FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
Algis Baronas
PAPRASTŲJŲ PERLUOČIŲ (Anthyllis vulneraria L.) AUGALŲ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Raimondas Benetis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
PAPRASTŲJŲ PERLUOČIŲ (Anthyllis vulneraria L.) AUGALŲ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Raimondas Benetis
DddDData Data Darbą atliko Magistrantas Algis Baronas Data KAUNAS, 2017 Recenzentas Dr. Vidmantas Dirsė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 7
1. SANTRUMPOS ... 9
2. ĮVADAS ... 10
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
4.1. Oksidacinis stresas ir laisvieji radikalai... 13
4.2. Antioksidacinio streso poveikis organizmui ... 14
4.2.1. Lipidų peroksidacija ... 14
4.2.2. DNR oksidacija ... 15
4.2.3. Baltymų oksidacija ... 15
4.3. Antioksidantai ... 15
4.4. Fenoliniai junginiai ... 16
4.4.1. Fenolinių junginių bendroji charakteristika ... 16
4.4.2. Fenolinių junginių antioksidacinio poveikio mechanizmas ... 18
4.4.3 Fenolinių junginių ekstrakcija ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 19
4.5. Paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) bendroji charakteristika ... 21
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24
5.1. Tyrimų objektas ... 24
5.2. Naudotos medžiagos ir reagentai ... 25
5.3. Naudota aparatūra ... 25
5.4. Tyrimų metodai ... 26
5.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 26
5.4.2. Reagentų paruošimas ... 26
5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27
5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28
5.4.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH radikalų surišimo metodu ... 28
5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe2+ jonų sujungimo metodu ... 29
5.4.7. Antioksidacinio aktyvumo įverinimas ABTS radikalų - katijonų surišimo metodu ... 29
5.5. Duomenų analizė ... 31
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32
6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 32
6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas ... 33
6.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros parinkimas ... 34
6.2. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 35
6.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas A. vulneraria žaliavose ... 35
6.2.2.Bendro flavonoidų kiekio nustatymas A. vulneraria žaliavose ... 38
6.3. A. vulneraria žaliavų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas... 41
6.3.1 A. vulneraria ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH surišimo metodu ... 42
6.3.2 A. vulneraria augalinių žaliavų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymas taikant ABTS metodą ... 46
6.3.3 A. vulneraria augalinių žaliavų ekstraktų chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų sujungimo metodu ... 49
6.4 Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų kiekių ir antioksidacinio aktyvumo ... 52
7. IŠVADOS ... 53
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 55
SANTRAUKA
Algio Barono magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas.
Paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.
Tikslas: Ištirti skirtinguose Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos regionuose natūraliai augančių ir
kultūroje auginamų paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) žaliavų bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei jų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1) Parinkti optimalias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš A.
vulneraria žaliavų bandinių. 2) Spektrofotometriniu metodu nustatyti bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį ir šių rodmenų įvairavimą A. vulneraria žaliavų mėginiuose. 3) Įvertinti A. vulneraria ekstraktuose esančių biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus taikant spektrofotometrinius ABTS, DPPH, FIC metodus. 4) Nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties rodiklių bei antioksidacinio aktyvumo pokyčius skirtingų fenologinių tarpsnių A. vulneraria žaliavose. 5) Įvertinti koreliacinius ryšius tarp A. vulneraria augalinių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
Tyrimo metodika: Tyrimams naudotos natūraliai augančių paprastųjų perluočių (Anthyllis
vulneraria L.) augalų augalinės žaliavos, surinktos iš 17 skirtingų Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos teritorijse esančių augaviečių, masinio žydėjimo metu. Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu. Naudojamas 70% (V/V) etanolis, ekstrakcijos laikas 10 min, temperatūra 50ºC. Suminiam fenolinių junginių kiekiui nustatyti taikomas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentais (mg/g). Bendras flavonoidų kiekis nustatomas vykdant reakciją su AlCl3,
rezultatai išreiškiami rutino ekvivalentais (mg/g). Antioksidaciniam aktyvumui nustatyti naudojami spektrofotometriniai DPPH, FIC (Fe2+ jonų sujungimo metodas) ir ABTS metodai. Procentais išreiškiami DPPH ir FIC gauti rezultatai. Trolokso ekvivalentais (TE, μmol/g) išreiškiami ABTS metodu gauti duomenys.
Rezultatai ir išvados: Atlikus tyrimus nustatyta, jog A. vulneraria žaliavose aptikti fenolinių
junginių ir flavonoidų kiekiai įvairavo plačiose ribose. A. vulneraria fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių varijavimas tiesiogiai priklauso nuo augalo morfologinių dalių, augaviečių ir fenologinių tarpsnių. Didžiausi fenolinių junginių ir flavanoidų kiekiai nustatyti A.vulneraria žiedų žaliavose, vidutiniškai atitinkamai (14,058 ± 1,071 mg/g ir 4,135 ± 1,003 mg/g), o mažiausias - stiebuose (4,848 ± 0,072 mg/g ir 1,419 ± 0,426 mg/g). Atlikus antiradikalinių A.vulneraria žaliavų ekstraktų savybių nustatymus nustatyta, jog didžiausiomis antiradikalinėmis savybėmis pasižymi A. vulneraria žiedų žaliavos. A. vulneriaria žiedų žaliavos vidutinis DPPH radikalų surišimo aktyvumas – 32,183 % ±
3,909 %, taikant ABTS metodą vidutinis antiradikalinis aktyvumas – 25,521 µmol/l ± 2,536 µmol/l, o vidutinis chelatinis aktyvumas nustatytas FIC metodu – 67,087 % ± 2,358 %. Atlikus A.vulneraria žaliavų tyrimus stipriausi koreliaciniai ryšiai nustatyti tarp fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo tiriant DPPH metodu (0,960, p<0,05), ABTS metodu (0,929, p<0,05), FIC metodu (0,913, p<0,05).
SUMMARY
The supervisor of the final master’s thesis/research prepared by Algis Baronas is assoc. prof. PhD. Raimondas Benetis; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. - Kaunas
The investigation of phenolic compounds and antioxidant activity of kidney vetch (Anthyllis vulneraria L.) plants.
The aim: to assay morphological parts such as stems, leaves, flowers, crown, of cultivated
and naturalised kidney vetches (Anthyllis vulneraria L.) in different Lithuanian, Latvian, Polish regions and explore total amount of phenolic compounds, flavonoids in raw materials of (Anthyllis vulneraria L.) and their antioxidant activity.
The objectives of the study: 1) To determine the optimal conditions of phenolic compounds
for the extract from (A. vulneraria) raw materials. 2) To discover the total content of phenolic and flavonoid compounds in (A. vulneraria) raw materials and analyse the stages of development using spectrophotometric methods 3) To evaluate antioxidant activity and its variability in extracts of (A. vulneraria) raw materials using DPPH and FIC assays. 4) To determine total content of phenolic compounds and antioxidant activity in (A. vulneraria) raw materials in different phenological stages of development. 5) To estimate the correlation between phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity.
Research methodology: The researches were carried out using morphological parts of
cultivated and naturalised kidney-vetches (Anthyllis vulneraria L) from Lithuania, Latvia and Poland. The method of extraction – ultrasonic agitation, extract - 70 % (V/V) ethanol, extraction time – 10 min, extraction temperature - 50 ºC. Spectrophotometric Folin-Ciocalteu method was used to determine the total content of phenolic compounds and results as gallic acid equivalent (mg/g). Specific reaction with AICI3 was used to determine the total content of flavonoids and results were expressed as rutin equivalent (mg/g).
Antioxidant activity was monitored by three spectrophotometric assays, namely DPPH , FIC and ABTS. The DPPH and FIC assays were used to determine the results as percentages compared. Trolox equivalent for plant extracts was presented by the ABTS assay.
Results and conclusions: The result from this study demonstrate that the total amount of
phenolic compounds, flavonoids in (A. vulneraria ) raw materials and their antioxidant activity different and all differences depend on morphological parts of plant, its habitats and the phenological stages of development. The highest content of phenolic compounds, flavonoids was found in the flowers (14,058 ± 1,071 mg/g ir 4,135 ± 1,003 mg/g) and showed the lowest content in the stems (4,848 ± 0,072 mg/g ir 1,419 ± 0,426 mg/g). DPPH showed the highest radical activity in the flowers
(A. vulneraria ) of the raw materials (32,183 % ± 3,909 %) and showed average antioxidative activity by ABTS assay (25,521 µmol/l ± 2,536 µmol/l) , showed average chelating activity by FIC assay - (67,087 % ± 2,358 %) This study revealed that (A.vulneraria) raw materials by DPPN assay (0,960, p<0,05), ABTS assay (0,929, p<0,05), FIC assay (0,913, p<0,05), found out strong correlation between content of phenolic compounds and antioxidant activity.
