FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
VYTAUTAS JAKUTIS
PUSIAU KIETO PREPARATO SU ARBUTINU TECHNOLOGIJOS
KŪRIMAS, KOKYBĖS IR STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Zenona Kalvėnienė
UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
PUSIAU KIETO PREPARATO SU ARBUTINU TECHNOLOGIJOS
KŪRIMAS, KOKYBĖS IR STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Darbą atliko
Doc. dr. Zenona Kalvėnienė Magistrantas Vytautas Jakutis
Data: Data:
Recenzentas:
TURINYS
SANTRUMPOS ... 6
SANTRAUKA... 7
SUMMARY... 9
ĮVADAS ... 12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13
Darbo tikslas: ... 13
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14
1.1. Oda ir vaistinių medžiagų prasiskverbimas pro ją. ... 14
1.2. pH reikšmės svarba ... 15
1.3. Pusiau kieti odos preparatai ... 15
1.4. Emulsiniai pagrindai ... 16
1.5. Emulsijos v/a, jų savybės ir technologiniai aspektai ... 17
1.6. Odą balinančios medžiagos. ... 17
1.7. Bruknė ... 18
1.8. Arbutinas ... 19
1.9. Nuoviro gamyba ... 19
1.10. Saulėgrąžų aliejus (Oleum Helianthi) ... 20
1.11. Ricinų aliejus (Oleum Ricini) ... 20
1.12. Kakavos sviestas (Oleum Theobromatis) ... 21
1.13. Kokosų aliejus (Cocois oleum raffinatum) ... 21
1.14. Bičių vaškas (Cera flava) ... 22
1.15. Vilnų riebalai (Adeps lanae) ... 22
1.16. Sorbitano monooleatas ... 23
1.17. Išgrynintas vanduo (Aqua purificata) ... 23
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1. Tyrimo objektas: ... 24
2.1.1. Naudotos medžiagos: ... 24
2.1.2. Tyrime naudota įranga: ... 25
2.2. Tyrimo metodai ... 27
2.2.1. Tyrimo atlikimo planas ... 27
2.2.2. Bruknių lapų žaliavos tyrimai. ... 28
2.2.2.1. Drėgmės nustatymas ... 28
2.2.2.2. Žaliavos smulkumo nustatymas ... 28
2.2.3. Bruknių lapų vandeninės ištraukos gamyba ... 28
2.2.4. Spektrofotometrija ... 29
2.2.4.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 29
2.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas ... 31
2.2.6. Pusiau kieto odos preparato su bruknių lapų vandenine ištrauka, gamyba ... 32
2.2.7. Centrifugavimo testas ... 32
2.2.8. pH reikšmės nustatymas ... 33
2.2.9. Tekstūros analizė ... 33
2.2.10. Vienalytiškumo vertinimas ... 34
2.2.11. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas ... 34
2.2.12. Stabilumo tyrimai ... 35
2.2.13. Statistinė analizė ... 36
3. REZULTATAI ... 37
3.1. Bruknių lapų žaliavos kokybės tyrimai ... 37
3.2. Bruknių lapų vandeninės ištraukos tyrimai ... 37
3.2.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas ... 37
3.2.2. Arbutino kiekio ištraukoje nustatymas ... 38
3.4. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato AA palyginimas su kontrolinėmis grupėmis.40
3.5. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato kokybės tyrimai. ... 41
3.6. Šviežiai pagamintų mėginių centrifugavimo testas ... 42
3.7. Šviežiai pagamintų mėginių pH reikšmės nustatymas ... 42
3.8. Šviežiai pagamintų mėginių antioksidacinis aktyvumas ... 43
3.9. Mikroskopinis šviežiai pagamintų mėginių vaizdas. ... 43
3.10. Šviežiai pagamintų mėginių tekstūros analizė ... 44
4. PUSIAU KIETO PREPARATO STABILUMO TYRIMAI. ... 46
4.1. Centrifugavimo testas stabilumo tyrimų metu ... 46
4.2. pH reikšmės pokyčio tyrimas ... 46
4.3. Antioksidacinio aktyvumo pokyčio tyrimas ... 47
4.4. Mikrskopinio vaizdo pokyčio tyrimas ... 48
4.5. Pusiau kieto preparato tekstūros pokyčių nustatymas stabilumo tyrimų metu ... 49
4.5.1. Kietumo pokyčių nustatymas ... 49
4.5.2. Konsistencija ... 49 4.5.3. Kohezija ... 50 4.5.4. Klampos indeksas ... 51 5. REZULTATŲ APTARIMAS... 52 6. IŠVADOS ... 54 7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 55 8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 56 9. PRIEDAI ... 61
SANTRUMPOS
AA – antioksidacinis aktyvumas al. – aliejus
a/v – aliejus vandenyje
DHICA – 5,6-dihidroksiindolo-2-karboksi rūgštis DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija Eur. F. – Europos farmakopėja
FDA – Jungtinių Amerikos Valstijų maisto ir vaistų administracija (US Food and Drugs administration) HLB – hidrofilinis – lipofilinis balansas
ištr. – ištrauka mg – miligramai proc. – procentai (%)
RBD – rafinuotas, balintas, dezodoruotas (kokosų aliejus) UV – ultravioletiniai spinduliai
UV-VIS – matomų ultravioletinių spindulių spektroskopija vand. – vandeninė
SANTRAUKA
Vytautas Jakutis „Pusiau kieto preparato su arbutinu technologijos kūrimas, kokybės ir stabilumo tyrimas“/ Mokslinio darbo vadovė doc. dr. Z. Kalvėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra, Kaunas, 2016.
Tyrimo tikslas: sukurti pusiau kietą preparatą odai ir vertinti jo kokybę.
Tyrimo uždaviniai: 1) Surinkti ir susisteminti mokslinę literatūrą apie pigmentinių dėmių
atsiradimo priežastis, arbutiną, pusiau kietų odos preparatų technologinius ypatumus įvertinant bruknių lapų ištraukų panaudojimo galimybes ir kokybės vertinimo metodus; 2) Parinkti pusiau kieto odos preparato probleminei odai sudėtį ir technologiją; 3) Įvertinti pusiau kieto preparato kokybę, nustatant jo klampą, pH reikšmę, tekstūrą ir stabilumą; 4) Nustatyti arbutino kiekį bruknių lapų ištraukoje ir pagaminto pusiau kieto odos preparato antioksidacinį aktyvumą.
Tyrimo metodai: žaliavos kokybė vertinta nustatant žaliavos drėgmės kiekį ir smulkumą.
Veikliosios medžiagos nustatymui pagamintoje ištraukoje naudotas spektrofotometrinis ir ESC metodai. Produkto stabilumo įvertinimui naudotas centrifugavimo testas. Nustatyta pH reikšmė, atlikta tekstūros analizė ir vienalytiškumo vertinimas mikroskopuojant, bei antioksidacinio aktyvumo vertinimas DPPH laisvojo radikalo surišimo metodu.
Tyrimo rezultatai: nustatyta, kad bruknių lapų smulkumas ir nuodžiūvis atitinka Europos
farmakopėjoje augalinei žaliavai keliamus reikalavimus. Pagamintoje bruknių lapų vandeninėje ištraukoje (1:10) įrodytas arbutino buvimas ir nustatytas jo kiekis žaliavoje 4.08±0,21 proc. Nustatyta, kad bruknių lapų nuoviruose bendrasis polifenolinių junginių kiekis pagal arbutiną yra 21.48 ± 0.68 mg/ml. Stabilumo tyrimų metu buvo stebėtos fizikinės pagamintų mėginių savybės ir tikrintas antioksidacinis aktyvumas bei pH reikšmė. Nustatytas geriausiai išsilaikęs mėginys M 27.
Išvados: 1) Vandeninė bruknių lapų ištrauka pagaminta pagal Eur.F. aprašą santykiu (1:10).
Bendras fenolinių junginių kiekis, ištraukoje nustatytas spektrofotometriniu metodu, o ESC analizės metodu įrodytas veikliosios medžiagos arbutino, buvimas ištraukoje ir nustatytas jo kiekis žaliavoje. 2) Sumodeliuota pusiau kieta, agregatyviai stabili, emulsinė sistema (v/a), kurios sudėtyje yra 33 proc. vandeninės bruknių lapų ištraukos, pasižymėjo stipriu antioksidaciniu aktyvumu pagal DPPH laisvojo radikalo inaktyvinimą, tačiau skirtingam antioksidaciniam aktyvumui tarp skirtingos sudėties mėginių daro įtaką lipofilinė sistemos dalis. 3) Atlikus pagamintų pusiaukietų preparatų mėginių kokybės tyrimus
nustatyta pH reikšmė yra neutrali, o atlikus tekstūros analizę nustatyta, kad skystosios lipofilinės dalies kiekis daro stiprią įtaką tekstūros parametrams, pH reikšmė yra nežymiai didesnė nei nustatyta arbutino
stabilumo ribinė reikšmė. 4) Stabilumo tyrimai parodė, kad pusiau kieto preparato su bruknių lapų vandenine ištrauka mėginių mikroskopinis vaizdas išlieka nepakitęs 2 mėnesius, tekstūros pokyčiai nėra statistiškai reikšmingi stebint 6 mėnesius, tačiau antioksidacinis aktyvumas kito statistiškai reikšmingai jau po 2 mėnesių. Siūloma gaminti sudėtis M 27 (procentais: saulėgrąžų aliejus 19.0; ricinų aliejus. 5.0; kakavos sviestas 5.0; kokosų aliejus 19.0; bičių vaškas 10.0; vand. bruknių lapų ištrauka 33.0; Span 80-8.0; 2 – fenoksietanolis 1.0) gali būti naudojama 2 mėnesius.
SUMMARY
Vytautas Jakutis „Creation of technology of semi solid preparation with arbutin, quality and stability evaluation“. Master Thesis. Scientific adviser: doc. dr. Z. Kalvėnienė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social Pharmacy, Kaunas, 2016.
The aim of research: to design a semi-solid dosage form preparation and evaluate the quality of
the product.
