MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
GEDIMINAS STASIUKEVIČIUS
APYNINIŲ LIUCERNŲ (Medicago lupulina L.) FENOLINIŲ
JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
doc. dr. Raimondas Benetis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
APYNINIŲ LIUCERNŲ (Medicago lupulina L.) FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Darbą atliko
doc. dr. Raimondas Benetis Magistrantas
Gediminas Stasiukevičius
Recenzentas
Turinys
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 7
2. ĮVADAS ... 8
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
4.1. Oksidacinis stresas ... 10
4.1.1. Laisvieji radikalai ir jų susidarymas organizme ... 11
4.1.2. Oksidacinio streso poveikis organizmui ... 11
4.2. Natūralūs antioksidantai ir jų panaudojimas ... 13
4.3. Fenoliniai junginiai ... 13
4.3.1. Fenolinių junginių bendroji charakteristika ... 13
4.3.2. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės ... 15
4.4. Medicago lupulina L. bendroji charakteristika ... 17
4.5. Medicago lupulina L. panaudojimas medicinoje ... 20
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22
5.1. Tyrimų objektas ... 22
5.2. Medžiagos ir reagentai ... 23
5.3. Naudota aparatūra ... 23
5.4. Tyrimų metodai ... 23
5.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 23
5.4.2. Reagentų paruošimas ... 24
5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 26
5.4.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu ... 27
5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu ... 28
5.4.7. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe2+ jonų surišimo metodu ... 29
5.5. Duomenų analizė ... 30
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 31
6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas ... 32
6.1.3. Temperatūros parinkimas ekstrahuojant ultragarsu ... 34
6.2. Fenolinių junginių ir flavonoidų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 35
6.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas M. lupulina augalinėse žaliavose ... 35
6.2.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas M. lupulina augalinėse žaliavose ... 37
6.3. M. lupulina augalinių žaliavų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 38
6.3.1. M. lupulina augalinių žaliavų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH surišimo metodu ... 39
6.3.2. M. lupulina augalinių žaliavų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu 40 6.3.3. M. lupulina augalinių žaliavų ekstraktų chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo metodu ... 41
6.4. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp suminio fenolinių junginių, flavonoidų kiekių ir antioksidacinio aktyvumo ... 42
7. IŠVADOS ... 44
SANTRAUKA
Gedimino Stasiukevičiaus magistro baigiamasis darbas. Darbo mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas. Apyninių liucernų (Medicago lupulina L.) fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.
Tikslas: ištirti Lietuvoje kultivuojamų apyninių liucernų (Medicago lupulina L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinę sudėtį ir antioksidacinį aktyvumą.
Uždaviniai: 1. Parinkti optimaliausias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš apyninių liucernų (M. lupulina) žaliavų. 2. Spektrofotometriniu metodu ištirti kiekybinę fenolinių junginių ir flavonoidų sudėtį apyninių liucernų (M. lupulina) žaliavose. 3. Nustatyti apyninių liucernų (M. lupulina) žaliavų ekstraktuose esančių bioaktyvių junginių antiradikalinį aktyvumą DPPH, ABTS metodais. 4. Nustatyti apyninių liucernų (M. lupulina) žaliavų ekstraktuose esančių bioaktyvių junginių chelatinį aktyvumą FIC metodu.
Tyrimo metodika: Šiame tyrime buvo naudojamos 2 auginimo metų apyninių liucernų (Medicago
lupulina L.) žaliavos. Ekstrakcija buvo atliekama ultragarso vonelėje, siekiant našesnės ekstrakcijos,
ekstrahentu buvo naudotas 70% (V/V) etanolis. Ekstrakcija buvo vykdoma 15 minučių, palaikant 50˚C temperatūrą. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti panaudotas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu (F-C) metodas. Gauti rezultatai buvo išreiškiami galo rūgšties ekvivalentu (mg/g). Bendro flavonoidų kiekio nustatymui buvo atliekama reakcija su AlCl3, o gauti rezultatai išreiškiami rutino ekvivalentu (mg/g). Buvo
panaudoti spektrofotometriniai DPPH ir ABTS metodai, norint nustatyti ekstraktų antiradikalinį aktyvumą, o taip pat FIC metodas, chelatinio aktyvumo įvertinimui.
Rezultatai ir išvados: Nustatyta, kad M. lupulina augalinėse žaliavose sukaupiami fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai įvairavo plačiose ribose. M. lupulina žaliavoms būdingas bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinių sudėčių morfologinis kintamumas. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis sukaupiamas žiedų žaliavose (15,337 ± 0,141 mg/g), o mažiausias - stiebuose (2,724 ± 0,124 mg/g). Tiriant flavonoidų kiekį augaluose, didžiausias kiekis nustatytas žiedų žaliavose (31,787 ± 0,700 mg/g), o mažiausias stiebuose (1,062 ± 0,477 mg/g). Įvertinus antiradikalines M. lupulina žaliavų ekstraktų savybes, nustatyta, kad jiems charakteringas ženklus aktyvumas abiejose modelinėse sistemose: DPPH (1,21 - 27,95%) ir ABTS (TE 1,048 - 10,837 µmol/g). Nustatyta, kad etanoliniai M. lupulina žaliavų ekstraktai pasižymi ženkliu gebėjimu chelatuoti dvivalentės geležies jonus (32,44 - 59,69%). Statistinė M. lupulina ekstraktų analizė atskleidė, kad bendri fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai stipriai koreliuoja (0,901, p<0,05). Pastebėta, kad didėjant fenolinių junginių kiekiui žaliavose, didėja ir jų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas.
SUMMARY
The supervisor of the final master‘s research prepared by Gediminas Stasiukevičius is assoc. Prof. PhD. Raimondas Benetis.
Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry.- Kaunas. The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of Black medic (Medicago lupulina L.).
The aim: to determine the quantitative composition and antioxidant capacity of phenolic compounds and flavonoids in M. lupulina, which were cultivated in Lithuania.
The objectives of the study: 1) set the optimization conditions in M. lupulina extraction. 2) explore quantitative composition and their variation of phenolic compounds and flavonoids in M. lupulina using spectrophotometric methods. 3) to assess the antiradical activity of biologically active substances in Black medic raw materials using DPPH, ABTS methods. 4) to assess the chelating activity of biologically active substances in Black medic raw materials using FIC method.
Research methodology: the reasearch was carried out using different parts of plants morphological. Extraction was done in ultrasonic agitation, using extractant of 70% (V/V) ethanol. Extraction time was 15 minutes in 50oC temperature. Folin-Ciocalteu method was used to determine the content of phenolic compounds and results were expressed as gallic acid equivalent (mg/g). For determination of the total content of flavonoids specific reaction with AlCl3 was used and then the results were expressed as rutin equivalents (mg/g). Three
spectrophotometric assays: DPPH, ABTS and FIC, were applied to evaluate antioxidant activity of extracts. Results and conclusion: this study had shown that M.lupulina plants accrue significant quantities of total phenolic acids and flavonoids in a wide range. Also the variation of biologically active substances were estimated, which depends on plant morphological part. The highest quantity of phenolic compounds was identified in M. lupulina flowers (15,337 ± 0,141 mg/g), while the lowest was in extract of stems (2,724 ± 0,124 mg/g). The highest amount in the research of flavonoids was also in the extracts of flowers (31,787 ± 0,700 mg/g) and the lowest in stems (1,062 ± 0,477 mg/g). The research showed that extracts from Black medic plants possessed antiradical activity in both modular systems: DPPH (1,21 - 27,95%) and ABTS (TE 1,048 - 10,837 µmol/g) by method. Chelating activity of M. lupulina extracts ranged from 32,44 -to59,69%),. In summary, the best antioxidant capacity of M. lupulina has the raw of flowers, because they accumulate more phenolic acids and flavonoids than other parts of plants.
1. SANTRUMPOS
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
BAM Biologiškai aktyvios medžiagos
F-C Folin-Ciocalteu analizės metodas
FIC geležies (II) jonų surišimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay)
ABTS 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalas
SOD superoksido dismutazė
CAT katalazė
GPx glutationo peroksidazė
GRx glutationo reduktazė
ALT alaninaminotransferazė
ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species)
DNR deoksiribonukleorūgštis
RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species)
NO azoto oksidas
TE trolokso ekvivalentas
2. ĮVADAS
Šių laikų medicina tobulėja sparčiau nei anksčiau, todėl apie esamas ligas surenkama ženkliai daugiau informacijos nei turėta anksčiau. Kai kurių ligų atsiradimas yra siejamas su laisvųjų radikalų ir metalų jonų poveikiu ląstelėms. Kuo labiau nukrypstama nuo pusiausvyros, tuo ląstelės yra stipriau pažeidžiamos, sukeliami DNR grandinės ir fermentinės sistemos pokyčiai ar net ląstelės apoptozė. Laisvieji radikalai nuolat susidaro ir žmogaus organizme vykstant metaboliniams procesams. Laisvieji radikalai, reaktyvios deguonies ar azoto rūšys, tai pagrindinės formos, kurios kenkia ląstelėms.[2]
Ieškant racionalių, pagrįstų įrodymais, gydymo būdų yra kuriami įvairūs cheminiai vaistai. Tačiau visuomenėje vyrauja nuomonė, kad natūralūs vaistai ir tradicinė medicina taip pat geba apsaugoti nuo ligų. Todėl plačiai tyrinėjami įvairūs augalai, kurie gali būti panaudoti medicinos praktikoje ir kurių gydomosios savybės žmonijai žinomos jau daugybę metų.