1. SANTRUMPOS
ABTS 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. AcsH Askorbo rūgštis
BAM biologiškai aktyvios medžiagos
BHT butilintas hidroksitoluenas (angl. butylated hydroxytoluene) CAT katalazė
DNR deoksiribonukleorūgštis (angl. DNA – Deoxyribonucleic acid) DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
FIC geležies (II) jonų sujungimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay) GAE galo rūgšties ekvivalentas
GPx glutationo peroksidazė GRx glutationo reduktazė GSH glutationas
LOOH Vandenilio lipido peroksidas
NADPH Nikotinamido adenino dinukleotido fosfato redukuota forma RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species)
ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species) SOD superoksido dismutazė
TE trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalent) UV ultravioletinė spinduliuotė
2. ĮVADAS
Oksidacinis stresas susijęs su tam tikrų ligų išsivystymu [16]. Oksidacinio streso priežastis disbalansas tarp žalojančių faktorių gamybos ir antioksidacinio atsako. Oksidacinį stresą gali sukelti laisvieji radikalai [6]. Laisvieji radikalai apibūdinami kaip nestabilios molekulės, turinčios elektronus, kurios gali reaguoti su įvairiais organinės kilmės substratais, tokiais kaip DNR, lipidai ar baltymai [44]. Antioksidantai užkerta kelią oksidacinio streso pasireiškimo tikimybei tokiu būdu apsaugodami organizmą nuo daugiaveiksmių ligų, tokių kaip vėžys, cukrinis diabetas, nervų, plaučių, širdies ir kraujagyslių ligų išsivystymo [32,49,58].
Daug bioaktyvių junginių randama vaisiuose, daržovėse, žoliniuose augaluose [26]. Mokslininkai teigia, jog du trečdaliai žinomų augalų gali būti naudojami skirtingų ligų gydymui. Ypač daug augaluose randamų junginių pasižymi antioksidacinėmis savybėmis. Antioksidantai kaupiami skirtingose morfologinėse augalų dalyse: žieduose, lapuose, stiebuose, sėklose, butonuose, skrotelėse, vaisiuose [32]. Nustatyta, kad augalų gebėjimas kaupti įvairių antioksidantų bei kitokių medicinoje naudingų junginių priklauso nuo augalo rūšies, chemotipo, augavietės geografinės padėties, augimo sąlygų, dirvožemio rūšies. Sudėtinga rasti augalus, kurie turėtų tokią pat junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, net tokios pačios rūšies augalų cheminių junginių sudėtis gali skirtis [15,26].
Paprastasis perluotis (Anthyllis vulneraria) priklauso Anthyllis L. genčiai, Loteae tribui ir Fabaceae šeimai. A. vulneraria yra plačiai paplitęs teritorijose nuo Volgos upės ir Šiaurės Europos iki pat Viduržemio jūros. Šias laikais augalas introdukuotas Šiaurės Amerikoje ir Naujojoje Zelandijoje [31]. A. vulneraria kaip vaistinis augalas aprašytas tik tam tikrose rytų Europos šalių farmakopėjose, bet per pastaruosius metus atsirado didesnis susidomėjimas augalu ir vakarų Europoje bei kituose žemynuose [31,19,50,62,22]. Šio augalo žaliavų vartojimas tradicinėje medicinoje yra platus: įvairių uždegimų ir metabolizmo sutrikimų, burnos ir gerklės ligų gydimui, žaizdų gijimui, spuogų naikinimui. A. vulneraria įeina į kompleksinių fitopreparatų, skirtų organizmo intoksikacijos simptomų mažinimui, sudėtį. Tyrimais įrodyta, jog alkoholinis A. vulneraria ekstraktas trukdo daugintis herpeso 1 bei poliomielito 2 virusams in vitro. Nustatyta, jog A. vulneraria ekstraktus galima naudoti kaip priemonę skatinančią plaukų augimą [19,62].
Kadangi Lietuvoje dar nebuvo atlikta A. vulneraria fenolinių junginių kiekybinės sudėties bei antioksidacinių savybių tyrimų, tikslinga ištirti bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį skirtingų A. vulneraria cenopopuliacijų žaliavose, nustatyti šių rodiklių kitimo dinamiką atskirose morfologinėse augalų dalyse ir fenologinių tarpsnių kaitoje bei įvertinti paprastųjų perluočių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo tikslas: Ištirti skirtinguose Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos regionuose natūraliai
augančių ir kultūroje auginamų paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) žaliavų bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei jų antioksidacinį aktyvumą.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Ištirti skirtinguose Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos regionuose natūraliai augančių ir
kultūroje auginamų paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) žaliavų bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei jų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1) Parinkti optimalias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš A. vulneraria žaliavų bandinių.
2) Spektrofotometriniu metodu nustatyti bendrąjį fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį ir šių rodmenų įvairavimą A. vulneraria žaliavų mėginiuose.
3) Įvertinti A. vulneraria ekstraktuose esančių biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus taikant spektrofotometrinius ABTS, DPPH, FIC metodus.
4) Nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties rodiklių bei antioksidacinio aktyvumo pokyčius skirtingų fenologinių tarpsnių A. vulneraria žaliavose.
5) Įvertinti koreliacinius ryšius tarp A. vulneraria augalinių žaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Oksidacinis stresas ir laisvieji radikalai
Terminas oksidacinis stresas yra naudojamas apibūdinant dažniausiai negrįžtamą žalą ląstelei, audiniams arba konkrečiam organui, kurį sukelia aktyvieji deguonies junginiai (ROS) bei aktyvieji azoto junginiai (RNS) [6].
Laisvieji radikalai tai molekulės, atomai ar jų grupės, kurios turi vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų savo išoriniame apvalkale [44]. ROS, priklausomai nuo koncentracijos, gali būti naudingas arba žalingas ląstelėms bei audiniams. Mažos ROS koncentracijos atlieka redokso nešiklių funkciją ląstelių signalizavimo ir reguliavimo sistemose, tačiau ROS perteklius slopina baltymų funkciją ir skatina ląstelių žūtį [11]. ROS susidaro vykstant deguonies redukcijai ir sudaro dvi grupes molekulių: 1) laisvuosius radikalus su trumpu pusperiodžiu, tokius kaip superoksidoanijonas (O2·ˉ), hidroksilo
radikalas (OH·), azoto oksidas (·NO) ir 2) neradikalus, tokius kaip singletinis deguonis (1O2),
vandenilio peroksidas (H2O2), hipochlorito rūgštis (HOCl), peroksinitritas (ONOOˉ) ir lipidų
peroksidai (LOOH). Pastarieji yra stabilesni ir turi ilgesnį pusperiodį nei laisvieji radikalai. Nors jie nėra radikalai tačiau taip pat yra vadinami oksidatoriais, nes lengvai gali sukelti oksidacinę pažaidą gyvuosiuose organizmuose [44,58]. RNS priklauso peroksinitritas (ONOOˉ), azoto dioksidas (·NO2),
nitrinti lipidai [59]. Laisvųjų radikalų susidarymas schematiškai pavaizduotas 1 pav. [9].
1 pav. Laisvųjų radikalų susidarymas [9]
Kai pH 7, hidroperoksilo radikalas (HO2·) disocijuoja iki superoksidoanijono radikalo (O2·ˉ).
Šis radikalas yra labai reaktyvus ir gali sąveikauti su daug skirtingų molekulių, taip generuodamas ROS tiesiogiai. Taip pat ROS jis gali generuoti per fermentų arba metalų katalizacijos procesus. Vykstant dismutacijai, superoksidoanijonas sąveikaudamas su superoksido dismutaze (SOD) gali būti detoksikuotas iki vandenilio peroksido. Galiausiai virsta vandeniu veikiamas fermento katalazės
(CAT). Jei vandenilio peroksidas reaguoja su Fe2+ jonais, susiformuoja hidroksilo radikalas (HO·) [9,17]. Kai superoksidoanijonas (O2·ˉ) prisijungia prie centrinio anglies atomo radikale L·, susidaro
peroksilo radikalas (LOO·) [25]. Vitaminas E yra vandenilio donoras lipido peroksido radikalams [7]. Laisvieji radikalai yra labai nestabilūs, todėl biologinėse sistemose gali reaguoti su įvairiais organinės kilmės substratais, tokiais kaip lipidai, baltymai ar DNR [44].
4.2. Antioksidacinio streso poveikis organizmui
Vykdant eksperimentus su gyvūnais buvo nustatyta, jog stresinės situacijos, miego trūkumas skatina ROS gamybą [7]. Emocinis stresas ir prislėgta nuotaika taip pat turi įtakos deguonies turinčių laisvųjų radikalų susiformavimui [8,48]. Laisvųjų deguonies radikalų gali padaugėti netinkamai laikantis dietos, kai vartojama per daug riebalų ir angliavandenių, o per mažai vitaminų ir antioksidantų. ROS formavimąsi gali sąlygoti ir kiti veiksniai tokie, kaip didelis alkoholio ar vaistų vartojimas, rūkymas, rentgeno spinduliai, hipertermija, įvairūs uždegimai ir geležies perteklius [7,45].