The objectives of research: 1) To collect and organize scientific literature on: occurance of
pigment spots, semi solid dosage forms technological peculiarities, by evaluating decoctum of lingonberry leaves usage opportunities and quality evaluation methods; 2) Choose the optimal composition and technology of semi solid preparation for problematic skin; 3) Evaluate the quality of the semi solid preparation, by determining its viscosity, pH, texture and stability; 4) Determine the amount of arbutin in the decoctum of lingonberry leaves and the antioxidant activity of the established semi solid preparation.
Methods used: the quality of plant material was evaluated by determining the humidity and
fineness. Detection of active compound in the decoctum was carried out by spectrophotometry and HPLC methods. Stability of the preparation was tested by centrifugating. pH value has been determined, also texture analysis and smoothness by microscopy, were carried out. Also antioxidant activity was evaluated by using DPPH method of free radical scavenging.
Results: it has been clarified that the fineness of the lingonberry leaves and their loss in drying
coincide with the European Pharmacopoeia herbal raw material requirements. In the produced lingonberry leaves decoctions (1:10) the presence of arbutin has been proved, and its quantity is 4.08±0,21 pct. The quantity of phenol compounds in the lingonberry leaves decoctions is 21.48±0.68 mg/ml. During the stability testing physical parameters of the preparations were monitored, also the antioxidant activity and pH of the preparations were monitored. It was determined that the most stable preparation was M 27.
Conclusions: 1) The decoction of lingonberry leaves has been made according to Ph. Eur. at the
ratio of (1:10). The amount of phenolic compounds in the decoction has been determined spectrophotometrically, the presence of arbutin has been proved and the amount of it in the plant material has been determined by using HPLC method. 2) Stable, semi solid emulsion system (w/o), which had 33 pct. of lingonberry decoction, has been designed. It showed strong antioxidant activity acording to DPPH
free radical scavenging, and it has been determined that different composition of lipophilic part shows different activity. 3) After quality analysis it has been determined that the pH of the preparation is neutral and the texture analysis has shown that the amount of liquid lipophylic part affects texture parameters, the pH in the preparation has been determined to be slightly higher than the arbutin stable pH limit. 4) Stability testing has shown that the microscopic view of the preparation stays stable for 2 months, the change in texture analysis was not significant during the 6 month period, but the antioxidant activity changed significantly after 2 months. The proposed composition is M 27 (pct.: sunflower oil 19.0; castor oil 5.0; cacoa butter 5.0; coconut oil 19.0; bees wax 10.0; lingonberry leaves decoction 33.0; Span-80 8.0; 2 – phenoxyethanol 1.0 ) this composition can be used for 2 months.
PADĖKA
Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti magistrinį baigiamąjį darbą tema: ,,Pusiau kieto preparato su arbutinu technologijos kūrimas, kokybės ir stabilumo tyrimas“ dėkoju Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedrai.
Už konsultacijas, pasiūlymus ir pagalbą tyrimų metu dėkoju savo darbo vadovei doc. dr. Zenonai Kalvėnienei.
Už pagalbą tiriant žaliavą, dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedrai ir Mindaugui Marksai.
ĮVADAS
Odos spalvą nulemia tam tikros odos ląstelės – melanocitai. Melanino gamybą dalinai lemia genai, tačiau odos spalvai įtakos turi saulės UV spinduliai, hormonų veiklos pokyčiai, kai kurie vaistai, cheminės medžiagos ir bendra sveikatos būklė. Svarbiausia melanino paskirtis – apsaugoti organizmą nuo saulės ultravioletinių spindulių. Veikiant tirozinazei (ląstelių fermentui), amino rūgštis tirozinas sudėtingų biocheminių procesų metu transformuojamas į melaniną, kuris koncentruojasi specialiose molekulėse-melanocituose. Bręsdami jie pasiekia epidermio paviršinius sluoksnius, transportuoja pigmentą į raginį sluoksnį, kuris atlieka natūralų UV spindulių filtrą. Sutrikus melaniną gaminančių odos ląstelių melanocitų veiklai ir jų kiekiui, pakinta odos pigmentacija - atsiranda apgamai, strazdanos, rudmės, senatviniai šlakai bei pigmento nykimas (vitiligo). Apsisaugoti nuo padidėjusios pigmentacijos ir atgauti tolygią odos išvaizdą gali padėti geras odos priežiūros režimas, apsauginių bei balinančių priemonių naudojimas. Kosmetikoje, be kitų medžiagų, gerai žinomas odą balinantį poveikį turintis arbutinas. Ši medžiaga yra nekenksminga, naudojant ant odos, ją balina, turi senėjimą mažinantį poveikį ir veikia kaip UV filtras [1]. Teigiama, kad arbutino aktyvumas yra susijęs su substrato tirozinazės panašumu vienas kitam, o tai priveda prie konkurencinio tirozinazės katalizinės funkcijos slopinimo. Taigi arbutinas stabdo tirozinazės aktyvumą, nepaveikdamas ląstelės gyvybingumo [2]. Tyrimais yra nustatyta, kad miltinės meškauogės, bruknės, kvapiojo mairūno, kriaušės lapuose yra nemaži kiekiai arbutino. Bruknių lapuose jo kaupiama 5.0-10.0 proc. [3] 2008 m. Ilgen Ertam ir kt. tyrimais įrodė arbutino aktyvumą pigmentinių dėmių gydyme [4]. 2015 metais buvo atlikti tyrimai naujo kremo, skirto odos melazmos gydymui. Kremo sudėtyje yra veikliosios medžiagos: nikotinamidas, arbutinas, bisabololis ir retinaldehidas. Publikacijos autoriai tyrimais įrodė šio kremo veiksmingumą [5]. Šiuo metu pigmentinių dėmių šviesinimui Lietuvos rinkoje siūloma AVENE linijos priemonės (veikliosios medžiagos: melanidas, pretokoferilas ir retinaldehidas), Derma viduals modular produkcija (veikliosios medžiagos: pipirmėtės, šlaitinės rasakilos, vaistinės veronikos ir paprastosios kraujažolės ekstraktai), Trio white balinančiųjų produktų linija (veikliosios medžiagos: α-arbutinas, askorbilo gliukozidas).
Iškelta hipotezė, kad bruknių lapų ištrauka, turinti arbutino, reguliuos melanino gamybą, pasižymės odą balinančiu veikimu. Svarbu parinkti formą, sumodeliuoti sudėtį ir vertinti stabilumą. Aktualu pagaminti pusiau kietą odos preparatą, panaudojant natūralios kilmės arbutino turinčią ištrauką, skirtą naudoti kaip odą balinančią ir drėkinančią priemonę. Šio darbo tikslas yra sukurti pusiau kietą preparatą ir vertinti jo kokybę.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: sukurti pusiau kietą preparatą ir vertinti jo kokybę.Darbo uždaviniai:
1. Surinkti ir susisteminti mokslinę literatūrą apie pigmentinių odos dėmių atsiradimo priežastis, arbutiną, pusiau kietų odos preparatų technologinius ypatumus, įvertinant bruknių lapų ištraukų panaudojimo galimybes ir kokybės vertinimo metodus.
2. Parinkti pusiau kieto odos preparato probleminei odai sudėtį ir technologiją.
3. Įvertinti pagaminto pusiau kieto preparato kokybę, nustatant jo klampą, pH reikšmę, tekstūrą ir analizuojant stabilumo tyrimų rezultatus.
4. Nustatyti arbutino kiekį bruknių lapų ištraukoje ir pagaminto pusiau kieto odos preparato antioksidacinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Oda ir vaistinių medžiagų prasiskverbimas pro ją.
Oda – didžiausias žmogaus organas. Jos plotas yra apie 1,6 – 2 m2 ir sudaro apie 20 proc. kūno masės, tipinio suaugusiojo žmogaus, sveriančio 70 kg, oda sveria apie 4 kg, o kraujo cirkuliacija odoje sudaro apie 5 – 10 proc. bendro širdies išstumiamo kraujo kiekio [6;7].
Odą sudaro 3 pagrindiniai sluoksniai, kurie dar skirstomi į smulkesnes dalis: 1) Epidermis: raginis ir pamatinis sluoksnis.
2) Tikroji oda (derma): limfagyslės, riebalų liaukos, prakaito liaukos, išorinis kraujagyslių tinklas. 3) Poodis: riebalų ląstelės, nervų skaidulos su receptoriais.
Oda tarnauja kaip barjeras apsaugantis organizmą nuo UV spindulių, mikrobų, cheminių medžiagų, radiacijos poveikio, šilumos ir drėgmės netekimo. Pažeidus odą atidaromi vartai infekcijai, atsiranda didelė rizika būti stipriai paveiktiems išorinių fizikinių veiksnių [8]. Nors oda atlieka barjerinę funkciją tarp organizmo ir aplinkos, tai nereiškia, kad ji nėra laidi. Medžiagos, būdamos tinkamos konsistencijos, gali patekti pro odą į organizmą, o dėl didelio paviršiaus ploto, kai kuriais atvejais oda gali
būti pagrindinis medžiagų patekimo kelias į organizmą [7]. Šis kelias naudojamas ir gydymo tikslais, kuriant odos preparatus, iš kurių vaistinė medžiaga patektų į kurį nors odos sluoksnį ar į organizmą, priklausomai nuo poreikio. Kaip vaistai prasiskverbia pro odą pavaizduota 2 paveikslėlyje.
1.2. pH reikšmės svarba
Odos funkcijos: svarbiausios yra apsauginė, termoreguliacinė ir jutiminė. Sveika oda turi natūralią apsauginę sistemą, ją sudaro riebalinės ir prakaito liaukos, drėkinamieji veiksniai, amino ir pieno rūgštys. Šios rūgštys padengia odos paviršių, sudarydamos pH reikšmę 5 – 6. Riebalinių ir prakaito liaukų sekrecija sudaro odos apsauginį rūgščių sluoksnį. Dominuojant rūgštims, oda yra sausa ir tampri. O dominuojant bazėms, oda yra riebi. Taigi, pH reikšmė yra svarbi odos priežiūros priemonėse. Jų uždavinys yra atstatyti natūralią odos rūgščių ir šarmų pusiausvyrą [9]. Optimali odos pH yra nuo 4.0 iki 7.0 [10], o arbutinas yra stabilus kai pH ribos yra nuo 3.5 iki 6.5 [11]. Dėl šios priežasties arbutinas yra tinkamas naudojimui preparate, skirtame tepti ant odos.
