidimetrinę analizę, stabiliausia a/v emulsija išrinkta Nr. 10, kurios HLB 13,93.
6 pav. Emulsijos a/v Nr. 9 ir Nr. 10 su 5 proc. emulsiklio
Turbidimetrinės analizės metu nustačius, jog stabiliausia linų sėmenų aliejaus emulsija yra Nr. 10 (HLB 13,93), tyrimas toliau buvo tęsiamas su Nr. 1 – 6 v/a emulsijomis. Atlikus pagamintų tirpalų spektrofotometrinius matavimus ir apskaičiavus reikšmes, matyti, jog didžiausiu turbidiškumu (p<0,05) praėjus 14 d. nuo emulsijų pagaminimo pasižymėjo emulsija Nr. 2 (98,16 proc.) ir emulsija Nr. 6 (99,79 proc.) (7 pav.).
Statistiškai reikšmingo skirtumo (p<0,05) tarp emulsijos Nr. 2 ir emulsijos Nr. 6 turbidiškumo reikšmių, tiek praėjus 24 val., tiek 14 d. nebuvo, todėl buvo nuspręsta pakartoti tyrimą, pasirenkant 5 proc. emulsiklių mišinio koncentraciją nuo aliejinės fazės.
95.54 98.73 95.85 99.31 95 95.5 96 96.5 97 97.5 98 98.5 99 99.5 100 Nr. 9 (12,86) Nr. 10 (13,93) T urbid iš ku m as , pro c. Emulsijos eilės Nr. ir HLB Po 24 val. Po 14 d.
7 pav. Emulsijų v/a turbidiškumo tyrimo rezultatai
Sumažinus emulsiklių koncentraciją ir ištyrus v/a emulsijas paaiškėjo, kad didžiausiu turbidiškumu (p<0,05) pasižymi emulsija Nr. 6 (87,87 proc.) (8 pav.).
8 pav. Emulsijos v/a Nr. 2 ir Nr. 6 su 5 proc. emulsiklio
Palyginus prieš tai tyrime nustatytų stabiliausių v/a emulsijų reikšmes matyti, kad vis dėlto apie 10 proc. didesniu turbidiškumu (p=0.005) pasižymėjo emulsija Nr. 6, lyginant su emulsija Nr. 2. Atsižvelgiant į tai, kad emulsijos, kurių turbidiškumas laikui bėgant yra didžiausias, laikomos stabiliausiomis, emulsija Nr. 6, kurios HLB 9,56 išrinkta stabiliausia v/a emulsija.
Apibendrinant rezultatus, gautus atlikus turbidimetrinę analizę galima teigti, kad reikalingas HLB skaičius emulsijai a/v suformuoti yra 13,93, o v/a emulsijai – 9,65.
60.19 99.73 54.81 73.57 50.69 99.79 68.19 98.16 64.36 84.83 64.33 98.32 35 45 55 65 75 85 95 105 Nr. 1 (4,3) Nr. 2 (5,37) Nr. 3 (6,44) Nr. 4 (7,51) Nr. 5 (8,58) Nr. 6 (9,56) Tu rb id išk u m as , p ro c. Emulsijos eilės Nr. ir HLB Po 24 val. Po 14 d. 74.83 83.36 76.53 87.82 72 75 78 81 84 87 90 Nr. 2 (5,37) Nr. 6 (9,56) T urbid iš ku m as , pro c.
Emulsijos eilės Nr. ir HLB reikšmė
3.1.2. Emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo nustatymas
Atlikus pagamintų Nr. 7 - 11 a/v emulsijų lašelių dydžių ir pasiskirstymo matavimus, buvo stebimas jų pokytis, laikant emulsijas natūralių sąlygų temperatūroje 14 dienų. Mėginiai buvo imami 2 kartus: po 24 val. ir po 14 d. nuo emulsijų pagaminimo bei stebimi emulsinių lašelių dydžio ir pasiskirstymo pokyčiai. Jie sąlygoja pagamintos emulsijos stabilumą: kuo mažesni lašeliai, tuo stabilesnė yra emulsija [34]. Emulsijų stabilumas buvo vertinamas pagal lašelių pasiskirstymą, vidutinį dalelių dydį (d4,3) pagal tūrį bei savitąjį tiriamos emulsijos paviršiaus plotą [43].