Oksidacinis stresas gali turėti įtakos lėtinių uždegiminių procesų išsivystymui, kurie gali tapti tokių daugiaveiksmių ligų kaip vėžys, cukrinis diabetas, nervų bei plaučių ligų priežastimi [49]. Nustatyta, kad jis yra svarbus tokių širdies ir kraujagyslių ligų kaip aterosklerozė, hipertenzija, miokardo infarktas patogenezėje [58]. Iš viso žinoma daugiau nei šimtas skirtingų ligų, kurias gali sukelti oksidacinis stresas [16].
4.2.1. Lipidų peroksidacija
Dažniausiai superoksidoanijonas ir hidroksilo radikalas inicijuoja autokalitinių lipidų peroksidaciją, kurią katalizuoja pereinamieji metalai. Lipidų peroksidacija - nesočiųjų lipidų virtimas lipidų hidroperoksidais. Tai sukelia padidėjusį membranų takumą, citozolinių skysčių ištekėjimą ir membranos baltymų aktyvumo praradimą. Stipri lipidų peroksidacija koreliuoja su membranos vientisumo praradimu ir ląstelių žūtimi [5].
4.2.2. DNR oksidacija
Manoma, jog hidroksilo radikalas ir singletinis deguonis yra pagindiniai ROS, kurie sąlygoja DNR pažaidas, tačiau ir kiti prooksidantai gali pažeisti DNR. DNR yra linkusi geležies katalizuojamai oksidacijai. Geležies jonai jungiasi prie fosfodiesterio pagrindo, kur vėliau susidaro hidroksilo radikalai. Nors oksidacinis stresas daro žalą DNR, tačiau nėra aišku ar tokia žala yra mirtina eukariotų ląstelėms [5].
4.2.3. Baltymų oksidacija
Yra žinoma, jog vieni baltymai yra jautresni oksidacinei pažaidai nei kiti. Tokį selektyvumą lemia oksidacijai jautrių aminorūgščių fragmentų kiekis jų struktūroje, metalų jungimosi vietų buvimas, baltymų vieta ląstelėje, molekulinė konformacija ir degradacijos greitis. Naujai susintetinti baltymai yra jautresni oksidaciniams pažeidimams. Oksidacijai jautrūs baltymai yra susiję su tam tikrais metabolizmo keliais bei funkcijomis. Tam tikrų žmogaus ligų ankstyvose degeneracijos stadijose baltymo oksidacija pažeidžia gyvybinius energijos metabolizmo kelius. Oksiduoti baltymai kaupiasi pas pacientus su supranukleariniu paralyžiumi, sergančius senatvės ligomis ir dėl kitokių priežasčių [5].
4.3. Antioksidantai
Oksidacinis stresas yra malšinamas antioksidantais [44]. Antioksidantai apibrėžiami kaip cheminės medžiagos, kurios mažesnėse koncentracijose nei oksiduojami junginiai, tokie kaip DNR, baltymai, riebalai ar angliavandeniai, uždelsia arba užkerta kelią ROS žalai [7]. Idealus antioksidantas toks, kurį lengvai pasisavina organizmas [45]. Antioksidantai pasigamina natūraliai žmogaus organizmo (viduje) arba gaunami iš maisto produktų ar maisto papildų. Endogeniniai ir egzogeniniai antioksidantai padeda užkirsti kelią ir neleidžia padaryti žalos, kurią sukelia ROS ir RNS, stiprina imuninę sistemą ir apsaugo nuo oksidacinio streso sukeltų ligų. Endogeniniai antioksidantai gali būti klasifikuojami kaip fermentiniai antioksidantai ir nefermentiniai antioksidantai. Pagrindiniai fermentiniai antioksidantai, kurie tiesiogiai dalyvauja ROS ir RNS neutralizacijoje, yra superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT), glutationo peroksidazė (GPx) ir glutationo reduktazė (GRx) [44]. Nefermentiniams antioksidantams priskiriami tokoferolis, askorbo rūgštis, redukuotas glutationas
(GSH), šlapimo rūgštis, koenzimas (kofermentas Q), albuminas, bilirubinas, NADPH [7,39]. Endogeninių antioksidantų neužtenka pilnai organizmo apsaugai, labai svarbūs ir egzogeniniai antioksidantai. Egzogeniniai antioksidantai išvardinti (1 lentelė). Tam, kad organizmas būtų apsaugotas nuo oksidacinio streso, žmogaus organizmui nuolat reikalingi egzogeniniai antioksidantai. Tačiau dideliais kiekiais jie gali būti toksiški [10]. Jei ROS kiekis ląstelėse nedidelis, tai ir atitinkamai efektyvus antioksidantų kiekis gali būti mažas [15].
1 lentelė Egzogeniniai antioksidantai [7]
Šiandien sukaupta pakankami mokslinių įrodymų, kad svarbu maitintis produktais, kurie savo sudėtyje turi daug natūralių antioksidantų, tokių kaip įvairūs vitaminai ar polifenoliai). Žmogus organizmas negali sintetinti šių antioksidantų. Augaliniai maistiniai produktai, tokie kaip obuoliai, slyvos, bananai, pomidorai, bulvės, svogūnai, brokoliai ir daugelis kitų, yra natūralus šių antioksidantų šaltinis [7].
4.4. Fenoliniai junginiai
4.4.1. Fenolinių junginių bendroji charakteristika
Fenoliniai dariniai sudaro didžiausią grupę antrinių metabolitų, kuriuos sintetina aukštesnieji augalai. Šie produktai evoliucijos eigoje, pradedant nuo melsvadumblių pirmtakų, išsivystė kaip
antioksidacinė ląstelių apsauga. Daugelis fenolinių junginių yra svarbūs augalams, gali apsaugoti nuo žalingų mikroorganizmų, suteikia augalams nemalonų skonį, todėl jų neėda žolėdžiai gyvūnai [4]. Fenoliniams junginiams priklauso flavonoidai, fenolinės rūgštys ir taninai [36].
Didžiausią augalinės kilmės fenolinių junginių grupę sudaro flavonoidai, tai daugiau nei pusė iš aštuonių tūkstančių žinomų polifenolių [36]. Pagrindinės flavonoidų klasės yra flavonoliai, flavonai, flavanonai, flavanoliai (katechinai), izoflavonai (izoflavanoidai) ir antocianidai. Flavonoidų klasės klasifikuojamos pagal skirtumus C žiede [28,36]. Bendrąją flavonoidų struktūrą (2 pav.) sudaro du aromatiniai žiedai (A ir B) sujungti trimis anglies atomais, kurie suformuoja deguonies turintį heterociklinį žiedą (C). Flavonolių C žiede tarp C2 ir C3 yra dvigubasis ryšys, C4 padėtyje keto grupė ir
C3 padėtyje hidroksilo grupė. Flavonai C žiede neturi hidroksigrupės C3 padėtyje ir turi prisotintą C
žiedą. Flavanolių C žiede nėra dvigubo ryšio tarp C2 ir C3 bei keto grupės C4 padėtyje. Izoflavonams,
skirtingai nei kitoms flavonoidų klasėms, būdinga tai, jog B žiedas yra prisijungęs prie C žiedo C3, o
ne C2 padėtyje.
2 pav. Bendroji flavonoidų struktūra [19]
Hidroksilo grupių skaičius B žiede bei jų išsidėstymas yra labai svarbus antioksidaciniam fenolinių junginių aktyvumui. Remiantis moksliniai tyrimais 3', 4' -O-dihidroksilo grupės yra esminis flavonoidų antioksidacinio aktyvumo indikatorius, ypač tiems, kurie nepriskiriami flavonoliams. Flavonoidų su o-dihidroksilo grupe B žiede aktyvumas paaiškinamas santykinai dideliu susidariusių radikalų stabilumu, kurį sąlygoja padidėjusi elektronų delokalizacija ir vidumolekuliniai vandeniliai ryšiai tarp 3' ir 4' hidroksigrupių. Papildoma hidroksilo grupė 5' B žiedo padėtyje mažina antioksidacinį aktyvumą. 2,3 padėtyje dvigubo ryšio, 4 padėtyje keto grupės arba 3 padėtyje hidroksilo grupės praradimas C žiede mažina aktyvumą flavonoidams turintiems B žiede katecholio grupę. Jei junginio B žiede C2 ir C3 padėtyse yra dvigubasis ryšys, o C4 padėtyje keto grupė, tai nors vienos iš
šių grupių netekimas ženkliai sumažina antioksidacinį aktyvumą [28].
Kaip ir flavonoidai, fenolio rūgštys taip pat yra svarbi ir plačiai paplitusi fenolinių junginių klasė augaluose. Šios rūgštys dažniausiai sutinkamos netirpių darinių formomis ir būna sudėtingesnių junginių, tokių kaip taninų bei lignanų komponentai. Fenolio rūgštis galima suskirstyti į dvi grupes:
hidroksibenzoines ir hidroksicinamono rūgštys. Dažniausiai sutinkama hidroksibenzoinės rūgštys yra galo rūgštis, o tarp hidroksicinamono rūgščių - kavos, ferulo, p- kumaro [34,36]. Šios rūgštys gali būti susijungusios su struktūriniais ląstelės sienelės komponentais, tokiais kaip celiuliozė, ligninas, ar baltymais [34]. Fenolio rūgštyse karboksilo grupė yra tiesiogiai ar per C2 tiltelį prijungta prie benzeno
žiedo (3 pav.) [29].