1.3. Pusiau kieti odos preparatai
Pusiau kieti odos preparatai Europos farmakopėjoje skirstomi į kremus, tepalus, gelius, pastas, šuteklius, vaistinius pleistrus. Tepalai sudaryti iš vienos fazės pagrindo ir jame disperguotos skystos arba kietos medžiagos. Emulsinio tipo tepaluose, emulsiklių pagalba, į riebalinį pagrindą įterpiama vandenyje
tirpi medžiaga arba atvirkščiai. Kremai yra sudėtingesnės sistemos, jų pagrindas – daugiafazis. Dažniausiai tai vandeninė ir lipofilinė fazės. Todėl kremai skirstomi į lipofilinius ir hidrofilinius. Gelius sudaro skysčiai, kurie yra gelifikuoti tam tikromis medžiagomis. Geliai taip pat gali būti lipofiliniai ir hidrofiliniai. Pastos yra pusiau kieti odos preparatai, kurių sudėtyje yra 25 proc. ir daugiau disperguotų sausųjų medžiagų.
Veikliųjų medžiagų veiksmingumas ir prasiskverbimas pro odą priklauso nuo farmacinių veiksnių, tokių kaip: vaistinės medžiagos fizinė būklė, cheminė struktūra, pagalbinių medžiagų savybės ir kiekiai, panaudotos technologijos ypatumai, o pasirinkta vaisto forma apsprendžia vaistinės medžiagos atsipalaidavimą ir poveikį.
Pagrindas pusiau kietos formos vaistuose yra labai svarbus, todėl jam keliami dideli reikalavimai. Veiklioji medžiaga turi būti gerai pasiskirsčiusi tepalo pagrinde tam, kad poveikis būtų vienodas ir nesusidarytų didelės vaistinės medžiagos koncentracijos vienoje vietoje. Pagrindas neturi erzinti odos, nepaveikti jos funkcijų, maišytis su odos sekretu ir būti netepus bei lengvai nuplaunamas. Turi būti priimtina spalva, išvaizda bei kvapas.
Pusiau kieti odos preparatai turi būti patvarūs laikant realiomis sąlygomis. Taigi pagrindas turi būti stabilus esant 25 ºC. Būtina pažymėti, kad negalima leisti tepalams užšalti ir reikia juos laikyti sandariuose induose [12;13;14].
1.4. Emulsiniai pagrindai
Emulsiniai pagrindai yra difiliniai, jie pasižymi hidrofilinėmis ir hidrofobinėmis savybėmis. Gali būti dviejų tipų: aliejus vandenyje (a/v) ir vanduo aliejuje (v/a). Emulsiniai pagrindai maišosi ir gerai emulguoja daugelį medžiagų, soliubilizuoja netirpias medžiagas ir emulsiniuose pagrinduose, gerai pasiskirsto vaistinės medžiagos. Difiliniai pagrindai turi savybę mažinti paviršiaus įtampą tarp tepalo ir odos, o to pasekoje lengviau pasisavinamos vaistinės medžiagos ir nesutrikdomi odos kvėpavimo ir šilumos reguliacijos procesai.
Emulsinių pagrindų privalumai: pagerina vaistinių medžiagų sugėrimą į odą, turi odą minkštinantį poveikį, bei suteikia jai elastingumo. Labai svarbu tai, kad emulsiniai pagrindai turi uždegiminius procesus mažinantį poveikį. Vaistines medžiagas galima įterpti tiek į vandeninę, tiek į hidrofobinę terpę, tad galima rinktis vaistines medžiagas tiek tirpias vandenyje, tiek tirpias riebaluose. v/a
pagrindai pasižymi geru stabilumu, yra lengvai pašalinami nuo odos, taip pat turi gerą išvaizdą ir konsistenciją, todėl pagamintas tepalas yra geros prekinės išvaizdos. Trūkumai: a/v emulsiniai pagrindai yra mažiau stabilūs, tačiau tai ištaisoma naudojant stabilizatorius ir konservantus. v/a emulsijos nors ir stabilesnės, bet pasižymi silpnesniu vaistinės medžiagos prasiskverbimu į odą [6;12;15;16;].
1.5. Emulsijos v/a, jų savybės ir technologiniai aspektai
Norint suprasti emulsinius pagrindus reikia suprasti ir jų savybes. Emulsijos v/a yra antro tipo emulsijos, jose dispersinė terpė yra hidrofobinė, o dispersinė fazė –hidrofilinė. Antro tipo emulsijos yra stabilizuojamos hidrofobiniais emulsikliais (tirpūs aliejuje ar milteliai, drėkinami aliejaus). Gaminant v/a tipo emulsijas reikia teisingai parinkti emulsiklį: plėvelė turi susidaryti ne lašelio viduje, o išorėje. Emulsiklių veiksmingumas išreiškiamas HLB (hidrofilinio – lipofilinio balanso) skaičiumi. Gaminant v/a emulsijas, naudojami emulsikliai, kurių HLB skaičius pagal Griffin’o skalę yra ≤10.
Technologiniai aspektai v/a emulsijų gamyboje: kadangi sudaromos tarpusavyje nesimaišančių medžiagų sistemos, jos turi būti stabilizuojamos emulsikliais, gaminant tokias emulsijas galimas mikrobinis užterštumas, todėl reikalingi konservantai, kurie šį užterštumą reguliuotų, be to labai svarbu, kad tepalo juslinės savybės būtų priimtinos vartotojui, tai pasiekiama parenkant tinkamas medžiagas bei jų koncentracijas. Emulsijos v/a yra stabilesnės nei a/v tipo, tai įtakoja hidrofobinės terpės padidintas sedimentacinis ir agregatinis pastovumas, tačiau juslines ir mikrobiologines savybes daro įtaką komponentų prigimtis (sintetinės ar gamtinės kilmės medžiagų parinkimas emulsijų gamyboje) [12;15;16].
1.6. Odą balinančios medžiagos.
Geriausiai žinoma ir labiausiai paplitusi odą balinanti medžiaga yra hidrochinonas. Ši medžiaga yra efektyvi ir plačiai naudojama melazmos, použdegiminės hiperpigmentacijos ir kitų hiperpigmentacijos sutrikimų gydymui. Hidrochinonas veikia stabdydamas tirozino virtimą melaninu. Nepaisant šios medžiagos efektyvumo, būtina atsižvelgti į jos keliamus pavojus. Dažniausiai pasitaikantys šalutiniai poveikiai yra odos dirginimas ir kontaktinis dermatitas. Rečiau pasitaiko tamsiai ruda hiperpigmentacija
gydymo vietoje. Dėl šių priežasčių pradėta ieškoti alternatyvų hiperpigmentacijos gydyme [17]. 2006m. BC Decker Inc. publikuotame straipsnyje aprašomos alternatyvios medžiagos, tai – aloesinas, arbutinas, azelaino rūgštis, glikolio rūgštis, kojinė rūgštis, saldymedžio ekstraktas, 4–hidroksianizolis, melatoninas, niacinamidas, baltojo šilkmedžio (Morus alba L.) ekstraktas, soja, vitaminas C. Visos šios medžiagos turi tinkamas balinančias savybes, yra saugios ir veiksmingos, be to šias medžiagas galima naudoti ir kombinacijose [18].
1.7. Bruknė
(Vaccinium vitis-idaea L.) Šeima: Erikiniai – Ericacea.
Bruknė – daugiametis žemas (iki 25cm aukščio) augalas. Visžalis krūmokšnis su požeminiais, šliaužiančiais, žvynuotais, įsišaknijančiais ūgliais. Jaunos šakelės pūkuotos. Lapai atvirkščiai elipsiški, buki, stori, odiški, tamsiai žalia viršutine ir šviesiai žalia, taškuota apatine puse, užsirietusiais žemyn kraštais. Lapų gyslos ryškios, plunksniškos. Žiedai maži, po 2-8 susitelkę tankiose viršūninėse kekėse, nusvirę. Vainikėlis varpiškas, baltas arba baltai rausvas. Žydi gegužę – birželį, neretai ir antrą kartą, nuo liepos iki rudeninių šalnų. Vaisius – raudona, sultinga, daugiasėklė, 3-8 mm skersmens, rūgštaus skonio uoga. Dauginasi šakniastiebiais ir sėklomis, kurias išnešioja
uogomis mintantys paukščiai. Šviesomėgis. Žaliava – bruknių lapai ir vaisiai. Lapai skinami ketvirtaisiais augimo metais rugsėjį – spalį arba pavasarį, balandį – gegužę. Uogos renkamos rugpjūtį. Veikliosios medžiagos. Lapuose kaupiama iki 5,0-10,0 proc. arbutino, 8,0-9,0 proc. raugų, 450,0-550,0 mg. flavanolių, fenolkarboninių rūgščių, hidrochinono, galo, elago, chino, ursolo, vyno rūgščių, vitamino C, mikroelementų – mangano, arseno, vario [3].
1.8. Arbutinas
Arbutinas, tai natūralus hidrochinono β-D-gliukopiranozidas, hidrochinono darinys (molekulinė formulė: C12H16O7)[19,20,21],
aptinkamas sudžiovintuose tam tikrų augalų, tokių kaip: miltinė meškauogė (Arctostaphylos
uva-ursi L., Ericaceae), bruknė (Vaccinium
vitis-idaea L., Ericaceae), kvapusis mairūnas (Origanum majorana L., Lamiaceae), kriaušė (Pyrus L., Rosaceae), lapuose [19;20;23;24]. Arbutinas veikia inhibuodamas melanosomų tirozinazės ir DHICA
(5,6-dihidrochindolo-2-karboksi rūgšties) polimerazės aktyvumą, netoksinėmis koncentracijomis, netrikdant šio fermento sintezės ir išskyrimo. Manoma, kad arbutino aktyvumas yra susijęs su substrato tirozinazės panašumu vienas kitam, o tai priveda prie konkurencinio tirozinazės katalizinės funkcijos slopinimo. Taigi arbutinas stabdo tirozinazės aktyvumą nepaveikdamas ląstelės gyvybingumo [2]. Dėl poveikio tiranozinui arbutinas plačiai naudojamas kosmetikoje, bei gydymo praktikoje naikinant pigmentines dėmes, balinant odą.