Taip pat buvo stebima kaip augalinės žaliavos turi būti paruošiamos, norint gauti saugų, efektyvų ir kokybišką augalinį vaistą. Per pastarąjį dešimtmetį augalų analizavimas itin pradėjo populiarėti.[49] Jų pagalba nustatyti chemostatiniai mechanizmai, dėl kurių augalai apsisaugo nuo žalingos aplinkos poveikio. Augalai biosintetina medžiagas, kurios geba apsaugoti ląsteles, chelatuoti metalų jonus.[20] Per daugybę metų augalai sugebėjo išvystyti savo fermentinę sistemą taip, kad gali apsisaugoti nuo aplinkos poveikio, galinčio pakenkti augimui ir tolimesniam dauginimuisi.[10] Tai viena iš dinaminių pusiausvyrų augaluose, dėl ko nesivysto oksidacinis stresas. Todėl buvo atliekami moksliniai tyrimai, norint išsiaiškinti kokių junginių pagalba augalai gali apsisaugoti. Tai gi atliekant augalų ir atskirų jų morfologinių dalių ekstrakcijas, buvo nustatyti junginiai kaip fenolinės rūgštys ir flavonoidai. Vėliau tiriant šiuos junginius buvo pastebėtas galimas poveikis žmogaus organizmui dėl gebėjimo surišti laivuosiuos radikalus ir veikti kaip antioksidantas, apsaugodamas ląsteles. [20]
Atkreipiant dėmesį į temos globalumą yra tikslinga ištirti mažiau žinomus augalus Lietuvoje. Todėl buvo pasirinkta apyninių liucernų augalinė žaliava, norint gauti daugiau ir išsamesnių duomenų apie šios rūšies augalinių žaliavų kokybinius rodiklius, kadangi iki šiol Lietuvoje šia tema nebuvo atliktų išsamių tyrimų.
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje kultivuojamų apyninių liucernų (Medicago lupulina L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinę sudėtį ir antioksidacinį aktyvumą.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje kultivuojamų apyninių liucernų (Medicago lupulina L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinę sudėtį ir antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimaliausias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš M. lupulina žaliavų.
2. Spektrofotometriniu metodu ištirti kiekybinę fenolinių junginių ir flavonoidų sudėtį M. lupulina žaliavose.
3. Nustatyti M. lupulina žaliavų ekstraktuose esančių bioaktyvių junginių antiradikalinį aktyvumą DPPH, ABTS metodais.
4. Nustatyti M. lupulina žaliavų ekstraktuose esančių bioaktyvių junginių chelatinį aktyvumą FIC metodu.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Oksidacinis stresas
Ši sąvoka apibūdinama kaip poveikis organizmui, kuomet atsiranda oksidacinis ląstelių pažeidimas dėl disbalanso tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų pusiausvyros. Jeigu laisvųjų radikalų kiekis organizme pasidaro per didelis, o žmogaus organizmas jau būna nepajėgus susitvarkyti, yra pažeidžiamos ląstelės arba tam tikra jų dalis. Kuomet ląstelės yra paveikiamos laisvųjų radikalų, kinta lipidų, baltymų ar nukleino rūgščių molekulių struktūros.[2] Žvelgiant iš cheminės pusės, oksidacinį stresą gali sukelti tik molekulės ar atomai, įskaitant ir deguonį, galintys prisijungti elektronus t.y. būti oksidatoriumi arba oksiduojančia medžiaga. Tačiau turi būti pusiausvyra. Jeigu organizme bus per daug antioksidantų, ląstelės taip pat gali būti pažeidžiamos ir dėl redukcinio streso.[1]
[1]
1 pav. Pusiausvyra tarp oksidacinio ir redukcinio streso.
Sukelti trumpalaikiai oksidaciniai stresai gali paveikti audinius, kuomet atsiranda traumos, infekcijos, terminiai pažeidimai, apnuodijamas organizmas kokiais nors toksinais ar atliekami intensyvūs pratimai.[2]
Pažeistuose audiniuose kinta radikalus sudarančių fermentų ekspresija ir kiekis. Tokie fermentai kaip ksantino oksidazė ar lipogenazė yra aktyvinami, ko pasekoje yra paveikiami fagocitai, atpalaiduojami geležies ar vario jonai, sutrikdoma elektronų pernašos sistema oksidacinio fosforilinimo metu, dėl ko daugėja aktyviųjų deguonies junginių (ROS). Tuo iš dalies pagrįstas ir vėžinių susirgimų išsivystymas, šalutiniai radiacijos ar chemoterapijos poveikiai, kuomet organizmas nebegali apsisaugoti nuo ROS. Oksidacinis stresas gali įtakoti ir diabeto, neurodegeneracinių ar kitų ligų atsiradimą. Šiuo
metu vyrauja tokia nuomonė, kad oksidacinis stresas svariai prisideda prie įvairių uždegiminių ligų (artrito, glomerulonefrito), išeminių ligų (insulto, žarnyno išemijos), įgyto imunodeficito sindromo, skrandžio opų, su rūkymu susijusių ligų išsivystymo. Taigi papildomai gaunant antioksidantų, galima apsaugoti ir iš dalies išvengti DNR pokyčių ar ląstelių apoptozės.[2]
4.1.1. Laisvieji radikalai ir jų susidarymas organizme
Laisvąjį radikalą galima apibūdinti kaip bet kokią molekulę ar atomą, kuri nepriklausomai gali egzistuoti, kuomet jos valentiniame sluoksnyje yra nesuporuotų elektronų. Dauguma radikalų yra nestabilūs ir labai reaktyvūs. Jie taip pat gali atiduoti arba prisijungti elektronus iš kitų molekulių, todėl gali būti kaip oksidatorius ir kaip reduktorius.[3] Dažniausiai radikalai, kurie sukelia ligas ir savo struktūroje turi deguonies yra: hidroksilo, superoksido anijono radikalai, vienvalentis deguonis, vandenilio peroksidas, hipochlorito rūgštis, azoto oksido ir peroksinitrito radikalai. Jos yra labai reaktyvios, todėl gali pažeisti ląstelės branduolį ir membranas, t.y. molekules, sudarančias įvairias struktūras. Laisvųjų radikalų taikiniai organizme yra įvairios molekulės (lipidai, nukleorūgštys, baltymai).[2,4] Organizme taip pat gali susidaryti laisvieji radikalai. Pagrindiniai šaltiniai tai: mitochondrijos, ksantino oksidazė, peroksisomos, ozonas, pramoniniai tirpikliai, narkotikai, cigarečių dūmai. [5]
Deguonies molekulė yra laisvasis radikalas, kuris turi du nesuporuotus elektronus ir panašų kvantinių sukinių skaičių. Šio sukinio sutrikdymas įtakoja tai, kad molekulė turi priimti elektronus, dėl ko ji būna aktyvi ir pažeidžia ląsteles. Tokios molekulės yra vadinamos aktyviaisiais deguonies junginiais. [6]
4.1.2. Oksidacinio streso poveikis organizmui
4.1.2.1. Vėžinės ligos įtakojamos oksidacinio streso
Oksidacinis stresas dalyvauja įvairaus pobūdžio vėžinių pakitimų atsiradimo ir progresavimo procesuose. Taip yra dėl to, kad endogeniniai ir egzogeniniai dirgikliai oksiduodami stimuliuoja pokyčius organizme ląsteliniame ir molekuliniame lygmenyse. Įvyksta mutacija, ko pasekoje prasideda
pakitęs ląstelių dalijimąsis. Oksidaciniai DNR pažeidimai sąlygoja azotinės bazės ir cukrinės dalies, baltymų jungimosi pakitimus. Pavyzdžiui tabako dūmai sukelia oksidacinį DNR pažeidimą, ko pasekoje išsivysto plaučių vėžys. [7]
4.1.2.2. Širdies ir kraujagyslių ligos įtakojamos oksidacinio streso
Nustatyta, kad oksidacinis stresas taip pat turi įtakos širdies ir kraujagyslių ligų atsiradimui. Žinoma, kad jų išsivystymą lemia daugybė faktorių: hipercholesterolemija, hipertenzija, rūkymas, diabetas ir kt. Atlikti in vivo ir ex vivo tyrimai atskleidė, jog oksidacinis stresas ženkliai prisideda prie aterosklerozės, išemijos, kardiomiopatijos, širdies hipertrofijos. [7]
4.1.2.3. Neurologinių ligų atsiradimas dėl oksidacinio streso
Oksidacinės pažaidos taip pat turi įtakos tokių neurologinių ligų, kaip Alzheimerio, Parkinsono, išsėtinės sklerozės, amiotrofinės lateralinės sklerozės ar depresijos atsiradimui ir vystymuisi. Šiuo metu atlikta nemažai tyrimų kurie nustatė, jog oksidacija pažeidžia neuronus ir sąlygoja jų degeneraciją, dėl ko didėja demencija. Tipiškas pavyzdys yra Alzheimerio liga, kurios svarbiausias patogenezės mechanizmas yra susijęs su β-amiloido baltymais, kurie veikdami oksiduojančiai ir sukelia neurodegeneracinius procesus. [7]
4.1.2.4. Reumatoidinis artritas įtakotas oksidacinio streso
Reumatoidinis artritas yra autoimuninė liga, kurios metu lėtinis uždegimas pažeidžia sąnarius ir audinius aplink jį su makrofagais ir aktyvuotomis T ląstelėmis. Uždegimo vietoje kaupiasi ROS ir RNS dėl ko didėja uždegimo plotas. Uždegimo plotas didėja, nes esantis azoto oksidas (NO) didina kraujagyslių spindį. Tai buvo įrodyta, lyginant su kontroliniais mėginiais, kuomet buvo pastebėtas izoprostanų ir prostaglandinų kiekių ženklus padidėjimas kraujo serume ir sinoviniame sąnarių skystyje. [7,8]