3 pav Fenolio rūgštys [21]
Taninai randami augaluose, dažniausiai aptinkami junginiuose su katechinais ir elago rūgštimi [61]. Taninai gali būti skirstomi į hidrolizuojamuosius taninus ir kondensuotuosius taninus arba pastovios struktūros polifenolius ir kintamos sudėties polifenolius. Taninai turi didesnę molekulinę masę palyginus su kitais augaliniai polifenoliais ir kitaip jungiasi prie baltymų bei didelių molekulinių junginių. Kondensuotieji taninai, priklausomai nuo augalo augimo būdo ir kaupiamų atsarginių medžiagų, nustatomi sezoniškai iš dalies modifikuotos struktūros [41].
4.4.2. Fenolinių junginių antioksidacinio poveikio mechanizmas
Fenoliniai junginiai kaip antioksidantai gali veikti net keliais būdais. Fenolinės hidroksilo grupės yra geri vandenilio jonų donorai. Antioksidantai, kurie yra vandenilio donorai, gali reaguoti su ROS ir RNS, tokiu būdu nutraukdami radikalines reakcijas, kurios sustabdo naujų radikalų susidarymą. Po antioksidantų reakcijos su pirminiais radikalais, susidaręs radikalas pasižymi didesniu cheminiu stabilumu nei pradinis radikalas. Fenolinių hidroksilo grupių sąveika su benzeno žiedo π-elektronais suteikia molekulėms specifinių savybių. Viena svarbiausių - tai gebėjimas generuoti mezomeriškai stabilizuotus radikalus. Šio proceso metu susiformuoja santykinai stabilesni radikalai, o tai leidžia sumažinti laisvųjų radikalų sukeliamą oksidacinį procesą [43].
Fenolinių junginių antioksidacinės savybės taip pat pasireiškia gebėjimu chelatuoti metalo jonus, dalyvaujančius laisvųjų radikalų susidaryme, taip sumažinamas ROS susidarymas. Reakcijos
gali vykti su geležies bei vario jonais bei redukuotais fenoliniais arba furano junginiais (4 pav.), tokiais kaip askorbo rūgštis (AcsHˉ) [35,43].
4 pav. Reakcija su geležies arba vario jonais bei redukuotu furano junginiu [35]
Fenoliai junginiai dažnai gali stipriai sąveikauti su baltymų hidrofobiniais benzenų žiedais. Dėl šios sąveikos fenoliai taip pat veikia kaip antioksidantai. Jie gali slopinti kai kuriuos fermentus dalyvaujančius radikalų susidaryme, tokius kaip įvairios citochromo P450 izoformos, lipoksigenazė, ciklooksigenazė [43].
Fenoliai junginiai yra aromatiniai vandenilio donorai bei pasižymi grandinines reakcijas stabdančiu veikimu [18]. Maisto sistemose, kuriose yra gausu laisvųjų radikalų (R·), polifenoliai (POH) elgiasi kaip vandenilio donorai, jie „deaktyvuoja“ oksidacinėmis savybėmis pasižyminčius junginius veikdami, kaip antioksidantai [3].
R· + POH → RH + PO∙
Susidarę fenoksilo radikalai (PO∙) gali būti stabilizuoti vandeniliniais ryšiais [3]. PO∙ + PO∙ → PO- PO
Nors ir yra daug skirtingų antioksidacinio aktyvumo tyrimo in vitro metodų, tačiau labai sudėtinga ekstrapoliuoti antioksidantų efektyvumą in vivo. Ypač sudėtinga vienareikšmiškai nustatyti, ar antioksidantas gali būti efektyvus ligų prevencijai bei gydymui. Kai kurių tyrėjų duomenimis dar nėra atlikta tyrimų, kurie parodytų patikimą koreliaciją tarp antioksidantų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ir jų antioksidacinio efektyvumo in vivo. Tačiau labai svarbu kompleksiškai įvertinti antioksidantų efektyvumą in vitro [40].
4.4.3 Fenolinių junginių ekstrakcija ir antioksidacinio aktyvumo nustatymo
metodai
Antioksidacinių junginių išskyrimui iš skirtingų augalinių žaliavų yra naudojami įvairūs ekstrakcijos metodai. Vandenyje tirpūs fenoliniai junginiai didesnėmis koncentracijomis yra kaupiami išoriniuose vaisių ir grūdų audiniuose (epidermyje), o ne giliau esančiuose (apyvaisyje, minkštime). Ekstrahavimas tirpikliu yra dažniausiai naudojamas augalo antioksidacines savybes turinčių junginių išskyrimui. Ekstrakto išeiga ir išskirtų iš augalinių žaliavų antioksidantų aktyvumas labai priklauso
nuo naudojamo ekstrahento, atsižvelgiant į jų tirpumą pasirinktame tirpiklyje. Polifenolinių junginių ekstrakcija tinkamiausi ekstrahentai yra etanolio, metanolio, acetono bei etilacetato vandeniniai tirpalai [54]. Alkoholiai metanolis ir etanolis yra plačiai naudojami ekstrahuojant antioksidacinius junginius iš įvairių augalų ir augalinės kilmės produktų tokių kaip bulvės, braškės, obuoliai, ginkmedis, ežiuolė, ženšenis, paprastasis perluotis, rudėtoji rusmenė, šalavijas ir daugelis kitų [37,54,56]. Etilo acetatas dažniausiai naudojamas ekstrahuojant antioksidacinius junginius iš svogūnų ar citrusinių augalų žievelių. Dideli fenolinių junginių kiekiai iš ryžių sėlenų bei Aliejinės Moringos lapų buvo gauti ekstrahentu naudojant etanolio ir acetono mišinį [54].
Folin-Ciocalteu (F-C) tyrimas tai klasikinis metodas naudojamas fenolinių junginių kiekio nustatymui įvairiuose maisto produktuose, maisto papilduose ir augalinėse žaliavose. F-C metodas remiasi fenolinių junginių elektronų perdavimo reakcijomis silpnai šarminėje terpėje susidarant mėlynos spalvos kompleksams, kurie yra nustatomi spektroskopiškai esant 720-765 nm bangos ilgiui. F-C metodikoje kaip etaloninis junginys yra naudojama galo rūgštis. Reikalingas tyrimui pH palaikomas pridedant natrio karbonato [2,10,46]. F-C yra vienas iš plačiausiai taikomų metodų fenolinių junginių kiekiui nustatyti. Tai gana nesudėtingas metodas, nereikalaujantis daug išlaidų, efektyvus naudojant nedidelės koncentracijos ekstraktus, plačiai taikomas skirtingų augalinių žaliavų analizei [10].
Vienas plačiausiai naudojamų metodų bendrojo flavonoidų kiekio nustatymui remiasi chelatavimo reakcijomis su AlCl3. Tyrimo metu Al jonai sudaro stabilius chelatinius kompleksus su
flavonoidais. Po 30 min. mišinio absorbcija matuojama spektrofotometru esant 404-430 nm bangos ilgiui. Remiantis išmatuotomis absorbcijomis tyrimo rezultatai būna pateikiami mg/g pagal rutino ekvivalentą (RE) [14,42,52].
1958 m. Bloisas pirmą kartą panaudojo α-difenil-β-pikrilhidrazilo (DPPH; C18H12N5O6)
radikalų surišimo metodą. DPPH ištirpinti etanoliniame tirpiklyje tirpalui suteikia violetinę spalvą. DPPH tirpalą sumaišant su medžiagomis, kurios yra vandenilio atomo donorai, tokiomis kaip antioksidantai, susidaro redukuota jo forma, kuri yra geltonos spalvos (5 pav.) [27,47].
Šiuo metodu spektrofotometriškai matuojamas mėginių absorbcijos dydžio mažėjimas esant bangos ilgiui 515-517 nm iki to momento kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra. Paprastai ji pasiekiama 5-30 min. intervale. Šis metodas yra greitas, paprastas, nebrangus ir suteikia pakankamai tikslią informaciją apie tiriamos žaliavos ekstraktų antioksidacinį aktyvumą [27,47].
Chelatines fenolinių junginių savybes galima nustatyti naudojant fotometrinį dvivalentės geležies (FIC) jonų sujungimo metodą. Tarp daugelio metalų jonų stipriausiu prooksidantu yra laikomas Fe2+. Šiam tyrimui inicijuoti yra naudojamas ferozinas, kuris reaguodamas su Fe2+ sudaro raudonos spalvos kompleksą. Po 10 min. spektrofotometru matuojama absorbcija esant 562 nm bangos ilgiui. Ekstrakto antioksidacinis aktyvumas dažniausiai yra išreiškiamas procentais [21,51].