1.9. Nuoviro gamyba
Nuoviras – tai vaisto forma, kurią gaminant žaliavos virinamos išgrynintame vandenyje. Ruošiant nuovirus žaliava apdorojama grūstuvėje, didesniu išgryninto vandens kiekiu, taip, kad būtų pakankamai drėgna, sudrėkinus ji paliekama stovėti 5 min. Vėliau apdorota žaliava užpilama reikiamu kiekiu verdančio išgryninto vandens ir vandens vonioje šildoma 30 min., uždengtame porcelianiniame inde, maišant. Pagaminta ištrauka filtruojama per marlę, kurioje yra nedidelis vatos gabalėlis ir yra lengvai nuspaudžiama. Ištrauka papildoma išgrynintu vandeniu iki nurodytos žymos. Jei žaliavos yra nestipriai veikiančios, 100-ui dalių išgryninto vandens imama 10 dalių žaliavos [25].
1.10. Saulėgrąžų aliejus (Oleum Helianthi)
Saulėgrąžų aliejus yra skaidrus, gelsvas, aliejingas skystis, turintis blyškų, neišreikštą silpną skonį. Įprastai saulėgrąžų aliejus yra naudojamas maisto gamyboje. Taip pat plačiai naudojamas kosmetikos bei farmacinių gaminių sudėtyje, kaip pagrindo sudedamoji dalis bei ingridientas, kuris teikia ląstelėms energiją, bei būtinąsias riebalų rūgštis, parenteraliniu keliu. Saulėgrąžų aliejus laikomas netoksiška ir nedirginančia medžiaga. Šis aliejus išgaunamas iš saulėgrąžų (Helianthus annus L.) sėklų, presavimo arba ekstrakcijos būdu. Saulėgrąžų aliejuje randama: linoleno rūgšties (66 proc.), oleino rūgšties (21,3 proc.), palmitino rūgšties (6.4 proc.), arachidono rūgšties (4,0 proc.), stearino rūgšties (1,3 proc.), bei benzeno rūgšties (0,8 proc.). Saulėgrąžų aliejaus virimo temperatūra 40 – 60 ºC, santykinis tankis 0.915 – 0.919 g/cm3, rūgščių skaičius 14 – 16, jodo skaičius 125 – 140, užšalimo temperatūra -18 ºC. Saulėgrąžų aliejus maišosi su benzenu, chloroformu, anglies tetrachloridu, dietilo eteriu, praktiškai netirpsta etanolyje (95 proc.) ir vandenyje [26;27].
1.11. Ricinų aliejus (Oleum Ricini)
Ricinų aliejus yra skaidrus, beveik bespalvis, arba blyškiai gelsvos spalvos klampus skystis. Šis aliejus turi nestiprų kvapą bei silpną skonį, kurio ataskonis gali būti aitrus. Ricinų aliejus yra plačiai naudojamas kosmetikoje, maisto produktuose ir farmacinėse vaistų formose, kaip pagalbinė medžiaga. Kremuose ir tepaluose šio aliejaus naudojama nuo 5 iki 12,5 proc. Į vidų šis aliejus buvo vartojamas kaip vidurius laisvinanti priemonė. Ricinų aliejus laikomas netoksišku ir nedirginančiu, kai yra naudojamas, kaip pagalbinė medžiaga. Ricinų aliejus išgaunamas šaltojo spaudimo būdu iš paprastojo ricinmedžio (Ricinus communis L.) sėklų. Aliejuje randama: ricinų rūgšties (87 proc.), oleino rūgšties (7 proc.), linoleno rūgšties (3 proc.), palmitino rūgšties (2 proc.), stearino rūgšties (1 proc.) ir dihidrosterino rūgšties pėdsakų. Ricinų aliejaus virimo temperatūra 313 ºC, savaiminio užsidegimo temperatūra 449 ºC, santykinis tankis 0.955 – 0.968 g/cm3 esant 25 ºC, lydymosi temperatūra -12 ºC. Aliejus tirpus chloroforme, dietilo eteryje, acto rūgštyje, metanolyje. Gerai tirpus etanolyje (95 proc.), benzene ir eteryje. Praktiškai netirpus vandenyje [27;28].
1.12. Kakavos sviestas (Oleum Theobromatis)
Kakavos sviestas yra gelsvos ar baltos spalvos, kietos, birios konsistencijos, turinti nestiprų savitą kvapą medžiaga. Naudojama kaip žvakučių pagrindas, tačiau galima naudoti ir tepalo pagrindo kietumo formavimui. Kakavos sviesto lydymosi temperatūra 31-34 ºC, Kakavos sviestas tirpus chloroforme, eteryje ir verdančiame etanolyje. Dalinai tirpsta etanolyje (95 proc.) Kakavos sviestas gaunamas iš kakavmedžio pupelių, kurios yra fermentuojamos, kepinamos ir atskiriamos nuo lukšto. Kakavos sviesto sudėtyje randama: oleino rūgšties iki 43 proc., stearino rūgšties iki 34 proc., laurino ir palmitino rūgščių iki 25 proc., linolevino rūgšties iki 2 proc. Ir arachino rūgšties pėdsakų [26;27].
1.13. Kokosų aliejus (Cocois oleum raffinatum)
Kokosų aliejus paprastai yra balta arba gelsva masė, arba bespalvis ar gelsvas skaidrus aliejus, turintis silpną kokosų kvapą bei skonį. Rafinuotas kokosų aliejus yra balta ar beveik balta, vientisa masė. Forma, kurią įgyja kokosų aliejus, priklauso nuo temperatūros. Jis gali būti blyškiai geltonas ar bespalvis skystis, esant 28 – 30 ºC temperatūrai; pusiau kietas, esant 20 ºC temperatūrai ir kietas, kristalinis esant žemesnei nei 15 ºC temperatūrai. Įprastai kokosų aliejus naudojamas tepalų, su lengvai absorbuojamu pagrindu, gamybai. Vartojant per burną, kokosų aliejus yra netoksiškas, tačiau dideli kiekiai gali sudirginti virškinamąjį traktą. Užtepus ant odos, kokosų aliejus gali ją sudirginti, ir gali būti absorbuojamas per odą. Kokosų aliejus gaunamas iš Riešutinės kokospalmės (Cocos nucifera L.) sėklų, tuomet jis yra rafinuojamas ir gaunamas rafinuotas kokosų aliejus, kuris pramonėje dar žymimas RBD (rafinuotas, balintas, dezodoruotas) kokosų aliejus. Šiame aliejuje randama kaproinės rūgšties (≤1,5 proc.), kaprilinės rūgšties (5,0 – 11,0 proc.), kaprinės rūgšties (4,0-9,0 proc.), laurino rūgšties (40,0-50,0 proc.), miristino rūgšties (15.0-20.0 proc.), palmitino rūgšties (7,0-12,0 proc.), stearilo rūgšties (1,5-5,0 proc.), arachidinės rūgšties (≤0.2 proc.), oleino rūgšties (4.0-10.0 proc.), linoleino rūgšties (1.0-3.0 proc.), linoleno rūgšties (≤0,2 proc.). Virimo temperatūra >450 ºC, jodo skaičius 8-9.5, lydymosi temperatūra 23-26 ºC. Aliejus praktiškai netirpsta vandenyje, gerai tirpsta dichlormetane, tirpsta eteryje, anglies disulfide ir chloroforme, esant 60 ºC temperatūrai tirpsta dvejose dalyse etanolio (95 proc.), tačiau žemesnėje temperatūroje tirpumas mažėja [27].
1.14. Bičių vaškas (Cera flava)
Geltonos ar rusvos spalvos plokštelės, nekristalinės struktūros, turi nestiprų charakteringą kvapą, pašildžius tampa minkštas ir lankstus. Bičių vaškas naudojamas maisto bei kosmetikos produktuose. Pagrindinis panaudojimas – farmaciniuose produktuose. Dažniausiai naudojamas tepaluose ir kremuose, kaip kietinanti medžiaga, nuo 5 iki 20 proc. Geltonasis vaškas gali daryti įtaką prailginant vaistinės medžiagos atpalaidavimo laiką. Bičių vaškas tirpsta esant 61 – 65 ºC temperatūrai, santykinis tankis 0.95 – 0.96 g/cm3, jodo skaičius 8-11. Vaškas tirpus chloroforme, eteryje, eteriniuose ir riebalų aliejuose,
šiltame anglies disulfide, praktiškai netirpus vandenyje. Bičių vaškas laikomas netoksišku ir nedirginančiu, naudojamas išorinio vartojimo preparatuose, bei yra patvirtintas FDA (Federal Drug Association) neaktyvių ingredientų duomenų bazėje, į kurią įtrauktos visos nepavojingos ir leistinos naudoti pagalbinės medžiagos. Tačiau hyper jautrumo reakcijos gali pasireikšti žmonėms, kurie yra alergiški bičių produktams. Bičių vaškas yra natūralus bičių sekretas, Vaškui leidžiama išvarvėti, arba išimamas centrifuguojant. Vaškas plaunamas šaltu vandeniu, taip pašalinamos visos tirpios priemaišos, pridedama karšto vandens, kuris vėliau nukošiamas, taip pašalinant pašalines medžiagas. Bičių vaške randama 70 – 75 proc. įvairių tiesios grandinės monohidrinių alkoholių esterių, turinčių lyginio skaičiaus anglies atomų grandines nuo C24 iki C36.pagrindinis esteris šioje sudėtyje yra miricilo palmitatas. Taip pat
randama laisvųjų rūgščių (~14 proc.), karbohidratų (~12 proc.) ir apytiksliai 1 proc. laisvųjų vaško alkoholių ir sterinių esterių bei riebiųjų rūgščių [27].