4.2. Natūralūs antioksidantai ir jų panaudojimas
Antioksidantais gali būti apibūdinamos tokios medžiagos, kurių mažos koncentracijos, palyginus su oksiduojančiomis medžiagomis, padeda sumažinti ar išvengti oksidacinės pažaidos. Antioksidantai gali būti suskirstomi į dvi grupes: fermentinius ir nefermentinius antioksidantus. Pagrindiniai antioksidantai: superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT), glutationo peroksidazė (GPx) ir glutationo reduktazė (GRx) yra įtraukiami į ROS ir RNS neutralizavimą. SOD yra vienas iš pagrindinių laisvuosius radikalus neutralizuojančių fermentų . Jis veikia katalizuodamas superoksido anijono radikalus (O2·-) į vandenilio peroksidą. Tuomet CAT arba GPx vandenilio peroksidą suskaido į
vandenį ir deguonį.[7,9]
Nefermentiniai antioksidantai gali būti skirstomi į metabolinius ir maistingus antioksidantus. Metaboliniai antioksidantai yra endogeniniai ir susidaro metabolizmo metu, tai būtų lipoinė rūgštis, glutationas, L-argininas, kofermentas Q-10, melatoninas, šlapalas, metalus chelatuojantys baltymai.[7] Įvairūs augalai dėl konkurencijos ir aplinkos, laisvųjų radikalų, ROS ir prooksidantų gamybos poveikio, išvystė tokią sistemą, kuri geba neutralizuoti junginius, galinčius pakenkti augimui ir vystymuisi.[10]
Maistas taip pat užima svarbų vaidmenį antioksidacinės gynybos sistemoje. Vartojant skirtingą maistą, kinta žmogaus organizmo ląstelių membranose esančių lipoproteinų riebalų rūgščių sudėtis. Vartojančių mėsos produktus asmenų membranose nustatoma daugiau arachidono rūgšties, vartojančių daugiau žuvies produktų- eikozapentaeno ir dokozaheksaeno rūgščių. Tuo tarpu vegetariškas maistas išsiskiria ženkliai mažesniu riebalų kiekiu. Tai iš dalies paaiškina mitybos svarbą siekiant sumažinti sergamumą įvairiomis širdies ir kraujagyslių ligomis. Maistingų antioksidantų žmogaus organizmas pasigaminti negali. Šie antioksidantai: vitaminai C ir E, karotenoidai, selenas, flavonoidai. Organizmui yra reikalingas kuo platesnis antioksidantų racionas, todėl šie komponentai turi būti gaunami iš maisto produktų arba papildų, nes skirtingose organizmo sistemose, kiekvienas antioksidantas veikia skirtingu stiprumu.[7,11]
4.3. Fenoliniai junginiai
4.3.1. Fenolinių junginių bendroji charakteristika
Augaluose yra sukaupiamas įvairus kiekis naturalių fenolinių junginių, ir jis varijuoja priklausomai nuo ekologinio plastiškumo. Fenoliniai junginiai, kurie sintezuojami augaluose gali būti:
fenolinės rūgštys, taninai, flavonodai, chinonai, lignanai ir daugelis kitų. Šie junginiai sudaryti iš vieno ar daugiau aromatinių žiedų, kurie gali turėti hidroksilo pakaitą. Priklausomai nuo žiedų ir hidroksigrupių skaičiaus fenoliniai junginiai ir yra skirstomi į įvairias grupes.[12]
Fenolinės rūgštys ir jų analogai yra vieni labiausiai paplitusių fenolinių junginių augaluose. Pagrindinės fenolinės rūgštys yra nurodytos (2 pav). Šie junginiai augaluose dažnai sutinkami esterių ar amidų konjugatų pavidalu, rečiau laisva forma. Šių pagrindinių radikalų ar karboksi grupės pakitimai molekulėse sudaro įvairias fenolines rūgštis, pvz.: rozmarino rūgštis ar kapsaicinas.[13,15]
[15]
2 pav. Pagrindinės fenolinės rūgštys
Flavonoidai sudaro didelę dalį fenolinių junginių. Jų skeletinė struktūra sudaryta iš difenilpropano su galimai skirtingai oksiduojamu centriniu pirano žiedu(3 pav.). [14] Atsižvelgiant į šių junginių įsotinimą ir pakaitų prijungimą pirano žiede galima suskirstyti flavonoidus į:
1. Flavonus- B žiedas jungiasi prie C2 atomo, 2. Flavonolius- hidroksilo pakaitų jungias prie C3, 3. Flavanonai- tarp C2- C3 yra soti jungtis,
4. Flavanonoliai- prie C3 flavanone prijungtas hidroksilo pakaitas, 5. Flavanoliai- prie C4 neturi keto grupės,
6. Antocianai- yra pirano žiedas, o C1-C2 ir C3-C4 yra nesočios jungtys, 7. Chalkonai- C žiedas yra atviras,
8. Izoflavonoidai- B žiedas prijungiamas prie C3, 9. Neoflavonoidai- prijungiamas B žiedas prie C4
10. Biflavonoidai- tai flavonų, flavonolių ir flavanonų dimerai.
Flavonoidai gamtoje sutinkami laisva aglikono forma. Taip pat gali būti su viena ar keleta prijungtų cukrinių dalių. Su cukrine dalimi jie gali būti sujungti su hidroksi grupe ir sudaryti O- glikozidus arba su anglies atomu ir būti C- glikozidais. [14,15]
3 pav. Struktūrinė flavonoidų formulė [16]
Taninai, tai dar vieni fenoliniai junginiai, kurie yra tirpūs vandenyje, o jų molekulinė masė gali svyruoti 500-4000. Dažniausiai taninai klasifikuojami į kondensuotuosius raugus ir hidroraugus. Hidroraugai sudaryti iš polihidroksilio alkoholio, kurio hidroksilo grupės esterifikuotos su galo arba heksahidroksi-difenoline rūgštimis. Kondensuoti taninai struktūriškai yra sudėtingesnės struktūros junginiai ir labiau pasiskirstę po augalo morfologines dalis. Pagrinde jie yra flavan-3-olių oligomerai ir polimerai.[14,15]
Stilbenai yra fenoliniai junginiai, sudaryti iš dviejų aromatinių žiedų sujungtų etileno tilteliu. Jie sutinkami aukštesniuose augaluose ir gali egzistuoti monomerų, dimerų, trimerų, polimerų ar oligomerų forma arba būti glikozilinti.
Kurkuminoidai yra ferulo rūgšties junginiai. Jie yra sudaryti iš dviejų ferulinės rūgšties molekulių sujungtų metileno tilteliu.[14] Šie junginiai būna geltonos spalvos ir naudojami kaip pigmentas maisto, kosmetikos ir farmacijos pramonėje. Pastarojoje kurkuminoidai dėl savo farmakologinių savybių yra naudojami vėžio prevencijoje, ŽIV ir cistinės fibrozės gydyme, bei kaip imunitetą reguliuojanti medžiaga.[17]
Kumarinai yra laktonai, susidarantys ciklizuojantis cis-O-hidroksicinamo rūgščiai, tai benzopirono darinys. Lignanai taip pat biosintetinami iš to paties junginio, tik šiuo atveju susidaro
dimerai. Abiejų tipų junginiai augaluose randami laisva arba glikozidų formomis.[18] Chinonai yra
skirstomi į 4 grupes: antrachinonai, fenantrachinonai, naftochinonai ir benzochinonai. Tai junginiai gaunami augaluose iš benzeno ar naftaleno. [14]
4.3.2. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės
Fenoliniai junginiai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, nes geba trumpam inhibuoti ar padėti išvengti oksidacinių procesų surišdami laisvuosius radikalus, atiduoti vandenilio atomus ar
elektronus, chelatuoti metalo katijonus, ko pasekoje sumažėja oksidacinio streso pasireiškimo tikimybė.[19] Oksidacinis stresas tai disbalansas tarp susidariusių ROS ar RNS, bei endogeninio antioksidacinio atsako, dėl ko prasideda biomakromolekulių, tokių kaip fermentų, baltymų, DNR ar lipidų oksidacija. Atliekant in vitro tyrimus paaiškėjo, kad fenoliniai junginiai pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu nei vitaminai C, E ar karotenoidai.[21] Fenolinių rūgščių aktyvumą lemia hidroksigrupių kiekis ir pozicija, karboksigrupės atžvilgiu, pvz.: monohidroksi benzoinė rūgštis, kuri turi hidroksilo pakaitą yra aktyvi tik meta padėtyje, o tuo tarpu ortho ir para padėtyse molekulė netenka aktyvumo. Tuo tarpu hidroksicinamono rūgštis pasižymi stipresniu aktyvumu nei prieš tai minimas junginys, dėl struktūroje esančios –CH=CH–COOH grupės., Pastaroji pasižymi stipresnėmis donorinėmis ir susidariusius radikalus stabilizuojančiomis savybėmis nei karboksilo grupė. [19]
Apibūdinti flavonoidų antioksidacines savybes atsižvelgiant į jų struktūrą yra sudėtingiau. Jie gali padėti išvengti žalos, kurią padaro laisvieji radikalai juos surišdami, aktyvuodami antioksidacinę fermentinę sistemą, chelatuodami metalų jonus, redukuodami α- tokoferolio radikalus, slopindami oksidazes, sušvelnindami oksidacinį stresą sukeltą azoto oksido, didindami šlapimo rūgšties kiekį, didindami antioksidacines savybes mažos molekulinės masės antioksidantais. Sąveikaujant laisviems radikalams su flavonoidais yra atiduodamas vandenilio atomas, kurio metu radikalai tampa neaktyvūs (4 pav.).[20]
[20]
4 pav. ROS inhibavimas flavonoidu.