Taip pat antiradikaliniam junginių savybių nustatymui gali būti naudojamas ABTS radikalų – katijonų surišimo metodas. Taikant šį metodą antiradikalinis ekstraktų aktyvumas būna įvertinamas trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos. ABTS analizė grindžiama mėlynai-žalių, (ABTS⁺·) radikalų redukcija. Šią redukciją sukelia tiriamųjų augalų ekstraktai, turintys savo sudėtyje antioksidantų. ABTS radikalas - katijonas prisijungia vandenilio atomą iš antioksidanto. Absorbcija matuojama spektrofotometru esant 734 nm bangos ilgiui [13,57].
In vitro tyrimus tikslinga vykdyti keletu metodų, nes fenoliniai junginiai gali funkcionuoti kaip antioksidantai keliais mechanizmais [13,27,57].
4.5. Paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) bendroji charakteristika
Gentis Anthyllis L. priklauso Loteae tribui ir Fabaceae šeimai bei yra glaudžiai susijusi su Hymenocarpus gentimi. Paprastasis perluotis (Anthyllis vulneraria) yra paplitęs teritorijose nuo Volgos upės ir Šiaurės Europos iki pat Viduržemio jūros. Taip pat šis augalas buvo introdukuotas Šiaurės Amerikoje ir Naujojoje Zelandijoje [31]. Anthyllis L taksonomiia yra sudėtinga, skirtinguose šaltiniuose rūšių skaičius nurodomas vis kitoks ir svyruoja nuo 25 iki 60 [31,50].
6 pav. Paprastasis perluotis (Anthyllis vulneraria L.) [60]
A. vulneraria skirstymas į porūšius yra labai sudėtingas. Taikoma daug skirtingų paskirstymo į porūšius variacijų, o labiausiai nusistovėjęs požiūris, jog yra išskiriami septyni porūšiai. Pati paprasčiausia rūšių skirstymo charakteristika yra pagal augalo plaukelių dispoziciją ant stiebo ir lapkočio. A. vulneraria porūšiai polyphylla ir colorata turi aiškius plaukelius ant stiebų ir lapkočių, o kiti porūšiai prispaustus prie stiebo bei lapkočio. Dvispalvė raudonai oranžinė A. vulneraria ssp. coccinea, baltica ir colorata taurelė atskiria nuo likusių keturių porūšių, kuriems būdinga vienspalvė žalia taurelė. A. vulneraria ssp. maritima skiriasi žydinčiomis taurelėmis, jų šilkinės pūkuotos taurelės ir žiedynai su keliais žiedais kartais būna ne pilnai išsivystę. Taip pat porūšį galima nustatyti pagal žiedkočių ilgį žiedynuose bei jų formą. A. vulneraria ssp. arenaria chrakteringi gerai išvystyti žiedynai, kurie yra auga tiesiai iš kotelių ir su stiebu sudaro smailų kampą. A. vulneraria porūšis coccinea pakankamai lengvai atskiriamas pagal raudonos spalvos žiedvainikį. Anthyllis x baltica kaip ir maritima turi keletą neišsivysčiusių žiedynų lapų pažastyse [31].
Natūralioje aplinkoje šis augalas yra daugiametis, pirmais metais vyksta vegetacija be žydėjimo, o žydėjimas - 1-5 augimo metais. Augalas paprastai negyvena ilgiau 5 metų. A. vulneraria pradeda žydėti birželio mėnesį. Augalo stiebai susitelkę į 1-14 žiedų galvučių su 10-25 žiedų. [23,22]. Žiedai yra baltai geltonos spalvos 2-3 cm pločio [33]. Vaisiai ir sėklos susiformuoja pora savaičių po žydėjimo, vaisiuje paprastai būna viena sėkla [23]. Vaisius įprastai sveria apie 3,5 mg. A. vulneraria nesidaugina vegetatyviškai. Sėklos yra reiklios dirvožemiui, plinta epizoochorijos būdu arba dėl žmonių agrarinės veiklos. [22]. Paprastojo perluočio aukštis varijuoja nuo 5 iki 60 cm [19,23,33,50]. Aukščiausias A. vulneraria ssp. maritima užauga iki 60 cm [50]. Belgijoje buvo ištirti A. vulneraria genetinės struktūros skirtumai priklausomai nuo paplitimo skirtinguose arealuose. Išsiaiškina, jog ryškių genetinių skirtumų tarp paprastųjų perluočių nebuvo aptikta, nepriklausomai nuo vietovės, kurioje augalai augo [23].
Paprastasis perluotis laikomas vertingu pašariniu augalu. Taip pat augalo užpilai ir tinktūros naudojamos tradicinėje medicinoje, uždegimų ir metabolizmo sutrikimų gydymui, bei spuogų naikinimui. Taip pat augalo arbatos, ekstraktai bei užpilai naudojami greitesniam žaizdų gijimui, burnos ir gerklės lygų gydymui bei augalinė žaliava įeina į fitopreparatų, organizmo intoksikacijai gydyti, sudėtį. Nustatyta, jog spiritinis Anthyllis vulneraria ekstraktas trukdo daugintis herpeso 1 ir poliomielito 2 virusams in vitro. Yra įrodymų, jog A. vulneraria ekstraktus galima naudoti kosmetologijoje skatinant plaukų augimą [19,62].
Atliekant antžeminių A. vulneraria dalių tyrimus, nustatyta, jog jose yra daug magnio, geležies bei mangano. Aptinkamas mažesnis vario ir cinko kiekis, palyginus su kitais pašariniais ir vaistiniais augalais. Aliuminio ir kitų sunkiųjų metalų kiekis neviršija maksimalaus leistino lygio. Galima teigti, jog A. vulneraria žaliavoms charakteringas gerai subalansuotas mikro- bei
makroelementų kiekis, savo kokybe viršijančia daugelį kitų pašarinių augalų, todėl gali būti naudojamas kaip pilnavertis pašarinis augalas [62]. A. vulneraria žaliavose nustatomi saponinai, flavonoidai (kvercitinas, kemferolis, izoramnetinas, ramnocitrinas, ramnetinas, fisetiną, geraldolį), antocianinus, fenolines rūgštis, karotinoidus ir taninus [12]. Šio augalo žaliavose esantys fenoliniai junginiai suteikia antioksidacinių savybių, todėl reikšminga nustatyti ar A. vulneraria galėtų būti vartojamas kaip vaistinis augalas [12,19,62].
5. TYRIMO METODIKA IR METODAI
5.1. Tyrimų objektas
Tyrimams naudotos natūraliai augančių paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria L.) augalų augalinės žaliavos, surinktos iš 17 skirtingų Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos teritorijse esančių augaviečių, masinio žydėjimo metu (7 pav.).
7 pav. A. vulneraria žiedų, lapų, stiebų žaliavų rinkimo vietos gamtinėse cenopopuliacijose 17 gamtinių cenopopuliacijų surinkti augalinės žaliavos pavyzdžiai buvo suskirstyti į lapus, žiedus ir stiebus, taip buvo gauti trijų augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdžiai. Tyrimams buvo naudojamos žiedų, lapų, stiebų, butonų, skrotelių žaliavos iš 17 skirtingų regionų (Lietuva: Klaipėda, Juodkrantė, Biržai, Kėdainiai, Prienai, Vilnius, Garliava, Marijampolė, Trakai, Alytus, Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodas (, Veršvo kraštovaizdžio draustinis, Daugyvenės kraštovaizdžio draustinis; Latvija: Liepoja, Daugavpils; Lenkija: Sopotas, Suvalkai).
Fenolinių junginių kiekiui ir antioksidaciniam aktyvumo kitimo fenologinių vystymosi tarpsnių kaitoje įvertinimui A. vulneraria žaliavos buvo surinktos Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sode, Veršvo kraštovaizdžio draustinyje ir Daugyvenės kraštovaizdžio draustinyje 2016 m. Žaliavą sudarė antžeminės augalo dalys, trijose fenologinėse fazėse: skrotelės, butonizacijos ir masinio žydėjimo. Augalai buvo suskirstyti į stiebus, lapus ir reprodukcinius organus.
Surinktos žaliavos džiovinimas vykdomas gerai vėdinamoje, nuo saulės spindulių apsaugotoje sausoje patalpoje esant kambario temperatūrai (20-25ºC).
5.2. Naudotos medžiagos ir reagentai
Visi tyrimų metu naudoti reagentai buvo analitinio švarumo. Fenolinių junginių nustatymui buvo naudoti Folin-Ciocalteu fenolinis tirpalas (2M) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Šveicarija), galo rūgšties monohidratas (≥98,0%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Kinija), natrio karbonatas (99,5-100,5%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Prancūzija), Flavanoidų kiekiui nustatyti buvo naudotas rutino hidratas (≥94%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Vokietija), acto rūgštis (100%) įsigyta iš Carl Roth GmbH (Vokietija), aliumino chlorido heksahidratas (≥95%) įsigytas iš Carl Roth GmbH (Vokietija), metenaminas (≥99,5%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (Rusija), Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodams buvo naudojami DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) (95%) radikalas įsigytas iš Alfa Aesar GmbH & Co (Karlsruhe, Vokietija), ferozinas (≥97,0%) įsigytas iš Sigma-Aldrich chemie GmbH (JAV), bevandenis geležies (II) chloridas (99,5%) įsigytas iš Alfa Aesar GmbH & Co (Karlsruhe, Vokietija), ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties reagentas)) įsigytas iš ,,Alfa Aesar“, JAV); kalio persulfatas („Alfa Aesar GmbH & Co“, Vokietija), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksirūgštis) („Sigma – Aldrich“, Vokietija). Tai pat buvo naudojamas 96 proc. (V/V) etanolis įsigytas iš UAB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva) ir išgrynintas vanduo.