Atlikus Nr. 7 – 11 a/v emulsijų lašelių dydžių matavimus (Malvern Instruments, UK) ir palyginus gautus rezultatus, tiek po 24 val., tiek po 14 dienų buvo nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0,05). Didžiausi lašeliai tiek po 24 val., tiek po 14 d. užfiksuoti emulsijoje Nr. 7 ir emulsijoje Nr. 8 (9 pav.), kurių dydis 14 dienų laikotarpyje kito (p<0,05) nuo 5,87 iki 7,54 µm (emulsija Nr. 7) ir nuo 5,46 iki 7,30 µm (emulsija Nr. 8). Tame pačiame laikotarpyje mažiausi lašeliai susidarė emulsijoje Nr. 10, šiek tiek didesni - emulsijoje Nr. 9 (9 pav.). Šiose emulsijose pastebėtas ir mažesnis vidutinio lašelio dydžio pokytis per 14 d.: nuo 4,20 iki 4,97 µm (emulsija Nr. 9) ir nuo 3,66 iki 3,96 µm (emulsija Nr. 10).
9 pav. Vidutinio a/v emulsijų lašelių dydžio kitimas laikymo metu
Siekiant nustatyti linų sėmenų aliejaus reikalingą HLB skaičių a/v emulsijoms, taip pat buvo analizuojamas ir kitas ne mažiau svarbus emulsijų stabilumo parametras - procentinis vidutinio lašelio dydžio pokytis. Kuo jis mažesnis, tuo emulsija tiriamuoju laikotarpiu išlieka stabilesnė. Visose a/v emulsijose buvo užfiksuotas statistiškai reikšmingas (p<0,05) emulsinių lašelių padidėjimas (9 pav.). Ištyrus, kad didžiausi emulsiniai lašeliai susidarė emulsijoje Nr. 7 ir Nr. 8, procentinio vidutinio lašelio dydžio pokyčio nustatymas patvirtina gautus rezultatus ir parodo, kad šiose emulsijose užfiksuotas ir didžiausias emulsinių lašelių dydžio augimas 14 dienų laikotarpyje: 28,46 proc. emulsijoje Nr. 7 ir 38,09 proc. emulsijoje Nr. 8 (10 pav.). Šiek tiek mažesnis emulsinių lašelių padidėjimas (18,33 proc.)
5.87 5.46 4.2 3.66 4.97 7.54 7.3 4.97 3.96 6.22 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Nr. 7 (10,72) Nr. 8 (11,79) Nr. 9 (12,86) Nr. 10 (13,93) Nr. 11 (15,0) V id utin is la še li ų dy dis ( d4,3 µm ) Emulsijos Nr. ir HLB Po 24val. Po 14d.
buvo užfiksuotas emulsijoje Nr. 9, tačiau tiek vertinant vidutinį lašelių dydį, tiek jų didėjimą (8,19 proc.) 14 dienų laikotarpyje, stabiliausia yra laikoma emulsija Nr. 10.
10 pav. Procentinis vidutinio a/v emulsijų lašelių dydžio padidėjimas 14 dienų laikotarpyje
Taip pat buvo vertinamas ir savitasis Nr. 7 - 11 a/v emulsijų paviršiaus plotas, kuris yra apibrėžiamas kaip suminis dalelių paviršiaus plotas, padalintas iš suminės dalelių masės. Svarbu yra paminėti tai, jog pagal emulsinių lašelių dydžio bei pasiskirstymo tyrimo metodą, šie skaičiai (7 lentelė) yra gaunami laikant, jog visos dalelės yra rutulio formos ir nėra akytos [43].