Svarbu pastebėti, kad fenoliniai junginiai taip pat gali veikti ir kaip prooksidantai. Veikdami kaip antioksidantai, fenoliniai junginiai gali pradėti autooksidacijos procesus. Vietoj to, kad būtų nutraukta laisvojo radikalo grandininė reakcija, fenoksilo radikalas gali reaguoti su deguonimi ir sudaryti superoksido anijoną.
Metalų jonai taip pat gali inicijuoti fenolinių junginių prooksidacinį aktyvumą:
Nustatyta, kad didėjant pH, metalų katijonų ar deguonies junginių koncentracijai, taip pat didėja ir tikimybė, kad gali prasidėti atooksidaciniai procesai. Mažus fenolinius junginius yra lengviau oksiduoti, todėl tokie junginiai kaip kvercetinas ar galo rūgštis įgauna prooksidantinį aktyvumą. Tuo tarpu didelės molekulinės masės fenoliniai junginiai, pvz.: taniniai, gali turėti mažą ar iš viso neturėti jokio prooksidantinio aktyvumo.[21]
4.4. Medicago lupulina L. bendroji charakteristika
Liucernų (Medicago L.) gentis priklauso ankštinių arba dar vadinamų pupinių (Leguminosae L. arba Fabaceae L.) šeimai. Šią gentį sudaro apie 87 augalų rūšys, kuriose yra žolinių augalų ir krūmų, paplitusių nuo Viduržemio jūros iki centrinės Azijos. Tai plačiai kultivuojami pašariniai augalai ir piktžolės.[22] Lietuvoje natūraliai auga 3 rūšys: geltonžiedė liucerna (Medicago falcata L.), apyninė liucerna (Medicago lupulina L.) ir mėlynžiedė liucerna (Medicago sativa L.). Šios genties atstovai yra daugiamečiai ar vienamečiai augalai, turintys po tris lapus. Daugumos šios genties augalų rūšių žiedai maži, geltoni ir sutelkti galviškose kekėse.
Dėl didelio ekologinio plastiškumo galima daryti prielaidą, kad šios genties augalai skiriasi savo cheminės sudėties rodmenimis, mase, augimo ir brendimo greičiu, o taip pat, kas yra svarbu, atsparumu nepalankioms klimatinėms sąlygoms. todėl tikslinga įvertinti ir palyginti apyninės liucernos (Medicago lupulina L.) augalų, augintų skirtingose agroklimatinėse sąlygose fitocheminės sudėties ir bioaktyvumo rodiklius. Taip pat šios genties augalai dėl ilgaamžiškumo ir kokybės (greito augimo, didelės biomasės ir baltymų) yra naudojami kaip žolinis pašaras gyvūliams.[23]
M. lupulina (apyninė liucerna) yra vienametis ar kelis metus išyvenantis augalas. Jo žiedynai
ant ilgų kotelių. Žiedai yra sudaryti iš 5 žiedlapių. [24,25] Vaisiai juodi, smailūs ir truputį sulenkti. Stiebai dažniausiai būna briaunuoti iš keturių kampų, plaukuoti ir yra 15-30 cm ilgio, o kartais siekia virš 61 cm ilgio, priklausomai nuo aplinkos sąlygų. Lapai sudaryti iš trijų mažų lapelių, kurių ilgis 6-31 mm ilgio, ovalūs, dantytais kraštais(5 pav.). Šį augalą galima lengvai supainioti su dobilų arba barkūnų rūšies augalais. Juos atskirti galima dėl jų ilgesnio lapkočio prie centrinio lapelio nei prie šoninių, o taip pat dėl lapelių dantytumo skirtumų. Nuo kitų Lietuvoje augančių šios genties augalų atskiriama tuo, kad
M. lupulina turi mažesnio skersmens žiedus, o vaisiai ne taip stipriai išlenkti kaip M. sativa (geltonžiedė
liucerna).[24] Augalai dažniausiai paplitę sausose pievose ir ganyklose, pakelėse, dirvonuose, pylimų šlaituose, nerūgščiuose, karbonatiniuose dirvožemiuose. Kaip ir jau minėta anksčiau apie liucernų gentį šios rūšies augalai taip pat yra pašariniai, kurie savo verte prilygsta raudoniesiems dobilams, nes gerai pakelia ganymą. Šis augalas atsparus šalčiams ir sausroms. Iš jo buvo išvesta „Arka DS“ veislė individinės atrankos metodu iš laukinio ekotipo rasto laukymėje Juodkrantėje. Šios veislės augalas užauga iki 110 cm, gerai žiemoja ir atželia po nupjovimo. Šią veislę sukūrė J. Bilis, G. Dabkevičienė ir B. Basiulienė.[23]
[26]
5 pav. Medicago lupulina L. (a-visa augalo dalis, b- lapai iš viršaus, c-lapai iš apačios, d-žiedo dalis.)
Šie augalai vidutiniškai žydi nuo balandžio iki rugpjūčio mėnesio. Sėklos yra sunokinamos nuo liepos iki rugsėjo mėnesio.
Pasak daktaro James Duke M. lupulina lapų žaliava yra labai turtinga proteinais. 90-yje g šios augalinės žaliavos atlikus tyrimus nustatyta, kad vidutiniškai joje yra 23,3 g proteinų, 3,3 g skaidulinių medžiagų ir 10,3 g pelenų. Taip pat randama 1330 mg kalcio, 300 mg fosforo, 450 mg magnio ir 2280
mg kalio. [27] Tai galima daryti išvadą apie fitoestrogenų kaupimą M. lupulina augalinėje žaliavoje. Fitoestrogenai yra naudojami medicinoje kaip estrogenų pakaitinė terapija. Ji naudinga moterims menopauzės metu. Terapija sumažina menopauzės simptomus ir taip pat apsaugo nuo tolimesnių besivystančių ligų, tokių kaip osteoporozė.[47]
1987-1988 metais buvo atliktas tyrimas norint išskirti ir identifikuoti flavonoidus, esančius M.
lupulina žiedų žaliavose. Tyrimui atlikti buvo naudojamas plonasluoksnės chromatografijos metodas.
Adsorbentais buvo panaudota: celiulioze, silikageliu ir poliamidu dengtos plokšelės. Tirpiklių sistemos buvo pasirinktos: S1 n- butanolio- acto rūgšties- vandens (4:1:5) organinė fazė, S2 15% acto rūgštis, S3
izo butanolio- piridino- acto rūgšties- vandens (12:8:4:3), S4 izo butanolio- piridino- acto rūgšties-
vandens (12:3:4:3), S5 chloroformo- acto rūgšties- vandens (50:45:5), S6 fenolio- vandens (4:1), S7 izo
butanolio- acto rūgšties- vandens (10:4:7), S8 chloroformo- acto rūgšties (2:3), S9 acto rūgšties- druskos
rūgšties- vandens (30:3:10), S10 chloroformo- etilo acetato (9:1), S11 tolueno- chloroformo- acetono
(40:25:35), S12 n- butanolio- piridino- vandens- benzeno (5:3:3:1). Detekcijai buvo pasirinkti trys
reagentai: 2% etanolinis aliuminio chlorido tirpalas, anilino ftalatas skiestame vandeniu butanolyje ir Pauly reagentas (šviežiai pagamintas diazotintas sulfanilo rūgšties tirpalas). Buvo pagaminti etanoliniai ekstraktai ir tuomet išgarinti, o vėliau ištirpinti vandenyje. Po ekstrakto nusausinimo petroleteriu ir metileno chloridu, vandeninis ekstraktas buvo tiriamas kolonėlėse.
Atlikus tyrimą buvo išskirti ir identifikuoti kemferolio, kvercetino ir miricetino junginiai. Taip pat buvo rastas laricitrinas ir trys jo glikozidai: 5-O-β-D- glikozidas, 3,5-O-β-D- diglikozidas ir 3,5,7-O-β-D- triglikozidas. Laricitrinas yra retai augaluose nustatomas junginys. Pupinių šeimos augaluose šis junginys sutinkamas tik trijų rūšių žaliavose: aukštosios liucernos (Medicago arborea), pievinio pelėžirnio (Lathyrus pratensis) ir Tetragonolobus siliquosus.[28]
Vėliau atliktuose tyrimuose, M. lupulina augaluose taip pat buvo detalizuota tikslesnė cheminė sudėtis: žieduose- mirikomplanozidas, medikageninė rūgštis, sojasapogenolis B, C, D ir F, lapuose- vestitolis, šaknyse- kaulosaponino, hederagenino, medikageninės rūgšties- 3-O-β-D- gliukopiranozido, medikozido G, sojasapogenolio B, C, D, E, F, sojasaponino I ir sėklose- 4-acetamido-2-butanoinės rūgšties ir S- kanavanino.[29] Įdomu pastebėti tai, kad sojasapogenolio randama įvairiose morfologinėse augalo dalyse. Į tai reikėtų atkreipti dėmesį, norint panaudoti šio augalo ekstraktus medicinoje, kuris pasižymi cholesterolį mažinančiu poveikiu.