5.3. Naudota aparatūra
Spektrofotometrinei analizei naudoti spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) ir „Agilent Technologies“ (Cary 60,JAV). Bandinių ekstrakcijai atlikti naudota ultragarso vonelė „ElmaSonic S40H“ (Elma Schmidbauer GmbH, Vokietija) ir orbitalinė kratyklė „IKA®KS 130 basic (Vokietija).
5.4. Tyrimų metodai
5.4.1. Tiriamųjų mėginių paruošimas
Paprastųjų perluočių (Anthyllis vulneraria) etanolinių ekstraktų paruošimui tiksliai atsveriama 0,100 g žaliavos. Žaliava užpilama 10 ml 70 % (V/V) vandens etanoliniu tirpalu, kurio litrui pagaminti naudojama 665 ml 96% etanolio užpilant išgrynintuoju vandeniu iki 1 l. Mėginiai veikiami ultragarso vonelėje 15 min. esant 50 ºC temperatūrai. Ekstraktai filtruojami į matavimo cilindrą, naudojant popierinius filtrus. Žaliava praplaunama 70 % (V/V) vandens etanoliniu tirpalu iki 10 ml. Iš kiekvienos žaliavos pagaminami du mėginiai, o iš viso buvo pagaminti 123 ekstraktai.
5.4.2. Reagentų paruošimas
70 % (V/V) etanolio tirpalas ruošiamas remiantis alkoholimetrinėje lentelėje pateiktomis duomenimis, 665 ml 96 % (V/V) etanolio skiedžiant 335 ml išgryninto vandens.
0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas matavimo cilindre 10 ml Folin-Ciocalteu (2M) reagentas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
7,5 % (W/V) Na2CO3 tirpalas ruošiamas 7,5 g bevandenio natrio karbonato tirpinant 100 ml
išgryninto vandens.
33 % acto rūgšties tirpalas ruošiamas 33 ml 99,8 % ledinę acto rūgštį skiedžiant išgrynintu vandeniu matavimo cilindre iki 100 ml žymos.
10 % aliuminio chlorido tirpalas ruošiamas 20,0 g aliuminio chlorido tirpinant 200 ml išgryninto vandens.
Rutino etanolinis tirpalas ruošiamas naudojant tiksliai atsveriant 0,025 g 99 % grynumo rutino ir tirpinant 25 ml 70 % (V/V) etanolio tirpalo.
5 % metenamino tirpalas ruošiamas 5 g metenaminą tirpinant 100 ml išgryninto vandens. 2mM FeCl2 tirpalas ruošiamas tiksliai atsveriant 0,0063 g FeCl2 ir tirpinant 25 ml išgryninto
vandens. Prieš kiekvieną tyrimą paruošiamas naujas FeCl2 tirpalas.
5 mM ferozino tirpalas ruošiamas tiksliai atsveriant 0,0616 g ferozino ir tirpinant 25 ml išgryninto vandens.
Kiekvieną tyrimo dieną paruošiamas vis naujas DPPH tirpalas. 6 x 10-5 DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) gaminamas tiksliai atsveriant 0,00118 g DPPH reagento ir tirpinant 50 ml 96 % (V/V) etanolyje. Gautas tirpalas laikomas tamsaus stiklo butelyje apsaugančiame nuo saulės spindulių.
ABTS (2,2-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties reagento)) tirpalas ruošiamas atsveriant tikslų kiekį 0,0548 g ABTS miltelių ir tirpinant 50 ml išgryninto vandens bei pridedant 70 mM kalio persulfato tirpalo. Kalio persulfato tirpalas pagaminamas tiksliai atsveriant 0,000945 g kalio persulfato tirpinant 50 ml vandens. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 16 valandų.
5.4.3. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendrajam fenolinių junginių kiekiui žaliavoje nustatymas atliekant taikant spektrofotometrinę analizę ir naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Analizei panaudojama 1ml tiriamojo ekstrakto (1:100) ir gerai sumaišomas su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu. Praėjus 4 minutėms įpilama 7,5 % (W/V) natrio karbonato tirpalo. Po valandos esant 765 nm šviesos bangos ilgiui matuojamas optinis tankis. Kaip palyginamasis tirpalas yra naudojamas išgrynintas vanduo. Kiekvienas ekstraktas yra matuojamas mažiausiai tris kartus, norint gauti kuo mažesnę rezultatų paklaidą.8 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)
Remiantis galo rūgšties kalibracine kreive (8 pav.), bendras fenolinių junginių kiekis reiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) taikant formulę:
GRE (mg/g) = c x V/m;
c- galo rūgšties koncentracija (mg/g); V- pagaminto ekstrakto tūris (ml); m- tikslaus žaliavos svėrinio kiekis (g).
5.4.4. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti turi būti pagaminami du tirpalai: lyginamasis ir tiriamasis. Tiriamasis tirpalas paruošiamas į 25 ml matavimo kolbą įpilant 1ml (1:100) tiriamojo etanolinio ekstrakto, 10 ml 96% (V/V) etanolio, 0,5 ml 33% acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5% metenamino tirpalo. Gautas turinys yra praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25ml žymės ir sumaišomas. Praėjus 30 minučių matuojama absorbcija ir lyginama su palyginamoju tirpalu esant bangos ilgiui 407 nm.
Palyginamasis tirpalas yra gaminamas įpilant į 25ml matavimo kolba 1ml (1:100) tiriamojo etanolinio ekstrakto, 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33 % acto rūgšties tirpalo. Gautas tirpalas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25ml žymės ir sumaišomas. Kiekvieno tiriamo ekstrakto absorbcija matuojama po 3 kartus.
Gauti duomenys yra vertinami palyginus gautas tiriamųjų ekstraktų absorbcijas su etaloninių tirpalų gautomis absorbcijomis. Gaminant etaloninį tiriamąjį ir palyginamąjį rutino tirpalus vietoje 1 ml ekstrakto yra įpilama 1 ml etaloninio rutino tirpalo.
Flavonoidų suminis kiekis, perskaičiuojamas rutinu bei išreiškiamas mg/g ir taikoma ši formulė:
mR – rutino masė g, sunaudota etanoliniam rutino tirpalui ruošti;
VR – etanolinio rutino tirpalo tūris, ml;
V – augalinio ekstrakto tūris, ml;
AR – etanolinio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
A – augalinio ekstrakto tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m – augalinio bandinio masė g, sunaudota ekstraktui paruošti.
5.4.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu DPPH radikalų surišimo
metodu
Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas atliekamas taikant DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodą. Šis metodas pagrįstas elektronų perdavimo reakcijomis. Mėginio paruošimui imama 50 μl tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:100) ir sumaišoma 1cm kvarcinėje kiuvetėje su 2 ml 6×10-5 M DPPH tirpalo. Tuščio bandymo paruošimui imama 50 μl (70 % V/V) etanolio ir sumaišoma su 6 x10-5 M DPPH tirpalu. Tuščias bandinys irgi paruošiamas 1cm kvarcinėje kiuvetėje.
Mėginių matavimas vyksta tol kol pasiekiama pusiausvyra (po 30 min.). Spektrofotometru matuojama esant bangos ilgiui 515 nm. Kiekvienas ekstraktas iš viso matuojamas po 3 kartus.
Antiradikalinis tiriamų ekstraktų aktyvumą išreiškiamas surišto DPPH procentais:
DPPH surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] × 100%; Ab– tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min);
Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu adsorbcijos dydis (po 30 min).
5.4.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas fotometriniu Fe2+ jonų sujungimo
metodu
Fenoliniai junginiai geba surišti pereinamųjų metalų, tokių kaip geležies ir varios, jonus sudarydami chelatus. Antioksidacinės augalinių ekstraktų savybės nustatomos matuojant Fe (II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimą esant bangos ilgiui 562 nm. Tyrimas vykdomas į 1ml tiriamo etanolinio ekstrakto (1:100) įpilant 50 μl 2 mM FeCl2 tirpalo ir gerai sumaišoma. Tam kad
reakciją būtų inicijuojama po 5 minučių įpilama 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo ir gerai sumaišoma. Praėjus 10 minučių spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija. Tuščio bandinio gamybai naudojamas 1ml 70% (V/V) etanolis, 50 μl 2 mM FeCl2 ir 0,2 ml 5mM ferozino tirpalai.
Palyginamasis tirpalas - 70% (V/V) etanolis. Kiekvienas ekstraktas iš viso matuojamas mažiausiai 3 kartus.