7 lentelė. Savitasis a/v emulsijų paviršiaus plotas, m2/kg Emulsijos eilės Nr. Po 24 val. Po 14 d. 7 3017 2007 8 3215 2111 9 5901 5032 10 6729 6013 11 4901 3930
Atlikus matavimus galima pastebėti, jog po 14 dienų visų a/v emulsijų savitasis paviršiaus plotas statistiškai reikšmingai (p<0,05) sumažėjo. Mažiausias savitasis paviršiaus plotas užfiksuotas emulsijoje Nr. 7 ir Nr. 8, o tai reiškia, kad jose emulsiniai lašeliai yra didžiausi ir emulsijos yra mažiausiai stabilios [34]. Vertinant pagamintų a/v emulsijų savitąjį paviršiaus plotą galima teigti, jog
28.45 38.09 18.33 8.19 25.15 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Nr. 7 (10,72) Nr. 8 (11,79) Nr. 9 (12,86) Nr. 10 (13,93) Nr. 11 (15,0) Vidu tini o a/v em uls ij ų la šelių dy džio pa did ėj im as po 1 4 dien ų, pro c. Emulsijos eilės Nr. ir HLB
šiek tiek stabilesnės yra emulsijos Nr. 9 ir Nr. 11, tačiau didžiausiu savituoju paviršiaus plotu tiek po 24 val., tiek po 14 dienų pasižymėjo emulsija Nr. 10 (7 lentelė).
Apibendrinus šiuos ir prieš tai atlikto emulsinių lašelių vidutinio dydžio nustatymo bei procentinio vidutinio lašelio dydžio pokyčio tyrimo rezultatus, nustatyta, kad emulsijoje Nr. 10, kurios HLB 13,93, susiformavus mažiausiems emulsiniams lašeliams, savitasis emulsijos paviršiaus plotas yra didžiausias, todėl ji yra laikoma stabiliausia a/v emulsija.
Atlikus Nr. 1 - 6 v/a emulsijų lašelių dydžių matavimus, buvo stebimas jų pokytis laikant emulsijas natūralių sąlygų temperatūroje 14 dienų. Mėginiai taip pat buvo imami 2 kartus: praėjus 24 val. ir 14 d. nuo emulsijų pagaminimo ir stebimi emulsinių lašelių dydžio, pasiskirstymo bei savitojo v/a emulsijų paviršiaus ploto pokyčiai.
Išmatavus v/a emulsijų vidutinius lašelių dydžius buvo nustatyta, jog visose emulsijose, išskyrus emulsiją Nr. 4, 14 d. laikotarpyje nustatyti statistiškai nereikšmingi (p>0,05) vidutinio emulsinių lašelio dydžio pokyčiai (11 pav.). Tačiau atsižvelgiant į emulsinių lašelių dydžius, tiek po 24 val., tiek po 14 d., ženkliai mažesni lašelių dydžiai (p<0,05), lyginant su kitomis a/v emulsijomis, stebimi emulsijoje Nr. 2 (1,45 µm ir 1,54 µm) ir emulsijoje Nr. 6 ( 1,34 µm ir 1,4 µm) (11 pav.).
11 pav. Vidutinio v/a emulsijų lašelių dydžio kitimas laikymo metu
Siekiant patikslinti gautus rezultatus, Nr. 1 – 6 v/a emulsijos buvo gaminamos iš naujo, kaip ir ankstesnių tyrimų metu, sumažinus emulsiklių kiekį. Buvo nuspręsta pasirinkti 5 proc. emulsiklių mišinio kiekį nuo aliejinės fazės. Emulsinių lašelių dydis buvo matuojamas praėjus 24 val. ir 14 d. nuo pagaminimo. Emulsija Nr. 6 ženkliai išsiskyrė – jos vidutinis dalelių dydis (2,57 µm) buvo apie 50 kartų mažesnis (p = 0,0001) negu emulsijos Nr. 2 (136 µm), kuri pagaminus Nr. 1 – 6 emulsijas v/a su 20 proc. emulsiklių mišinio (11 pav.), buvo priskirta mažiausią lašelių dydį turinčioms emulsijoms.
129.85 1.45 125.77 122.04 120.98 1.34 131.27 1.54 126.67 129.53 122.33 1.4 0 20 40 60 80 100 120 140 Nr. 1 (4,3) Nr. 2 (5,37) Nr. 3 (6,44) Nr. 4 (7,51) Nr. 5 (8,58) Nr. 6 (9,56) V id utin is la še li ų dy dis ( d4,3 µm ) Emulsijos eilės Nr. ir HLB Po 24 val. Po 14 d.