1.15. Vilnų riebalai (Adeps lanae)
Vilnų riebalai (lanolinas) yra blyškiai geltonos spalvos, aliejinga, vaškinės struktūros medžiaga, turinti charakteringą kvapą. Ištirpintas lanolinas yra skaidrus ar beveik skaidrus geltonas, aliejingas skystis. Naudojamas kaip hidrofobinis pagrindas, tepalų gamyboje. Sumaišius su augaliniu aliejumi ar skystu parafinu, gaminami emulsiniai kremai. Vilnų riebalai sugeria dvigubai didesnį vandens kiekį, gaminant stabilias emulsijas, kurios laikant nesukietėja. Tai natūrali medžiaga, randama ir išgaunama iš avių vilnų. Vilnų riebalai yra laikoma netoksiška ir nedirginančia medžiaga tačiau jautriems žmonėms gali sukelti alergines reakcijas. Vilnų riebalų lydymosi temperatūra 38 – 44 ºC, jodo skaičius 18-36, lengvai
tirpus benzene, chloroforme, eteryje, dalinai tirpus etanolyje (95 proc.), verdančiame tirpsta geriau, netirpus vandenyje [27].
1.16. Sorbitano monooleatas
Span 80 Tai geltonas, lakus, aliejingas skystis. Sorbitano esteriai yra plačiai naudojami kosmetikoje, maisto produktuose bei farmaciniuose produktuose, kaip lipofiliniai, nejoniniai surfaktantai. Dažniausiai naudojami farmacijoje, kaip emulsikliai, gaminant kremus, tepalus, emulsijas, skirtas išoriniam vartojimui. Kai naudojami vieni sorbitano esteriai, gaunamos stabilios v/a emulsijos ir mikroemulsijos, tačiau dažnai šie sorbitano esteriai naudojami įvairiomis proporcijomis su polisorbatais. Sorbitano monooleato HLB reikšmė yra 4,3. Kaip emulsiklis yra netoksiškas, jis įtrauktas į FDA neaktyvių ingridientų sąrašą. Jungtinėje Karalystėje naudojamas neparenteralinių vaistų sudėtyje, Kanadoje įtrauktas į priimtinų nemedicininių ingredientų sąrašą [27;29].
1.17. Išgrynintas vanduo (Aqua purificata)
Vanduo yra bespalvis, bekvapis skaidrus skystis. Farmacijoje išgrynintas vanduo naudojamas kaip tirpiklis ir ingredientas kuriant ir gaminant farmacinius preparatus. Norint naudoti vandenį farmacinių produktų gamybai, jis turi būti išgryninamas. Geriamasis ,,žalias” vanduo turi daug priemaišų, joms pašalinti yra įvairių metodikų. Išgrynintas vanduo, tinkamas naudoti farmacijai gali būti ruošiamas keliais būdais: distiliacija, dejonizacija arba atvirkštiniu osmosu. Išgryninto vandens saugumas yra neginčytinas, jei jis atitinka Europos farmokopėjos keliamus reikalavimus. Vandens virimo temperatūra yra 100 ºC. Vanduo yra stabilus visose agregatinėse būsenose (kietas, skystas, garai). Išgrynintam vandeniui paliekant gryninimo sistemą ir patenkant į laikymo talpą, būtina užtikrinti, kad vanduo būtų apsaugotas nuo bet kokio joninio ir organinio užterštumo. Taip pat sistema turi būti apsaugota nuo fizinių dalelių ir mikroorganizmų patekimo. Išgrynintas vanduo turi būti laikomas sandariai uždarytose talpose, sąlygose kurios ribotų mikroorganizmų augimą [27].
1.18. 2-Fenoksietanolis (Phenoxyethanolum)
2-fenoksietanolis yra bespalvis, mažai lakus skystis, turintis silpną, malonų kvapą ir deginantį skonį. Ši medžiaga naudojama kaip antimikrobinis konservantas kosmetikoje ir išorinio naudojimo farmaciniuose preparatuose, koncentracijomis 0,5 – 1,0 proc. Taip pat fenoksietanolį galima naudoti kaip konservantą ir antimikrobinę medžiagą vakcinų gamyboje. Terapiškai, 2,2 proc. tirpalas arba 2,0 proc. kremas buvo naudojamas ,kaip dezinfektantas paviršinėms žaizdoms, nudegimams ir mažoms odos, bei gleivinės infekcijoms gydyti. 2 -fenoksietanolis yra antibakterinis konservantas, kuris veikia
plačiame pH reikšmių spektre, prieš Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Aspergillus niger,
Candida albicans, Escherichia coli. 2 – fenoksietanolis yra įtrauktas į FDA neaktyvių ingridientų sąrašą,
bei į Kanados priimtinų nemedicininių medžiagų sąrašą. Pagal Europos kosmetikos nuostatus (76/768/EEC), maksimali leistina fenoksietanolio koncentracija, kosmetikoje ir išorinio naudojimo preparatuose, yra 1,0 proc. 2-fenoksietanolio virimo temperatūra yra 245,2 ºC, o lydymosi temperatūra – 14 ºC. Medžiaga gerai tirpsta acetone, etanolyje (95 proc.), glicerolyje, o dalinai tirpsta izopropilo palmitate, mineraliniuose aliejuose, alyvuogių, riešutų aliejuje ir vandenyje [31].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas:
Bruknių lapų vandeninė ištraukaPusiau kietas odos preparatas su bruknių lapų ištrauka
2.1.1. Naudotos medžiagos:
Saulėgrąžų aliejus (Aceitera General Dehenza S.A.);
Ricinų aliejus (Carl roth Gmbh, Vokietija);
Kakavos sviestas („Henry Lamotte GmbH“, Vokietija); Kokosų aliejus (UAB EKO PIRK);
Karnaubo vaškas (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Brazilija); Bičių vaškas (bitininkų draugija ,,Bitutė”, Lietuva);
Bruknių lapai (gamintojas – “Acorus calamus”, Lietuva);
Sorbitano monooleatas (Span 80) (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija); Sorbitano trioleatas (Span 85) (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija); Polioksietilen (20)–sorbitano monostearatas (Tween 60) (Sharlab S.L., Ispanija); Vilnų riebalai (Lanolinas) (Carl Roth GmbH & Co KG, Vokietija);
2-fenoksietanolis (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija); ± -α – tokoferolis (Carl Roth GmbH & Co KG, Vokietija); Gvazdikų et. al. (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija); Mandarinų et. al. (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija); Išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2008:0008, LSMU laboratorija);
Reagentai:
DPPH• reagentas (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija); Etilo acetatas (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija); Folin-Ciocalteu‘s phenol reagentas
2.1.2. Tyrime naudota įranga:
Analitinės svarstyklės (Mettler Toledo);Termometras (LCD Digital Portable Multi – Thermometer, Kinija); Vandens vonelė (J. P. selecta, s.a., Ispanija);
Kaitinimo plytelė (,,Farel”, Lenkija); Centrifuga („SIGMA3-18KS“, Vokietija);
Spektrofotometras (Shimadzu Europa GmbH, Vokietija); Drėgnomatis (Kern MLS, Vokietija);
Chromatografinė sistema „Waters 2695” su detektoriumi „Waters 996 PDA“ Kolonėlė ACE C18 5 μm, 4,6×250 mm (Waters, Milford, JAV)
Tekstūros analizatorius TA.XT.plus (Stable Micro Systems Ltd, Godalming, Surrey, Jungtinė Karalystė); Maišyklė ,,Unguator 2100” (Unguator technologie, Vokietija);
Sietai (Retsch GmbH, Vokietija);
Automatinės pipetės (Ependorf, Didžioji Britanija);
pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija); Klampomatis („ALPHA SERIES“ FUNGILAB, S.A., Ispanija);
Mikroskopas Motic® (Motic China Group Co., Ltd., Kinija); Kiuvetės 1cm 4 ml talpos, kvarcinio stiklo (Vokietija)
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1.
Tyrimo atlikimo planas
Prieš pradedant modeliuoti pusiau kietą odos preparatą su arbutinu, buvo sudarytas planas, kuriuo vadovaujantis buvo atliktas darbas. Planas susideda iš kelių etapų. Pirmas etapas – bruknių lapų ištraukos gamyba ir arbutino kiekio joje nustatymas. Antrasis etapas – kuriamas pusiau kieto odos
6 pav. Tyrimo atlikimo planas
Bruknių lapų žaliavos tyrimas Produkto sudėties modeliavimas
Pagrindo gamyba Ištraukos gamyba
Sumodeliuoto produkto gamyba
Kokybinė analizė
Arbutino kiekio ištraukoje nustatymas Pagrindo antioksidacinio
aktyvumo nustatymas
Centrifugavimas pH reikšmės nustatymas
Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Vienalytiškumo vertinimas Tekstūros analizė Stabilumo tyrimai Statistinė analizė
preparato pagrindas. Siekiama sukurti stabilų pagrindą, į kurį būtų galima įterpti vandeninę ištrauką. Trečiasis etapas – pagaminamas pusiau kietas odos preparatas su bruknių ištrauka ir atliekama kokybinė analizė, kurios metu buvo vertintas emulsinės sistemos vienalytiškumas, stabilumas centrifuguojant, atlikta tekstūros analizė, nustatytas antioksidacinis aktyvumas ir pH reikšmė, atlikti stabilumo tyrimai.
2.2.2. Bruknių lapų žaliavos tyrimai.
2.2.2.1. Drėgmės nustatymas
Nuodžiūvis nustatytas drėgnomačiu “KERN MLS”, (Vokietija). 1,0g tiriamosios žaliavos, talpiname ant prietaiso lėkštelės ir džioviname 105 °C temperatūroje, džiovinama iki nekintamos masės [30]. Įvertinama tiriamosios žaliavos drėgmė 0,01 proc. tikslumu. Tyrimas kartotas tris kartus, apskaičiuotas rezultatų vidurkis. Drėgmės kiekis lapų žaliavoje neturi viršyti 13 proc. [14].