4.5. Medicago lupulina L. panaudojimas medicinoje
Viena iš sudedamųjų M. lupulina dalių yra flavonoidai. Pagrindiniai randami junginiai: kemferolis, kvercetinas, miricetinas ir laricitrinas. Todėl įdomu panagrinėti jų farmakologinį panaudojimą medicinos praktikoje. Bendrai paėmus flavonoidai pasižymi antioksidaciniu, prieš uždegiminiu, trombocitų agregaciją slopinančiu poveikiu, antihistamininiu poveikiu. [43]
Kemferolis, kvercetinas ir miricetinas pasižymi antinavikiniu poveikiu. Tai pagrįsta atliktais tyrimais. Pastebėta, kad veikiant šiems flavonoidams, gali būti apsaugota DNR. Tai yra reikalinga, norint išvengti naviko išsivystymo. Norint vystytis navikams, ląstelės turi būti apsaugotos nuo apoptozės ir gauti papildomai kraujo, dėl ko atsiranda angiogenezė. Tuo tarpu flavonoidai gali sukelti tokių ląstelių apoptozę, o atliktuose in vitro tyrimuose pastebėtas angiogenezės inhibavimas. Prieš uždegiminiu poveikiu labiau pasižymi kemferolis ir miricetinas. Atliktuose in vitro ir in vivo tyrimuose pastebėta, kad šie flavonoidai ir jų glikozidai turi prieš uždegiminį poveikį, kuris gali pasireikšti skirtingais mechanizmais. Aktyvuojantis branduolio faktoriui kappa B (NF-B) yra didinama citokinų, chemokinų ir fermentų, atsakingų už uždegimo atsiradimą, kiekis. Flavonoidai šiuo atveju inhibuoja (NF-B) veikimą, taip sumažindami uždegimą.[43-45]
Aktualiausia yra tai, kad kemferolis pasižymi ŽIV slopinančiu poveikiu. Tai patogenas, kuris mokslininkams kelia iššūkį jau pastaruosius 3 dešimtmečius. Maždaug 39,5 milijono suaugusiųjų gyvena su šiuo sindromu. Visi bandymai rasti vakciną buvo beverčiai, nes šiai dienai, ŽIV negali būti pašalintas iš organizmo. Tiriant kitas alternatyvas, kaip šio viruso slopinimas, buvo pastebėtas kemferolio aktyvumas, kuris leidžia inhibuoti augimą ir vystymąsi. Tai pagrįsta tuo, kad flavonoidas geba įsiterpti keliose dauginimosi stadijose. Žmogaus imundeficito virusui, patekusiam į ląstelę yra reikalingos trys baltymų grupės: ŽIV-1 proteazė, integrazė ir atvirkštinė transkriptazė. Taigi paveikus kemferoliu, buvo nustatytas ŽIV-1 proteazės inhibavimas.[43,46]
Kadangi augalo sudėtyje yra stebimas sojasaponino ir sojasapogenolio buvimas, būtų įdomu panagrinėti, kuo šitie triterpeniniai saponinai yra naudingi žmogaus organizmui. Daugiausiai šių junginių amfifilinis oleanano tipo triterpeninis glikozidas su poline cukraus molekule sujungta su pentacikliniu žiedu ir yra klasifikuojama į 4 grupes: A, B, E, ir DDMP (2,3-dihidro-2,5-dihidroksi-6-metil-4H-piran-4-onas). Šie junginiai pasižymi įvairiu biologiniu aktyvumu, kuris gali būti pritaikytas medicinoje. Viena svarbiausių jų savybių yra uždegimo mažinimas. Buvo ištirta, kad pagamintas sojasaponinų ekstraktas ženkliai slopina uždegiminių naviko nekrozės faktoriaus (TNF)-α ir monocitus pritraukiančio baltymo (MCP)-1, prostaglandino E2 (PGE2) ir azoto oksido, ciklooksigenazės (COX)-2 gamybą. Jis indukuoja azoto oksido sintazės (iNOS) veikimą, kapa polipeptido geno branduolio faktoriaus B- ląstelėse
degradaciją (IκBα), esančio inhibitoriumi branduolio arba neuroninio perdavimo faktoriaus (NF-B) lipopolisacharidus stimuliuojančiuose makrofaguose. IκBα fosforilinimas ir degradacija leidžia NF-κB patekti į branduolį ir jungtis su specifiniais promotoriaus centrais ir taip reaguoti į ląstelės pažaidą. Taip pat yra slopinama PGE2 ir IL-6 gamyba, slopinamas NF-κB aktyvumas, taip sumažinant lipidų peroksido malondialdehido (MDA) ir 4-hidroksi-2-nonenalio kiekį ir padidinant glutationo ir superoksido dismutazės ir katalazės aktyvumą.[30,31,32]
Taip pat yra sojasaponinų ekstraktuose pastebimas ir antimutageninis ir antikarcinogeninis efektas. Yra inhibuojamas aflatoksinas B1, kuris sukelia mutacijas ir inicijuoja karcinogenezę.
Etanoliniai ekstraktai su sojasaponinais B, E ir išgrynintu sojasapogenoliu B slopino 2-acetoksiacetilaminofluoreno indukuojamą DNR pažeidimą kininio žiurkėno kiaušidžių ląstelėse, taip sumažindamas genotoksinį 2-acetoksiacetilaminofluoreno aktyvumą.[33,34]
Ekstraktai pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu. Jis buvo ištirtas tiriant laboratorijoje auginamų žiurkių hepatocitų ląsteles ir matuojant alaninaminotransferazės (ALT) kiekį. Buvo pažeidžiamos kepenų ląstelės ir tuomet veikiamos sojasaponinais. Pastebėtas silpnas sojasapogenolio B hepatoprotekcinis poveikis veikiant tetra butil peroksidu, tačiau sojasapogenolis A ir B parodė ženklų aktyvumą prieš aflatoksino B1 sukeliamą citotoksinį poveikį hepatocitams. Taip pat sojasapogenolis B
buvo aktyvus prieš aktinomicino sukeliamą ląstelių apoptozę ir padidėjusią limfocitų reakciją.[35,36] Reninas yra svarbus fermentas renino-angiotenzino sistemoje, o jo padidėjęs aktyvumas sukelia hipertenziją. Tyrime buvo naudojamas sojasaponinas I, kuris parodė aktyvesnį renino slopinimą, negu palyginus su sintetiniu natrio tetradekanoil-acetalsulfatu.[37,38] Buvo analizuojami 14 saponinų ir sapogenolių, kuriuose buvo rasta 3-O-β-D-gliukopiranozido liekana, kuri yra svarbi renino inhibavimui.[39]
Sojasaponinas I dar pasižymi antimikrobiniu, antigrybeliniu ir antivirusiniu poveikiu. Pastebėtas stiprus poveikis prieš Escherichia coli ir Candida albicans, tačiau mažas aktyvumas prieš herpes simplex 1-o tipo virusą.[40] Tuo tarpu sojasapogenolis A ir E parodė dvidešimtadaliu, o sojasapogenolis B dešimtadaliu mažesnį aktyvumą. Teigiama, kad hidroksilo grupės ties C-21 ir karbonilo grupės C-22 sumažina antivirusinį aktyvumą, o sojasapogenolis C su dvigubu ryšiu tarp C-21 ir C-22 parodė didesnį antivirusinį aktyvumą prieš herpes simplex virusą.[41]
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI
5.1. Tyrimų objektas
Suminiam fenolinių junginių kiekiui ir antioksidaciniam aktyvumui įvertinti buvo naudojama apyninių liucernų augalinė žaliava. Ji buvo užauginta centrinėje Lietuvoje (55o23‘49“N; 23o51‘40“E).
Tyrimui naudota apyninių liucernų (Medicago lupulina) rūšis, Arka kultivuojama augalinė žaliava. Kolekcija buvo įkurta 2012 metais, agrarinių ir miškų mokslų centre, kuriame yra žemdirbystės instituto bandymų laukai. Apyninių liucernų žaliavos buvo auginamos karbonatiniame sekliau glėjiškame, vidutinio sunkumo priemolio rudžemyje, jos armuo 25-30 cm, ph 6,5-7,0, o humuso 2,0-2,4%. Šios augalinės žaliavos kolekcija buvo pasodinta birželio mėnesį. Augalinė žaliava buvo sėjama 4 pakartojimais, 2,5 m2 laukeliais: po 2 eilutes, kurių ilgis 5 metrai, o atstumai tarp numerio eilučių 0,5 metro, atstumas tarp skirtingų numerių 0,5 metro. Herbicidai auginant M. lupulina žaliavą nebuvo naudojami.
Norint altikti detalią M. lupulina cheminę analizę, augalinė žaliava buvo surenkama žydėjimo metu 2013 ir krūmijimosi metu 2014 metais. Antrųjų auginimo metų antžeminės dalies mėginiai buvo dalijami į dar du mėginius. Viena dalis panaudojama bendram antžeminės dalies mėginiui gauti, o kita dalis yra skirstoma į lapų, stiebų, žiedų augalines žaliavas. Mėginiai buvo nuplauti vandeniu, o tuomet skalauti distiliuotu vandeniu ir džiovinami ant filtrinio popieriaus. Žaliavos smulkinamos ir laikomos 105o C temperatūroje lygiai 15 minučių ir perkeliamos į džiovyklę 65±1 o C temperatūroje. Baigus džiovinti žaliavą atliekamas smulkinimo ir sijojimo procesas. Iš pusės augalinės žaliavos yra gaminamas liofilizatas. Surinkti žaliavų mėginiai apdoroti tą pačią dieną, kuomet buvo nuskinti.