Tiriamųjų ekstraktų chelatinėms savybėms apskaičiuoti naudojama formulė ir rezultatai išreiškiami procentais.
Fe2+ surišimas = [(Ab-Aa)/Ab] × 100% ;
Ab- tuščio bandinio absorbcijos dydis;
Aa- bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis.
5.4.7. Antioksidacinio aktyvumo įverinimas ABTS radikalų - katijonų surišimo
metodu
Antiradikalinis tiriamųjų ekstraktų aktyvumas įvertinamas pritaikant 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono rūgšties sujungimo metodą. Iš pradžių reikia pagaminti 2mM motininį
ABTS tirpalą. Motininis tirpalas pagaminamas tiksliai atsvėrus 0,0548 g ABTS reagento ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. Pagamintas tirpalas saugomas tamsaus stiklo talpoje, kad būtų apsaugotas nuo galimo šviesos poveikio. Motininio tirpalo aktyvacijai paruošiamas 70 mM vandeninis kalio persulfato tirpalas. Motininis bei 70 mM vandeninis kalio persulfato tirpalai kruopščiai sumaišomi ir paliekami 16 valandų kambario temperatūroje. Pagamintas ABTS•+ tirpalas reaguoja su antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčiomis BAM, esančiomis tiriamųjų žaliavų ekstraktuose.
Atliekami gauto pradinio ABTS•+ tirpalo skiedimai išgrynintu vandeniu iki tol kol, esant 734 nm bangos ilgiui, gaunama tiksli tirpalo absorbcija (0,800±0,03). Tyrimas vykdomas į 3 ml praskiesto ABTS•+tirpalo įpilant 30 μl tiriamo etanolinio ekstrakto (1:100). Praėjus 60 minučių esant bangos ilgiui 734 nm nustatomas absorbcijos kitimas. Palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Kiekvienas ekstraktas iš viso matuojamas po 3 kartus.
Remiantis trolokso kalibracine kreive (9 pav.) sudaryta 400-8000 μmol/l koncentracijų intervale apskaičiuojamas tiriamųjų etanolinių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais (TE) gramui augalinės žaliavos ir apskaičiuojamas taikant formulę:
TE = c×V/m, μmol/g;
c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (μmol/l); V- pagaminto ekstrakto tūris (ml);
m – atsvertos žaliavos kiekis (g);
5.5. Duomenų analizė
Statistinės duomenų analizės ir grafiniam atvaizdavimui ir statistiniam įvertinimui atlikti pasirinktos „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) ir “SPSS 20” (IBM, JAV) kompiuterinės programos. Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuotas standartinis nuokrypis, vidurkis, standartinė paklaida bei variacijos koeficientas. Pasirinktas statistinis lygmuo – 0,05 todėl visi rezultatai kurių p<0,05 laikomi statištiškai reikšmingais. Koreliacinių ryšių įvertinimas atliktas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą.
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Tinkamiausių ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrahavimas tirpikliu dažniausiai naudojamas metodas antioksidacines savybes turintiems junginiams iš augalo išskirti. Labai svarbu parinkti tinkamą tirpiklį ir žaliavos ekstrahavimo sąlygas. Tirpiklis parenkamas atsižvelgiant įtiriamųjų medžiagų tirpumą, panaudojimą publikuotuose kitų mokslinikų darbuose. Taip pat stengiamasi parinkti mažiau toksišką tirpiklį [54]. Išanalizavus kitų tyrėjų rezultatus, kuriuose kaip tirpikliai dažniausiai naudojami alkoholiai ir jų mišiniai su vandeniu, kaip tirpiklis buvo pasirinktas etanolis, o metanolio buvo atsisakyta dėl didesnio jo toksiškumo. Kadangi mokslinėje literatūroje nebuvo rasta duomenų apie bioaktyvių junginių ekstrakciją iš paprastųjų perluočių žaliavų, todėl reikėjo atlikti tyrimus parenkant ekstrahento poliškumą, tinkamą ekstrakcijos temperatūrą ir laiką.
6.1.1. Ekstrahento poliškumo parinkimas
A. vulneraria žaliavų ekstrakcijai tinkamas ekstrahentas buvo parenkamas paprastosios maceracijos metodu. Buvo pagaminti augaliniai ekstraktai su skirtingų koncentracijų etanoliu. Kaip ekstrahentai šiuose tyrimuose buvo naudojami 40%, 50%, 60%, 70%, 80% (V/V) koncentracijų etanolio ir vandens mišiniai. Žaliavos ir ekstrahento santykis 1:100. Analizei naudojama žaliava paprastųjų perluočių žiedai. 0,100 gramų tiriamosios žaliavos užpilama atitinkamos koncentracijos etanolio ir vandens mišiniu ir 1 val. purtoma automatinėje kratyklėje. Po to laikoma 24 valandas ir dar karta purtoma 1 val. Galiausiai po ekstrahavimo ekstraktas nufiltruojamas. Buvo paruošti 3 minėtų etanolio koncentracijų ekstraktai. Kiekvieno tiriamo ekstrakto absorbcija matuojama po 3 kartus. Gauti rezultatai pateikiami grafike 10 pav.
10 pav. Ekstrahento poliškumo įvertinimas A. vulneraria žiedų bandiniuose, paprastosios maceracijos metodu (vidurkis ± standartinė paklaida). GRE-galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Iš grafike pateikiamų duomenų matyti, jog daugiausiai fenolinių junginių išekstrahuojama su 70% (V/V) etanolio ir vandens mišiniu (13,537 ± 0,321 mg/g). Dėl šios priežasties tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas 70% (V/V) etanolio ir vandens mišinys.
6.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės parinkimas
Ekstrakcijos ultragarsu tinkamam laiko parinkimui naudota ultragarso vonelė, 70% (V/V) etanolio ir vandens mišinys ir paprastųjų perluočių žiedų žaliava. Bandiniai esant 30 ºC temperatūrai buvo veikiami ultragarsu 5, 10, 15, 20 minučių. Buvo paruošta po 3 ekstraktus ultragarsu žaliavą veikiant skirtingą laiko intervalą . Kiekvieno tiriamo ekstrakto absorbcija matuojama po 3 kartus. Gauti rezultatai pateikiami grafike (11 pav.).
11 pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės įvertinimas A. vulneraria žiedų bandiniuose, ekstrahentu nadojant 70% (V/V) etanolį (vidurkis ± standartinė paklaida). Temperatūra 30± 5ºC.
Iš grafiko (11 pav.) matome, kad daugiausiai fenolinių junginių išekstrahuojama veikiant ultragarsu 10 minučių (14,228 ± 0,094 mg/g) ir tai didesnis kiekis nei taikant maceracijos metodą (13,537 ± 0,321 mg/g). Tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas žaliavas veikiant ultragarsu 10 minučių. Šis metodas yra efektyvesnis nei maceracijos, o be to trunka daug trumpiau, t.y. tik 10 minučių, o maceracijos - net 26 valandas.
6.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros parinkimas
Svarbu nustatyti kokioje temperatūroje atliekant ekstrakciją ultragarsu išsiskiria daugiausiai fenolinių junginių. Ekstrakcijos ultragarsu tinkamos temperatūros parinkimui panaudota ultragarso vonelė, 70% (V/V) etanolio ir vandens mišinys ir paprastųjų perluočių žiedų žaliava. Ekstrahavimo laikas pasirinktas atsižvelgiant į prieš tai atlikto tyrimo rezultatus – 10 minučių. Bandiniai buvo ekstrahuojami esant skirtingoms temperatūroms (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, ± 5°C). Buvo pagaminta po 3 skirtingomis temperatūromis ekstrahuotų žaliavų ekstraktai. Kiekvieno tiriamo ekstrakto absorbcija matuojama po 3 kartus. Gauti rezultatai pateikiami grafike 12 pav.
12 pav. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros įvertinimas A. vulneraria žiedų bandiniuose, ekstrahentu nadojant 70% (V/V) etanolį (vidurkis ± standartinė paklaida). Laiko intervalas – 10min.
GRE- galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Remiantis tyrimo rezultatais matome jog atliekant ekstrakciją ultragarsu gauname daugiausiai fenolinių junginių esant 50ºC (16,31 ± 0,109 mg/g). Pakėlus temperatūrą tik 10ºC fenolinių junginių gauta ≈8,5% mažiau (14,910 ± 0,152 mg/g), o sumažinus temperatūrą 10ºC fenolinių junginių gauta ≈5,3% mažiau (15,441 ± 0,109 mg/g). Todėl tolimesnėms tyrimams buvo pasirinktas ekstrakcijos ultragarsu metodas atliekamas 50 ± 5°C temperatūroje.
Įvertinus gautus ekstrakcijos sąlygų parinkimo rezultatus, tolimesniems tyrimams A. vulneraria mėginiai ekstrahuojami su 70 % (V/V) etanoliu, naudojant ultragarso vonelę (laikas – 10 min., temperatūra – 50 ± 5°C).