2.2.2.2. Žaliavos smulkumo nustatymas
Sietų analizė gali būti atliekama sijojant rankomis arba naudojant sijotuvus. Atliekant sietų analizę rankomis, sietas judinamas vertikaliais judesiais, sukant. Mėginys turi nepertraukiamai judėti per visą sieto paviršių. Sijojimo metu buvo naudotas sietas, kurio ø 500 μm ir sietas, kurio ø 300 μm Po sijojimo sverta žaliava likusi ant sieto ir išbirusi pro ø 500 μm sietą, apskaičiuotas jų procentinis kiekis. Prabyrėti pro ø 500 μm sietą turi ne mažiau kaip 90 proc. žaliavos masės, o pro sietą ø 300 prasijojamos dulkės (Eur. Ph. 01/2011, 2.1.4)
2.2.3. Bruknių lapų vandeninės ištraukos gamyba
Bruknių lapų vandeninė ištrauka buvo gaminama masės – tūrio metodu, santykiu 1:10. Ištraukos gamybai buvo naudota žaliava, kuri prabirėjo pro sietą ø 500 μm, bet neprabirėjo pro ø 300 μm (taip ji buvo atskirta nuo dulkių). Atsverta 10 g paruoštos žaliavos. Skaičiuojamas ištraukai pagaminti reikalingas išgryninto vandens kiekis. Bruknių lapų sugerties koeficientas Ks=1,4.
V vandens =100 ml + (10,0 x 1,4) = 114 ml. Paruošta žaliava dedama į pašildytą infundyrinį indą
užpilama reikiamu vandens kiekiu, uždengiama ir šildoma pamaišant 30 min. Kadangi bruknių lapai kaupia raugus, nuoviras košiamas iškart po kaitinimo. Košiama pro dvigubą marlės sluoksnį. Ištrauka aušinama 10 min., papildoma vandens iki 100 ml žymės.
2.2.4. Spektrofotometrija
UV-VIS spektrofotometrija, yra ekonomiškas ir greitas, todėl labai populiarus biocheminių matavimų metodas. Fitochemijoje dažnai naudojamas kiekybiniams tyrimams bei priemaišų nustatymui. kaip didelį atrankumą turintis metodas. Cheminės medžiagos turi savybę absorbuoti įvairios energijos (bangos ilgio) matomosios šviesos fotonus. Dėl skirtingo įvairių bangos ilgių sugėrimo, junginiai būna spalvoti, o savybė sugerti šviesą priklauso nuo cheminės struktūros. Spektrofotometru galima tiksliai išmatuoti šviesos pralaidumą tirpaluose (T) tarp 10 ir 90 proc., t.y. nuo T=0,1 iki T=0,9, absorbcija atitinkamai 0,046 ir 1,000. Geriausi rezultatai gaunami, kai T=0,5, o absorbcija – A=0,301. Spektrofotometrinis tyrimo metodas yra grindžiamas – Bugero, Lamberto ir Bero dėsniu, juo nustatoma šviesos sugerties priklausomybė nuo medžiagos ir jos koncentracijos tirpale. Tyrimų metu patogiausia naudoti kalibracinės kreivės metodą [33;34].
2.2.4.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu
Tyrimo metu bendrąjį polifenolinių junginių kiekį nustatėme spektrofotometriškai, naudojant spektrofotometrą Shimadzu Europa GmbH, Vokietija. Atlikta reakcija su Folin-Ciocalteu‘s phenol reagentu. Siekiant nustatyti bendrą polifenolinių junginių kiekį, buvo sudaryta kalibracinė kreivė. Kalibracinei kreivei sudaryti, buvo pagaminti 0,07, 0,10, 0,13, 0,16, 0,19, 0,22 mg/ml vandeniniai arbutino tirpalai. Analitinėmis svarstyklėmis atsverta 100,0 mg (0,001 mg tikslumu) arbutino ir ištirpinta 100 ml išgryninto vandens. Gauto pradinio tirpalo koncentracija – 1 mg/ml. Siekiant gauti reikiamos koncentracijos tirpalus, kalibracinei kreivei sudaryti, buvo paimta atitinkamai: 0,7 ml, 1,0 ml, 1,3 ml, 1,6 ml, 0,19 ml, 2,2 ml pradinio tirpalo (1 mg/ml) ir matavimo kolbutėse praskiesta iki 10 ml žymos. Iš gautų
tirpalų paimta po 1 ml mėginio ir atlikta spalvinė reakcija, sumaišant su 3 ml išgryninto vandens ir 1 ml Folin-Ciocalteu‘s phenol reagento. Pridedama 1,5 ml 20 proc. vandeninio Na2CO3 tirpalo, skiedžiama
išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Tirpalai laikomi 30 min. 25 °C ± 2 °C temperatūroje, jų spalva kinta iš žalsvos į melsvą. Absorbcija matuota esant 765 nm bangos ilgiui. Kiuvetės absorbuojančio sluoksnio storis 1 cm, lyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Bandymas kartotas 3 kartus (n=3). Kalibracinė kreivė sudaryta iš vidutinių reikšmių, naudojantis lygtimi C=K1*A; koeficientas K1—0,28110 mg/ml; A—absorbcija; (koreliacijos koeficientas R2 = 0,99593). Gauta kalibracinė kreivė pateikta 7 pav.
7 pav. Kalibracinė kreivė pagal arbutiną bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti
Tiriamasis tirpalas paruoštas imant 1 ml tiriamojo tirpalo (bruknių lapų vandeninio ekstrakto) ir praskiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml žymos, sumaišius 1 ml šio tirpalo matavimo kolbutėje skiedžiamas 3 ml išgryninto vandens, pilama 1 ml Folin-Ciocalteu‘s phenol reagento ir 1,5 ml 20 proc. Na2CO3 vandeninio tirpalo, išgryninto vandens iki 10 ml. Po 30 min. tirpalų spalva iš žalsvos pakinta į
melsvą. Naudojantis kalibracine kreive, UV-Vis spektrofotometru nustatyta paruošto tirpalo polifenolinių junginių koncentracija pagal arbutiną. Matavimai pakartoti tris kartus (n = 3).
2.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas
Šiuo metu ESC–dažniausiai taikomas metodas augalų cheminėms sudėtims tirti. Chromatografija pagrįsta daugkartine medžiagų sorbcija ir desorbcija, joms judant judriosios fazės sraute per stacionariąją fazę (sorbentą) [35]. Fitochemijos tyrimų metu daugiausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija. Šiam metodui būdinga didelė skiriamoji geba, didelis efektyvumas, atrankumas ir rezultatų atkūrimas [34]. Arbutino kiekiui nustatyti taikytas Europos farmakopėjoje aprašytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas (Eur. Ph. 01/2011:1054). ESC atlikimui naudotas “Waters 2695” chromatografo ir detektoriaus 996 diodo matricos sistema. Naudota ACE C18 (4,6x250 mm, 5 µm) kolonėlė. Judančioji fazė metanolio ir vandens mišinys santykiu 1:9. Arbutino nustatymui taikytas UV spektro bangos ilgis 280 nm. Tekėjimo greitis 1 ml/min. Mėginių injekcijos tūris – 10 µl. Chromatografinės analizės rezultatai apdoroti „Empower 2” programoje.
Standartinių arbutino tirpalų paruošimas. 50,0 mg arbutino miltelių tirpinama judančioje
fazėje (metanolio ir vandens mišinyje santykiu 1:9) ir praskiedžiama judančiąja faze iki 50 ml žymos. Pagaminti 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 mg/ml koncentracijos arbutino standartiniai tirpalai, kalibracinės kreivės sudarymui (8 pav.).
2.2.6. Pusiau kieto odos preparato su bruknių lapų vandenine ištrauka, gamyba
Pusiau kieta emulsinė sistema buvo gaminama rankiniu būdu ir panaudojant maišyklę. Aliejinė fazė, kurią sudaro saulėgrąžų, ricinų, kokosų aliejai, kakavos sviestas, bičių vaškas ir emulsiklis Span 80, kaitinama porcelianinėje lėkštelėje virš vandens vonelės. Aliejinės fazės sudedamosios dalys dedamos lydymosi temperatūros mažėjimo tvarka. Bruknių lapų ištraukos temperatūra taip pat buvo palaikoma 70±5 ºC vonelės pagalba. Abi fazės, aliejinė ir vandeninė turėtų būti vienodos temperatūros (literatūroje iki 66-80 ºC) [36]. Vandeninė fazė, mažais kiekiais, intensyviai maišant, įterpiama į aliejinę fazę, sujungus fazes, maišoma kol sistema atvėsta.
Jei maišymas atliekamas maišyklės, UNGUATOR 2100,pagalba, abi fazės supilamos į maišymo indą, jų temperatūra susilygina maišymo proceso metu. Emulsinimas vyksta maišant, todėl ši gamybos stadija lemia produkto stabilumą. Jei emulsinė sistema nebus tinkamai maišoma, produkto struktūra gaunama grubi, nevienalytė. Dispersinės sistemos gamybai svarbi ir aušinimo stadija. Naudojant greitą vėsinimą emulsinė sistema gali išsisluoksniuoti. Vėsinimas turėtų būti vykdomas apie 2,0 ºC/min. [37].
2.2.7. Centrifugavimo testas
Vertinant pagamintos dispersinės sistemos stabilumą, taikomas centrifugavimo testas. Naudota centrifuga („SIGMA3-18KS“, Vokietija). Šio testo metu tiriama ar pagamintas pusiau kietas odos preparatas išlieka stabilus esant kritinėms sąlygoms. Testui naudoti 2 ml talpos vienkartiniai mėgintuvėliai. Jie buvo užpildyti vienoda pusiau kieto prepaparato mase, sveriant po 2±0,02 g. Pasirinktas rotorius 12131, centrifugavimo režimas 3000 aps/min, centrifuguojant 5 minutes, esant 25 ºC temperatūrai. Fazių atsiskyrimas vertinamas vizualiai. Šiuo tyrimu buvo vertinti šviežiai pagaminti pusiau kieti preparatai atliekant stabilumo tyrimus laikymo metu. Matavimai buvo atliekami centrifuguojant po tris vienodus mėginius( n=3).