Apyninių liucernų M. lupulina mėginius sudaro: 2013 m. antžeminė augalo dalis, 2014 m. antžeminė augalo dalis, krūmijimosi metu surinkta žaliava, kurios viena dalis džiovinta įprastu būdu, o kita liofilizuojant, žiedai, lapai, stiebai, sėklos, daigintos sėklos, želmenys.
5.2. Medžiagos ir reagentai
Tyrimų metu naudoti analitiškai švarūs reagentai. Buvo naudojamas: Išgrynintas vanduo, Folin-Ciocalteu fenolinis tirpalas (2M) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Šveicarija), natrio karbonatas (99,5-100,5%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Prancūzija), galo rūgšties monohidratas (≥98,0%) įsigytas iš Aldrich chemie GmbH (Kinija), rutino hidratas (≥94%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Vokietija), acto rūgštis (100%) įsigyta iš Carl Roth GmbH (Vokietija), aliumino chlorido heksahidratas (≥95%) įsigytas iš Carl Roth GmbH (Vokietija), heksametilentetraminas (≥99,5%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Rusija), DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) (95%) radikalas įsigytas iš Alfa Aesar GmbH & Co (Karlsruhe, Vokietija), ferozinas (≥97,0%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (JAV), Bevandenis geležies (II) chloridas (99,5%) įsigytas iš Alfa Aesar GmbH & Co (Karlsruhe, Vokietija), 96 proc. (V/V) etanolis įsigytas iš UAB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva), ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties reagentas)) įsigytas iš ,,Alfa Aesar“, JAV); kalio persulfatas („Alfa Aesar GmbH & Co“, Vokietija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) („Sigma – Aldrich“, Vokietija).
5.3. Naudota aparatūra
Bandinių ekstrakcijai buvo naudojamas distiliatorius, orbitalinė kratyklė „IKA®KS 130 basic (Vokietija), ultragarsinė vonelė „ElmaSonic S40H“ (Elma Schmidauer GmbH, Vokietija). Spektrofotometriniams tyrimams atlikti buvo naudojamas spektrofotometras „Genesys 2“ (Spectronic, JAV).
5.4. Tyrimų metodai
5.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas
Apyninių liucernų ekstraktams gaminti pirmiausiai reikėjo 70% (V/V) vandens-etanolinio tirpalo. Grynas 96% etanolis buvo skiedžiamas vandeniu. 100ml ekstrahento pagaminti reikėjo 66,5 ml 96% etanolio sumaišyti išgrynintuoju vandeniu iki 100ml. Ekstraktam gaminti buvo ruošiami tikslūs
0,100 g Apyninės liucernos svėriniai ir užpilami 10 ml ekstrahento, veikiami ultragarso vonelėje 15 min, 50o C temperatūroje. Gautas ektraktas filtruojamas pro popierinį filtrą, kuris buvo suvilgomas nedideliu kiekiu ekstrahento, į matavimo cilindrą. Likutis praplaunamas ekstrahentu iki 10 ml. Taip buvo gaminami po tris visų augalo morfologinių dalių ekstraktai. Iš viso buvo pagaminta 30 ekstraktų.
5.4.2. Reagentų paruošimas
70% (V/V) etanolio tirpalas ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele, 66,5 ml 96% (V/V) etanolio skiedžiant 33,5 ml išgryninto vandens.
0,2 N Ciocalteu reagentas ruošiamas matavimo cilindre, kuomet 10 ml 2N Folin-Ciocalteu reagentas skiedžiamas išgrynintuoju vandeniu iki 100 ml.
7,5% (W/V) natrio karbonato tirpalas paruošiamas 7,5 g bevandenio natrio karbonato tirpinant 100 ml išgryninto vandens.
Rutino etanoliniam tirpalui ruošti buvo imamas 0,025 g tikslus svėrinys 99% grynumo rutino ir tirpinant 25 ml 70% (V/V) etanolinio tirpalo.
33% acto rūgšties tirpalas ruošiamas 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
10% aliuminio chlorido tirpalas paruošiamas 10,0 g aliuminio chlorido tirpinant 100 ml išgryninto vandens.
5% heksametilentetramino tirpalas ruošiamas 2,5 g analitinio grynumo heksametilentetramino tirpinant 50 ml išgryninto vandens.
6×10-5 M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas ruošiamas imant 0,00118 g tikslaus
DPPH reagento svėrinio tirpinant 50 ml 96% (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas turi būti paruošiamas tiriamajai dienai naujas, kad atlikti tyrimai būtų tikslesni ir laikoma užsuktame tamsaus stiklo buteliuke.
5 mM ferozino tirpalas ruošiamas 0,0616 g tikslaus ferozino svėrinio tirpinant 25 ml išgryninto vandens.
2 mM FeCl2 tirpalas ruošiamas 0,0063 g tikslaus FeCl2 svėrinio tirpinant 25 ml išgryninto
vandens. Ruošiami nauji tirpalai, dėl didesnio tikslumo.
ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties reagentas)) ruošiamas 0,0548 g tikslaus ABTS reagento svėrinio tirpinant 50 ml išgryninto vandens ir tirpale vėliau ištirpinant 0,0095 g tikslaus svėrinio kalio persulfato.
5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Norint nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį augalinėje žaliavoje yra naudojamas Folin- Ciocalteu reagentas, matuojant spektrofotometru absorbcijos dydį. Atliekant analizę imamas 1ml turimo ekstrakto ir maišoma su 5 ml 0,2N F-C reagentu. Mišinys paliekamas stovėti 3 minutes. Tuomet papildomai įpilama 4 ml 7,5% (W/V) natrio karbonato tirpalo ir paliekama valandai. Paskui spektrofotometru matuojamas optinis tankis, esant 765 nm šviesos bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu buvo naudotas išgrynintas vanduo. Kiekvienas ekstraktas matuojamas 3 bandymais, vienai morfologinei augalo daliai atliekami iš viso 9 bandymai, norint sumažinti galimą paklaidą. Bendras fenolinių junginių kiekis reiškiamas pagal galo rūgšties ekvivalentus, naudojant galo rūgšties kalibracinę kreivę. (6 pav.) norint apskaičiuoti bendrą fenolinių junginių kiekį naudojama formulė:
GRE (mg/g) = c x V/m;
c- galo rūgšties koncentracija nurodoma kalibracinėje kreivėje (mg/g); V- pagaminto ekstrakto tūris (ml);
m- tikslaus žaliavos svėrinio kiekis (g).
y = 9.3076x + 0.1377 R² = 0.9958 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.92 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.93 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 O p ti n is t a n k is
Galo rūgšties koncentracija mg/ml
6 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)
5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Tyrimas buvo altiekamas kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100), 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5% heksametilentetramino tirpalo ir praskiedžiant mišinį iki 25 ml žymės. Sumaišius laikoma 30 minučių. Tuomet matuojami palyginamojo ir tiriamojo tirpalų absorbcijos dydžiai, esant 407 nm bangos ilgiui.
Payginamojo tirpalo ruošimui buvo sumaišoma 1 ml tiriamo ekstrakto su 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties ir skiedžiant išgrynintuoju vandeniu iki žymės ir sumaišoma. Kiekvienas buteliukas su ektraktu buvo tiriamas tris kartus.
Duomenys buvo vertinami lyginant gautą absorbciją su rutino etaloninio tirpalo absorbcijos dydžiu. Etaloninio tiriamojo ir palyginamojo tirpalų ruošimas atliekamas vietoj 1 ml ekstrakto įpilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo.
Flavonoidų suminis kiekis išreiškiamas rutino kiekiu mg/g:
X=
- rutino masė, sunaudota etanoliniui rutino tirpalui ruošti (g);
A- Tiriamo ekstrakto absorbcijos dydis; V- tiriamo ekstrakto tūris (ml);
m- augalinės žaliavos bandinio masė, sunaudota ekstraktui paruošti (g);
- etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis; - etaloninio rutino tirpalo tūris (ml).
5.4.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH radikalų surišimo
metodu
Antioksidacinis aktyvumas gali būti įvertintas veikiant DPPH (2,2- difenil- 1- pikrilhidrazilas) reagentu. Šis tyrimo metodas yra pagrįstas DPPH radikalų surišimu, dėl elektronų perdavimo reakcijų. Tyrimas atliekamas 50µl tiriamojo ekstrakto (1:100) sumaišant su 2 ml 6×10-5 DPPH tirpalo. Tuščias
bandinys ruošiamas vietoj 50µl tiriamo ekstrakto įpilant 50µl 70% (V/V) etanolio. Matavimai atliekami esant 515 nm šviesos bangos ilgiui. Stebimas absorbcijos sumažėjimas. Optinis tankis nemažėja pasiekus pusiausvyrą, t.y. maždaug po 30 minučių.[48] Iš kiekvieno augalo morfologinės dalies ekstrakto buteliuko atliekami trys pakartojimai, o palyginamuoju tirpalu naudojant 70% (V/V) etanolį.
Antiradikalinį ekstraktų aktyvumą išreiškiama surišto DPPH procentais:
DPPH surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] × 100% ;
Ab- tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min);
Aa- tiriamojo ekstrakto bandinio absorbcijos dydis (po 30 min.).