6.2. Bendro fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio nustatymas
spektrofotometriniu metodu
Fenoliniai junginiai ekstraktuose veikia kaip antioksidantai [43]. Antioksidacinis augalinių ekstraktų poveikis, remiantis dideliu skaičiumi tyrimų, gerai koreliuojasu fenolinių junginių kiekiu juose. Nors yra atlikta daug skirtingų fenolinių junginių kiekybinės analizės tyrimų, tačiau sudėtinga pritaikyti vieną metodo atlikimo būdą visiems augalams tirti, todėl metodai yra nuolat tobulinami. Labai svarbu parinkti tinkamas tyrimo sąlygas. Vienas dažniausiu kiekybinei fenolinių junginių analizei taikomų metodų yra UV spektrofotometrija, tai ganėtinai pigus, patikimas ir paprastas metodas [24,30].
6.2.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas A. vulneraria žaliavose
Spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu buvo tiriamos Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos gamtinėse cenopopuliacijose surinktos A. vulneraria augalinės žaliavos. Taip pat fenolinių junginių kaupimosi dinamika buvo nustatyta skirtingose fenologiniuose tarpsniuose surinktose žaliavose Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sode, Veršvo kraštovaizdžio draustinyje ir Daugyvenės kraštovaizdžio draustinyje.
Atlikus visų A. vulneraria žaliavų tyrimus nustatyta, kad vidutinis bendras fenolinių junginių kiekis jose ženkliai įvairuoja (13 pav.).
13 pav. Vidutinis bendras fenolinių junginių kiekis A. vulneraria skirtingų morfologinių dalių žaliavose (vidurkis ± standartinė paklaida). GRE-galo rūgšties ekvivalentai.
Iš grafiko matome, jog daugiausiai fenolinių junginių kaupia A. vulneraria žiedai 14,058 ± 1,071 mg/g, tai 39,13 % daugiau nei lapuose ir 65,51 % daugiau nei stiebuose.
Taip pat buvo nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis žiedų, lapų ir stiebų žaliavose surinktose skirtinguose Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos regionuose (14 pav.).
14 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas gamtinėse A. vulneraria cenopopuliacijose surinktose A. vulneraria žiedų, lapų ir stiebų žaliavose (vidurkis ± standartinė
paklaida). GRE-galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Tyrimų rezultatai parodė, jog A. vulneraria žiedų žaliavose fenolinių junginių kiekis skirtinguose regionuose rinktose žaliavose varijuoja nuo 10,971 iki 16,210 mg/g. Apskaičiuotas variacijos koeficientas žiedų bandiniuose buvo 32,32 %. Daugiau fenolinių junginių žieduose kaupia augalai surinkti regionuose prie Baltijos jūros, vidutiniškai 15,58 % daugiau palyginus su A. vulneraria žiedų žaliavomis, surinktomis kitose augavietėse. Didesnę fenolinių junginių koncentraciją žiedų žaliavose galėjo nulemti aplinkos veiksniai, pvz. tai jog prie jūros esančiuose regionuose dirvožemis paprastai yra skurdesnis. Todėl tam, kad augalas galėtų prisitaikytų prie esamų aplinkos sąlygų jis turi sintezuoti didesnį fenolinių junginių kiekį.
Fenolinių junginių kiekis A. vulneraria lapų žaliavose rinktose skirtinguose regionuose ženkliai varijuoja: nuo 5,806 iki 11,151 mg/g. Nustatytas variacijos koeficientas žiedų bandiniuose buvo 47,93 %. Skirtingai nuo žiedų žaliavų, lapuose didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti piečiau esančiuose regionuose surinktuose paprastųjų perluočių lapų bandiniuose. Juose sukaupiama vidutiniškai 28,06 % daugiau tirtų junginių palyginus su A. vulneraria lapų žaliavomis, surinktomis šiauriau esančiuose regionuose.
A. vulneraria stiebuose fenolinių junginių kiekis tarp skirtingų regionų kinta nuo 3,921 iki 5,892 mg/g. Apskaičiuotas variacijos koeficientas žiedų bandiniuose – 33,45 %. Įdomu pažymėti, kad stiebuose surinktuose augavietėse prie Baltijos jūros fenolinių junginių koncentracija 14,51 % didesnė nei augaluose surinktuose kituose regionuose.
Tyrimo rezultatai atskleidė, kad bendrasis fenolinių junginių kiekis A. vulneraria žaliavose įvairuoja priklausomai nuo fenologinio tarpsnio. Bendras fenolinių junginių kiekis A. vulneraria generatyvinių organų žaliavose skirtinguose fenologiniuose tarpsniuose pavaizduotas (15 pav.).
15 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis A. vulneraria generatyvinių organų žaliavose skirtinguose fenologiniuose tarpsniuose (vidurkis ± standartinė paklaida). GRE-galo rūgšties
ekvivalentai. (n=3)
Nustatyta, kad ženkliai didesni fenolinių junginių kiekiai sukaupiami masinio žydėjimo metu surinktuose žieduose (Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodas - 13,023 ± 0,489 mg/g, Veršvo kraštovaizdžio draustinis – 11,850 ± 0,560 mg/g, Daugyvenės kraštovaizdžio draustinis – 10,971 ± 0,670 mg/g) lyginant su jų kiekiais butonuose (Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodas - 8,079 ± 0,569 mg/g, Veršvo kraštovaizdžio draustinis – 7,223 ± 0,430 mg/g, Daugyvenės kraštovaizdžio draustinis – 6,891 ± 0,660 mg/g), o tai 38,06 % daugiau žieduose nei butonuose.
Fenolinių junginių kiekio įvairavimas A. vulneraria vegetatyvinių organų žaliavose skirtinguose fenologiniuose tarpsniuose pateiktas 16 pav.
16 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis A. vulneraria vegetatyvinių organų žaliavose skirtinguose fenologiniuose tarpsniuose (vidurkis ± standartinė paklaida). GRE-galo rūgšties
ekvivalentai. (n=3)
Didžiausi fenolinių junginių kiekiai sukaupti lapuose butonizacijos stadijoje (Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodas – 12,070 ± 0,032 mg/g, Veršvo kraštovaizdžio draustinis – 11,661 ± 0,579 mg/g, Daugyvenės kraštovaizdžio draustinis – 9,709 ± 0,617 mg/g). Tuo tarpu augalui vystantis šių junginių kiekis lapų žaliavose ženkliai sumažėjo (daugiau nei 2 kartus). Panašios tendencijos yra stebimos ir stiebų atveju: butonizacijos stadijoje randamas didesnis fenolinių junginių kiekis nei masinio žydėjimo metu rinktose žaliavose. Skrotelėse paprastai nustatomos fenolinių junginių sankaupos vidutiniškai 29,80 % didesnės palyginus su jų kiekiais stiebuose. Apibendrinant galima konstatuoti, kad didžiausi fenolinių junginių kiekiai nustatyti Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sode surinktuose paprastųjų perluočių generatyviniuose ir vegetatyviniuose organuose.
Remiantis moksliniuose šaltiniuose pateikiamais duomenimis A. vulneraria antžeminių dalių ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis yra panašus ir siekė nuo 6,8 ± 0,2 mg/g iki 12.02 ± 0.42 mg/g [12,56]. Deja, nepavyko rasti informacijos apie bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimą atskirose A. vulneraria žaliavose.
6.2.2.Bendro flavonoidų kiekio nustatymas A. vulneraria žaliavose
Siekiant išsamiau įvertinti augalines žaliavos antioksidacines savybes svarbu nustatyti flavonoidų kiekį. Atlikus visų A. vulneraria žaliavų tyrimus nustatyta, kad vidutinis bendras fenolinių junginių kiekis labai įvairavo (17 pav.).
17 pav. Vidutinis bendras flavonoidų kiekis A. vulneraria skirtingų morfologinių dalių žaliavose
(vidurkis ± standartinė paklaida). RE-rutino ekvivalentai. (n=3)
Matome jog daugiausiai flavonoidų kaupia A. vulneraria žiedai 4,135 ± 1,003 mg/g, tai 37,25 % daugiau nei lapuose ir 65,68% daugiau nei stiebuose.
Nustatytas bendras flavonoidų kiekis žiedų, lapų ir stiebų žaliavose surinktose skirtinguose Lietuvos, Latvijos ir Lenkijos regionuose pateiktas 18 pav.
18 pav. Bendro flavonoidų kiekio įvairavimas gamtinėse A. vulneraria cenopopuliacijose surinktose A. vulneraria žiedų, lapų ir stiebų žaliavose (vidurkis ± standartinė paklaida). GRE-galo
rūgšties ekvivalentai. RE-rutino ekvivalentai. (n=3)
Atlykus tyrimus matome, jog A. vulneraria žiedų žaliavose fenolinių junginių kiekis skirtinguose regionuose rinktose žaliavose varijuoja nuo 2,975 mg/g iki 6,484 mg/g. Nustatytas variacijos koeficientas žiedų bandiniuose siekė 54,12 %. Pastebėta, jog daugiau flavonoidų žieduose