2.2.8. pH reikšmės nustatymas
pH reikšmė nustatyta kiekvienam mėginiui tik ką pagaminus ir stabilumo tyrimo metu, po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių. 5,0 g. produkto, ištirpinama 45 ml išgryninto vandens, šildant. Pagamintas tirpalas pro popierinį filtrą. Tirpalo pH reikšmės nustatytos esant 27 º C mėginio temperatūrai [38]. Tyrimo metu naudotas pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija). Prieš matuojant ir po matavimų pH-metro elektrodas plaunamas išgrynintu vandeniu iki pastovios pH reikšmės. Rezultatai pateikiami išvedus gautų duomenų aritmetinį vidurkį su paklaida. Mėginių reikšmės buvo nustatytos kartojant tyrimą 3 kartus (n=3).
2.2.9. Tekstūros analizė
Tekstūros analizė buvo atliekama tekstūros analizatoriumi TA.XT plus (Stable Micro Systems Ltd, Godalming, Surrey, Jungtinė Karalystė). Tyrimo metu vertinta produkto kokybė nustatant kietumą, konsistenciją, koheziją, klampos indeksą, ir jų pokyčius laikymo metu. Programoje “Exponent” pasirinktas tyrimas, skirtas kosmetinių kremų vertinimui. Matavimai atlikti esant mėginio temperatūrai 24± 2 ºC. Matavimams atlikti naudotas organinio stiklo diskas 3,5 mm skersmens, pritaikytas atitinkamo skersmens indui, į kurį talpinamas tiriamasis pusiau kietas preparatas. Analizatoriaus darbinis režimas: atstumas 15,0 mm, greitis 3.0 mm/s. Prasidėjus darbui, prietaiso diskas leidžiasi į tiriamąjį mėginį 3.0mm/s greičiu. Matuojamas mėginių klampos indeksas, kohezija, konsistencija, kietumas. Rezultatus programa pateikia grafikuose ir lentelėse. Tokio grafiko pavyzdys pateiktas 9 paveiksle. Bandymas kartotas 3 kartus kiekvienam mėginiui kiekvieną kartą indas pakraunamas iš naujo.
2.2.10. Vienalytiškumo vertinimas
Tepalo vienalytiškumas buvo vertinamas optiškai, naudojant elektroninį mikroskopą Motic® (Motic china Group Co., Ltd., Kinija), su integruota kamera ir Motic programine įranga. Vienalytiškumas įvertintas vizualiai pagal produkto spalvą ir mikroskopinio vaizdo struktūrą. Vertinti švieži gaminiai ir stabilumo tyrime dalyvavę mėginiai po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių. Naudotas 40X didinantis lęšis, o objektyvas didina l0 kartų, todėl vaizdas gaunamas padidintas 400 kartų.
2.2.11. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas
Pusiau kieto odos preparato antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometrijos metodu, naudojant laisvojo DPPH radikalo surišimo metodiką. Laisvasis DPPH radikalas reaguoja su antioksidacinių savybių turinčiais junginiais, šie junginiai mažina laisvojo DPPH radikalo aktyvumą ir
keičia tirpalo spalvą nuo violetinės iki blyškiai gelsvos, pokytis priklauso nuo antioksidaciniø aktyvumu pasižyminčių junginių koncentracijos [39]. Antioksdaciniam aktyvumui nustatyti panaudota Amerikos chemikų draugijos mokslininkų Sibel U. ir Nurhayat O. metodika. Tirpalo paruošimas: sveriama 0,0024 g DPPH miltelių ir tirpinama 100 ml etilacetato. Paruoštas tirpalas laikomas 1 parą tamsoje. Paruošto tirpalo absorbcija turi būti 0.700 ± 0.020 ties 520 nm bangos ilgiu.
Mėginio paruošimas: sveriama 20 mg mėginio, tirpinama 80 µl etilacetato ir 2,9 ml paruošto DPPH tirpalo. Mėginys maišomas 20 s ir laikomas 30 min tamsoje. Absorbcija matuojama esant 520 nm bangos ilgiui, palyginamuoju tirpalu naudojant etilo acetatą. [40] Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas inaktyvuoto DPPH radikalo kiekiu, procentais, apskaičiuojant pagal formulę:
A0 – kontrolinio mėginio absorbcija (t = 0 min.)
Ax – tiriamojo mėginio absorbcija (t = 30 min.)[41]
Tyrimas kartojamas 3 kartus (n=3).
2.2.12. Stabilumo tyrimai
Paprastai galiojimo laikas nustatomas vadovaujantis dviem stabilumo tyrimų tipais: realaus laiko stabilumo ir pagreitinto stabilumo. Realaus laiko stabilumo tyrimo metu, produktas laikomas esant rekomenduojamoms sąlygoms ir stebimas kol pasikeis produkto kokybės parametrai. Tiriant produktą pagreitintu metodu, jis yra patalpinamas į stresines sąlygas, tokias kaip, temperatūra, drėgmė. pH. Degradacija rekomenduojamomis sąlygomis apsprendžiama vertinant stresinio faktoriaus ir degradacijos greičio santykį [42]. Taigi stabilumo tyrimų tikslas – įsitikinti, kad naujas, ar pakeistas produktas išlaiko numatytas fizikines ir chemines savybes, bei funkcionalumą ir estetinį vaizdą, kai jis yra patalpinamas tinkamomis sąlygomis, numatytą laikotarpį. Tiek stresinių sąlygų, tiek realaus laiko testai turi būti sudaryti taip, kad būtų galima patikimai įvertinti šiuos aspektus: 1) Stabilumą ir fizinį kosmetinių produktų vientisumą, esant tinkamoms sandėliavimo, transportavimo ir naudojimo sąlygoms. 2) Cheminį stabilumą. 3) Mikrobiologinį stabilumą. 4) Talpos ir turinio suderinamumą [43].
Kiekvienas gamintojas turi apspręsti jų produktui tinkamiausias sąlygas, kuriomis pagamintas produktas turėtų būti laikomas, atsižvelgiant į panašių sudėčių produktų laikymą. Remiantis IFSCC monografija, nr.2 “Stabilumo tyrimų pagrindai”, stabilumo tyrimams turėtų būti taikomi vertinimo kriterijai pateikti 1-oje lentelėje.
Tyrimo metu stabilumas vertintas laikant mėginius 24 ± 2 ° C temperatūroje. Bandymai atlikti šviežiai pagamintam mėginiui ir mėginiams laikytiems 1, 2, 4, ir 6 mėnesius.
2.2.13. Statistinė analizė
Tyrimų rezultatai statistiškai apdoroti ir susisteminti naudojant statistines duomenų analizės programas: Microsoft® Office Excel 2007 ir Sigma Plot 20.0. Išvesti tyrimų aritmetiniai vidurkiai pateikiami su vidutinėmis kvadratinėmis paklaidomis. Apskaičiuojamas vidurkių patikimumas.
Kriterijus Priimtinumo ribos
Išvaizda Produkto išvaizda - spalva, kvapas ir mikrospkopinis vaizdas turi išlikti nepakitę visą testavimo laiką, pH reikšmė pH reikšmė neturėtų būti didesnė ar mažesnė nei natūrali žmogaus pH,
numatomos ribos nuo 4.0 iki 7.0. Tekstūra
Klampos indekso, kohezijos, konsistencijos ir kietumo ribos nustatomos palyginant šviežiai pagaminto mėginio su stabilumo tyrimų metu nustatytais.
Antioksidacinis aktyvumas
Antioksidacinio aktyvumo ribas nustato gamintojas lygindamas pagrindo be veikliųjų medžiagų bei pagaminto produkto antioksidacinį aktyvumą ir jo pokyčius stabilumo tyrimų metu.
Centifugavimo testas
Mėginiai laikomi stabiliais, jei centrifugavimo metu prie nurodyto režimo, jie neišsisluoksniuoja.
1 lentelė. Vertinimo kriterijai ir priimtinumo ribos, atliekant stabilumo tyrimus [9].
3. REZULTATAI
3.1. Bruknių lapų žaliavos kokybės tyrimai
Bruknių lapų žaliavos kokybė buvo vertinta nustatant nuodžiūvį drėgnomačiu KERN MLS ir atliekant frakcijų smulkumo vertinimą sietų analizės metodu. Metodika aprašyta 7.2.2.1 ir 7.2.2.2 skyriuose. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Bruknių lapų žaliavos tyrimo rezultatai
Tiriamasis rodiklis Žaliavos frakcijų smulkumas (%) Bruknių lapų nuodžiūvis (%)
Bandymo Nr. Sietas Nr. 500 Sietas Nr. 355
1. 95.00 2.00 6.05
2. 97.00 1.40 5.58
3. 96.00 1.70 5.48
Vidurkis 96.00 ± 1.00 1.70 ± 0.30 5.70 ± 0.30
± standartinis nuokrypis (Δ), n=3
Bruknių lapų nuodžiūvis matuotas tris kartus (n=3), apskaičiuotas rezulatų vidurkis. Nustatytas bruknių lapų nuodžiūvis 5.70 ± 0.3 proc, kuris atitinka augalinei žaliavai keliamus reikalavimus ( < 13 proc.).
Atlikus žaliavos smulkumo tyrimus pro sietą Nr. 500 prabyrėjo 96.00 ± 1.00 proc susmulkintų bruknių lapų (>90 proc. žaliavos), o pro sietą Nr. 355 – 1.70 ± 0.30 proc. (<30 proc. Žaliavos).
Bruknių lapų žaliavoje esanti drėgmė ir žaliavos smulkumas atitinka Europos farmakopėjoje keliamus reikalavimus, todėl žaliava yra tinkama tolimesnių tyrimamų atlikimui.