5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS radikalų-katijonų surišimo
metodu
Antiradikalinis apyninių liucernų ekstraktų aktyvumas įvertintas naudojantis 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino- 6- sulfono rūgšties radikalo sujungimo metodu. Šis radikalas, dar vadinamas ABTS, yra stabilus, spalvotas katijonas. Pagaminamas 2mM motininis ABTS tirpalas. Jis gaminamas tiksliai atsveriant 0,0548 g ABTS reagento ir jį ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. Norint mišinį apsaugoti nuo galimo šviesos poveikio, ištirpiname ir laikome tamsaus stiklo buteliuke. Tuomet pagaminamas 70 mM vandeninis kalio persulfato tirpalas ir sumaišomas su motininiu ABTS tirpalu taip jį aktyvuojant. Kruopščiai sumaišytas tirpalas paliekamas stovėti tamsioje, vėsioje vietoje 16 h. Taip pagamintas ABTS·+, kuris reaguos su antiradikališkai aktyviomis BAM.
Gautas pradinis ABTS•+ tirpalas atskiedžiamas, iki kol jo absorbcija tampa 0,800±0,03 esant 734 nm šviesos bangos ilgio, palyginamuoju tirpalu naudojant išgrynintąjį vandenį. Tyrimas atliekamas į 3 ml ABTS•+ atskiesto darbinio tirpalo įpilant 30 µl tiriamojo ekstrakto ir laikant kambario temperatūroje 60 minučių. Tyrimas atliekamas pakartojant 3 kartus su kiekvienu tiriamu augalinės žaliavos ekstraktu.
7 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų-katijonų surišimo metodu (n=3)
Tiriamųjų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas yra išreiškiamas trolokso ekvivalentais gramui augalinės žaliavos (7 pav.) ir apskaičiuojamas pagal formulę:
TE= c × V/m, µmol/g
Čia:
c- trolokso tirpalo koncentracija, kuri nustatyta pagal kalibracinę kreivę (µmol/l); V- tiriamos augalinės žaliavos ekstrakto tūris (ml);
m- tikslus augalinės žaliavos kiekis. (g)
5.4.7. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe
2+jonų surišimo metodu
Fenoliniai junginiai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis nes gali surišti geležies ir vario jonus. Chelatines savybes galima vertinti dvivalentės geležies ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimu esant 562 nm švieso bangos ilgiui. Tyrimas atliekamas sumaišant 1 ml tiriamojo ekstrakto
su 50 µl 2mM FeCl2 ir laikant 5 minutes. Vėliau įpilama ir sumaišoma su 0,2 ml 5mM ferozino tirpalo.
Paliekama stovėti 10 minučių. Paruošiamas tuščias bandinys iš 1 ml 70% (V/V) etanolio, 50 µl 2mM FeCl2 ir 0,2 ml 5mM ferozino tirpalų. Tuomet matuojamas absorbcijos dydis, o palyginamuoju tirpalu
naudojant 70% (V/V) etanolį. Visi ekstraktai tiriami atliekant po tris pakartojimus. Fe2+ jonų surišimo geba išreiškiama procentais:
Fe2+ surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] × 100% ;
Ab- tuščio bandinio absorbcijos dydis;
Aa- bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis.
5.5. Duomenų analizė
Statistinis duomenų analizavimas ir grafinis atvaizdavimas atliktas „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa. Duomenų įvertinimui atliktų tyrimų metu apskaičiuotas matematinis vidurkis, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida ir pirsono koreliacijos koeficientas. Taip pat buvo įvertintas statistinis patikimumas. Buvo pasirinktas 0,05 reikšmingumo lygmuo, todėl visi rezultatai p<0,05, bus laikomi statistiškai reikšmingais.
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Norint pagaminti kokybišką augalinių žaliavų ekstraktą, kuriame kiekybiškai būtų didžiausiausias biologiškai aktyvių junginių kiekis, reikia parinkti ekstrahavimo tirpiklį, palyginti skirtingus ekstrakcijos metodus ir jų sąlygas. Tikslinga parinkti optimalias ekstrahavimo sąlygas tyrinėjamoms rūšies žaliavoms, nes niekada nebus dviejų identiškų augalinių žaliavų. Visada skirsis auginimo sąlygos, žaliavos sudėtis ir paruošimas. Atsižvelgus į tai, kad literatūros ar mokslinių straipsnių apie fenolinių junginių ekstrakciją iš liucernų genties rūšių augalinių žaliavų rasta mažai, buvo nuspręsta, kad reikalingas tinkamų ekstrakcijos sąlygų parinkimas.
6.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas
Norint nustatyti tinkamiausią ekstrahentą iš M.lupulina augalinių žaliavų, ekstrakcijai buvo pasirinktas paprastosios maceracijos metodas. Tyrimui atlikti buvo naudojami 40%, 50%, 60%, 70%, 80% (V/V) koncentracijų etanolio ir vandens mišiniai.
Analizei buvo panaudota pirmųjų auginimo metų antžeminė apyninių liucernų žaliava. Žaliavos-ekstrahento santykis buvo 1:100. Ruošiami 3 mėginiai kiekvienai etanolio koncentracijai, gaunamų rezultatų atsikartojamumui įvertinti. Gauti duomenys pateikiami grafike (8 pav).
8 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas M. lupulina pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies bandiniuose paprastosios maceracijos metodu (vidurkis± standartinė paklaida). GRE-galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Žvelgiant į grafiką, galima spręsti, kad naudojant etanolį, kurio koncentracija iki 50% stebimas didėjantis fenolinių junginių kiekis ekstraktuose (6,356± 0,073 mg/g). Tačiau naudojant 60% etanolį, biologiškai aktyvių junginių kiekis staigiai sumažėja ir vėl pradeda didėti naudojant 70% etanolį.70% etanolis pasižymi geriausiomis dezinfekcinėmis ir baktericidinėmis savybėmis. Kadangi 70% etanolis yra tinkamiausias flavonoidų ekstrakcijai, tolimesniems tyrimams bus pasirenkamas būtent jis.[50]
6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas
Be maceracijos taip pat yra tikslinga palyginti ir kitą ekstrakcijos metodą. Norint palyginti ekstrakcijos efektyvumą, tyrime buvo naudojama ultragarso vonelė, 70% (V/V) etanolis, pirmųjų auginimo metų antžeminė apyninės liucernos žaliava, kuri buvo surinkta masinio žydėjimo metu. Bandiniai ultragarso vonelėje laikomi skirtingais laiko tarpais: 10, 15, 20, 25 minutes, esant 50±5oC temperatūrai. Norint gauti tikslesnius duomenis, buvo ruošiama po 3 kiekvieno laiko intervalo bandinius. Gauti rezultatai pateikiami grafike (9 pav).
9 pav. M. lupulina pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies bandinių ekstrakcijos ultragarsu trukmės įvertinimas ekstrahentu nadojant 70% (V/V) etanolį (vidurkis± standartinė paklaida). Temperatūra 50± 5oC. GRE-
galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Ekstrakcija ultragarso vonelėje yra efektyvesnė, kadangi po 10 min jau stebimas didesnis išekstrahuotų medžiagų kiekis nei maceracijos metu. Fenolinių junginių kiekio padidėjimas stebimas po 15 min (6,689± 0,169 mg/g), o toliau ilginant ekstrahavimo laiko periodą jis mažėja (25 min 5,619± 0,095 mg/g). Tolimesniems tyrimams buvo pasirinkta 15 minučių ekstrakcija ultragarso vonelėje.
Atlikus palyginamuosius tyrimus nustatyta, kad tikslingiau yra naudoti ekstrakciją ultragarso vonelėje, nes jos metu išekstrahuojamas didesnis biologiškai aktyvių medžiagų kiekis nei paprastosios maceracijos metodu (6,689± 0,169 mg/g ir 5,556± 0,088 mg/g), o ekstrakcijos trukmė sumažėja nuo 26 h iki 15 min.
6.1.3. Temperatūros parinkimas ekstrahuojant ultragarsu
Atliekant ekstrakciją ultragarso vonelėje, tikslinga nustatyti optimaliausią temperatūrą, kurioje ekstrahavimo išeiga bus didžiausia. Ekstrakcijai atlikti naudojama ultragarso vonelė, 70% (V/V) etanolis, pirmųjų auginimo metų antžeminė apyninių liucernų augalinė žaliava surinkta masinio žydėjimo metu. Kiekvieno temperatūrinio rėžimo tyrime buvo naudojami 3 žaliavos mėginiai. Bandiniai ultragarso vonelėje veikiami 15 minučių, įvertinant 5 skirtingų temperatūrinių rėžimų (30 oC, 40 oC, 50 oC, 60 oC, 70 oC± 5oC) įtaką fenolinių junginių ekstrakcijai: . Gauti duomenys apibendrinami grafike (10
pav).
10 pav. M. lupulina pirmųjų auginimo metų antžeminės augalo dalies mėginių ekstrakcijos su 70% (V/V) etanoliniu ultragarso vonelėje įvertinimas esant skirtingoms temperatūroms (vidurkis ± standartinė paklaida). t- 15 min. GRE-
galo rūgšties ekvivalentu. (n=3)
Atlikus tyrimą pastebėta, kad didėjant temperatūrai tuo pačiu didėja ir fenolinių junginių išeiga. analizei ir tolimesniam fenolinių junginių bei antioksidacinio aktyvumo nustatymui efektyviausia yra 50oC temperatūra. Esant 50oC temperatūrai yra išekstrahuojama (6,649 ± 0,118 mg/g) fenolinių junginių. Pakėlus temperatūrą dar 10 laipsnių yra stebimas ryškus fenolinių junginių sumažėjimas (2,871 ± 0,121 mg/g). Dėl to galima daryti prielaidą, kad fenoliniai junginiai yra neatsparūs aukštai temperatūrai, todėl įvertinus temperatūrinį rėžimą ir ekstrakcijos greitį buvo pasirinkta 50oC temperatūra. [43] Palyginus
gautus duomenis su M. Sativa pastebimas temperatūrinis kintamumas, kadangi pastarojoje efektyvesnė ekstrakcija gaunama naudojant 60 oC temperatūrą.[48]
Bendrai paėmus tinkamiausiomis ekstrakcijos sąlygomis buvo pasirinkta: 70% (V/V) etanolio-vandens mišinys, eksponuojant bandinius ultragarsu 15 minučių ir palaikant 50 ± 5 oC temperatūrą.