3.2. Bruknių lapų vandeninės ištraukos tyrimai
3.2.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas
Bruknių lapų vandeninė ištrauka – nuoviras pagamintas pagal skyriuje 7.2.3 pateiktą metodiką. Bendrasis polifenolinių junginių kiekis pagal arbutiną nustatytas spektrofotometriškai (skyrius 7.2.4), naudojant kalibracinę kreivę (7 pav.). Tyrimas kartotas 3 kartus. Rezultatai pateikti 3 lentelėje.
Polifenolinių junginių kiekis pagal arbutiną
(mg/ml)
Bruknių lapų nuoviras 21.48 ± 0.68 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3
Vandeninėje bruknių lapų ištraukoje nustatytas bendrasis polifenolinių junginių kiekis ištraukoje - 21.48 ± 0.68 mg/ml.
3.2.2. Arbutino kiekio ištraukoje nustatymas
Arbutino kiekiui nustatyti taikytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Metodika pateikta skyriuje 7.2.5 Rezultatams apskaičiuoti naudotąsi kalibracine kreive (8 pav.) Gauta ES chromatograma, pateikta 10 pav., rezultatai pateikti 4 lentelėje.
10 pav. ES chromatograma, arbutino nustatymas
4 lentelė. Bruknių lapų ištraukos tyrimo, nustatant arbutino kiekį ESC metodu, rezultatai
Bandymo numeris
Sulaikymo laikas, min.
Plotas po smaile Arbutino kiekis ištraukoje mg/ml Arbutino kekis bruknių lapuose mg/g Arbutino kiekis bruknių lapuose (%) Nr. 1 2.00 493001 0.422 42.2 4.22 Nr. 2 2.00 447594 0.384 38.4 3.84 Nr. 3 2.00 486059 0.417 41.7 4.17 Vidurkis 2.00 ± 0.00 475551.3 ± 24459.3 0.408 ± 0.02 40.77 ± 2.06 4.08 ± 0.21 ± standartinis nuokrypis (Δ), n=3
Nustatyta arbutino sulaikymo trukmės vidurkis – 2.00 ± 0.00 min., plotų po smaile vidurkis 475551.3 ± 24459.3. Nustatyta arbutino koncentracija bruknių lapų vandeninėje ištraukoje 0.408 ± 0.02 mg/ml, tai atitinka 4.08 ± 0.21 proc. bruknių lapuose. Apskaičiuotas arbutino kiekis 1g žaliavos lygus 40.77 ± 2.06 mg.
3.3. Pusiau kieto preparato sudėties parinkimas
Atsižvelgiant į nustatytą arbutino kiekį ištraukoje apskaičiuota kiek ištraukos reikia panaudoti pusiau kieto preparato gamybai, kad arbutino kiekis pagamintame produkte būtų saugus. Ieškant priimtinos ir stabilios pusiau kieto odos preparato sudėties, buvo pagaminti 29 mėginiai, su skirtingomis sudedamosiomis dalimis ar jų kiekiais, kol sumodeliuotas galutinis tinkamas variantas. Sudėtys pateiktos 1 priede. M 01 sudėtyje visos lipofilinės fazės sudedamosios dalys buvo minkštos konsistencijos, todėl gautas produktas buvo takus, nepriimtinos konsistencijos. Produkto konsistencijai pagerinti buvo nuspręsta į sudėtį įterpti kietinančios medžiagos, karnaubo vaško. Įterpus į sudėtį karnaubo vašką (sudėtis M 02) gautas pusiau kietas preparatas buvo linkęs išsisluoksniuoti laikant, todėl mėginta keisti karnaubo vaško kiekį kokosų aliejaus sąskaita. Pastebėta, kad didinant karnaubo vaško kiekį, produktas mažiau sluoksniuojasi, tačiau, sutrinka vienalytiškumas, atsiranda grūdėtumas. Padidintas emulsiklio kiekis visiškai grūdėtumo nepanaikino, dėl šios priežasties buvo nuspręsta pakeisti karnaubo vašką bičių vašku (sudėtis M 09). Gauta vienalytė emulsinė sistema, stabili centrifuguojant. Konservuojančios medžiagos
parinkimui buvo išmėgintos sekančios galimybės: pagaminti keturių sudėčių mėginiai, į sudėtį įterpiant 1 proc. mandarinų eterinio aliejaus (M 10), 1 proc. 2- fenoksietanolio(M 11), 1 proc. α-tokoferolio (M 12) ir 1,5 proc. gvazdikų eterinio aliejaus (M 13). Mėginiai laikyti 3 mėnesius, laboratorijos sąlygomis ( temp.18– 25 ºC) Po trijų mėnesių mėginiuose M 12 ir M 10 pastebėtas pelėsio augimas, o mėginiai M 11 ir M 13 išliko nepakitę. Konservantu nuspręsta naudoti 2-fenoksietanolį, mėginio su gvazdikų eteriniu aliejumi kavapas buvo per ryškus. Po trijų mėnesių stebėjimo mėginiuose atsirado grūdėtumas. Išmėginus kitus emulsiklių Tween ir Span mišinio santykius ir derinius, teigiamo rezultato sulaukta naudojant vieną emulsiklį – Span 80. Pusiau kieto preparato grūdėtumo klausimą buvo bandoma spręsti modeliuojant kokosų aliejaus kiekį. Pastebėta, kad mažinant kokosų aliejaus kiekį, bei didinant saulėgrąžų aliejaus kiekį grūdėtumas mažėja. Sumažinus jo iki 19 dalių (sudėtis M 18) plika akimi grūdėtumo jau nesimatė, o sudėtyje M 19 grūdėtumo nelieka ir stebint pro lupą (padidinus 10 kartų). Siekiant įsitikinti ar kokosų aliejaus ar vaško kiekis sąlygoja gaminamo pusiau kieto preparato grūdėtumą, mėginta mažinti vaško kiekį (sudėtis M 20), grūdėtumas pastebėtas. Pagaminti mėginiai (sudėtys M 21, M 23, M 24, M 25) ir nustatytos kokosų aliejaus, vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykių ribos, kuriose grūdėtumo nestebėta, sistema gauta vienalytė ir išlieka stabili centrifugavimo metu. Tai sudėtys M 24 ir M 25. Tolimesniems tyrimams pagaminti keturių sudėčių mėginiai M 26, M 27, M 28, M 29, kuriuose kokosų aliejaus kiekiai atitinkamai: 24, 19, 14, 9 proc. Šių sudėčių pusiau kietos emulsinės sistemos stabilios ir homogeniškos.
3.4. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato AA palyginimas su kontrolinėmis
grupėmis.
Siekiant įsitikinti, kad pagaminus preparatą išlieka arbutinas, atliktas antioksidacinio aktyvumo tyrimas lyginant su mėginiu be arbutino (Mėg A) ir su mėginiu kuriame yra tokios pačios koncentracijos arbutino substancijos tirpalas (Mėg B), preparatas su ištrauka – Mėg C. Šiam tyrimui pasirinktas M 26 sudėties pagrindas. Rezultatai pateikiami 11 pav. grafike. AA matavimui naudota metodika aprašyta skyriuje 7.2.11.
11 pav.Pusiau kieto preparato AA palyginimas su kontrolinėmisgrupėmis
.
Nustačius antioksidacinį aktyvumą pastebėta, kad mėginys su bruknių lapų vandenine ištrauka yra statistiškai reikšmingai aktyvesnis (p<0.05) už mėginį be arbutino, ir už mėginį su arbutino tirpalu. Todėl galima manyti, kad į pusiau kieto preparato sudėtį įvesta bruknių lapų vandeninė ištrauka savo savybes išlaikė.
3.5. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato kokybės tyrimai.
Pagaminti mėginiai su bruknių lapų ištrauka M 26, M 27, M 28, M 29. Jų sudėtys pateiktos 5 lentelėje
5 lentelė. Pusiau kieto preparato mėginių sudėtys procentais
Mėginio Nr. M 26 M 27 M 28 M 29 Saulėgrąžų al. 14 19 24 29 Ricinų al. 5 5 5 5 Kakavos sviestas 5 5 5 5 Kokosų al. 24 19 14 9 Bičių vaškas 10 10 10 10
Bruknių lapų ištr. 33 33 33 33
Span 80 8 8 8 8
2-Fenoksietanolis 1 1 1 1
63.76%
41,24% 36,64%
Pagaminti mėginiai paliekami stabilumo tyrimams. Pagaminta po keturis kiekvienos sudėties mėginius, kurie bus atidaromi po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių.
3.6. Šviežiai pagamintų mėginių centrifugavimo testas
Centrifugavimo testas atliktas norint vertinti pagamintų pusiau kietų dispersinių sistemų stabilumą. Naudota centrifuga SIGMA3-18KS, (Vokietija). Tyrimas atliktas pagal metodiką pateiktą skyriuje 7.2.7. Tyrimo metu nustatyta, kad pagamintos pusiau kietos emulsinės sistemos v/a su bruknių vandenine ištrauka išlieka stabilios centrifuguojant 3000 aps/min, 5 minutes, esant 25ºC temperatūrai.
3.7. Šviežiai pagamintų mėginių pH reikšmės nustatymas
pH reikšmės nustatytos M 26, M 27, M 28, M 29, sudėčių mėginiuose pagal metodiką pateiktą skyriuje 7.2.8. Naudotas pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija); Tyrimai kartoti 3 kartus, rezultatai pateikti 6 lentelėje.
Mėginys M 26 M 27 M 28 M 29
pH vertė 6.9442 6.8791 6.9848 6.9246
Standartinis
nuokrypis 0.0112 0.0098 0.009 0.0072
Šviežiai pagaminto pusiau kieto odos preparato su vandenine bruknių lapų ištrauka, mėginių pH reikšmė nustatyta tarp 6.8791 ± 0.0098 ir 6.9848 ± 0.0090. Tokia terpė yra neutrali, todėl produktas turėtų nedirginti odos ir būti tinkamas visiems odos tipams, tačiau arbutinas išlieka stabilus terpėje, kurios pH reikšmė 3.5 – 6.5.