6.2. Fenolinių junginių ir flavonoidų suminio kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu
Fenoliniai junginiai skiriasi tarpusavyje chemine sudėtimi ir paplitimu augalinių žaliavų ekstraktuose. Būtent dėl šių priežaščių yra sudėtinga ir brangu atskirai išanalizuoti individualius fenolinius junginius. Naudojantis spektrofotometriniais metodais, fitocheminius tyrimus galima atlikti efektyviai, nebrangiai ir nereikalinga sudėtinga technika, o taip pat yra ekologiškiau. Visi fenoliniai junginiai pasižymi antioksidaciniu aktyvumu, todėl tikslinga nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį ir taip numatyti poveikį žmogaus ląstelėms. Norint nuosekliai ištirti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį ir nustatyti jos kitimus skirtingose M. lupulina žaliavose buvo atrinkti šiuolaikiniai analizės metodai ir jie papildomai modifikuoti.
6.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas M. lupulina augalinėse žaliavose
Spektrofotometriniu metodu buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis Lietuvoje kultivuotos apyninių liucernų augalinėse žaliavose. Tirti kiekvienos morfologinės dalies 3 ekstraktai ir iš jų daromi trys pakartojimai. Eksperimente buvo naudojama F-C metodika. Tyrimo rezultatai nurodomi (11 Pav).
Bendras fenolinių junginių kiekis augalinių žaliavų ekstraktuose varijavo plačiose ribose 2,724- 15,337 mg/g. Įdomu atkreipti dėmesį į tai, kad fenolinių junginių kiekiai tarp skirtingų auginimo metų antžeminės dalies žaliavų skyrėsi: pirmųjų 6,649 ± 0,118 mg/g, o antrųjų 7,734 ± 0,123 mg/g. Krūmijimosi tarpsnio antžeminių augalo dalių ekstraktuose stebimas panašus suminio fenolinių junginių kiekis: liofilizuojant žaliavą buvo gautas 7,89 ± 0,141 mg/g suminis fenolinių junginių kiekis, o džiovinant įprastai 7,58 ± 0,145 mg/g. Palyginus skirtingo fenologinio tarpsnio augalines žaliavas
ryškaus skirtumo nepastebima. Didžiausias sukaupiamas fenolinių junginių kiekis pastebėtas žiedų 15,337± 0,141 mg/g. Tuo tarpu mažiausias kiekis suminių fenolinių junginių kiekio randamas stiebuose 2,724 ± 0,124 mg/g. Lyginant sekoje sėklos- daigintos sėklos- želmenys, bendras fenolinių junginių kiekis išsidėstė sekančiai: sėklų 8,212 ± 0,114 mg/g > želmenų žaliavose 7,236 ± 0,365 mg/g ≥ daigintų sėklų 7,008 ± 0,365 mg/g .
Atlikus tyrimą galima daryti išvadą, kad bendram fenolinių junginių kiekiui M. lupulina augalinėse žaliavose turi įtakos augalinės žaliavos paruošimas. Sukaupiamas fenolinių junginių kiekis varijuoja priklausomai nuo morfologinės augalo dalies.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 GR E, m g/ g
11 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis M. lupulina augalinėse žaliavose (vidurkis ± standartinė paklaida). GRE- galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Palyginus gautus duomenis su M. sativa galima įžvelgti panašius dėsningumus tarp skirtingų morfologinių augalo dalių ekstraktuose esančių fenolinių junginių kiekio. M. lupulina antrųjų metų antžeminės augalo dalių žaliavose sukaupiamas panašus suminis fenolinių junginių kiekis 7,734 ± 0,123 mg/g, kaip M. sativa Birutės ir Malvinos veislėse (atitinkamai, 8,44 ± 2,08 mg/g ir 7,28 ± 0,79 mg/g). Taip pat stebimas aiškus didesnis sukaupiamas fenolinių junginių kiekis žiedų žaliavose: M. lupulina 15,337± 0,141 mg/g, o Birutės ir Malvinos veislėse atitinkamai 19,19 ± 1,48 mg/g ir 21,33 ± 3,43 mg/g. Tai gi galima daryti išvadą, kad tos pačios genties augalai gali kaupti panašius fenolinių junginių kiekius augalinėse žaliavose.[48]
6.2.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas M. lupulina augalinėse žaliavose
Norint nustatyti bendrą flavonoidų kiekį augalinių žaliavų ekstraktuose, buvo naudojamas spektrofotometrinis metodas. Tyrimo metu augaliniai ekstraktai yra veikiami aliuminio chloridu, kuris su flavonoidais suformuoja stabilius kompleksus. Įvertinus flavonoidų kiekį žaliavoje, galima spręsti apie antioksidacinį aktyvumą ir galimą panaudojimą medicinos praktikoje. Atlikto tyrimo su M. lupulina augalinių žaliavų ekstraktais bendro flavonoidų kiekio įvertinimas pateikiamas (12 pav.)
12 pav. Bendras flavonoidų kiekis M. lupulina augalinių žaliavų mėginiuose (vidurkis ± standartinė paklaida). RE- rutino ekvivalentai. (n=3)
Bendras flavonoidų kiekis apyninių liucernų augalinėse žaliavose varijavo labai didelėse ribose 1,062- 31,787 mg/g. Atlikus tyrimą buvo išsiaiškinta, kad didesni flavonoidų kiekiai sukaupiami antrųjų auginimo metų antžeminėse augalinėse žaliavose 5,642 ± 0,905 mg/g, palyginus su pirmųjų metų- 3,778 ± 0,879 mg/g. Masinio žydėjimo metu surinktose žaliavose sukaupiami didesni flavonoidų kiekiai palyginus su krūmijimosi metu surinkta žaliava. Džiovinimo būdas taip pat turi įtakos flavonoidų kiekiui apyninės liucernos žaliavose. Atliekant eksperimentą buvo nustatyta, kad krūmijimosi tarpsnyje rinktose žaliavose liofilizuojant gaunamas didesnis bendras flavonoidų kiekis 5,636 ± 0,656 mg/g, palyginus su džiovinimu įprastu būdu 4,947 ± 0,732 mg/g. Lyginant morfologinį kintamumą didžiausias flavonoidų
kiekis nustatytas žiedų 31,787 ± 0,700 mg/g, o mažiausias stiebų 1,062 ± 0,477 mg/g augalinėse žaliavose. Palyginus grandinėje sėklos- daigintos sėklos- želmenys, stebimas bendro flavonoidų kiekio išsidėstymas sekančiai: sėklų 11,009 ± 0,998 mg/g > daigintų sėklų 1,475 ± 0,425 mg/g ≥ želmenų 1,291 ± 0,333 mg/g.
Palyginus M. lupulina ir M. sativa žaliavų rezultatus yra pastebimi bendri įvairavimo dėsningumai. Antrųjų metų antžeminėse M. lupulina žaliavose sukaupiama 5,642 ± 0,905 mg/g, o M.
sativa Birutės ir Malvinos veislių žaliavose rasti panašūs kiekiai (atitinkamai 4,29 ± 1,38 mg/g ir 5,56 ±
1,19 mg/g). [48] Įdomu pastebėti tai, kad M. lupulina žiedų žaliavose sukaupiamas ženkliai didesnis kiekis (31,787 ± 0,700 mg/g) nei M. sativa Birutės ir Malvinos veislėse (atitinkamai, 18,61 ± 1,79 mg/g ir 20,54 ± 2,13 mg/g). Taigi galima daryti prielaidą, kad šių dviejų rūšių augalinėse žaliavose yra kaupiamas panašus flavonoidų kiekis .
6.3. M. lupulina augalinių žaliavų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas
Epidemiologiniai tyrimai patvirtina, kad fenoliniai junginiai yra labai svarbūs mūsų gyvenime, kadangi yra atsakingi už žmogaus sveikatos būklės gerinimą. Šie fenoliniai junginiai gaunami iš augalinės kilmės maisto. Jie veikia kaip antioksidantai dėl savo hidroksilo grupės pakaitų ir aromatinės struktūros, kuri leidžia surišti laisvuosius radikalus taip juos neutralizuojant. [42] Taigi, būtų vertinga nustatyti M. lupulina augalinių žaliavų antioksidacinį aktyvumą.
Norint įvertinti galimą antioksidacinį efektyvumą, reikalingi patikimi kiekybinio įvertinimo metodai, kurie būtų patogūs ir lengvai atkartojami. Siekiant, kad vertinimas būtų kompleksiškesnis ir tikslesnis, analizei buvo pasirinkti trys analizės metodai: chelatinis Fe2+ jonų surišimo įvertinimas,
fotometrinis DPPH radikalų surišimo metodas ir ABTS katijono surišimo metodas. Dvivalentės geležies jono surišimas gali padėti įvertinti kaip pereinamieji metalai gali būti surišti, taip nutraukiant grandinines reakcijas organizme, kuriose šie metalai dalyvauja. Tuo tarpu DPPH ir ABTS radikalų surišimas padeda nustatyti kaip fenoliniai junginiai gali sumažinti oksidacinį stresą, taip sumažinant oksidacinę pažaidą ląstelėms.
